Nous avons analysé, chez les patients atteints d'hépatite virale C chronique, les lymphocytes exprimant des récepteurs de molécules HLA de classe I (NKG2A et les membres CD158a,b et CD158b,j du groupe KIRs) qui sont important pour réguler les cellules NK et qui peuvent aussi être exprimés par les cellules T (LT)CD8+ activés/mémoires. Nous n'avons pas détecté de phénomènes d'accumulation généralisée de ces cellules dans le foie ou le sang des patients. Nonobstant, l'infection VHC semble influencer le phénotype des LT CD8+. Par rapport aux paramètres cliniques, nous avons observé une corrélation positive entre la fréquence intra-hépatiques de cellules T CD8+ NKG2A+ et le degré de sévérité des lésions. Ces résultats montrent de multiples altérations de la représentation de sous populations lymphocytaires T au cours de l'hépatite virale C chronique et révèle des associations positives de certaines de ces sous populations avec des paramètres cliniques majeurs de la maladie.

Plusieurs paramètres participent à l'homéostasie du système immunitaire. On peut notamment citer : la production lymphocytaire (les lymphocytes B dans la moelle osseuse ou les lymphocytes T (LyT) dans le thymus), la prolifération et la survie des lymphocytes périphériques et enfin, la compétition entre les différents clones de lymphocytes ou les différentes populations de lymphocytes pour des ressources limitées en particulier les cytokines. Les mécanismes de régulation homéostatique sont différents selon la sous-population de lymphocyte considérée. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié le rôle de l'interleukine-7 (IL-7) dans l'homéostasie des lymphocytes et plus particulièrement les lymphocytes T ΑΒ. Disposant de souris surexprimant l'IL-7 dans un état lymphopénique plus ou moins sévère, nous avons pu décortiquer les effets de l'IL-7 sur le développement précoce des LyT et leur survie périphérique. L'analyse du développement précoce des lymphocytes n'a pas révélé d'effet notable de la sur-expression de l'IL-7 sur le développement thymique des LyT. En revanche, une expansion considérable des LyT périphériques a été observée. A partir d'expérience de transferts adoptifs, nous avons montré que l'IL-7 favorisait la prolifération et la survie des LyT périphériques. La quantité d'IL-7 disponible module donc le devenir des LyT présents dans les organes lymphoïdes lors d'un épisode lymphopénique.

Problème de santé mondial, le cancer tue chaque année des milliers de personnes en France, malgré de réels progrès dans les traitements médicaux. Parmi ceux-ci, l'immunothérapie qui vise à stimuler le système immunitaire afin qu'il reconnaisse et élimine les cellules tumorales, fait l'objet de nombreuses études, notamment depuis la découverte de lymphocytes T spécifiques d'antigènes tumoraux.<br />Bien que les premiers essais d'activation de lymphocytes T cytotoxiques réalisés in vitro et in vivo chez l'animal avec des peptides tumoraux ou des cellules tumorales aient été encourageants, les essais cliniques de vaccination qui ont succédé ont globalement échoué. Un nouvel axe de recherche est apparu avec l'amélioration des connaissances sur la biologie des cellules dendritiques myéloïdes (mDC), dont le rôle est primordial. En effet, les mDC sont capables d'initier les réponses immunes spécifiques car elles peuvent activer les lymphocytes T naïfs et restimuler les lymphocytes mémoires avec une grande efficacité. Les mDC sont, dès lors, devenues les candidates idéales pour l'immunothérapie anti-tumorale et les essais se sont multipliés. A nouveau, alors que les expériences réalisées in vitro et in vivo chez l'animal étaient très encourageantes, les essais cliniques ont été décevants ; l'injection de mDC chargées avec des antigènes tumoraux sous différentes formes n'induit que peu de réponses cliniques. Notre hypothèse est que l'efficacité de la vaccination anti-tumorale pourrait être améliorée par une optimisation du ciblage des antigènes tumoraux vers les DC in vivo. Dans ce travail, nous avons développé de nouvelles stratégies visant à vectoriser les antigènes tumoraux pour les délivrer efficacement, voire spécifiquement aux cellules dendritiques.<br />Dans un premier temps, nous avons ciblé le récepteur au mannose, exprimé par les mDC, grâce à un vecteur chimique (le RAFT) qui permet d'accrocher à la fois des résidus mannose et des antigènes tumoraux (melan-A). Nous avons montré que le RAFT(Man)16-melan-A était efficacement endocyté par les mDC et que le peptide tumoral était cross-presenté aux lymphocytes T spécifiques.<br />Dans un second temps, nous avons opté pour une stratégie permettant d'améliorer la stabilité de l'antigène tumoral et de le délivrer dans le cytosol des cellules en utilisant des virosomes. Les virosomes sont des particules dérivées du virus de l'Influenza, dont le matériel génétique a été retiré mais qui ont conservé les protéines membranaires du virus, et qui ont la particularité de pouvoir encapsuler des peptides ou des protéines. Grâce à la présence de l'hémagglutinine, ils peuvent être endocytés et ainsi délivrer leur contenu dans le cytoplasme de la cellule. Nous avons testé un virosome encapsulant le peptide tumoral melan-A et nous avons montré que les mDC étaient capables de présenter l'antigène tumoral aux lymphocytes T et de les activer efficacement. Parallèlement, nous avons réalisé la même étude sur une autre population de cellules dendritiques, les cellules dendritiques plasmocytoïdes (pDC). Ces cellules, encore largement méconnues, jouent un rôle unique dans l'immunité anti-virale grâce à la sécrétion d'IFN-. Dans ces expériences, réalisées avec une lignée de pDC développée dans notre laboratoire à partir des cellules d'un patient atteint d'une leucémie à pDC (lignée GEN2.2), nous avons montré que les pDC sont également capables de présenter un antigène encapsulé dans un virosome et d'activer efficacement les lymphocytes T spécifiques. <br />Nous avons, par ailleurs, approfondi notre étude sur les fonctions biologiques des pDC dans l'immunité antivirale, notamment leur capacité à cross-présenter des antigènes issus de l'endocytose de cellules traitées par un virus. Dans notre modèle, nous avons montré que des lymphocytes B incubés avec le virus de l'Influenza inactivé étaient phagocytés par les pDC, que les pDC étaient alors activées et que les antigènes viraux cross-présentés activaient des lymphocytes T spécifiques. Cette caractéristique confère un rôle potentiel dans l'initiation des réponses immunes au même titre que son homologue myéloïde, et un rôle intéressant dans l'immunité anti-tumorale.<br />Ainsi, à travers ce travail, nous avons développé des stratégies innovantes de vectorisation d'antigènes sur les cellules dendritiques en utilisant de nouveaux outils chimiques, viraux ou cellulaires. La validation in vitro de ces outils devra permettre, dorénavant, de mettre en place des expérimentations chez l'animal pour démontrer l'efficacité in vivo de ces stratégies.

