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Thermophilic Campylobacter species such as Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are recognised worldwide as major causes of acute gastroenteritis in humans. Campylobacteriosis is frequently a mild to moderate self-limited illness and most cases do not require antimicrobial therapy; antimicrobial therapy is necessary for patients with systemic Campylobacter infections, for patients with severe disease, or for immunosuppressed patients. Antimicrobial susceptibility testing of Campylobacter species using disk diffusion currently is not standardised by the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), however, in order to monitor the prevalence of antimicrobial resistance in Campylobacter species, there is a need for standardised or calibrated methods of susceptibility testing. Initially, 90 human clinical isolates of thermophilic Campylobacter species from Southeast Queensland, Australia, were screened for resistance to ampicillin, erythromycin and tetracycline using the disk diffusion susceptibility testing method. Levels of resistance were then determined using E test MIC and agar dilution methods to determine the reliability of disk diffusion results. Results of the disk diffusion testing showed 87 (97%) isolates resistant to ampicillin, 14 (16%) isolates were resistant to tetracycline and three (3.4%) isolates were resistant to erythromycin. Results of disk diffusion testing showed 100% correlation (+1 log2 dilution) with agar dilution for erythromycin and tetracycline, and 77% for ampicillin. E test showed 68% correlation with agar dilution for ampicillin, 100% for erythromycin and 64% for tetracycline. These data suggest that disk diffusion susceptibility testing may be used to screen thermophilic Campylobacter spp. for putative resistance to erythromycin and tetracycline and that the incidence of resistance of Campylobacter spp. to erythromycin and tetracycline is low in Southeast Queensland, Australia. Agar dilution remains the most accurate method for determination of ampicillin susceptibility. Numerical analyses of restriction endonuclease (RE) fragment profiles were performed to elucidate relatedness of the antibiotic resistant isolates and the results suggested a high level of isolate variation. The role of the B-lactamase in the resistance of C. jejuni to various B-lactams has been well documented and B-lactamase production in C. jejuni has been reported in 83-93% of strains. The expression and characterisation of the Campylobacter B-lactamase, however, has not been described. In this work, standard cloning techniques utilising a high-copy number E. coli cloning vector and a previously described E. coli-Campylobacter shuttle cloning vector were unsuccessful in isolation and expression of the C. jejuni B-lactamase gene in E. coli, possibly due to a lack of expression of the campylobacter gene in its host or low efficiency of transformation. Therefore, in order to facilitate the isolation, expression and characterisation of the C. jejuni B-lactamase gene, it was necessary to construct a new E.coli-Campylobacter shuttle cloning vector for the purposes of expressing the C. jejuni B-lactamase in Campylobacter. To aid in the construction of the vector, the sequence and genetic organisation of a 4.0-kb cryptic plasmid, termed pCJ419, identified in a human clinical isolate of C. jejuni was determined. Plasmid pCJ419 is a circular molecule of 4013 bp and contains four open reading frames (ORFs), the products of which share significant sequence similarity with putative proteins from known C. jejuni and C. coli plasmids. ORF-1 encodes a putative mobilisation protein (Mob); ORF-2 and ORF-3 encode proteins which have high identity to putative RepA and RepB proteins, respectively, of known C. jejuni and C. coli plasmids. ORF-4 encodes a protein which has high identity to a hypothetical protein of unknown function, Cjp32, previously described in a pVir plasmid of C. jejuni. Tandem repeating sequences typical of a plasmid replication origin (ori) were identified upstream of the DNA sequences encoding putative replication initiation proteins RepA and RepB. An E. coli-Campylobacter shuttle cloning vector, pGU0202, was constructed using plasmid pMW2 which harbours a Campylobacter-derived kanamycin-resistance gene, aphA(3’)-III. The sequences encoding pCJ419 mob, repA and repB were inserted upstream of aphA(3’)-III resulting in a stable construct of 6174 bp that was used successfully to transform both E. coli and Campylobacter. Subsequently, a novel molecular class D ?