Το γένος Pseudomonas ανήκει στην οικογένεια Pseudomonadaceae και περιλαμβάνει πολλά είδη. Το συχνότερο είδος ψευδομονάδας που προκαλεί νόσο στον άνθρωπο είναι η Pseudomonas aeruginosa. Η P.aeruginosa είναι ένα Gram αρνητικό, αυστηρά αερόβιο βακτηρίδιο, το οποίο αναπτύσσεται στους 37-42οC και καλλιεργείται σχετικά εύκολα σε κοινά θρεπτικά υλικά. Η P. aeruginosa έχει χαρακτηριστεί ως ένα από τα σημαντικότερα και σοβαρότερα ευκαιριακά παθογόνα βακτηρία, τα οποία είναι υπεύθυνα για νοσοκομειακές λοιμώξεις σε διάφορες ειδικές ομάδες ασθενών όπως ανοσοκατασταλμένα άτομα, άτομα με κυστική ίνωση (cystic fibrosis), ασθενείς με νεοπλασίες, κ.α. Οι λοιμώξεις που προκαλεί η P. aeruginosa χαρακτηρίζονται σοβαρές και επικίνδυνες αφενός μεν γιατί προκαλεί νόσο σε άτομα ήδη επιβεβαρυμένα από άλλες καταστάσεις, αφετέρου δε γιατί εμφανίζει ανθεκτικότητα στα περισσότερα αντιβιοτικά. Ο τρόπος με τον οποίο η P. aeruginosa ασκεί την παθογόνο δράση της είναι πολύπλοκος και δεν έχει διευκρινισθεί επακριβώς. Διάφοροι κυτταρικοί παράγοντες αλλά και εξωκυττάρια προϊόντα θεωρούνται υπεύθυνα για την έκφραση της παθογόνου δράσης του μικροοργανισμού. Οι πιο σημαντικοί κυτταρικοί παράγοντες είναι: ο λιποπολυσακχαρίτης, οι φίμπριες, οι πρωτεΐνες της εξωκυττάριας μεμβράνης, ο εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης (Slime), καθώς επίσης και ο βλεννώδης πολυσακχαρίτης (αλγινικό οξύ) που σχετίζεται με τα βλεννώδη στελέχη. Επίσης διάφορα εξωκυττάρια προϊόντα-παράγοντες τα οποία θεωρούνται υπεύθυνα για τη λοιμογόνο δράση του βακτηρίου, είναι διάφορα ένζυμα και κυρίως το Εξωένζυμο-S και η Εξωτοξίνη-A. Στους μηχανισμούς άμυνας του ξενιστή έναντι της P. aeruginosa τα μακροφάγα που προσελκύονται στην εστία της λοίμωξης παίζουν το σπουδαιότερο ρόλο. Οι κυτταροκίνες που παράγονται από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα καθορίζουν την έκταση της βλάβης και την έκβαση της λοίμωξης. Σε πειραματικά μοντέλα σήψης από P. aeruginosa η παραγωγή του παράγοντα νεκρώσεως όγκου (TNF-α) σε μικρά ποσά έχει συσχετισθεί με προστασία σε σοβαρές λοιμώξεις, ενώ η υπερπαραγωγή του οδηγεί σε σηπτικό σοκ. Η ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α αντικατοπτρίζει τη ρύθμιση της ενεργοποίησης του μακροφάγου. Διαφορετικοί υποδοχείς επιφανείας όπως οι TLR’s, συμβάλουν στην αναγνώριση του μικροβίου και την επακόλουθη ενεργοποίηση του μακροφάγου. Τα ενδοκυττάρια γεγονότα που σχετίζονται με τη μετάδοση του σήματος ενεργοποίησης στα μακροφάγα δεν είναι απόλυτα αποσαφηνισμένα. Πρώιμα συμβάντα ενεργοποίησης των μακροφαγων που ρυθμίζουν την παραγωγή του TNF-α, είναι η ενεργοποίηση των MAP κινασών. Η οικογένεια των MAPK’s περιλαμβάνει 3 κινάσες: την p38, την Erk1,2 και την JNK, που έχουν ταυτοποιηθεί ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι σε πειραματικά μοντέλα σήψης. Η διαδοχική φωσφορυλίωση υποστρωμάτων ενεργοποιεί διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες, χαρακτηριστικότεροι των οποίων είναι ο NF-κΒ και ο AP-1, ο οποίοι συμμετέχουν στη μεταγραφή των γονιδίων των κυτταροκινών που εκφράζονται στη διάρκεια της σηπτικής καταπληξίας. Σημαντικότερη από αυτές είναι ο TNF-α. Η ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α είναι αντιπροσωπευτικός στόχος μελέτης των μηχανισμών που διέπουν την ενεργοποίηση των μακροφάγων. Αυτή η ρύθμιση γίνεται τόσο στο επίπεδο μεταγραφής του γονιδίου όσο και στο μετά-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο. Συνεργασία μεταξύ των πρωτεϊνών μεταγραφής και αυτών που δεσμεύονται στη 3-UTR περιοχή του mRNA του TNF-α συμβάλουν στην εκλεκτική ρύθμιση της παραγωγής του από τα μακροφάγα. Οι μηχανισμοί που ενέχονται στην ενεργοποίηση των μακροφάγων από την P. aeruginosa δεν έχουν πλήρως μελετηθεί. Ταυτοποίηση των συγκεκριμένων μορίων-στόχων στη μετάδοση του σήματος ενεργοποίησης στα μακροφάγα συμβάλει στην κατανόηση των μηχανισμών ελέγχου της σηπτικής καταπληξίας. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η αποσαφήνιση της δράσης της P. aeruginosa στα διάφορα στάδια ενεργοποίησης των μακροφάγων όπως: α) το επίπεδο της φωσφορυλίωσης-ενεργοποίησης διαφόρων πρωτεϊνικών κινασών (π.χ. MAPK’s), β) την ενεργοποίηση-δράση μεταγραφικών παραγόντων με αντιπροσωπευτικότερους τον NF-κΒ και AP-1, και τέλος, γ) την διερεύνηση των υποδοχέων επιφανείας όπως οι Toll-like υποδοχείς στη μετάδοση του σήματος ενεργοποίησης, αλλά και σύνδεση αυτών με την ενεργοποίηση των MAPK’s. Σε επίπεδο παραγωγής TNF-α πρωτεΐνης και ενεργοποίησης μεταγραφικών παραγόντων, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι: α) Το Slime-GLP είναι ισχυρότερος διεγέρτης από τον LPS P. aeruginosa για την παραγωγή TNF-α σε υπερκείμενα μονοκυτταρικών καλλιεργειών. β) Αυτή η διαφορετική ρύθμιση της παραγωγής πρωτεϊνικού TNF-α, αντικατοπτρίζεται και σε επίπεδο ενεργοποίησης μεταγραφικών παραγόντων. Συγκεκριμένα, το Slime-GLP μπορεί και επάγει περισσότερο την ενεργοποίηση του NF-κΒ από ότι ο LPS της P. aeruginosa και αυτή η ενεργοποίηση είναι σχεδόν ίση με αυτή που προκαλεί ολόκληρο το ζωντανό κύτταρο της P. aeruginosa. γ) Ο NF-κΒ που ενεργοποιείται με Slime-GLP αποτελείται από το ετεροδιμερές p50/p65. δ) Ο μεταγραφικός παράγοντας AP-1 ενεργοποιείται σχετικά πιο καθυστερημένα από ότι ο NF-κΒ, αλλά και σε αυτή την περίπτωση το Slime-GLP φαίνεται να είναι ισχυρότερος διεγέρτης από τον LPS P. aeruginosa. Σε επίπεδο ενεργοποίησης των MAP κινασών τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η διαφορετική ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α, σε επίπεδο πρωτεΐνης, μετά από διέγερση με LPS ή Slime-GLP αντικατοπτρίζεται και σε επίπεδο ενεργοποίησης των διαφορετικών MAP κινασών. Συγκεκριμένα το Slime-GLP ενεργοποιεί τις p38 και Εrk1,2 σε μεγαλύτερο βαθμό από ότι ο LPS της P. aeruginosa. Η ενεργοποίηση των p38 και Erk1,2 που αποτυπώνεται με αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσής τους, αντιστοιχεί και με αύξηση της ενεργότητάς τους. Η χρήση ειδικών αναστολέων έναντι των p38 (SB203580) και Erk1,2 (PD98059) μπορεί και αναστέλλει σημαντικά την παραγωγή του πρωτεϊνικού TNF-α κατά 80-95% και 60-80% αντίστοιχα. Το Slime- GLP διαφέρει από τον ομόλογο LPS της P. aeruginosa μόνο στο βαθμό της ενεργοποίησης των MAP κινασών, δηλαδή μπορεί και επάγει ισχυρότερα τις MAP κινάσες από ότι ο ομόλογος LPS. Η συμμετοχή των Toll-like υποδοχέων στη μετάδοση του σήματος αυτής της διαφορετικής ενεργοποίησης των MAP κινασών από τους LPS και Slime-GLP της P. aeruginosa, μελετήθηκε με τη χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων (anti-TLR2) και (anti-TLR4). Συγκεκριμένα, η ενεργοποίηση της p38, μετά από διέγερση με Slime-GLP, μειώνεται σημαντικά παρουσία του anti-TLR2, ενώ παρουσία του anti-TLR4 η μείωση της ενεργοποίησης της p38 δεν είναι τόσο προφανής. Αντίθετα, μείωση της ενεργοποίησης της p38, όταν αυτή επάγεται από τον LPS της P. aeruginosa, παρατηρούμε μόνο στην περίπτωση που αδρανοποιούμε τον TLR4. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έναν μοριακό μηχανισμό με τον οποίο ο LPS και ο εξωκυττάριος πολυσακχαρίτης Slime-GLP της P. aeruginosa, χρησιμοποιούν διαφορετικούς υποδοχείς στην επιφάνεια των μακροφάγων για την διαφορετική ενεργοποίηση των MAP κινασών και τη ρύθμιση της παραγωγής του TNF-α στα ανθρώπινα μακροφάγα κύτταρα / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic Gram-negative pathogen that is associated with severe infections of immunocompromized or critically ill patients. P. aeruginosa infections both chronic and acute, are associated with high incidence of morbidity and mortality. Many gene products of the bacterium, involving lipolysaccharide (LPS), extracellular slime glycolipoprotein (Slime-GLP), exotoxin- A, and exoenzyme-S, contribute to the pathophysiology of P. aeruginosa infection, by stimulating different cell types of the immune system. Macrophages play a key role in execution of the innate and adaptive arms of the immune response to Pseudomonas infection. Activated macrophages exert their effects by producing several types of cytokines and/or other mediators. TNF-α an early proinflammatory cytokine produced by activated macrophages is probably the most important mediator of systemic toxicity. TNF-α production primarily by cells of monocytic lineage is a crucial event in the course of these infections. During in vivo infections with P. aeruginosa, both LPS and Slime-GLP produced by mucoid and non-mucoid strains are being released. Extracellular Slime-GLP causes systemic toxicity when administered in vivo. Signal transduction pathways and early activation intracellular events that mediate induction of TNF-α by human monocytes have been the subject of great interest by many investigators. A key component of many intracellular signaling pathways are the mitogen-activated protein (MAP) kinases. This superfamily includes the extracellular signal response kinases (ERK’s), c-jun N-terminal kinases and the p38 family of kinases. A wide range of bacterial compounds including LPS of Gram-negative bacteria, LTA and peptidoglycan of Gram-positive bacteria and Treponema components differentially activate the MAP kinase family members. Recently it has been shown that cell surface Toll-like receptor (TLR) proteins participate in the ability of the host to discriminate different LPS structural features, and/or other components of the bacterial cell. Although it is now clear that the TLR family of membrane proteins is linked to the activation of MAP kinase family members by different microbial components the subsequent pathways that lead to inflammatory mediator production are still being elucidated. The aim of our study was to delineate the molecular mechanisms leading to differential TNF-α induction by P. aeruginosa LPS and Slime-GLP, specifically theIdentification of specific molecular targets of P. aeruginosa Slime-GLP in human monocytes-macrophages may have important therapeutic implications for P. aeruginosa mediated systemic toxicity.

Ο S. epidermidis αποτελεί κύριο μέλος της χλωρίδας του δέρματος και των βλεννογόνων του ανθρώπου, ενώ συνιστά ένα από τα συχνότερα παθογόνα που προκαλούν νοσοκομειακές λοιμώξεις, ιδιαίτερα σε ανοσοκατασταλμένους ή ασθενείς φέροντες προσθετικά υλικά. Κύριος λοιμογόνος παράγοντας του S. epidermidis είναι ο σχηματισμός βιομεμβράνης. Διάφοροι πολυσακχαρίτες έχουν απομονωθεί από την εξωκυττάρια ουσία του S. epidermidis και έχουν συσχετισθεί με το σχηματισμό βιομεμβράνης καθώς και με την παθογόνο δράση τους. Ο πλέον μελετημένος και εδραιωμένος είναι ο ΡΙΑ, ενώ οι άλλοι πολυσακχαρίτες (PS/A ή PNSG ή PNAG και το SSA) απεδείχθησαν τελικώς ότι είναι ταυτόσημοι ή χημικώς ανάλογοι του ΡΙΑ. Ο ΡΙΑ είναι μία ομογλυκάνη αποτελούμενη από μονάδες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης συνδεδεμένες με β-1,6-γλυκοζιτικό δεσμό και η σύνθεσή του ελέγχεται από ένζυμα που κωδικοποιούνται από τον icaADBC γενετικό τόπο. Η εξωκυττάρια ουσία του S. epidermidis περιέχει επίσης έναν πολυσακχαρίτη, τον 20-kDaPS, ο οποίος απομονώθηκε από ερευνητές του Πανεπιστημίου Πατρών και αποτελείται κυρίως από