La microsporidie Encephalitozoon intestinalis est la cause de diarrhées fréquemment associées à d'autres manifestations, chez les sujets immunodéprimés infectés par le VIH. La muqueuse intestinale constitue la première barrière physiologique et immunologique s'opposant à l'entrée du parasite dans l'organisme. Pourtant, la majorité des connaissances concernant l'immunobiologie des microsporidies résulte d'études effectuées chez la souris infectée par la voie intra-péritonéale. L'immunité protectrice vis-à-vis des microsporidies a largement été associée à la réponse immune cellulaire et à la production de cytokines de type Th1, et plus particulièrement d'IFN-g. Cependant, le ou les mécanismes par lequel l'IFN-g intervient dans le contrôle des microsporidioses reste encore mal caractérisé. Nous avons donc étudié et comparé la réponse immune cellulaire chez les souris sauvages et chez les souris déficientes pour le récepteur à l'IFN-g (GRKO), après infection orale avec E. intestinalis. Dans un premier temps, nous avons observé chez les souris sauvages infectées, capable de contrôler et d'éradiquer le parasite, 1) la mise en place d'une réponse immune cellulaire de type Th1 au niveau de la muqueuse intestinale, des ganglions mésentériques et de la rate ; 2) la production au niveau du duodenum de chimiokines connues pour attirer les lymphocytes T et les macrophages ; et 3) une augmentation du nombre de lymphocytes intraépithéliaux intestinaux, capables d'exercer une activité cytotoxique contre des macrophages infectés par le parasite. Chez les souris GRKO infectées, nous avons montré 1) une altération du profil d'expression des chimiokines au niveau de la muqueuse intestinale ; 2) un défaut d'expression des cytokines Th1 et une expression plus précoce et/ou plus importante des cytokines Th2 au niveau de tous les compartiments étudiés ; et 3) une réponse splénique T CD8+ cytotoxique moins efficace. L'ensemble de ces résultats nous permet de mieux cerner le rôle de l'IFN-g dans l'immunité anti-microsporidienne.

