Η ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης ορίζεται ως παθολογική μείωση του ρυθμού εμβρυικής ανάπτυξης που καταλήγει σε ένα έμβρυο το οποίο δεν έχει την αναμενόμενη ανάπτυξη σύμφωνα με την ηλικία κύησης και το οποίο διατρέχει κίνδυνο αυξημένης περιγεννητικής νοσηρότητας και θνησιμότητας. Ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης είναι η ανικανότητα του εμβρύου να διατηρήσει τον αναμενόμενο ρυθμό ανάπτυξης ανεξάρτητα αν το βάρος του είναι κάτω από τη 10η εκατοστιαία θέση. Όταν η ανάπτυξη του εμβρύου είναι κάτω από την 5η εκατοστιαία θέση τότε ίσως να μπορεί να θεωρηθεί πραγματική ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης. Σύμφωνα με το αμερικανικό κολέγιο γυναικολόγων και μαιευτήρων American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) η ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης ορίζεται ως το έμβρυο που αποτυγχάνει να έχει τον αναμενόμενο ρυθμό ανάπτυξης. Πολλές φορές οι όροι ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης (IUGR) και μικρό για την ηλικία κύησης (SGA) συγχέονται και για αυτό το λόγο διευκρινίζεται ότι ο όρος μικρό για την ηλικία κύησης (SGA) αναφέρεται σε έμβρυο του οποίου το εκτιμώμενο βάρος είναι κάτω από τη 10η εκατοστιαία θέση. Από το σύνολο των μικρών για την ηλικία κύησης (SGA) εμβρύων το 40% είναι υγιή, 20% είναι μικρά εξαιτίας χρωμοσωμικών και περιβαλλοντικών παραγόντων και 40% διατρέχουν ιδιαίτερα αυξημένο κίνδυνο ενδομήτριου θανάτου και σχετίζονται με ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης. Η ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης είναι μια πολυσυστηματική διαταραχή και διακρίνεται σε: Α) Συμμετρική. Όταν η ανάπτυξη της κεφαλής και της κοιλιάς επιβραδύνονται συμμετρικά. Είναι λιγότερο συχνή, 20%-30%. Β) Ασύμμετρη. Δυσανάλογη ελάττωση του μεγέθους της κοιλιάς σε σχέση με αυτό της κεφαλής. Είναι περισσότερο συχνή, 70%-80%, και οφείλεται συνήθως σε μητροπλακουντιακή ανεπάρκεια και συμβαίνει μετά την 28η εβδομάδα. Στη φάση αυτή γίνεται η μεγαλύτερη εναπόθεση λίπους. Η ενδομήτρια καθυστέρηση ανάπτυξης αποτελεί κύριο πρόβλημα στην περιγεννητική ιατρική, είναι η ΔΕΥΤΕΡΗ αιτία θανάτου μετά την προωρότητα. 52% των ανεξήγητων ξαφνικών θανάτων των εμβρύων συσχετίζονται με ανάπτυξη IUGR. 10% των περιπτώσεων περιγεννητικής θνησιμότητας στην Ευρώπη είναι αποτέλεσμα μη διαγνωσμένης IUGR. Η επίπτωση της ενδομήτριας καθυστέρησης ανάπτυξης είναι 8% στον γενικό πληθυσμό. / Intrauterine growth restriction (IUGR) is the failure of the fetus to achieve his/her intrinsic growth potential and is associated with significantly increased perinatal morbidity and mortality. IUGR affects 10% of pregnancies and perinatal mortality rates are 4-8 times higher for infants with this disorder. Intrauterine growth restriction is not a specific disease entity with a unique pathophysiology, but the result of suboptimal intrauterine growth conditions in conjunction with a variety of disorders from genetic to metabolic, vascular, coagulative, autoimmune, as well as infectious. Newborns with intrauterine growth restriction (IUGR) present reduced fat mass and undergo adaptational changes of endocrine/metabolic mechanisms as a result of intrauterine malnutrition. Recently, it was shown that fat-secreted adipokines such as visfatin, a novel adipokine improving glucose tolerance through insulin-mimetic effects, and vaspin , profoundly influence insulin sensitivity and energy metabolism.