-lactamase gene, blaOXA-61, from a B-lactamase-positive, ampicillin-resistant (MIC 64 mg l-1), clinical strain of Campylobacter jejuni, strain GC015 was isolated, cloned and characterized using the newly constructed shuttle vector pGU0202. An open reading frame of 774 bp was identified on a ClaI genomic fragment of 2.2 kb and encodes a protein of 257 amino acids. Conserved motifs composed of identical amino acids typical of penicillin-recognising proteins and specific class D motifs were identified. blaOXA-61 was cloned into the shuttle cloning vector pGU0202 and expressed in B-lactamase-negative, ampicillin-susceptible C. jejuni and E. coli. A conserved 122-bp sequence directly upstream of blaOXA-61 was identified and shown to be required in cis for high-level resistance of Campylobacter to the penicillins although blaOXA-61 expressed only at low levels in E.coli. Southern hybridisation analysis demonstrated that the bla gene was chromosomally encoded and present on the same BglII and ClaI-digested genomic DNA fragments from various strains of Campylobacter with ampicillin MICs of between 4 and 64 mg l-1. In addition, DNA fragments encoding two putative zinc-dependent hydrolases from the metallo-B-lactamase superfamily, designated GLX2-1 and GLX2-2, were identified in a clinical isolate of Campylobacter jejuni, strain 012, cloned and sequenced. A strictly conserved motif, -H-X-H-X-D-, characteristic of the metallo- B-lactamase superfamily of proteins, including the class B metallo- B-lactamases, was identified in both proteins although functional B-lactamase could not be expressed in either E. coli or C. coli transformed using the C. jejuni hydrolase-containing shuttle vector pGU0202. Further work is warranted to determine the exact function of these proteins.

Les intéines sont des éléments protéiques qui sont excisés d'une séquence polypeptidique par un processus autocatalytique appelé épissage. Les intéines monomériques ou dimériques effectuent respectivement des réactions d'épissage intra- et intermoléculaires. L'objectif du travail est de mettre au point une technique pour la création de banques de mutants de grandes tailles en combinant deux banques de fragments protéiques. La protéine monomérique est restaurée par épissage d'une intéine dimérique. Comme les déterminants qui permettent l'épissage des intéines ne sont pas encore bien connus, il a été décidé d'étudier l'épissage d'une intéine introduite dans la bêta-lactamase. Des collections de mutants ont été construites et caractérisées par sélection in vivo. Parmi les clones sélectionnés tolérant l'insertion de l'intéine, mais incapables d'épisser, un grand nombre présentent, à la jonction N-terminale, deux cystéines de part et d'autre de la liaison peptidique à cliver. L'hypothèse est que la liaison entre les deux cystéines se trouve dans une conformation non coplanaire permettant ainsi la formation d'un pont disulfure entre ces deux résidus. Cette conformation est probablement imposée par l'intéine de manière à déstabiliser la liaison peptidique et à favoriser ainsi son clivage dans le mécanisme d'épissage. D'autre part, les mutants capables d'épisser possèdent tous une glycine du côté N-terminal de l'intéine et une sérine du côté C-terminal de l'intéine. Ces deux acides aminés sont donc les seuls requis pour permettre un épissage efficace. Afin de déterminer si l'épissage intermoléculaire est possible, une des enzymes sélectionnées a été fragmentée au niveau de l'intéine. Bien qu'aucun produit d'épissage n'ait été détecté par Western Blot, une faible activité bêta-lactamase in vivo permet de supposer que l'épissage a eu lieu.

Metallo-beta-lactamases (MBLs) are members of the metallohydrolases family and constitute a very effective resistance mechanism employed by bacteria to escape the action of most beta-lactam antibiotics. Emergence of acquired MBLs among pathogenic species represents a major clinical threat, especially since no efficient inhibitors are available. On the basis of their primary structures, these enzymes have been subdivided in three subclasses (B1, B2 and B3). The enzyme studied in this work, termed BcII, is produced by Bacillus cereus, strain 569/H/9, and is the most studied MBL so far (class B1 ; 227 a.a. ; M.W. 24960 Da). It displays a binuclear active site centre, which can bind various metal ions (e.g. Co2+ and Cd2+), although Zn2+ is the natural cofactor used for beta-lactams hydrolysis. The first part of this work was dedicated to the characterization of the equilibrium folding properties of both the apo and holo forms of BcII. We used a variety of biophysical techniques, including absorbance, circular dichroism and intrinsic fluorescence spectroscopy, nuclear magnetic resonance (NMR), and mass spectrometry (MS). Interestingly, optical measurements revealed that although the apo and dizinc species exhibit undistinguishable tertiary structural organizations, the metal-depleted enzyme shows a significant decrease in its α-helical content, presumably associated with enhanced flexibility. The holoenzyme was found to be much more stable than the zinc-depleted form. Whereas the latter unfold according to a simple two-state mechanism, unfolding of the holoenzyme was found to be non-cooperative, with the population of intermediate species showing 3D structures very similar to the native species. Besides folding studies, we investigated the process of metal binding to BcII. Zinc binding was monitored using complementary techniques, including circular dichroism in the far UV, enzymatic activity measurements, competition with a chromophoric chelator, MS and NMR. Most noticeably, MS and NMR experiments, together with catalytic activity measurements demonstrated that two zinc ions bind cooperatively to the enzyme active site (with K1/K2 ≥ 5, indicating positive cooperativity) and hence that catalysis is associated with the dizinc enzyme species only. Furthermore, competitive experiments with the chromophoric chelator Mag-Fura-2 indicated K2 < 80 nM.

