Η διπλωματική αυτή εργασία σχετίζεται με την ανίχνευση νεοπλασιών σε μαστογραφίες. Στις μέρες μας, έχουμε μία καλή εικόνα για τον τρόπο που δημιουργείται ο καρκίνος. Αυτό βοηθά στην βελτίωση της θεραπείας αλλά και στην μείωση εμφάνισης της πάθησης. Το κλειδί για την επιτυχή καταπολέμηση της νόσου είναι η πρώιμη ανίχνευση. Οι πιο διαδεδομένες μέθοδοι εξέτασης και διάγνωσης καρκίνου του μαστού είναι η αυτοεξέταση των μαστών από την ίδια τη γυναίκα, η τακτική προληπτική εξέταση του στήθους από το γιατρό καθώς και η πρόληψη μέσω της μεθόδου της μαστογραφίας. Η ανίχνευση του καρκίνου, είναι μια διαδικασία δύσκολη και απαιτεί υψηλό βαθμό αυτοσυγκέντρωσης. Τα νεοπλάσματα αποτελούν παθολογίες και μπορούν να καταταχθούν σε καλοήθη και κακοήθη με ενδιάμεσες διαβαθμίσεις. Το μεγαλύτερο ποσοστό των βιοψιών καταλήγουν τελικά να είναι καλοήθεις. Το νεόπλασμα του μαστού είναι το συχνότερο νεόπλασμα του γυναικείου πληθυσμού. Η διαδικασία συρρίκνωσης της εικόνας, ο αλγόριθμος μετατροπής βάθους των εικονοστοιχείων, ο εμπλουτισμός και η κλιμάκωση της εικόνας αποτελούν κάποιες μεθόδους βελτίωσης της ψηφιακής εικόνας στον τομέα της μαστογραφίας. Περιγράφονται οι τεχνικές ανίχνευσης των ανωμαλιών, με τη βοήθεια των οποίων, μπορούν να εντοπιστούν ανωμαλίες των ιστών στις μαστογραφικές εικόνες. Τέτοιες μορφές ανωμαλιών είναι οι οζώδεις σκιάσεις και οι μικροαποτιτανώσεις. Παρουσιάζονται τα λεγόμενα συστήματα απόφασης και πιο συγκεκριμένα, περιγράφεται ο ορισμός και οι αρχές λειτουργίας των νευρωνικών δικτύων που αποτελούν και τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα. Τέλος, παρουσιάζεται μια μέθοδος ανίχνευσης νεοπλασιών σε μαστογραφίες, ξεκινώντας από μία γενική εισαγωγή στο σύστημα και στα επίπεδα από τα οποία αποτελείται, και συνεχίζοντας με την ανάλυση των μεθόδων που χρησιμοποιεί. / This assignment is related to neoplasia detection in mammograms. Nowadays, we are aware of the way cancer is created. This fact helps to the improvement of the treatment and also to the reduction of the disease appearance. The key to the successful opposition of the disease is the precocity detection. The most prevalent examination and diagnosis methods of breast cancer are self-examination, regular preventive examination by a doctor and the prevention through the method of mammography. Breast cancer detection, is a difficult procedure and requires a high degree of concentration. Neoplasms represent pathologies and can be categorized in benign and malignant. Breast neoplasm is the most common neoplasm of the female population. The procedure of shrinking the digital image, the depth transduction algorithm of the pixels, the enhancement and the scale of the image, comprise some improvement methods of the digital image in the field of mammography. There is a description of the techniques used for detecting abnormalities of the tissues. Masses and micro-calcifications are examples of that kind of abnormalities. Furthermore, there is a presentation of the well known decision systems, and particularly, definition and principles of functionality of neural networks are described, which are the most widely used. Finally, a new method of neoplasias detection is presented in mammograms, starting from a general introduction of the system and the levels it consists of, and continuing with the analysis of the methods used.