Les protéines solubles sont généralement faiblement immunogènes, ce qui constitue une limite pour le développement de vaccins sous unitaires à base de protéines. Mes travaux de thèse ont eu pour objectif de décrypter certains mécanismes moléculaires et cellulaires qui contribuent à l'immunogénicité et d'en tirer partie pour développer des approches originales permettant d'améliorer la capacité des protéines à déclencher la réponse immunitaire. Pour cela, j'ai principalement utilisé le transactivateur transcriptionnel (Tat) du VIH-1. J'ai montré que l'oligomérisation de Tat permet à un mécanisme de collaboration B-TH-2 d'induire la réponse immunitaire en absence d'adjuvant. J'ai identifié le déterminant minimal responsable de l'effet et montré qu'il confère la propriété adjuvante à d'autres antigènes. J'ai ensuite montré que la présentation aux cellules T restreinte aux CMH I et CMH II est accrue lorsque les protéines sont dotées de la capacité à lier des sucres sulfatés d'expression ubiquitaire: les héparanes sulfate. Ces travaux ont permis de définir de nouvelles approches pour améliorer l'immunogénicité de protéines susceptibles d'être intégrées dans des préparations vaccinales.

La mastocytose est une maladie hétérogène, caractérisée par une accumulation de mastocytes dans l'organisme. Les enfants et les adultes ont des mutations différentes de c-Kit. Dans un premier travail, nous avons montré que seules les formes adultes sont associées à la réactivation de la télomérase, alors que les formes pédiatriques ne sont pas. Cela semble être lié aux différences de mutations de c-Kit observées entre adultes et enfants et pourrait expliquer pourquoi seules les formes pédiatriques de mastocytose régressent spontanément et non les formes adultes. Ces résultats aident à mieux comprendre la physiopathologie de la mastocytose. Dans un second travail, nous a étudié le lien entre la longueur des télomères et les troubles psychologiques des adultes atteints de mastocytose. Nous avons montré que réactions émotionnelles négatives sont corrélées au raccourcissement de la longueur des télomères des leucocytes et que l'érosion télomérique est fortement prédite par les défauts de régulation des émotions. Nous émettons l'hypothèse qu'au cours des troubles neuropsychologiques, le mastocyte pourrait être impliqué dans le raccourcissement de la longueur des télomères en périphérie.

L'engagement des récepteurs de forte affinité pour les IgE (RFcγI), qui contiennent des motifs d'activation nommés ITAM, induit l'activation des mastocytes et des basophiles. Les récepteurs de faible affinité pour les IgG (RFcγIIB) contiennent des motifs d'inhibition nommés ITIM et inhibent l'activation cellulaire lorsqu'ils sont coagrégés aux récepteurs à ITAM. Les RFcγIIB inhibent également la prolifération cellulaire induite par les récepteurs à activité tyrosine kinase comme Kit. Les propriétés inhibitrices des RFcγIIB reposent sur le recrutement de l'inositol phosphatase SHIP1, qui dégrade le Phosphatidyl Inositol tri-phosphate PI(3,4,5)P3, une molécule impliquée dans de nombreuses voies de signalisation. Au cours de ma thèse, j'ai montré que lorsqu'ils sont coagrégés avec les RFcγI, les RFcγIIB, inhibent non seulement l'activation induite par ces RFcγI (cis-inhibition), mais aussi l'activation induite par d'autres RFcγI et la prolifération induite par Kit. Nous avons appelé cette nouvelle propriété, la trans-inhibition. De même, la coagrégation de Kit avec les RFcγIIB inhibe l'activation des mastocytes induite par les RFcγI. La trans-inhibition peut être également induite dans les basophiles murins et humains. Finalement, la coagrégation de Kit et des RFcyIIB inhibe la prolifération, dépendante de l'oncogène Abl, d'un mastocytome murin. En conclusion, la trans-inhibition est un nouveau mécanisme de régulation, dépendant de SHIP1, qui induit un état d'anergie de la cellule, l'empêchant de répondre à des signaux d'activation et de prolifération

L'existence d'une immunité anti-tumorale a longtemps été controversée. Aujourd'hui, de nombreuses études ont montré des réponses anti-tumorales spécifiques. Les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) jouent un rôle dans l'inhibition de la croissance des tumeurs et sont associés à un meilleur pronostic. Cependant, la présence d'une tumeur malgré le système immunitaire met en évidence des mécanismes d'échappement. J'ai tout d'abord participé à la caractérisation de la valeur pronostic de marqueurs lymphocytaires. La densité de l'infiltrat lymphocytaire T, en particulier les lymphocytes T mémoires, et leurs localisations au niveau du centre et du front de progression de la tumeur sont associées au devenir clinique des patients. Ces paramètres permettent une classification des patients à risque élevé de récidive bien plus significative que les paramètres anatomopathologiques. En étudiant plus précisément ces paramètres, nous avons montré l'altération progressive des réponses immunitaires anti-tumorales lors de l'envahissement des ganglions ou d'organes à distance. Je me suis donc intéressée aux marques de cytotoxicité en relation avec les différentes sous-populations T helper. Nous avons à nouveau trouvé des clusters fonctionnels mais seuls les réponses Th1, cytotoxique et Th17 sont associées au pronostic des patients. Les patients avec une forte réponse Th1 ou cytotoxique sont de bon pronostic tandis que ceux avec une forte réponse Th17 sont de mauvais pronostic. La combinaison de ces paramètres est plus discriminante pour déterminer les patients à risque de récidive. Les microARNs interviennent dans de nombreux processus biologiques physiologiques (dont le système immunitaire) et physiopathologiques (dont le cancer). J'ai étudié leurs profils d'expression dans des colons sains et tumoraux. Ces profils sont différents, avec des sur-expressions et sous-expressions de certains microARNs. J'ai également observé l'association de certains microARNs au devenir clinique de patients mais aussi à des marqueurs du système immunitaire. L'ensemble des travaux réalisés montre l'importance de la réaction immunitaire adaptative pour l'établissement du pronostic des patients atteints de cancers colorectaux. Son évaluation en routine permettrait de mieux orienter les patients vers une stratégie thérapeutique adaptée.