The DNA sequence of the gene coding for the OXA-2 beta-lactamase has been completed. The primary amino acid sequence deduced from the DNA sequence was used to study homologies with other beta-lactamases; no good homologies were observed with any class of beta-lactamase. A more detailed analysis has revealed from comparison of both primary and predicted secondary structure, that the OXA-2 beta-lactamase may be more closely related to class A enzymes. Confirmation that the OXA-2 beta-lactamase is a serine enzyme has come from the DNA sequence and the interaction with mechanism based inactivators. Clavulanic acid and a novel beta-lactamase inhibitor, BRL36148, both interact specifically with the OXA-2 beta-lactamase by branched pathway mechanisms. Analysis of inactivated enzymes by peptide mapping and isoelcetric focusing have revealed that more than one inactive enzyme species is formed with each inactivator. A specific DNA probe was designed to come entirely from within the coding sequence of the OXA-2 beta-lactamase gene. This probe was found to interact only with plasmids specifying the OXA-2 or OXA-3 type enzymes. These results confirm earlier observations that OXA-2 and OXA-3 beta-lactamases are related. Another probe which comprised the whole of the OXA-2 beta-lactamase gene as well as segments of DNA on either side of the gene, was found to hybridise with a number of resistance plasmids. This interaction suggests that multi resistance plasmids carry common segments of DNA. Characterisation of the physical properties of the OXA-2 enzyme by analytical ultracentrifugation have not only confirmed the dimeric nature of this beta-lactamase but have also shown that this enzyme forms aggregates at high protein concentrations. Probing of the enzyme structure with trypsin, strongly points to the OXA-2 beta-lactamase having a domain structure.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo86_1.pdf: 1510824 bytes, checksum: 62b4555e47d568b472501070ff9eaf79 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / A resistência aos carbapenêmicos pode dar-se através de vários mecanismos, incluindo a expressão de beta-lactamases do tipo carbapenemases. Metalo-beta-lactamases (MBLs) constituem o grupo mais clinicamente importante das carbapenemases, na medida em que elas hidrolisam praticamente todos os beta-lactâmicos e, em alguns casos, também os monobactams (devido a outros mecanismos associados), o que implica em uma vasta redução das opções terapêuticas atualmente disponíveis. O objetivo deste trabalho foi detectar a produção de MBLs em cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes tanto a imipenem quanto a ceftazidima, verificar o perfil de susceptibilidade dos isolados aos mais utilizados grupos de antibióticos comercialmente disponíveis, investigar a ocorrência dos genes blaSPM-1 e blaIMP e realizar a tipagem molecular dos isolados MBL positivos. Foram analisadas 61 amostras do biênio 2002/2003 e 12 amostras do biênio 2008/2009, identificadas em um hospital de ensino. A susceptibilidade aos antimicrobianos foi feita de acordos com os critérios estabelecidos pelo CLSI. A identificação dos isolados MBL positivos seguiu o método de disco-difusão proposto por Arakawa. A detecção dos genes blaSPM-1 e blaIMP foi feita por análise de PCR usando iniciadores específicos. A análise dos fragmentos das macrorestrições do DNA genômico foi feita por PFGE. Os resultados mostraram que 86,3% (63/73) dos isolados resistentes a imipenem e ceftazidima foram confirmados como MBL positivos pelo teste fenotípico. O gene blaSPM-1 foi encontrado em 61 destes isolados. Nenhuma das amostras testadas possuía o gene blaIMP. Quanto aos ensaios de susceptibilidade, foi observado que dos anos 2002 e 2003: 100% dos isolados eram resistentes a ciprofloxacina, gentamicina e amicacina; 44% eram resistentes a piperacilina/tazobactam e 56% mostraram sensibilidade a esta droga. Dos anos 2008 e 2009: 100% dos isolados eram resistentes a ciprofloxacina e gentamicina; 91,6% eram resistentes a amicacina; 8,4% mostraram resistência intermediária a este aminoglicosídeo; 83,3% eram resistentes a piperacilina/tazobactam e 16,7% mostraram sensibilidade a este