Τα ρετινοειδή αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια οργανικών μορίων που μοιάζουν δομικά με τη βιταμίνη Α. Το all-trans ρετινοϊκό οξύ (atRA) συμμετέχει σε μεγάλο εύρος βιολογικών διεργασιών μέσω της πρόσδεσής του και της ενεργοποίησης των υποδοχέων του, τους υποδοχείς ρετινοϊκού οξέος (RAR) και τους υποδοχείς ρειτινοειδών Χ (RXR). Κάθε κατηγορία υποδοχέων περιλαμβάνει τρία μέλη, α, β και γ. Τα ρετινοειδή χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία πολλών ασθενειών, από την κοινή ακμή ως την οξεία προμυελωτική λευχαιμία. Λόγω των σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών τους, γίνεται προσπάθεια να συντεθούν ανάλογα με λιγότερες ανεπιθύμητες δράσεις ή/και καλύτερη αποτελεσματικότητα. Προς αυτήν την κατεύθυνση έχουν συντεθεί πολλά ανάλογα, ανάμεσα τους και αυτά που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία: RA2SPM (ένα σύζευγμα δύο μορίων atRA με σπερμίνη), ACI2SPM (ένα σύζευγμα δύο μορίων ασιτρετίνης με σπερμίνη), TRX2SPM (ένα σύζευγμα δύο μορίων τριοξαλενίου με σπερμίνη), ACI-SPM-TRX (σύζευγμα ασιτρετίνης και τριοξαλενίου με σπερμίνη), RA-SPM-ACI (σύζευγμα atRA και τριοξαλενίου με σπερμίνη). Τα ανάλογα αυτά συντέθηκαν από την ερευνητική ομάδα του καθηγητή Δ. Παπαϊωάννου, στο Τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δράση των αναλόγων αυτών στην ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3 in vitro και έγινε μια αρχική διερεύνηση του μηχανισμού δράσης και της πιθανής εμπλοκής των υποδοχέων ρετινοειδών. Ως πρότυπη ένωση με την οποία συγκρίθηκαν όλες οι άλλες ενώσεις χρησιμοποιήθηκε το ανάλογο RA2SPM, Το ανάλογο ACI2SPM έχει την καλύτερη δράση σε σύγκριση με τα άλλα ανάλογα, αφού προκάλεσε δοσο-εξαρτώμενη μείωση του αριθμού των κυττάρων PC3 σε ποσοστό παρόμοιο με τη δράση του RA2SPM και είναι πιο δραστικό στη συγκέντρωση 10-6Μ σε σχέση με τα άλλα ανάλογα. Αυτή η δράση φαίνεται να σχετίζεται με αύξηση των επιπέδων του mRNA του ογκοκατασταλτικού γονιδίου RARβ, που όμως είναι μικρότερη από αυτήν που προκαλεί το ανάλογο RA2SPM. Ο εκλεκτικός ανταγωνιστής του RARα, Ro-41-5253, βρέθηκε ότι επίσης προκαλεί αύξηση των επιπέδων του mRNA του RARβ, ενώ δεν επηρεάζει τη δράση του ACI2SPM. Επιπλέον, το ανάλογο ACI2SPM μείωσε τα επίπεδα της πρωτεΐνης πλειοτροπίνης (PTN), η οποία είναι γνωστό πως παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3. Η μείωση είναι μικρότερη από αυτήν που προκαλεί το ανάλογο RA2SPM και δεν επηρεάζεται από τον ανταγωνιστή Ro 41-5253, ο οποίος έχει από μόνος του ανασταλτική δράση. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι το ανάλογο ACI2SPM είναι αποτελεσματικό στη μείωση του αριθμού των καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3 και στη μείωση των επιπέδων της (PTN), αλλά η δράση του είναι μικρότερη από αυτήν του RA2SPM. Επίσης, καταδεικνύουν ότι ο εκλεκτικός αναστολέας του RARα Ro-41-5253, όπως έχει αναφερθεί ξανά στη διεθνή βιβλιογραφία, παρουσιάζει προβλήματα εκλεκτικότητας και πρέπει να χρησιμοποιείται με προσοχή. / Retinoids constitute a large family of organic compounds structurally related to the naturally occurring vitamin A. All-trans-retinoic acid (atRA) is known to modulate a wide range of cellular biological processes through binding to and activation of its specific receptors, retinoic acid receptors (RAR) and retinoid X receptors α, β and γ. Retinoids are being used for the treatment of various diseases, ranging from acne vulgaris to acute promyelocytic leukemia. However, due to serious adverse effects, there has been a great effort to synthesize analogues with better efficacy or/and minimized adverse effects. Towards this direction, many analogues have been synthesized, among which those that have been used in the present work: RA2SPM (a conjugate of all-trans retinoic acid with spermine), ACI2SPM (a conjugate of 2 molecules of acitretin with spermine), TRX2SPM (a conjugate of 2 molecules of trioxalen with spermine), ACI-SPM-TRX (a conjugate of trioxalen and acitretin with spermine), RA-SPM-ACI (a conjugate of all-trans retinoic acid and acitretin with spermine). These analogues have been synthesized by the research group of Prof. D. Papaioannou at the Department of Chemistry of the University of Patras. The present work represents an initial investigation of the in vitro effects of these analogues on prostate cancer cell growth (PC3), as well as of their mechanism of action and the possible involvement of retinoid receptors. The analogue RA2SPM was used as a reference control. The analogue ACI2SPM decreased the number of prostate cancer PC3 cells in a concentration-dependent manner, being as effective as RA2SPM and more effective compared with the rest of the tested analogues. This effect seems to correlate with an increase of the mRNA levels of the RARβ tumour repressor gene; however, the RARβ tumour repressor mRNA levels decrease is smaller than that observed with RA2SPM. The RARa selective antagonist Ro 41-5253 also increases the RARβ mRNA levels, while it does not affect the ACI2SP-induced increase. Furthermore, the ACI2SPM analogue was found to decrease the protein levels of the growth factor pleiotrophin (PTN), which is known to play an important role in the growth of the prostate cancer cell line PC3. Similarly to the effect on RARβ, the decrease of the PTN levels achieved by ACI2SPM is smaller than the one achieved by RA2SPM and is unaffected by the antagonist Ro 41-5253. Ro 41-5253 decreased PTN levels by itself, supporting the increasing notion that it should be used with caution as a RARα antagonist. In conclusion, the results of this work suggest that the ACI2SPM analogue is efficient in decreasing the prostate cancer PC3 cell numbers and PTN protein levels but seems to be less effective than RA2SPM action. More work is required in order to define the mechanism(s) of action of the tested analogues, as well as to better specify their effectiveness and toxicity.