La voie de signalisation des récepteurs à domaine de mort (RDM) intervient dans l'hématopoïèse. En effet, l'invalidation de FADD, la molécule adaptatrice des RDM, dans le compartiment lymphocytaire murin résulte en une absence totale de lymphocytes B en périphérie. Nos travaux ont révélé que l'invalidation de la fonction FADD inhibe profondément la production de cellules hématopoïétiques humaines à la fois B et non-B. Ces données suggèrent une implication de FADD dans l'expansion des CSH et des progéniteurs hématopoïétiques humains. Outre les RDM, les récepteurs Toll (TLR), dévolus à la reconnaissance des pathogènes, sont également capables de recruter FADD. Ceci nous a conduit à nous intéresser au rôle des TLR dans l'hématopoïèse humaine. Nous avons montré que les CSH et les progéniteurs hématopoïétiques humains expriment des TLR fonctionnels (TLR1, 2, 3 et 6 notamment). Nos résultats démontrent que la stimulation des TLR sur les CSH et les progéniteurs hématopoïétiques humains est susceptible de remodeler le développement hématopoïétique en favorisant l'engagement myéloïde au détriment du développement lymphocytaire B. Ce processus pourrait contribuer au renforcement du bras de l'immunité innée au cours des infections microbiennes

L'immunité innée et l'immunité adaptative constituent les deux volets du système immunitaire. Contrairement à l'immunité adaptative qui utilise un vaste répertoire de récepteurs spécifiques obtenus par réarrangements géniques, l'immunité innée utilise un nombre réduit de récepteurs appelés " Pattern Recognition Receptors " ou PRR. Les PRR reconnaissent des motifs hautement conservés et exclusivement exprimés par les micro-organismes, et appelés " Pathogen-Associated Molecular Patterns " ou PAMP. Les PRR sont soit associés aux cellules (impliqués dans l'endocytose et/ou la signalisation), soit solubles (impliqués dans l'élimination des micro-organismes et du soi modifié). Les pentraxines courtes (SAP et CRP) et longues (PTX3) sont des PRR solubles impliqués dans la capture du non-soi et/ou du soi modifié et facilitent leur élimination par les phagocytes. La protéine Tat du VIH-1 est indispensable à la synthèse du génome viral. Sa forme soluble, sécrétée par les cellules infectées, régule de nombreuses fonctions cellulaires. Cependant, la nature des structures de fixation de Tat soluble aux cellules reste mal connue. Nous avons montré que Tat interagit sélectivement avec les pentraxines SAP, CRP et PTX3. Cependant, et de manière inattendue, nous avons observé que seule la protéine CRP augmente la transcription in vitro du VIH-1 induite par Tat en favorisant son accumulation nucléaire. Nous avons également observé une influence significative de Tat et des complexes Tat/pentraxines sur la différenciation de monocytes en cellules dendritiques (DC). L'ensemble de ces données met en évidence un nouveau mécanisme mis en jeu par le VIH pour exploiter le bras humoral de l'immunité innée et échapper au système immunitaire. Des données préliminaires suggèrent également un rôle potentiel de Tat dans l'acquisition d'un phénotype immunosuppresseur par les cellules dendritiques. En parallèle, dans le cadre d'un projet fédératif portant sur la régulation d'expression du FcγRIII (CD16), nous avons montré que les cytokines IL-1β, IL-6, IL-10 et IL-21 induisent non seulement l'augmentation d'expression de CD16 sur les monocytes/macrophages et son induction sur les DC, mais également son acquisition par la sous population monocytaire CD14+ CD16-. Ces données suggèrent donc un rôle de ces cytokines dans la modulation d'expression de CD16 par les cellules myéloïdes.