Στην παρούσα διπλωματική εργασία, εκτιμώνται τα πλεονεκτήματα που παρέχουν οι βοηθητικές τεχνολογίες, όπως είναι τα εικονικά περιβάλλοντα, για προγράμματα σπουδών σε μαθητές με ελαφρά νοητική καθυστέρηση. Επίσης, μελετώνται οι αντιληπτικές και χωρικές ικανότητες παιδιών με νοητική καθυστέρηση συγκριτικά με αυτές των παιδιών τυπικής ανάπτυξης, χρησιμοποιώντας μία εφαρμογή εικονικής πραγματικότητας. Για την διερεύνηση των παραπάνω, πραγματοποιήθηκε μία ερευνητική διαδικασία αποτελούμενη από δύο φάσεις. Η πρώτη φάση συνίσταται σε μία πιλοτική εφαρμογή του προγράμματος εικονικής πραγματικότητας, όπου ζητήθηκε από μία ομάδα 10 ατόμων, ηλικίας 16-23 ετών, να το αξιολογήσουν ώστε να επιτραπεί η χρήση του στην επόμενη φάση. Η δεύτερη φάση περιέχει την κυρίως έρευνα, όπου συμμετέχουν δύο ομάδες παιδιών, η μία εκ των οποίων αποτελείται από παιδιά με νοητική καθυστέρηση, ενώ η άλλη από παιδιά τυπικής ανάπτυξης. Τα υποκείμενα των δύο ομάδων εξερεύνησαν το εικονικό περιβάλλον και εν συνεχεία αξιολογήθηκαν σε κάποια έργα χωρικής μνήμης και χωρικής αντίληψης. Τέλος, αξιολογήθηκε ο προσανατολισμός, η λεπτή κινητικότητα και κάποια άλλα χαρακτηριστικά της συμπεριφοράς των υποκειμένων. Βάσει των δεδομένων που προέκυψαν από την ερευνητική διαδικασία, εξήχθησαν συμπεράσματα για τα παραπάνω, τα οποία παρουσιάζουν τα παιδιά με νοητική καθυστέρηση να μειονεκτούν έναντι των παιδιών τυπικής ανάπτυξης. / The following research paper, which serves as a part of the Departments requirements leading to a Bachelor’s Degree, unfolds its goal and objectives into phases. The goal of this endeavor is to present the advantages that assistive technologies, such as Virtual Environments, offer to students with mental retardation. In addition, the conceptual and spatial abilities of mentally retarded children are examined, comparatively with the abilities of nonretarded children using an application of virtual reality. In order to investigate the above, a two-phase research had taken place. In the first phase, that is a pilot test, a group of ten subjects, 16-23 years old, evaluated this application in order to be possible to use the application in the next phase. The second phase involves the basic research, where two groups of children, one of mentally retarded children and one of nonretarded children, took part. The subjects of these two groups explored the virtual environment and afterwards they completed tests of spatial memory and spatial cognition. In the end, the orientation, the “delicate mobility” (the ability to handle small objects) and some other characteristics of the children’s behavior were assessed. On the basis of the data that emerged from the research procedure, there were extracted conclusions that indicate that mentally retarded children are deficient against nonretarded children.