Τα γλοιώματα είναι η πιο συχνή κακοήθης μορφή καρκίνου του κεντρικού νευρικού συστήματος. Δυστυχώς, είναι επίσης μεταξύ των πιο δύσκολων μορφών όσο αναφορά τη θεραπεία, με αποτέλεσμα την κακή πρόγνωση των ασθενών. Γλοιώματα παρουσιάζουν πολύπλοκη κυτταρική και γενετική ετερογένεια, περιορίζοντας σημαντικά τις στοχευμένες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Η ανακάλυψη γονιδίων και σηματοδοτικών μονοπατιών που ρυθμίζουν την επιβίωση και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων θα βοηθήσουν στην ανάπτυξη νέων και πιο αποτελεσματικών θεραπειών. Η πρωτεΐνη απόκρισης στο κυκλικό-AMP (CREB) είναι ένα πυρηνικό μόριο που ενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης από κινάσες σερίνης/θρεονίνης και ελέγχει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων στα νευρικά κύτταρα. Ο ρόλος του CREB στη νευρωνική λειτουργία κυμαίνεται από την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό σε πιο πολύπλοκες εγκεφαλικές λειτουργίες, όπως η μνήμη και οι συμπεριφορές εθισμού. Δεδομένα από πρόσφατες έρευνες δείχνουν πως ανώμαλη έκφραση ή ενεργοποίηση του CREB μπορεί να προσδώσει καρκινικές ιδιότητες σε διάφορους τύπους ιστών και κυττάρων. Επίσης το CREB συμμετέχει σε διαδικασίες επιβίωσης και μετάστασης σε μεγάλο αριθμό καρκινικών κυτταρικών σειρών. Με βάση αυτά μελετήθηκε ο ρόλος του CREB σε κύτταρα καρκίνου του εγκεφάλου, με έμφαση στις περιπτώσεις γλοιοβλαστώματος. Δείξαμε ότι τόσο τα επίπεδα ενεργοποίησης όσο και ο αριθμός των κυττάρων που στα οποία το CREB είναι φωσφορυλιωμένο/ ενεργοποιημένο είναι σημαντικά αυξημένος σε σχέση με δείγματα παρακείμενου μη καρκινικού ιστού. Επιπλέων βρέθηκε πως η αποσιώπηση του CREB σε καρκινικές σειρές γλοιοβλαστώματος, με χρήση μορίων siRNA, επέφερε σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα τους. Τα παραπάνω ευρήματα συσχετίζουν για πρώτη φορά το μεταγραφικό παράγοντα CREB με το γλοιοβλάστωμα και του προσδίδουν ένα αρκετά σημαντικό ρόλο όσο αναφορά την επιβίωση των συγκεκριμένων καρκινικών κυττάρων. / Gliomas are the most common malignant cancers of the nervous system. Unfortunately, they are also amongst the most difficult cancers to treat, resulting in poor patient prognosis. Gliomas exhibit complex cellular and genetic heterogeneity, limiting effective targeted therapy approaches. Discovering the genes and pathways that regulate cancer cells survival and growth will aid in the development of novel and more effective treatments. The Cyclic-AMP Response Element Binding protein (CREB) is a serine/threonine kinase-regulated nuclear factor modulating the transcription of numerous genes in nerve cells and has various roles in neuronal function, ranging from survival and proliferation to more complex brain functions, such as memory and drug addiction behaviours. Given recent findings that aberrant CREB expression can impart oncogenic properties on myeloid cells, liver cells and ovarian epithelial cells, we explored the potential role of CREB in brain cancer biology by examining its expression in a panel of human patient brain tumour specimens. We show that both the level of expression and the number of cells expressing activated/phosphorylated CREB is markedly elevated in tumours compared with adjacent non-tumour control brain tissue. Moreover using siRNA molecules we knocked-down the expression of CREB in glioblastoma cell lines and then we studied the viability of these cells throughout 96 hours with the use of MTT assay. A significant reduction in viability was observed at CREB siRNA transfected cells against the control. These observations are the first to highlight a link between CREB and brain tumours. Our hypothesis is that CREB has a role in brain tumour development/growth and that at least some of CREB's neuro-oncogenic properties are due to its role in neural cells survival and proliferation.

Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας προϋποθέτει τη σωστή διαδοχή των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Σημαντικό μηχανισμό ελέγχου αποτελεί η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, η οποία εξασφαλίζει την πλήρη αντιγραφή του γονιδιώματος μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Η διαδικασία αυτή λαμβάνει χώρα στο τέλος της μίτωσης και κατά τη φάση G1 και περιλαμβάνει τη συγκρότηση των προ-αντιγραφικών συμπλόκων στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Τα σύμπλοκα αυτά απαρτίζονται από τις πρωτεΐνες MCM2-7 οι οποίες έχουν ενεργότητα ελικάσης. Σημαντικό παράγοντα αδειοδότησης αποτελεί η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία συσσωρεύεται κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και απαιτείται για τη στρατολόγηση των ελικασών MCM2-7 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Στα μετάζωα, η πρωτεΐνη Geminin, η οποία εκφράζεται κατά τις φάσεις S, G2 και Μ, αποτελεί αναστολέα του παράγοντα Cdt1 και προσδένεται σε αυτόν παρεμποδίζοντας την αδειοδότηση της αντιγραφής. Αρκετές μελέτες έχουν καταδείξει ότι η εκτοπική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 επάγει την επανέναρξη της αντιγραφής του DNA και τον υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος συμβάλλοντας στην ογκογένεση. Στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας μελετήθηκε η έκφραση του παράγοντα Cdt1 σε κλινικά δείγματα όγκων μαστού. Από την ανάλυση διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 υπερεκφράζεται στατιστικώς σημαντικά στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό, γεγονός που καταδεικνύει την πιθανή αξία του παράγοντα ως διαγνωστικού βιοδείκτη. Επιπλέον, η υπερέκφραση του συγκεκριμένου παράγοντα δείχθηκε ότι συσχετίζεται αντίστροφα με την παρουσία ή μη οιστρογονικών (ER) και προγεστερονικών υποδοχέων (PR). Επίσης, διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και της έκφρασης του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 καθώς και του υποδοχέα HER2/neu. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι ο παράγοντας Cdt1 ενδέχεται να αποτελεί δείκτη άσχημης πρόγνωσης στον όγκο μαστού. Επιπλέον η ανάλυση κατέδειξε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 σε όγκους θετικούς για τον υποδοχέα HER2/neu σε σύγκριση με τα περιστατικά που δεν εξέφραζαν τον υποδοχέα. Δεδομένου ότι στο 95% των περιπτώσεων όγκων μαστού όπου διαπιστώνεται υπερέκφραση του υποδοχέα HER2/neu, αυτή οφείλεται σε ενίσχυση του αντίστοιχου γονιδίου, διερευνήθηκε κατά πόσο η γονιδιακή ενίσχυση θα μπορούσε να αποτελεί λειτουργική επίπτωση της ογκογόνου δράσης του παράγοντα Cdt1 στον όγκο μαστού. Η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης Cdt1 και Cdc6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa και MCF7 είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ανθεκτικών αποικιών στη μεθοτρεξάτη. Έχει δειχθεί ότι η ανθεκτικότητα στο φάρμακο αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στη γονιδιακή ενίσχυση του ενζύμου διυδροφολική αναγωγάση (DHFR). Συνεπώς, είναι πιθανό η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 να συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας μελετήθηκε η κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MCM2-7 με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας. Αρχικά αναπτύχθηκε ένα σύστημα μελέτης το οποίο βασίζεται στις μεθόδους FRAP και FLIP και επιτρέπει τη μελέτη της δυναμικής συμπεριφοράς των πρωτεϊνών MCM και κατ’ επέκταση τη χωροχρονική ποσοτική εκτίμηση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα. Η ανάλυση της κινητικής των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 7. Περίληψη - Abstract - 212 - αποκάλυψε σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την αντίστοιχη του παράγοντα Cdt1, καθώς οι πρωτεΐνες MCM παρουσιάζουν πιο σταθερή αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη. Επίσης, διαπιστώθηκε σταδιακή πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G1, περαιτέρω πρόσδεση μορίων MCM στο τέλος της φάσης αυτής και σταδιακή αποδέσμευση αυτών από τη χρωματίνη καθώς εξελίσσεται η φάση S. Πειράματα FLIP αποκάλυψαν ότι η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη λαμβάνει χώρα σε συγκεκριμένες υποπυρηνικές περιοχές. Οι περιοχές αυτές αυξάνονται σε αριθμό με την πρόοδο της φάσης G1 και ελαττώνονται με την εξέλιξη της φάσης S. Η παρατήρηση των υποπεριοχών αυτών κατά τη φάση S κατέδειξε ότι δεν συμπίπτουν με τις υποδομές της πρωτεΐνης PCNA, γεγονός που υποδεικνύει ότι οι πρωτεΐνες MCM2-7 δεν εντοπίζονται στις περιοχές σύνθεσης του DNA. Επιπλέον, διερευνήθηκε η πιθανή επίδραση της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MCM. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin είχαν ως αποτέλεσμα τη μείωση του δεσμευμένου κλάσματος των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 κατά τη διάρκεια της φάσης G1, καθώς και την αποσταθεροποίηση των ήδη δεσμευμένων μορίων στο τέλος της φάσης αυτής. Επίσης, η απουσία της πρωτεΐνης Geminin είχε ως αποτέλεσμα την αδυναμία των κυττάρων να εισέλθουν στη φάση S. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας καταδείχθηκε η πιθανή αξία του παράγοντα Cdt1 ως διαγνωστικού και προγνωστικού βιοδείκτη στον όγκο μαστού. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 πιθανώς συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης, παρατήρηση που προτείνει ένα νέο μηχανισμό ογκογόνου δράσης του παράγοντα αυτού. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διαπιστώθηκε ότι η κινητική των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 αλλάζει κατά τη διάρκεια των φάσεων G1 και S. Επίσης, η πρωτεΐνη Geminin δείχθηκε ότι απαιτείται για την πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη και για την πρόοδο των κυττάρων από τη φάση G1 στη φάση S, παρατήρηση που καταδεικνύει ένα πιθανό θετικό ρόλο της πρωτεΐνης Geminin στην αντιγραφή του DNA. / Tight regulation of the DNA replication initiation is crucial for the maintenance of genomic integrity. Faithful replication in time and space is ensured by a process called DNA licensing, which takes place in late mitosis and during G1 phase. Licensing involves the stepwise assembly of pre-replicative complexes at origins of replication. These complexes render DNA origins competent to initiate replication. Cdt1 is an essential regulator of DNA licensing that accumulates only in G1 phase of the cell cycle and is required for the recruitment of MCM2-7 helicases onto replication origins. In metazoans, Cdt1 is negatively regulated by a protein called Geminin, which is expressed from S to M phases. Geminin binds to Cdt1 preventing replication licensing. Several lines of evidence suggest that Cdt1 overexpression in cell lines and animals drives rereplication and contributes to genomic instability. In the first part of this thesis, Cdt1 expression levels were analyzed in breast cancer specimens. Cdt1 protein expression was correlated to clinicopathological parameters of the disease, proliferation index and HER2/neu status. Analysis revealed that Cdt1 was statistically significantly overexpressed in the invasive tumor areas compared to adjacent non-neoplastic tissue. Moreover, a significant inverse correlation was established between Cdt1 expression levels and oestrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) status. A significant positive correlation of Cdt1 expression with the proliferation index Ki67 was demonstrated. These observations imply that Cdt1 may constitute a useful prognostic and diagnostic biomarker for breast cancer. Additionally, Cdt1 expression levels were significantly higher in HER2/neu score 3+ tumors (known to show HER2/neu gene amplification by FISH in 95% of cases) compared to HER2/neu negative tumors (known to show HER2/neu gene amplification by FISH in only 0-7% of cases). This observation prompted us to investigate whether gene amplification is a direct consequence of Cdt1 overexperssion. To this end, Cdt1 and Cdc6 were overexpressed in HeLa and MCF7 cell lines. The overexperssion of these licensing factors resulted in the generation of methotrexate resistance colonies. Given that the major cause of resistance to methotrexate is the increased expression levels of the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) due to gene amplification, it is probable that Cdt1 overexpression may lead to this type of genomic instability. In the second part of this thesis, live cell imaging techniques were used to assess dynamics of licensing within the cell nucleus. In particular, we established an in vivo licensing assay, which is based on FRAP and FLIP techniques and permits the investigation of the kinetics of MCM helicases within live human cells. FRAP analysis of GFP-MCM2 and GFP-MCM4 kinetics revealed that MCMs maintain stable association with chromatin during G1 phase in contrast to Cdt1, which exhibits transient interaction with chromatin throughout G1 phase. Moreover it was shown that MCMs are gradually bound to chromatin as G1 phase progresses, being maximally bound in late G1, before the onset of DNA replication and are displaced from chromatin during the course of S phase. Fluorescence-Loss-In-Photobleaching (FLIP) experiments indicated that MCM-chromatin association is not homogenous throughout the nucleus but shows subnuclear concentrations which differ as cells progress through G1 and are adjacent to sites of ongoing DNA synthesis in S phase cells. Moreover, it was shown that Geminin is required for MCM proteins being stably bound to chromatin as well as for proper progression of 7. Περίληψη - Abstract - 214 - cells from G1 to S phase. Taken together our results suggest additional levels of regulation of MCM chromatin association during G1 and S phases. Furthermore, Geminin appears to have a positive regulatory role in DNA replication.