antimicrobiano. Quando as duas principais drogas para tratamento de infecções causadas por cepas MBL positivas foram analisadas, dos isolados de 2002/2003, apenas 1,63% foram resistentes ao aztreonam; 62,2% tiveram resistência intermediária e 36% mostraram sensibilidade. Dos isolados de 2008/2009, 83,4% foram resistentes e 16,6% apresentaram resistência intermediária, com nenhum isolado mostrando sensibilidade. Quanto à polimixina B, todos os isolados deste trabalho eram sensíveis. A análise dos fragmentos das macrorestrições dos isolados mostrou um único tipo de PFGE (A), com sete subtipos (A1 a A7). Estes achados sugerem que a produção de MBLs mediada por um clone único epidêmico continua sendo um importante mecanismo de resistência aos carbapenems no hospital estudado, como confirmado pela detecção do gene SPM. Além disso, o perfil de pan-resistência encontrado também alerta para a possível presença de múltiplos mecanismos de resistência nos isolados bacterianos, o que sinaliza uma necessidade urgente por estratégias de vigilância e melhoria das práticas de controle de infecções

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Cette étude a eu pour but d'élucider le rôle physiologique de l'enzyme ß-lactamase. Nous avons postulé que la ß-lactamase n'est pas exclusivement de nature bactérienne, qu'elle est reliée à une fonction physiologique importante et que cette fonction peut se retrouver chez les mammifères. Nous avons d'abord entrepris de vérifier le concept d'universalité des ß-lactamases. Des méthodes sensibles de détection ont été appliquées afin de mesurer la capacité de souches bactériennes, dites ß-lactamases-négatives, de synthétiser cette enzyme. La présence de ß-lactamase a semblé être une caractéristique commune aux bactéries grain-négatives. Une souche de Mycoplasma pneumoniae n'a montré aucune activité de ce type. Chez les micro-organismes à Gram positif, les actinomycètes Bifidobacterium et Propionibacterium ont montré une faible activité ß-lactamase. Deux Peptococcus anaerobius et un Peptostreptococcus productus n'ont pas révélé d'activité ß-lactamase décelable. Ces deux espèces sont des bactéries anaérobies strictes. Cette observation suggère que la ß-lactamase peut jouer un rôle dans le métabolisme aérobie des cellules productrices. Nous avons ensuite réalisé des expériences métaboliques avec des souches d'entérobactéries afin de vérifier si la synthèse de ß-lactamase est accrue en aérobiose. Nous avons mesuré l'effet de l'oxygène sur la synthèse de ß-lactamases inductibles et constitutives, en présence ou non de cyanure de potassium. De plus, l'influence de la pénicilline, de la source d'énergie et de la composition du milieu de culture sur le taux de synthèse de ß-lactamase fut évaluée en présence et en absence d'oxygène. L'aérobiose ainsi que le milieu minimal ont augmenté les niveaux des ß-lactamases d'Enterobacter et de Citrobacter. Le cyanure de potassium a freiné l'effet inducteur de 1'oxygène en aérobiose. Ce résultat semble suggérer que la synthèse de g-lactamase dépend davantage du fonctionnement normal de la chaîne des transporteurs d'électrons que de l'influence directe de l'oxygène à d'autres niveaux métaboliques. Nous avons justifié la nécessité de réaliser ce type d'expériences avec des souches microbiennes génétiquement définies. A la suite de ces observations, nous avons dirigé nos efforts vers la mise en évidence et la caractérisation d'une activité g-lactamase dans des cellules de mammifères. Les méthodes d'études ont été basées sur 1 'interaction des protéines de rat avec une gamme d'antibiotiques appartenant aux principaux groupes de ß-lactamines. Les résultats ont indiqué que le surnageant 100,000 g d'un homogénat de foie de rat peut dégrader les ß-lactamines. L'activité a été jugée complexe. L'inactivation de deux céphalosporines chromogéniques, le PADAC (pyridinium-2-azo-p-diméthy 1-ani 1ine chromophore) et la nitro- céfine, a semblé reposer sur deux mécanismes différents. Les caractéristiques spectrophotométriques de ces deux substrats et de leurs produits de dégradation ont rappelé une activité de type g-lactamase. Nous avons déterminé l'absence de relation avec d'autres