Οι σύγχρονες τάσεις της Επιστήμης Σχεδιασμού των Υπολογιστικών Συστημάτων έχουν υιοθετήσει την χρήση των Κρυφών Μνημών ή Μνημών Cache, αποβλέποντας στην απόκρυψη της Καθυστέρησης της Κύριας Μνήμης των Συστημάτων (Memory Latency) και την γεφύρωση του χάσματος της απόδοσης του Επεξεργαστή και της Κύριας Μνήμης (Processor – Memory Performance Gap). Οι Μνήμες Cache έτσι έχουν αποκτήσει αδιαμφισβήτητα πρωτεύοντα ρόλο στην Ιεραρχία Μνήμης των Ηλεκτρονικών Υπολογιστών. Οι νέες τάσεις Σχεδιασμού ανέδειξαν την Έννοια του Παραλληλισμού σε πρωτεύοντα ρόλο. Αρχικά διερευνήθηκε ο Παραλληλισμός Επιπέδου Εντολών, ωστόσο η αύξηση της Απόδοσης των Υπολογιστών σύντομα έφτασε ένα μέγιστο. Την τελευταία δεκαετία το κέντρο του ενδιαφέροντος των σχεδιαστών έχει και πάλι μετατοπιστεί, καθώς ένας νέος τύπος Επεξεργαστών έχει εισέλθει στο προσκήνιο, οι Πολυπύρηνοι Επεξεργαστές, ή όπως είναι αλλιώς γνωστοί on-chip Multiprocessors (CMP). Αυτές οι εξελίξεις, σε συνδυασμό με την ολοένα αυξανόμενη πολυπλοκότητα της “συμπεριφοράς” των εκτελούμενων Εφαρμογών, ώθησαν το σχεδιαστικό ενδιαφέρον προς την εκμετάλλευση ενός νεοσύστατου τύπου Παραλληλισμού. Ο Παραλληλισμός Επιπέδου Μνήμης ή Memory Level Parallelism (MLP) αποτελεί τα τελευταία χρόνια, το πλέον ισχυρό μέσο αύξησης της απόδοσης των Υπολογιστικών Συστημάτων και μαζί με τους Πολυπύρηνους Επεξεργαστές θα κυριαρχήσει στο προσκήνιο των εξελίξεων τα επόμενα χρόνια. Σκοπός της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας είναι η ανάπτυξη ενός Στατιστικού – Πιθανοτικού Μοντέλου για μελέτη και πρόβλεψη των φαινομένων που αναπτύσσονται σε Μνήμες Cache, στις οποίες αποθηκεύονται δεδομένα από εκτελούμενες Εφαρμογές, με έντονο Παραλληλισμό Επιπέδου Μνήμης. Θα οριστεί ένας Εκτιμητής του Φόρτου που επιβάλλεται στο Σύστημα, από φαινόμενα Παραλληλισμού Επιπέδου Μνήμης (MLP). Στην συνέχεια, με βάση το Μοντέλο που αναπτύσσουμε, θα διερευνηθεί ένα ικανοποιητικό σύνολο Εφαρμογών, και θα εξαχθεί μια Εκτίμηση – Πρόβλεψη για τον Φόρτο (MLP) του Συστήματος. Εφόσον οι Προβλέψεις μας κριθούν επιτυχής, το Μοντέλο Πρόβλεψης Φόρτου MLP που αναπτύξαμε, μπορεί να αποτελέσει χρήσιμο Εργαλείο στα χέρια των Σχεδιαστών που ασχολούνται με την αύξηση της Απόδοσης των Σύγχρονων Υπολογιστικών Συστημάτων. / -

Αντικείμενο της διατριβής είναι η επίδειξη μεθόδων, που βρίσκουν εφαρμογή, τόσο ειδικότερα στην σχεδίαση πολύπλοκων ψηφιακών μικροηλεκτρονικών κυκλωμάτων μεγάλης ταχύτητας, για τηλεπικοινωνιακά δίκτυα οπτικών ινών, όσο και γενικότερα για την επίλυση θεμάτων χρονισμού, που προκύπτουν κατά την υλοποίηση πολύπλοκων ολοκληρωμένων συστημάτων πάνω σε chip. Όσον αφορά, τον χώρο των τηλεπικοινωνιακών κυκλωμάτων, παρουσιάζονται μέθοδοι, τόσο για την συνολική οργάνωση του ολοκληρωμένου κυκλώματος, όσο και για την κυκλωματική υλοποίηση λειτουργικών μονάδων κοινών σε τηλεπικοινωνιακά κυκλώματα, με απαιτήσεις υψηλής ταχύτητας, χαμηλής κατανάλωσης, και ταυτόχρονης συνύπαρξης πολλαπλών ρολογιών. Η επίδειξη των προτεινόμενων μεθόδων καθώς και η επαλήθευση της ορθότητά τους, πραγματοποιείται, μέσα από την υλοποίηση σε πυρίτιο, ενός πολύπλοκου τηλεπικοινωνιακού ολοκληρωμένου κυκλώματος, με