H νουκλεολίνη είναι μια πρωτεΐνη μοριακού βάρους 110 kDa και απαντάται στον πυρήνα, το κυτταρόπλασμα αλλά και στην επιφάνεια των κυττάρων, ενώ υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα και σε ενεργά ενδοθηλιακά κύτταρα. Πρόσφατες έρευνες υποδεικνύουν την συμμετοχή της στις διαδικασίες ανάπτυξης καρκινικών όγκων και στην αγγειογένεση. Στην επιφάνεια του κυττάρου δρα ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας αυξητικών παραγόντων, μορίων κυτταρικής προσκόλλησης (ιντεγκρίνες και σελεκτίνες) λιποπρωτεϊνών και ορισμένων ιών (HIV-1 και coxsackie B). Παρουσιάζει πλήθος λειτουργιών, αλληλεπιδρώντας τόσο με πρωτεΐνες, όσο και με νουκλεϊνικά οξέα. Το HB-19 και το Ν6L είναι συνθετικά πεπτίδια που προσδένονται στην νουκλεολίνη της κυτταρικής επιφάνειας και καταστέλλουν τόσο την ανάπτυξη καρκίνου όσο και την αγγειογένεση. Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήσαμε την βιολογική δράση των πεπτιδίων αυτών και βρέθηκε ότι αναστέλλουν τον in vitro πολλαπλασιασμό και την in vitro προσκόλληση των κυττάρων HUVEC. Τα πεπτίδια αυτά παρουσιάζουν in vivo ογκοκατασταλτική δράση και βρέθηκε να αναστέλλουν την αγγειογένεση στο σύστημα της χοριοαλλαντοϊδικής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας. Επίσης αναστέλλουν τη μετανάστευση των κυττάρων HUVEC στο in vitro σύστημα μελέτης της μετανάστευσης Boyden chamber. Το πεπτίδιο HB-19 αναστέλλει την έκφραση διαφόρων αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων όπως ο FGF, VEGF και των υποδοχέων τους σε επίπεδο mRNA. Το HB-19, όπως και το Ν6L επηρεάζουν την έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης MMP-2 τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο έκφρασης γονιδίου. Επιπλέον, κανένα από τα δύο πεπτίδια δεν προκαλεί απόπτωση in vitro στα κύτταρα HUVEC. Τα πεπτίδια HB-19 και Ν6L δεσμεύονται στη νουκλεολίνη της επιφάνειας του κυττάρου και φαίνεται ότι για την άσκηση των βιολογικών τους δράσεων διαμεσολαβούν οι κινάσες SRC, ERK1/2, AKT και FAK καθώς αναστέλλουν την ενεργοποίησή τους σε κύτταρα HUVEC. Τέλος, μείωση της έκφρασης της νουκλεολίνης με χρήση siRNA επιβεβαίωσε τον ρόλο της νουκλεολίνης στην βιολογική δράση των πεπτιδίων HB-19 και N6L. Συνοψίζοντας τα παραπάνω αποτελέσματα, φαίνεται ότι τόσο το HB-19 όσο και το Ν6L εμφανίζουν βιολογικές δράσεις που τα καθιστούν υποψήφια μόρια για αντινεοπλασματική χρήση. / Nucleolin is a 110 kDa protein, located in the nucleus and the cytoplasm while it is over expressed on the surface of tumor and endothelial cells. Recent studies have demonstrated the involvement of nucleolin in tumor growth and angiogenesis. Thus, this cell surface molecule serves as a receptor for various ligands implicated in pathophysiological processes such as growth factors, cell adhesion molecules (integrins and selectins), laminin-1, lipoproteins and viruses (HIV and coxsackie B). HB-19 and N6L are synthetic peptides that bind cell surface expressed nucleolin and inhibit both tumor growth and angiogenesis. In the present work, we investigated the biological actions of peptides HB-19 and N6L. Our results show that both peptides inhibit the in vivo angiogenesis on the chicken embryo CAM assay and inhibit the in vitro adhesion, proliferation, migration and motility of HUVEC cells. HB-19 peptide inhibits the expression of growth factors FGF and VEGF mRNA as well as the expression of their receptors FGFR1 and FLT-1 respectively. We also found that both enzyme activity and expression of MMP-2 was inhibited by HB-19 and N6L. Furthermore, we found that HB-19 and N6L treatment shows no toxicity in HUVEC cells in vitro. The above biological actions seem to be regulated by SRC, ERK1/2, AKT and FAK kinases as we found that HB-19, as well as N6L, inhibit their activation in HUVEC cells. Finally, down regulation of nucleolin using siRNA confirmed the implication of nucleolin in the biological actions of these peptides. Taken all the above results into account, it is indicated that HB-19 and N6L could constitute an interesting tool for tumor therapy strategy targeting nucleolin.

Η διατριβή αφορά την ανάπτυξη και υλοποίηση ενός τετραδιάστατου, διακριτού μοντέλου προσομοίωσης της συμπεριφοράς καρκινικών κυτταρικών συστημάτων σε ελεύθερη ανάπτυξη και της απόκρισής τους σε χημειοθεραπευτική ή και ακτινοθεραπευτική αγωγή. Υλοποιήθηκαν δύο εκδοχές του μοντέλου: η χωρική και η μη χωρική προσέγγιση. Η χωρική προσέγγιση αναφέρεται στην τετραδιάστατη προσομοίωση συμπαγών όγκων. Η μη χωρική προσέγγιση βρίσκει εφαρμογή στην περίπτωση μη συμπαγών όγκων, καθώς και συμπαγών όγκων, όταν δεν δίνεται έμφαση στη χωρική εξέλιξή τους. Η ερευνητική εργασία έχει επικεντρωθεί σε τρεις τύπους καρκινικών όγκων: καρκίνος του μαστού, καρκίνος του πνεύμονα και πολύμορφο γλοιοβλάστωμα και σε θεραπευτικά σχήματα χορήγησης των σκευασμάτων: επιρουβικίνη (epirubicin), τεμοζολομίδη (temozolomide), σισπλατίνη (cisplatin), γεμσιταμπίνη (gemcitabine), βινορελμπίνη (vinorelbine) και δοσεταξέλη (docetaxel). Σκοπός της εργασίας είναι η ανάπτυξη ενός εργαλείου για την αξιόπιστη υποστήριξη ιατρών στη λήψη αποφάσεων σχετικά με την επιλογή θεραπευτικών σχημάτων και την εξατομικευμένη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής αγωγής. Η αφετηρία είναι η μοντελοποίηση του κυτταρικού κύκλου και των πιθανών μεταβάσεων μεταξύ των καταστάσεων που μπορεί να βρεθεί ένα κύτταρο. Το μοντέλο βασίζεται στην υπόθεση ότι ο καρκινικός όγκος διατηρείται από μια συγκεκριμένη κατηγορία κυττάρων, τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (cancer stem cells), και έχει επεκταθεί ώστε να περιλαμβάνει σε μεγαλύτερη λεπτομέρεια διάφορους βιολογικούς μηχανισμούς σε μοριακό (πχ. εκφράσεις γονιδίων) και κυτταρικό επίπεδο. Ο μηχανισμός δράσης, η φαρμακοκινητική και η φαρμακοδυναμική των θεωρούμενων σκευασμάτων έχουν μελετηθεί βιβλιογραφικά και έχουν ενσωματωθεί στο μοντέλο. Επίσης, το μοντέλο έχει αναπτυχθεί ώστε να λαμβάνει υπόψη του την κλινική εικόνα του ασθενούς με χρήση εξατομικευμένων κλινικών δεδομένων, όπως απεικονιστικά δεδομένα (π.