Les adénomes hépatocellulaires (AHC) sont des tumeurs bénignes rares dérivant de la prolifération d'hépatocytes et se développent dans un contexte hépatique par ailleurs normal, principalement chez des femmes suite à la prise de contraceptifs oraux. D'autres études ont identifié des facteurs de risque supplémentaires comme le syndrome métabolique et des mutations germinales d’HNF1α. Les travaux réalisés dans le laboratoire ont permis le classement des AHC en cinq sous-groupes : 1) les AHC-H avec des mutations inactivatrices du facteur de transcription HNF1α, 2) AHC-I avec une activation de la voie inflammatoire, 3) B-AHC portant des mutations activatrices du gène CTNNB1, codant pour la β-caténine 4) Sh-AHC avec une activation de la voie sonic hedgehog et 5) U-AHC sans altération moléculaire spécifique trouvée à ce jour. Les AHC montrent un faible risque de transformation maligne en carcinome hépatocellulaire (CHC). Le CHC est la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde entier, ce qui en fait un problème majeur de santé publique. Le CHC se développe dans 90% des cas sur un foie cirrhotique et est lié à une infection virale (VHB et HCV), à une consommation d'alcool et au syndrome métabolique. L'une des modifications génétiques les plus fréquentes dans les CHC est la réactivation de la télomérase (TERT), une enzyme clé nécessaire à la maintenance des télomères. Tout d'abord, dans nos travaux, nous avons cherché à établir une corrélation génotype-phénotype des AHC activés pour la β-caténine pour mieux comprendre l'hétérogénéité des tumeurs et le risque de transformation maligne. Notre étude a permis d'identifier trois sous-groupes d’AHC mutés CTNNB1 selon le type de mutation : mutations fortement, modérément et faiblement activatrices. De façon intéressante, chaque type de mutation présentait immuno marquage spécifique de la GS et un risque de transformation maligne diffèrent. En plus, nous avons identifié la mutation du promoteur de TERT comme un événement tardif au cours de la tumorigenèse nécessaire à la transformation des AHC-B en CHC. Deuxièmement, en raison de l’importance de la réactivation de TERT dans les tumeurs du foie, nous avons testé un nouveau traitement potentiel basé sur des oligonucléotides antisens conduisant à l’inhibition de l’expression transcriptionelle de TERT. En accord avec l'érosion progressive des séquences télomériques qui se produisent à chaque division cellulaire, nous avons pu observer un effet sur la prolifération cellulaire après traitement à long terme. Nous avons montré que les effets observés étaient liés au raccourcissement des télomères. De plus, nous avons identifié AAV2 comme un nouveau virus lié au développement de rares cas de CHC. Nos résultats sont soutenus par l'expansion clonale des cellules tumorales avec insertion virale, la surexpression des gènes insérés et l'insertion observée uniquement dans des gènes déjà connus pour être impliqués dans la tumorigenèse comme TERT, TNFSF10, MLL4, CCNA2 et CCNE1. En conclusion, dans nos études, nous avons affiné la classification des AHC, avec des possibles applications dans la prise en charge clinique des patients pour identifier le meilleur traitement selon le type de mutation et le risque de transformation maligne. De plus, nous avons obtenu des résultats prometteurs concernant l'utilisation de TERT comme cible thérapeutique. Cependant, des études supplémentaires sont nécessaires pour mieux évaluer les effets du traitement par ASO contre le TERT sur la physiologie cellulaire et les avantages possibles avec des combinaisons thérapeutiques. Enfin, nos résultats remettent en question la sécurité des thérapies génique basées sur l'AAV actuellement en cours, mais des études supplémentaires sont actuellement en cours au laboratoire pour comprendre les conséquences et les mécanismes impliqués dans de l'insertion virale. / Hepatocellular adenomas (HCA) are rare benign tumors deriving from proliferation of hepatocytes occurring in normal liver background mainly of female patients with history of oral contraceptive assumption. Further studies identified additional risk factors as metabolic syndromes and germline mutations. Works performed in the laboratory allowed the classification of HCA in five subgroups: 1) H-HCA with inactivating mutation of transcription factor HNF1α, 2) I-HCA with activation of the inflammatory pathway, 3) B-HCA carrying activating mutations of CTNNB1 gene, coding for β-catenin 4) Sh-HCA with activation of the sonic hedgehog pathway and 5) U-HCA with no specific alteration found to date. HCA show an average low risk of malignant transformation in hepatocellular carcinoma (HCC). HCC is the second cause of cancer-related deaths worldwide making it a major problem of public health. HCC development occurs in 90% of the cases on cirrhotic background and is linked to virus infection (HBV and HCV), alcohol intake and metabolic syndromes. One of the most frequent genetic alterations in HCC is the reactivation of TERT, a key enzyme necessary for telomeres maintenance. First, in our works we aimed to perform a