υψηλές απαιτήσεις ταχύτητας λειτουργίας. Όσον αφορά, τον γενικότερο χώρο της σχεδίασης πολύπλοκων ολοκληρωμένων System-on-Chip (SoC), παρουσιάζονται μέθοδοι για την επίλυση προβλημάτων χρονισμού, στα σύγχρονα ψηφιακά ολοκληρωμένα κυκλώματα, που σχετίζονται με την διάδοση και τον πολλαπλασιασμό της συχνότητας του ρολογιού, στο εσωτερικό των κυκλωμάτων αυτών. Πιο συγκεκριμένα, παρουσιάζονται μέθοδοι που μπορούν να εφαρμοστούν, τόσο για την εξάλειψη της παρέκκλισης, μεταξύ των κόμβων των εσωτερικών ρολογιών, όσο και για την εξάλειψη της παρέκκλισης μεταξύ εξωτερικού και εσωτερικού ρολογιού, στα ολοκληρωμένα κυκλώματα. Όσον αφορά το δεύτερο, η συχνότητα του εσωτερικού ρολογιού δεν ταυτίζεται απαραίτητα με αυτήν του εξωτερικού, αλλά επιτρέπεται να έχει πολλαπλάσια τιμή από αυτήν. Για την ευθυγράμμιση του εσωτερικού με το εξωτερικό ρολόι, προτείνεται η συστηματική μέθοδος LCD-SMD, η οποία είναι κατάλληλη για χρήση σε ολοκληρωμένα όπου επικρατούν συνθήκες μακρύ οδηγού ρολογιού, παράγει εσωτερικό ρολόι πολλαπλάσιο του εξωτερικού με σταθερό 50% duty-cycle, έχει μικρό χρόνο κλειδώματος, και χρησιμοποιεί εξ’ ολοκλήρου ψηφιακές λογικές πύλες. Η επικύρωση της ορθότητας των προτεινόμενων μεθόδων για θέματα χρονισμού, γίνεται κατά ένα μέρος με υλοποίηση σε πυρίτιο, και κατά ένα άλλο μέρος με εξομοιώσεις. / This Thesis aims to demonstrate design methods that can be applied as much in the design of high complexity, high speed, digital integrated circuits for optical fiber networks, as more generally to resolve timing issues, arising during the implementation of integrated circuits (IC’s). Specifically, in this Thesis we present methods for the holistic organization of a digital integrated circuit (driven by the needs imposed by nowadays telecommunications area), as well as methods regarding circuit implementation of various common functional units in telecommunications circuits that require high speed, low power and multiple clocks. The proposed methods are demonstrated and validated through the silicon implementation of a complex telecom integrated circuit (SDH framer). The design of the here-above mentioned chips lie into the more general area of the complex integrated Systems-on-Chips (SoCs). The methods developed in the Thesis, concern the distribution and frequency multiplication of the clock signal, inside the chip. In particular, we address between others, methods to remove the skew between the internal clock nodes, as well as methods to remove the skew between the internal and external clock. The internal clock frequency is allowed to be a multiple of the external clock frequency. For the alignment of the internal with the external clock, the systematic open-loop method LCD-SMD has been proposed, which is applicable to IC’s with long clock driver conditions. Through this method, we accomplish the generation of an internal clock with multiple frequencies than the external, while preserving a constant 50% duty-cycle. The method results into a fast lock time, and employs only standard digital logic gates. The proposed methods are validated both by silicon implementation and by simulations.