χ. CT, MRI, PET), ιστοπαθολογικά δεδομένα (π.χ. τύπος όγκου, βαθμός διαφοροποίησης) και μοριακά δεδομένα (π.χ. έκφραση γονιδίων). Στα πλαίσια της διατριβής πραγματοποιούνται έλεγχοι αξιοπιστίας και εκτενείς παραμετρικές μελέτες για την αποσαφήνιση της ευαισθησίας του μοντέλου στη διακύμανση των παραμέτρων του τόσο κατά την προσομοίωση της ελεύθερης ανάπτυξης όσο και κατά την εφαρμογή της χημειοθεραπευτικής αγωγής. Η ποσοτική αξιολόγηση, προσαρμογή και βελτιστοποίηση του μοντέλου πραγματοποιείται στα πλαίσια των ευρωπαϊκών ερευνητικών προγραμμάτων ACGT (Advancing Clinicogenomic Trials on Cancer, FP6-2005-IST-026996), ContraCancrum (Clinically Oriented Cancer Multilevel Modelling, FP7-ICT-2007-2-223979) και P-medicine (From data sharing and integration via VPH models to Personalized medicine, FP7-ICT-2009-6-270089) μέσω της αξιοποίησης πραγματικών κλινικών δεδομένων. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της προσαρμογής του μοντέλου σε κλινικά δεδομένα του καρκίνου του μαστού, του καρκίνου του πνεύμονα και του πολύμορφου γλοιοβλαστώματος. Επιπλέον, διάφορες εκδόσεις του μοντέλου έχουν αξιοποιηθεί για ‘την επάνδρωση’ μιας ευρωπαϊκής βάσης μοντέλων για τον καρκίνο, που υλοποιείται στα πλαίσια του ευρωπαϊκού ερευνητικού προγράμματος TUMOR (Transatlantic Tumour Model Repositories, FP7-ICT-2009-5-247754). Το μοντέλο υλοποιείται σε γλώσσα προγραμματισμού C++. / In the present thesis, a clinically oriented, multiscale, discrete simulation model of cancer free growth and response to chemotherapy and/or radiotherapy is presented and investigated. Two versions of the model have been implemented: the spatial and the non spatial approach. The spatial model concerns the spatiotemporal evolution of solid tumours, whereas the non spatial model can be applied in the case of non solid cancers, as well as solid tumours, when no emphasis is put on the spatial features of a tumour evolution. The research work has been focused on the paradigms of early breast cancer treated with the single agent epirubicin, primary lung cancer treated with various combinations of cisplatin, gemcitabine, vinorelbin and docetaxel and glioblastoma multiforme treated with combined modality treatment using radiation and chemotherapy with temozolomide. The goal is to end up with a reliable simulation system able to assist clinicians in selecting the most appropriate therapeutic pattern, extracted from several candidate therapeutic schemes in the context of patient individualized treatment optimization. The model incorporates the biological mechanisms of cell cycling, quiescence, recruitment (reentry into the cell cycle), differentiation and death. It is based on the well documented assumption that tumour sustenance is due to the existence of cancer stem cells, i.e. cells which have the ability to preserve their own population, as well as give birth to cells that follow the path towards terminal differentiation. Furthermore, the mechanism of action, pharmacokinetics and pharmacodynamics of all considered agents have been bibliographically studied and incorporated into the model. Finally, the model has been developed to support and incorporate individualized clinical data such as imaging data (e.g. CT, MRI, PET slices, possibly fused), including the definition of the tumour contour and internal tumour regions (proliferating, necrotic), histopathologic (e.g., type of tumour) and genetic data (e.g., gene expression). An exhaustive and in-depth examination of the model behaviour with respect to the variation of its input parameters has been performed, in order to determine the impact of its parameters, guarantee a biologically relevant virtual tumour behaviour and enlighten aspects of the interplay and possible interdependencies of the biological mechanisms modeled. Finally, the model has been quantitativily validated and adaptated in the framework of the ACGT (Advancing Clinicogenomic Trials on Cancer, FP6-2005-IST-026996), ContraCancrum (Clinically Oriented Cancer Multilevel Modelling, FP7-ICT-2007-2-223979) and P-medicine (From data sharing and integration via VPH models to Personalized medicine, FP7-ICT-2009-6-270089) European Commission-funded projects by exploiting real clinical data. In the present thesis, the clinical adaptation of the model focuses on breast cancer, lung cancer and glioblastoma multiforme clinical cases. Moreover, various versions of the model have been uploaded to the EU cancer model repository developed by the TUMOR (Transatlantic Tumour Model Repositories, FP7-ICT-2009-5-247754) European Commission-funded project. The model has been developed in the C++ programming language.