correlation between genotype and phenotype of β-catenin activated HCA to better understand tumor heterogeneity and risk of malignant transformation. Our study allowed the identification of three subgroups of CTNNB1 mutated HCA according to the mutation type: highly, moderately and weakly activating mutations. Interestingly each type of mutation showed specific IHC staining for GS and risk of malignant transformation. Additionally we identified TERT promoter mutation as a late event in tumorigenesis necessary for HCA transformation in HCC with a significant correlation with CTNNB1 alterations. Second, due to the relevance of TERT reactivation in tumors, we tested a new potential treatment based on antisense oligonucleotides leading to TERT transcript ablation and lack of protein production. According to the slow erosion of the telomere sequences that occurs at each cell division, we were able to observe some effect on cell proliferation with long-term treatment. We showed that the observed effects were linked to telomere shortening. Further, we identified AAV2 as a new virus linked to tumor formation. Our results are supported by the clonal expansion of cells with viral insertion, overexpression of the inserted genes and insertion observed only in genes already known to be involved in tumorigenesis like TERT, TNFSF10, MLL4, CCNA2 and CCNE1. Taken together, in our studies we refined HCA classification, with possible direct applications in the clinical care of the patients in identifying the best treatment according to mutation type and risk of malignant transformation. Additionally we obtained promising results regarding using TERT as a therapeutic target. Still, additional studies are needed to better assess the effects of ASO treatment against TERT on cell physiology and possible advantages in using combination therapies. Finally, our findings challenge the safety of AAV based targeted therapies currently ongoing but additional studies to understand the effective consequences and mechanisms of viral insertion are object of current work in the laboratory.

Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont un ensemble de pathologies rétiniennes incurable provoquant la cécité. Les DRH sont caractérisées par le dysfonctionnement/dégénérescence des photorécepteurs et le remodelage de la structure de la rétine. Une des approches thérapeutiques envisagées pour traiter les DRH est la thérapie génique spécifique, c’est à dire le remplacement du gène défectueux par un gène sain. Cependant, bien qu’efficace, la thérapie génique spécifique n’est pas toujours applicable, en particulier quand la dégénérescence est trop avancée ou quand le gène muté n’est pas connu. Afin de traiter tous les cas de DRH quelle que soit leur origine génétique et leur stade de progression, une approche de thérapie génique d’addition est envisagée : Le transfert d’optogène. Cela consiste à convertir les cellules encore présentes dans la rétine malgré la dégénérescence, en cellule photosensible suite à l’expression d’un optogène (protéine photosensible). Mon projet de thèse a consisté dans un premier temps à évaluer le transfert de gène avec un vecteur AAV2/2 dans les cellules ganglionnaires rétiniennes de chien et de primate non-humain. Cette première partie a permis d’initier un second projet qui a eu pour objectif d’évaluer l’efficacité du transfert d’optogène (Channelrhodopsin-2) pour la restauration de la fonction visuelle dans un modèle canin de dystrophie rétinienne (le chien Rpe65- /-). / Inherited retinal dystrophies (IRD), a group of incurable retinal pathologies, are associated with visual impairments due to a malfunction and/or degeneration of photoreceptors and/or retinal pigment epithelium (RPE). Significant progress in the field of gene therapy has allowed the development and the characterization of an innovative tool to treat IRD patients: recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) that carry and deliver therapeutic nucleic acids. However, due to the heterogenic nature of IRD, gene supplementation will not allow to treat all forms of IRD because: (i) the numbers of mutated genes are unknown according to the state of art; (ii) the dominant forms of IRD in which mutations lead to negative effects are not eligible; (iii) the limit of AAV packaging excludes large-sized mutated genes and (iv) this approach is only applicable when photoreceptors are still alive. To treat all IRD patients, a novel therapeutic approach, independently of the mutated gene and the disease kinetic is suitable: the optogene transfer (light-sensitive protein) to restore photosensitivity in neurodegenerative retina by converting surviving retinal cells into photosensors. The primary goal of my research was to promote and characterize adeno-associated virus type 2-(AAV2) transduction in retinal ganglion cells of dog and non-human primate. A second aim was to investigate the feasibility of AAV2-mediated optogenes transfer in retinal ganglion cells as a therapeutic approach to restore visual function in RPE65 deficient dog, a canine model of IRDs.