protéines capables de réagir sur les g-lactamines comme la peptidase rénale, l'albumine et l'acylase. La présence d'une ß-lactamase dans les cellules de foie de rat pourrait contribuer à élucider son rôle physiologique essentiel. Dans cette perspective, nous avons entrepris de purifier l'activité ß-lactamase des cellules de foie de rat. Les tentatives entreprises afin d'isoler la protéine responsable de l'hydrolyse du PADAC ont échoué. Chaque étape de purification a été caractérisée par une faible récupération de l'activité enzymatique et, par conséquent, une perte d'activité spécifique. Nous avons d'abord attribué ce résultat à une grande instabilité de l'enzyme. La recherche des conditions optimales pour stabiliser cette protéine a permis de déterminer qu'elle nécessite la présence d'un cofacteur, le NADPH. Elle possède un poids moléculaire voisin de 25,000 et un point isoélectrique d'environ 7.7. Elle a réagi aussi avec quelques pénames et céphèmes. La protéine qui a dégradé la nitrocéfine possède un poids moléculaire inférieur à celle qui a hydro lysé le PADAC et un point isoélectrique près de 5.4. Elle a réagi avec un pénème et un monobactame. Ces propriétés n'écartent pas la possibilité qu'il s'agit de g-lactamases. Cependant, l'appartenance définitive de ces protéines à la famille des ß-lactamases devra attendre leur purification complète. / Montréal Trigonix inc. 2018

La résistance bactérienne aux antibiotiques est une menace en constante expansion. Les bactéries ne cessent de développer de nouvelles résistances à un rythme parfois plus rapide que notre capacité à développer de nouveaux médicaments pour les combattre. Il est donc important si l'on veut garder la cadence dans ce marathon contre les bactéries de continuer la recherche de nouvelles méthodes pour contrer la résistance aux antibiotiques. La présente étude se divise en deux projets portant chacun sur une approche distincte dans le but de développer de nouveaux antibiotiques. La première partie porte sur l'étude des peptides antimicrobiens comme nouvelle classe d'antibiotiques. Leur mode d'action distinct des antibiotiques sur le marché est prometteur pour un développement de résistance amoindrie. Par contre, leur complexité entraîne une conception de médicament plus ardue. Afin d'aider la compréhension des facteurs influençant l'interaction des peptides avec leur principale cible, les membranes cellulaires, un peptide modèle synthétique simple et neutre ainsi que des analogues chargés positivement furent développés dans notre groupe. Ces peptides, notamment surnommés 14-mère, R4R11 et R5R10, ont d'abord été étudiés par des multiples méthodes spectroscopiques, biophysiques et bio-informatique. Ces études démontrent qu'il est possible de moduler la structure secondaire des peptides par la position des acides aminés cationiques dans la séquence. De plus, la conformation des peptides influence leurs interactions avec les membranes modèles et les cellules où ceux en feuillets β sont plus sélectifs envers les modèles et cellules procaryotes alors que ceux sous forme d'hélice α interagissent indistinctement avec les deux types membranes modèles ou cellules. Il a aussi été observé une différence d'orientation entre les peptides hélicoïdaux neutres et cationiques en présence de différentes membranes lipidiques. Les peptides étudiés ont une plus grande affinité envers les bicouches plus minces et les peptides cationiques ont une plus grande interaction avec les membranes anioniques. Ensuite, le projet s'est poursuivi par l'étude de l'effet de l'ajout d'un groupement ayant une propension à se lier aux membranes procaryotes. Pour ce faire, un ligand bis-dipicolylamine (bis-DPA) a été ajouté à l'extrémité N-terminale des peptides 14-mère, R4R11 et R5R10 afin de former un complexe de Zn(II) in situ avec le ligand bis-DPA (Zn₂•bisDPA). En général, la présence du complexe augmente la sélectivité des peptides par l'entremise d'une interaction plus grande envers les cellules procaryotes et membranes modèles anioniques. La seconde partie vise plutôt la recherche de nouveaux inhibiteurs de β-lactamases visant sur une approche de combinaison de médicaments afin de diminuer