Vitamin A and its metabolites retinal and retinoic acid are important molecules for the regulation of normal cellular growth, differentiation and other important functions. Retinoids are known to exert mutagenic as well as antimutagenic activity, although conflicting reports are known. All-trans retinoic acid (ATRA) is used in the treatment of many diseases such as acne, psoriasis and ichthyosis. It is also used in differentiated therapy of acute promyelocytic leukemia; however, it is frequently observed that relapses occur when ATRA is prescribed as maintenance therapy. Therefore, understanding the mechanism of action of ATRA in cells would be helpful in the development of high potent and low toxic chemotherapeutic agents. EA-4 is a newly synthesized steroidal analogue of ATRA and is considered as a promising agent for the inhibition of human leukemic cell growth. The study of genotoxicity is an important parameter for the design and development of new chemotherapeutic agents. Genotoxic effects of anticancer drugs in non-tumour cells are of special significance due to their possibility of inducing secondary tumours in cancer patients. Therefore, it is important to determine the genotoxic potential of a drug that will be used in chemotherapy, particularly in native human cells. Taking into consideration the above referred, it would be of interest to evaluate the genotoxic potential of EA-4 in comparison to ATRA, as to their ability to provoke micronucleus (MN) generation, due to both chromosome breakage and chromosome delay. Micronuclei originate from chromosome fragments or whole chromosomes, which lag behind at anaphase during nuclear division. According to our knowledge, there is no information on the ability of all-trans retinoic acid (ATRA) to induce micronucleus formation. To investigate the ability of ATRA and its steroidal analogue EA-4 to enhance micronucleation on human lymphocytes cultured in vitro, the Cytokinesis Block MicroNucleus (CBMN) assay was conducted. By this assay, the cytotoxic effect of the two retinoids was also estimated. To clarify the mechanism by which micronuclei are generated due to ATRA and EA-4 treatment, CBMN was combined with Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) using an α-satellite pancentromeric probe to detect centromere inclusion and thus intact chromosome(s) in micronuclei or acentric chromosome fragments. ATRA and EA-4 were shown to be cytotoxic by decreasing CBPI (Cytokinesis Block Proliferation Index) to statistically significant levels in relation to untreated cells. A statistically significant increase in micronucleus frequency was also observed for both investigated compounds. ATRA generated micronuclei mainly via chromosome breakage while a mild effect on chromosome delay was also apparent. On the other hand, EA-4 generated micronuclei exclusively via chromosome breakage. To verify ATRA and EA-4 genotoxicity, micronucleation was investigated in a second biological system coming from a different organism, C2C12 mouse cells. Micronucleus analysis was achieved by α-tubulin/CREST immunostaining for the visualization of microtubules and the detection of kinetochore inside micronuclei and hence the inclusion of whole chromosome(s) or acentric chromosome fragments. Additionally the effect of ATRA and EA-4 on cell proliferation was investigated by the estimation of Mitotic Index (M.I.). We found that ATRA and EA-4 exerted cytotoxic activity in C2C12 mouse cells by reducing the cell proliferation rate at significant levels, as evaluated by the decrease of M.I. A statistically significant elevation in the frequency of interphase cells with micronuclei was shown. CREST analysis confirmed the clastogenic activity of the studied retinoids that was indicated in human lymphocytes. Micronucleation due to ATRA was mediated mainly by chromosome breakage and in a lesser extent by chromosome