Les adénomes hépatocellulaires (AHC) sont des tumeurs hépatiques bénignes rares se développant chez la femme jeune suite à la prise de contraceptifs oraux et pouvant se compliquer d’hémorragie et de transformation maligne en carcinome hépatocellulaire (CHC). Une classification génotype/phénotype a mise en évidence trois groupes d’AHC : les AHC inactivés pour le facteur de transcription HNF1A, les AHC mutés pour la β-caténine et les AHC dit « inflammatoires » ayant une activation de la voie JAK/STAT. Nous avons identifiés des mutations activatrices du gènes GNAS, codant pour la sous unité alpha de la protéine Gs, dans un sous-groupe d’AHC inflammatoires ainsi que chez des patients avec des AHC et atteints d’un syndrome de McCune Albright, une maladie rare combinant des tumeurs endocriniennes, une dysplasie fibreuse osseuse et des taches cutanés café au lait. Cette découverte confirme les interactions entre la voie de l’AMP cyclique induite par les mutations GNAS et la voie JAK/STAT. Les CHC sont les tumeurs primitives du foie les plus fréquentes, survenant souvent sur un foie cirrhotique exposé à différents facteurs de risque comme l’hépatite B chronique, l’hépatite C chronique, l’alcool ou le syndrome métabolique. Le CHC est le résultat de l’accumulation d’altérations génétiques et épigénétiques. Premièrement, nous avons identifiés les mutations du promoteur de TERT (Telomerase reverse transcriptase) comme les altérations génétiques somatiques les plus fréquentes des CHC. Ces mutations ont été aussi retrouvées dans des lésions prénéoplasiques développées sur cirrhose suggérant leurs rôles précoces dans l’initiation tumorale et la transformation maligne. A l’inverse l’étude des mutations du promoteur de TERT et la réalisation de séquençage haut-débit dans les AHC et les transformation d’adénome en CHC nous a permis de disséquer les mécanismes de transformation maligne sur foie sain avec la présence de manière précoce d’une mutation de la β-caténine et dans un second temps l’apparition d’une mutation dans le promoteur de TERT. Par la suite, nous avons mis en évidence une signature moléculaire pronostique transcriptomique chez les patients avec CHC traités par résection hépatique. Cette signature moléculaire prédisant à la fois la récidive tumorale et le décès a été validée dans des cohortes de patients à l’étranger. Enfin, nous avons mise en évidence le rôle oncogénique de l’adeno-associated virus de type 2 dans la survenue de CHC sur foie sain via un mécanisme de mutagénèse insertionnelle dans des gènes clés de la carcinogénèse comme TERT, CCNA2, MLL4 ou TNFSF10. Ces résultats ont permit de mettre en évidence de nouveaux facteurs de risque viraux de survenue du CHC, d’identifier de nouvelles altérations génétiques impliquées dans la transformation maligne sur cirrhose et sur foie sain et permit de développer une signature moléculaire pronostique qui pourrait être utiliser dans le futur comme une aide à la stratification thérapeutique chez les patients atteint de CHC. / Hepatocellular adenomas (HCA) are rare benign liver tumors occuring in young women taking oral contraception and complications as haemorrhage or malignant transformation in hepatocellular carcinomes (HCC) could occur. A genotype/phenotype classification has defined different subgroups of tumors : HCA with inactivating mutations of HNF1A, HCA with activating mutations of β-catenin and inflammatory HCA with activation of the JAK/STAT pathway. We have identified activation mutations of GNAS, that codes for the alpha subunit of the Gs protein in a subgroup of inflammatory HCA and in patients with HCA and McCune Albright syndrom, a rare disease that combined endocrine tumor, bone fibrous dysplasia and « cafe au lait » skin macula. These findings highlight the crosstalk between the cyclic AMP pathway induced by GNAS mutation with the JAK/STAT pathway. HCC are the most frequent primary liver tumors worldwide and mainly occur on cirrhosis due to various risk factor as hepatitis B and C virus, alcohol consumption and metabolic syndrome. HCC is due to the accumulation of genetic and epigenetic alterations in the malignant hepatocytes. We have identified TERT (telomerase reverse transcriptase) promoter mutations as the most frequent somatic genetic alterations in HCC. These mutations were also found in cirrhotic premalignant nodules underlying their role in tumor initiation and malignant transformation. In contrast, the study of the different steps of malignant transformation of HCA into HCC using next generation sequencing and TERT promoter screening have shown that activatiing mutation of β-catenin is an early genetic alteration whereas TERT promoter mutation is required in a second step to promote a full malignant transformation. We have also identified a prognostic molecular signature, the 5-gene score, in patients with HCC treated by liver resection. The 5-gene score predicts tumor recurrence and disease specific survival and has been validated in different cohorts of patients worldwide. Finally, we have shown that adeno-associated virus type 2 is involved in liver carcinogenesis on normal liver through insertional mutagenesis in key cancer genes as TERT, CCNA2, MLL4 and TNFSF10. These results have underlined a new oncogenic virus involved in HCC development, identified new genetic alterations involved in malignant transformation on cirrhosis and normal liver and a new prognostic molecular signature that will help to guide treatment of patients with HCC in the future.

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