la résistance aux antibiotiques β-lactames. Malgré leurs similitudes avec les composés β-lactames et leurs propriétés d'inhibiteurs de protéases, les molécules de la famille des sulfahydantoïnes n'ont pas été investiguées comme inhibiteurs de β-lactamases. Divers analogues ayant comme cœur l'hétérocycle sulfahydantoïne ont été synthétisés à partir d'acides aminés et ont été évalués pour leur pouvoir inhibiteur sur les β-lactamases courantes TEM-1 et TEM-15. De ces analogues, certain ont démontré une inhibition notable des deux β-lactamases avec des valeurs de IC₅₀ entre 130 et 510 μM et des valeurs inférées de Kᵢ entre 32 et 55 μM. Ces résultats indiquent que ce type de composés ont un potentiel intéressant comme futur inhibiteur de β-lactamases. / Antibiotic resistance is one of the top worldwide healthcare problems. Bacteria are continuously finding new ways to survive the treatment we develop. To stay ahead in this race, we must accelerate the development of new drugs that counteract bacterial resistance. The present study is divided in two projects each using a separate approach aiming to find new antimicrobial molecules. The first part of this thesis focusses on the study of antimicrobial peptides as a potential new class of antibiotics. Their mode of action is different than commercially available antibiotics and is less prone to induce resistance development. However, the design of new peptides for clinical uses is challenging because of the complexity of these compounds. To have a better understanding of the molecular determinants affecting their interaction with cellular membranes, we have developed a simple synthetic model peptide with a neutral global charge named 14-mer. Multiple analogs were synthesized bearing cationic amino acids at different positions in the sequence. Notably, analogs R4R11 and R5R10, bearing arginine residues at positions 4 and 11, and 5 and 10 respectively, were studied alongside the 14-mer model by various spectroscopic, biophysical and bioinformatics methods. These experiments show that the secondary structure and supramolecular self-assembly can be modulated by the position of the cationic residue in the peptide sequence. The peptide secondary structure affects their interactions with model membranes and living cells. The β-strand peptides tend to interact more selectively toward prokaryotic model membranes and cell whereas α-helical peptides interact indistinctly with both prokaryotic and eukaryotic model membranes and cells. In addition, a difference in peptide orientation has been observed between uncharged and cationic α-helical peptides when they interact with phospholipid membranes. These peptides have generally a higher affinity with thinner bilayers, and cationic peptides possess better interaction with cationic membranes. The investigation was continued by studying the effect of the incorporation of a molecular tag that is known to have a high affinity toward prokaryotic membranes. This was achieved by adding a bis-dipicolylamine (bis-DPA) ligand at the N-terminus of peptides 14-mer, R4R11 and R5R10 to form a Zn(II) complex in situ. The Zn(II) complex tends to increase the selectivity of the studied peptides toward prokaryotic model membranes and cells. The second part of this thesis instead focusses on finding new β-lactamase inhibitors in order to reduce the antibiotic resistance of one of the most versatile antibiotic families, the β-lactams. As potential candidates, the sulfahydantoin family has never been investigated for this application even if they possess similar structure to β-lactam antibiotics and has been shown to inhibit similar enzymes like proteases. To evaluate their potential, we synthesized multiple analogs containing the sulfahydantoin heterocycle starting from amino acids. These analogs were tested as inhibitors of two of the most prevalent β-lactamases, TEM-1 and TEM-15. Out of these compounds, two analogs have shown substantial inhibition with IC₅₀ values between 130 and 510 μM and inferred Kᵢ values between 32 and 55 μM. These results suggest that sulfahydantoin compounds have a good potential for the development of new and improved β-lactamase inhibitors.