delay. EA-4 was shown to induce chromosome breakage as well as chromosome delay, as opposed to human lymphocytes at which only clastogenic effect was shown. These observations suggest that, ATRA and EA-4 are able to provoke chromosome fragmentation, but additionally and in a lesser extent to disturb chromosome segregation at anaphase due to chromosome lagging. Cell cycle analysis showed that ATRA and EA-4 accumulated cells at ana-telophase. The analysis of ana-telophases revealed micronucleation, nucleoplasmic bridges and multinucleation, phenomena that may explain the dual genetic activity of ATRA and EA-4. Multinucleated and multimicronucleated interphase cells were also apparent, the second ones generated due to both chromosome delay and breakage. To further investigate the mechanism of genotoxic activity of ATRA and EA-4 we proceeded our research on two axes based on their aneugenicity and clastogenicity. Thus we studied the effect of ATRA and EA-4: i) on the integrity of mitotic spindle, as a target of aneugens by using double immunofluorescence staining of β- and γ-tubulin in C2C12 mouse cell line, which is a convenient system to apply this experimental procedure, and ii) to investigate the ability of the studied retinoids to induce double-strand breaks on DNA by using neutral Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE assay-Comet assay) in two different cell lines, C2C12 mouse cells and HL-60 human leukemic cells. Analysis of mitotic spindle has shown that the studied retinoids affect chromosome orientation during metaphase by inducing bipolar metaphases with non-congressed genetic material due to abnormal microtubule network. In addition defects on centrosome duplication and/or separation were observed due to the presence of monopolar metaphases. Ana-telophases as well as interphases with supernumerary centrosomes were also apparent. Additionally, interphase cells with abnormal microtubule network were observed. The above findings may explain aneugenic as well as clastogenic activity of the studied retinoids. Comet assay revealed that ATRA and its steroidal analogue EA-4 provoke DNA migration due to double strand DNA fragmentation in both C2C12 mouse cells and HL-60 human leukemic cells. EA-4 was shown to be the stronger inducer of DNA fragmentation. These results confirm the findings from FISH and CREST analysis indicating that the studied retinoids show high clastogenic activity. . Taking into account the above, we may say that our findings clarify the cytotoxic and genotoxic activity of retinoic acid and the mechanism of its action by indicating its ability to induce chromosome breakage via double-strand DNA breaks and secondary its ability to provoke chromosome delay due to defects in microtubule network and mitotic spindle integrity. / Η βιταμίνη Α και οι μεταβολίτες της, ρετινόλη και ρετινοϊκό οξύ είναι ισχυροί παράγοντες για τη ρύθμιση σημαντικών λειτουργιών, όπως της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης και άλλων. Τα ρετινοειδή είναι γνωστά για την μεταλλαξιγόνο αλλά και αντιμεταλλαξιγόνο δράση τους, αν και έχουν αναφερθεί αντικρουόμενα ευρήματα. Το all-trans ρετινοϊκό οξύ (ATRA) χρησιμοποιείται στη θεραπεία πολλών ασθενειών, όπως η ακμή, ψωρίαση, ιχθύωση, αλλά και στη θεραπεία κακοηθειών όπως η μυελογενής λευχαιμία. Συχνά σε περιπτώσεις όπου το ATRA αποτελεί τη βασική θεραπεία παρατηρούνται υποτροπιάσεις Έτσι, η κατανόηση του μηχανισμού δράσης του ATRA στα κύτταρα θα αποτελέσει χρήσιμο εργαλείο για την ανάπτυξη νέων, ισχυρών και μη-τοξικών θεραπευτικών παραγόντων προερχόμενων από αυτό. Το EA-4 είναι ένα πρόσφατα συντεθέν στεροειδικό ανάλογο του ATRA, που θεωρείται υποσχόμενος παράγοντας για την αναστολή της ανάπτυξης ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων. Η μελέτη της γονιδιοτοξικότητας αποτελεί σημαντική παράμετρο για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων. Οι γονιδιοτοξικές επιπτώσεις αντικαρκινικών φαρμάκων σε μη-καρκινικά κύτταρα είναι ιδιαίτερης σημασίας, και αποτελούν πιθανή αιτία εμφάνισης δευτερογενών όγκων σε ασθενείς. Έτσι, είναι σημαντικό να μελετηθεί η γονιδιοτοξική δράση ενός φαρμάκου που θα χρησιμοποιηθεί στη χημειοθεραπεία. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω, θεωρήθηκε ενδιαφέρον να εκτιμηθεί η γονιδιοτοξικότητα του EA-4 σε σύγκριση με το ATRA ως προς την ικανότητά τους να προκαλούν την εμφάνιση μικροπυρήνων (MN) είτε μέσω της χρωμοσωματικής θραύσης είτε μέσω της χρωμοσωματικής καθυστέρησης. Οι μικροπυρήνες προέρχονται από χρωμοσωματικά θραύσματα ή ολόκληρα χρωμοσώματα, τα οποία καθυστερούν κατά την ανάφαση της μείωσης ή της μίτωσης. Σύμφωνα με όσα μέχρι σήμερα γνωρίζουμε, δεν φαίνεται να υπάρχουν στοιχεία που αφορούν την ικανότητα του all-trans ρετινοϊκού οξέος (ATRA) να επάγει το σχηματισμό μικροπυρήνων. Για τη διερεύνηση της ικανότητας του ATRA και του στεροειδικού αναλόγου του EA-4 να επάγει την εμφάνιση μικροπυρήνων, πραγματοποιήθηκε η μέθοδος αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN assay) σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα in vitro. Με την ίδια μέθοδο εκτιμήθηκε και η κυτταροτοξικότητα των δύο ρετινοειδών. Για την διευκρίνιση του μηχανισμού δημιουργίας των μικροπυρήνων από τη δράση των ATRA και EA-4, η μέθοδος CBMN συνδυάστηκε με την in situ υβριδιποίηση με φθοροχρώματα (FISH) και χρήση α-δορυφορικού (α-satellite) πανκεντρομερικού ανιχνευτή για την επισήμανση του κεντρομέρους και την ανίχνευσή του σε μικροπυρήνες. Η παρουσία σήματος υβριδοποίησης στους μικροπυρήνες υποδηλώνει την ύπαρξη άθικτου χρωμοσώματος στο εσωτερικό τους. Το αντίθετο υποδεικνύει την παρουσία άκεντρου χρωμοσωματικού θραύσματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και οι δύο χημικές ενώσεις προκαλούν στατιστικά σημαντική αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων Το ATRA οδηγεί στην δημιουργία μικροπυρήνων κυρίως μέσω χρωμοσωματικής θραύσης, και σε ηπιότερο βαθμό μέσω χρωμοσωματικής καθυστέρησης. Αντίθετα, το EA-4 επάγει το σχηματισμό μικροπυρήνων αποκλειστικά μέσω χρωμοσωματικής θραύσης. Επίσης το ATRA και το EA-4 παρουσάζουν ισχυρή κυτταροτοξικότητα, όπως φάνηκε από τη στατιστικά σημαντική μείωση του κυτταρικού δείκτη πολλαπλασιασμού (CBPI), σε σύγκριση με τις καλλιέργειες του μάρτυρα. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί η γονιδιοτοξικότητα του ATRA και του EA-4, διερευνήθηκε η ικανότητά τους να προκαλούν αυξημένες συχνότητες μικροπυρήνων σε ένα δεύτερο βιολογικό σύστημα, την κυτταρική σειρά ποντικού C2C12. Η ανάλυση των MN πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο διπλού ανοσοφθορισμού α-τουμπουλίνης/CREST, για την ανίχνευση σήματος κινητοχώρου στο εσωτερικό του μικροπυρήνα κι έτσι την παρουσία ολόκληρου χρωμοσώματος. Επίσης,η κυτταροτοξικότητα τους διερευνήθηκε με την εκτίμηση του μιτωτικού δείκτη. Με τη ίδια μέθοδο αναλύθηκε η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου. Παρατηρήθηκε ότι το ATRA και το EA-4 παρουσιάζουν κυτταροτοξική δράση στα κύτταρα C2C12 μειώνοντας το ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε στατιστικά σημαντικά επίπεδα. Επιπλέον αποκαλύφθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση της συχνότητας κυττάρων με μικροπυρήνες. Η επισήμανση του κινητοχώρου επιβεβαίωσε τη θραυσματογόνο δράση των υπό μελέτη ρετινοειδών που παρατηρήθηκε στα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα. Η δημιουργία μικροπυρήνων μέσω του ATRA ήταν αποτέλεσμα κυρίως χρωμοσωματικής θραύσης και σε μικρότερη έκταση χρωμοσωματικής καθυστέρησης, σε συμφωνία με τα ευρήματα από τα πειράματα στις καλλιέργειες ανθρώπινων λεμφοκυττάρων. Αντίθετα, παρατηρήθηκε ότι το EA-4, πλην της ισχυρής θραυσματογόνου δράσης, προκαλεί και χρωμοσωματική καθυστέρηση. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδεικνύουν ότι το ATRA και το EA-4 είναι ισχυροί θραυσματογόνοι παράγοντες, αλλά σε μικρότερο βαθμό είναι ικανοί να διαταράξουν και τον χρωμοσωματικό αποχωρισμό κατά την πυρηνική διαίρεση. Η μελέτη του κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι τόσο το ATRA και όσο και το EA-4 προκαλούν καθυστέρηση συσσωρεύοντας τα κύτταρα στα στάδια ανάφασης και τελόφασης της πυρηνικής διαίρεσης. Κύτταρα που συσσωρεύονται στα παραπάνω στάδια χαρακτηρίζονται από την εμφάνιση πυρηνοπλασματικών γεφυρών, την παρουσία περισσότερων του ενός πυρήνων, αλλά και την παρουσία μικροπυρήνων, φαινόμενα τα οποία είναι σύμφωνα με τη διττή γενετική δράση των ATRA και EA-4. Επίσης, παρατηρήθηκαν πολυπύρηνα μεσοφασικά κύτταρα και μεσοφασικά κύτταρα με πολλαπλούς μικροπυρήνες, με τον δεύτερο τύπο κυττάρων να προέρχεται τόσο από χρωμοσωματική θραύση όσο και από χρωμοσωματική καθυστέρηση. Έτσι, φαίνεται ότι τα δύο υπό μελέτη ρετινοειδή μπορούν να χαρακτηρισθούν μόρια με θραυσματογόνες αλλά και ανευπλοειδογόνες ιδιότητες. Για τη λεπτομερέστερη ανάλυση του μηχανισμού δράσης του ATRA και του EA-4 σχεδιάσθηκαν πειράματα σε δύο βασικούς άξονες που αφορούσαν την περαιτέρω μελέτη τόσο της ανευπλοειδογόνου όσο και της θραυσματογόνου δράσης τους. Έτσι, μελετήθηκε η επίδραση του ATRA και του EA-4 αντίστοιχα ως προς: α) την ακεραιότητα της μιτωτικής συσκευής, η οποία αποτελεί κυτταρικό στόχο ανευπλοειδογόνων ενώσεων. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε στην κυτταρική σειρά C2C12, μέσω της μεθόδου διπλού ανοσοφθορισμού για τη β- και γ-τουμπουλίνη, δομικά στοιχεία των μικροσωληνίσκων και του κεντροσώματος, και β) την δημιουργία δίκλωνων ρηγμάτων στο DNA μέσω της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων (SCGE assay-Comet assay) σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές, στα κύτταρα ποντικού C2C12 και στα λευχαιμικά κύτταρα ανθρώπου HL-60. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι τα υπό εξέταση ρετινοειδή επηρεάζουν τον χρωμοσωματικό προσανατολισμό κατά τη μετάφαση με την εμφάνιση διπολικών μεταφάσεων με τα χρωμοσώματα μη-διατεταγμένα στο ισημερινό πεδίο, λόγω ανωμαλιών του δικτύου των μικροσωληνίσκων. Επίσης, φάνηκε ότι προκαλούν ανωμαλία στον πολλαπλασιασμό και πιθανόι στον αποχωρισμό των κεντροσωμάτων, παρατήρηση που δικαιολογείται από την παρουσία μονοπολικών μεταφάσεων, καθώς και ανάτελοφάσεων αλλά και μεσοφασικών κύττάρων με υπεράριθμο κεντροσωματικό αριθμό. Επιβεβαιώθηκε επίσης η επίδρασή τους στην πορεία του κυτταρικού κύκλου με συσσώρευση των κυττάρων στα στάδια ανάφασης-τελόφασης. Επιπρόσθετα, φάνηκε ότι το ΕΑ-4, στη μεγαλύτερη συγκέντρωση, διακόπτει τον κυτταρικό κύκλο στο στάδιο της μετάφασης. Παράλληλα, παρατηρήθηκε διαταραχή στη δομή του δικτύου των μικροσωληνίσκων. Όλα τα παραπάνω ευρήματα ερμηνεύουν τόσο την ανευπλοειδογόνο όσο και τη θραυσματογόνο δράση των δύο ρετινοειδών. Με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων δείχθηκε ότι το ATRA και το στεροειδικό του ανάλογο EA-4 προκάλεσαν τη δημιουργία «κομητών», δηλαδή πυρήνων με ανώμαλη μορφολογία μέσω του σχηματισμού δίκλωνων θραυσμάτων DNA. Το φαινόμενο αυτό παρατηρήθηκε τόσο στα κύτταρα ποντικού C2C12 όσο και στα λευχαιμικά κύτταρα ανθρώπου HL-60, με το EA-4 να παρουσιάζει ισχυρότερη επαγωγή θραύσης του DNA. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τα ευρήματα των μεθόδων FISH και CREST, υποδεικνύοντας ότι τα υπό εξέταση ρετινοειδή παρουσιάζουν ισχυρή θραυσματογόνο δράση. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω, μπορούμε να ισχυριστούμε ότι τα ευρήματά μας διευκρινίζουν την κυτταροτοξική και γονιδιοτοξική δράση του ρετινοϊκού οξέος. Υποδεικνύουν ιδιότητες ισχυρώς θραυσματογόνων παραγόντων μέσω δημιουργίας δίκλωνων ρηγμάτων στο DNA των κυττάρων. Δευτερογενώς μπορούν να χαρακτηρισθούν ως ήπιες ανευπλοειδογόνες ενώσεις που προκαλούν ανώμαλο χρωμοσωματικό αποχωρισμό μέσω ανωμαλιών τόσο του δικτύου των μικροσωληνίσκων όσο και της ακεραιότητα της μιτωτικής συσκευής.