γλυκόζη, Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη, και είναι μερικώς θειωμένος. Ο 20-kDaPS αντιορός αναστέλλει την προσκόλληση του S. epidermidis στα ενδοθηλιακά κύτταρα και την εμφάνιση βακτηριακής κερατίτιδας σε κουνέλια. Με βάση αναλύσεις κλινικών στελεχών, ο 20-kDaPS εκφράζεται σε μεγάλο ποσοστό στελεχών S. epidermidis, ενώ δεν ανευρέθηκε σε στελέχη άλλων πηκτάση αρνητικών σταφυλοκόκκων. Η παρεμβολή αλληλουχιών εισδοχής σε διάφορα σημεία του icaADBC οπερονίου, το οποίο ελέγχει τη σύνθεση του ΡΙΑ, δεν παρεμβάλλεται στην έκφραση του 20-kDaPS. Η κατεργασία βακτηριακών κυττάρων S. epidermidis με το ένζυμο dispersin B, το οποίο διασπά ειδικά τον β-1,6-γλυκοζιτικό δεσμό που συνθέτει το πολυμερές του ΡΙΑ, και με μετα-περιοδικό νάτριο που διασπά το δεσμό μεταξύ των ατόμων άνθρακα C-3 και C-4 των μονομερών Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης, οδηγεί σε διάσπαση της βιομεμβράνης, χωρίς όμως να διαφοροποιείται αντιγονικά ο 20-kDaPS. Τα κλάσματα, μετά την έκλουση της εξωκυττάριας ουσίας του S. epidermidis από στήλη Q-Sepharose, που εμφανίζουν τη μεγαλύτερη ανοσοδραστικότητα για τον ΡΙΑ, στερούνται πλήρως 20-kDaPS. Η προεπώαση κλινικού στελέχους που δεν εκφράζει τον 20-kDaPS με τον πολυσακχαρίτη αναστέλλει την ενδοκυττάρωση, ενώ η προεπώαση του πρότυπου στελέχους ATCC35983 που συνθέτει τον 20-kDaPS με ειδικό αντιορό ενισχύει την ενδοκυττάρωση από τα ανθρώπινα μακροφάγα. Κατά συνέπεια, ο icaADBC γενετικός τόπος δεν εμπλέκεται στη σύνθεση του 20-kDaPS. Οι ανοσοχημικές και χρωματογραφικές ιδιότητες του PIA και του 20-kDaPS είναι διακριτές. Ο 20-kDaPS πιθανό να επιδεικνύει αντιφαγοκυτταρική δράση, ενώ τα ειδικά αντισώματα έχουν δράση οψωνίνης. Η οργάνωση των βακτηρίων εντός βιομεμβράνης προστατεύει από τις αντιμικροβιακές ουσίες και το σύστημα ανοσίας. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης περιέχουν στην εξωκυττάρια ουσία τους μεγαλύτερα ποσά ΡΙΑ από τα ελεύθερα αναπτυσσόμενα, πλαγκτονικά κύτταρα. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης επιδεικνύουν μεγαλύτερη ικανότητα για προσκόλληση και επιβίωση εντός των ανθρώπινων μακροφάγων από τα πλαγκτονικά κύτταρα. Τα βακτήρια εντός βιομεμβράνης επάγουν την παραγωγή μικρότερων ποσών φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως ο TNFα, καθώς και Th1 κυτταροκινών, όπως οι IL-12p40, IL-12p70 and IFN-γ, ενώ ενισχύουν τις IL-8, GM-CSF και IL-13. Οι συγκεκριμένες παρατηρήσεις αφορούν ζωντανά βακτηριακά κύτταρα καθώς και βακτηριακά κύτταρα μονιμοποιημένα με φορμαλδεΰδη. Τα ανωτέρω δεδομένα συνάδουν με την ήπια συμπτωματολογία των σχετιζόμενων με βιομεμβράνη λοιμώξεων S. epidermidis και τη διαφυγή της επιτήρησης του ανοσολογικού συστήματος. Συμπερασματικά, ο 20-kDaPS αποτελεί κύριο συστατικό της εξωκυττάριας ουσίας του S. epidermidis με αντιφαγοκυτταρικές και ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες. Οι ανοσοχημικές και χρωματογραφικές ιδιότητες του 20-kDaPS είναι πλήρως διακριτές του ΡΙΑ, του κύριου πολυσακχαρίτη που σχετίζεται με το σχηματισμό βιομεμβράνης, ενώ ο γενετικός τόπος icaADBC δε ρυθμίζει τη σύνθεση του 20-kDaPS. Η οργάνωση των βακτηρίων εντός βιομεβράνη εξασφαλίζει αντίσταση στην ενδοκυττάρια θανάτωσή τους από τα μακροφάγα και καταστολή της ανοσιακής απόκρισης. / The skin commensal and opportunistic pathogen Staphylococcus epidermidis is a leading cause of hospital-acquired and biomaterial-associated infections. The polysaccharide intercellular adhesin (PIA), a homoglycan composed of β-1,6-linked N-acetylglucosamine residues, synthesized by enzymes encoded by the icaADBC operon is a major functional factor in biofilm accumulation, promoting virulence in experimental biomaterial-associated S. epidermidis infections. Extracellular mucous layer extracts of S. epidermidis contain another major polysaccharide, referred to as 20-kDa polysaccharide (20-kDaPS), composed mainly out of glucose, N-acetylglucosamine, and being partially sulfated. 20-kDaPS antiserum prevents adhesion of S. epidermidis on endothelial cells and development of experimental keratitis in rabbits. Here we provide experimental evidence that 20-kDaPS and PIA represent distinct molecules and that 20-kDaPS is implicated in endocytosis of S. epidermidis bacterial cells by human monocyte-derived macrophages. Analysis of 75 clinical coagulase-negative staphylococci from blood-cultures and central venous catheter tips indicated that 20-kDaPS is expressed exclusively in S. epidermidis but not in other coagulase-negative staphylococcal species. Tn917-insertion in various locations in icaADBC in mutants M10, M22, M23, and M24 of S. epidermidis 1457 are abolished for PIA synthesis, while 20-kDaPS expression appears unaltered as compared to wild-type strains using specific anti-PIA and anti-20-kDaPS antisera. While periodate oxidation and dispersin B treatments abolish immuno-reactivity and intercellular adhesive properties of PIA, no abrogative activity is exerted towards 20-kDaPS immunochemical reactivity following these treatments. PIA polysaccharide I-containing fractions eluted from Q-Sepharose were devoid of detectable 20-kDaPS using specific ELISA. Preincubation of non-20-kDaPS-producing clinical strains with increasing amounts of 20-kDaPS inhibits endocytosis by human macrophages, whereas, preincubation of 20-kDaPS-producing strain ATCC35983 with 20-kDaPS antiserum enhances bacterial endocytosis by human macrophages. In conclusion, icaADBC is not involved in 20-kDaPS synthesis, while the chemical and chromatographic properties of PIA and 20-kDaPS are distinct. 20-kDaPS exhibits anti-phagocytic properties, whereas, 20-kDaPS antiserum may have a beneficial effect on combating infection by 20-kDaPS-producing S. epidermidis. As stated above, biofilm formation is a major virulence factor of S. epidermidis. Biofilm protects bacterial cells from antimicrobial agents and components of the immune system. Interactions of peripheral blood mononuclear cells and monocyte derived macrophages with planktonic or biofilm phase S. epidermidis cells were also studied. Biofilm phase bacteria exhibited higher attachment, as well as, a ten fold higher intracellular survival in monocyte-derived macrophages than their planktonic counterparts. Stimulation of peripheral blood mononuclear cells and monocyte derived macrophages was performed with live or formalin-fixed bacterial cells. Supernatant concentration of selected cytokines was measured by Luminex® xMAP™ technology at different time points. As compared to planktonic phase, biofilm phase bacteria elicited lower amounts of proinflammatory cytokines and Th1 response cytokines, such as TNFα, IL-12p40, IL-12p70 and IFN-γ, whereas, they enhanced production of IL-8, GM-CSF and IL-13. This phenomenon was independent of formalin pretreatment. Taken together, these results may contribute to interpretation of observed silent course of biofilm associated infections. In conclusion, 20-kDaPS represents a major component of S. epidermidis extracellular matrix and data show that 20-kDaPS posseses antiphagocytic and immunomodulatory properties. 20-kDaPS and PIA are immunochemically and chromatographically discrete molecules, whereas icaADBC locus is not involved in 20-kDaPS synthesis. Biofilm mode of growth ensures higher resistance rates to intracellular killing and down regulation of immune responses.