Εισαγωγή: Ο καρκίνος του λάρυγγα, ιδιαιτέρως σε προχωρημένα στάδια, είναι μία καταστροφική νόσος η οποία χαρακτηρίζεται από αυξημένη διηθητικότητα και μεταστατικότητα. Η ανεύρεση ενός δείκτη πρώιμης διάγνωσης, παρακολούθησης και πρόγνωσης της νόσου θα ήταν ιδιαίτερα ευπρόσδεκτη. Συνεχώς αυξανόμενα δεδομένα στη βιβλιογραφία υποστηρίζουν την προγνωστική αξία των ζελατινασών και τον πιθανό ρόλο τους ως μοριακών δεικτών μεταξύ άλλων και στον καρκίνο του λάρυγγα. Σκοπός: Η διαπίστωση μεταβολών στα επίπεδα ορού των ζελατινασών Α και Β σε ασθενείς με καρκίνο του λάρυγγα μετά από εφαρμογή θεραπείας, καθώς και η πιθανή συσχέτιση με διάφορες κλινικοπαθολογικές παραμέτρους πριν και μετά τη θεραπευτική παρέμβαση. Υλικό και μέθοδος: Σαράντα εννέα ασθενείς και 8 υγιείς μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Ελήφθησαν προεγχειρητικά και μετεγχειρητικά δείγματα ορού τα οποία στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ζυμογραφία ζελατίνης. Η παρουσία ζελατινασών επιβεβαιώθηκε με την τεχνική western blotting. Οι ζώνες λύσης ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση Scion Image PC. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα SPSS 17 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Αποτελέσματα: Στα ζυμογραφήματα αποτυπώθηκαν μόνο οι λανθάνουσες μορφές των ενζύμων (προένζυμα). Τα προ της θεραπείας επίπεδα και των δύο ζελατινασών στον ορό του αίματος των ασθενών με καρκίνο του λάρυγγα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε σχέση με αυτά των υγιών μαρτύρων. Ασθενείς με υπεργλωττιδικό καρκίνωμα και ενεργοί καπνιστές είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα proMMP-2 σε σχέση με ασθενείς που έπασχαν από γλωττιδικό καρκίνωμα και με πρώην καπνιστές αντίστοιχα. Ασθενείς με πρωτοδιαγνωσμένη νόσο και ασθενείς με λεμφαδενικές μεταστάσεις είχαν σημαντικά χαμηλότερα προ της θεραπείας επίπεδα proMMP-9 σε σχέση με ασθενείς που προσήλθαν με υποτροπή και με ασθενείς στους οποίους δεν διαπιστώθηκε επιχώρια νόσος αντίστοιχα. Κατά τη διάρκεια της συστηματικής παρακολούθησης τα επίπεδα της proMMP-2 στον ορό παρουσίασαν σημαντική αύξηση τις πρώτες 10 με 15 ημέρες μετά την εφαρμογή θεραπείας, για να μειωθούν σταδιακά εντός των επόμενων μηνών. Οι ενεργοί καπνιστές παρουσίασαν σημαντική μείωση των επιπέδων της proMMP-2 κατά την περίοδο παρακολούθησης, σε αντίθεση με τους πρώην καπνιστές οι οποίοι εμφάνισαν σημαντική αύξηση κατά το ίδιο χρονικό διάστημα. Οι ασθενείς σταδίου ΙΙ είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα proMMP-2 σε σχέση με ασθενείς προχωρημένων σταδίων πέντε με οκτώ μήνες μετά τη θεραπεία, όπως και οι ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε συντηρητική αντιμετώπιση σε σχέση με τους χειρουργημένους ασθενείς. Τα επίπεδα της proMMP-9 στον ορό επίσης παρουσίασαν σημαντική πτώση μετά την εφαρμογή θεραπείας. Διαφορές στο ρυθμό μείωσης των επιπέδων της proMMP-9 παρατηρήθηκαν μεταξύ των διαφόρων ομάδων ως προς το στάδιο, τη διαφοροποίηση, την εντόπιση, τον τύπο της νόσου (πρωτοδιαγνωσμένη ή υποτροπή), τις λεμφαδενικές μεταστάσεις, τον τρόπο αντιμετώπισης και την κατανάλωση αλκοόλ. Ωστόσο αυτή η διαφορά δεν διατηρήθηκε πέντε με οκτώ μήνες μετά την εφαρμογή θεραπείας, με εξαίρεση την ομάδα των χειρουργημένων ασθενών, οι οποίοι διατήρησαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα ενζύμου στον ορό. Αύξηση των ζελατινασών παρατηρήθηκε στον ορό ασθενών που εκδήλωσαν υποτροπή μετά από αντιμετώπιση πρωτοδιαγνωσμένης νόσου σε σχέση με αυτούς που δεν υποτροπίασαν. Ωστόσο εξαιτίας του μικρού δείγματος δεν είναι δυνατόν να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα. Συμπεράσματα: Αν και δεν υφίστανται φυσιολογικές τιμές, το πρότυπο μεταβολής των επιπέδων της proMMP-9 στον ορό μετά από θεραπεία καταδεικνύει πιθανές ιδιότητες μοριακού δείκτη. Ωστόσο υπάρχουν ενδείξεις ότι και οι δύο ζελατινάσες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την εξατομικευμένη παρακολούθηση ασθενών με καρκίνο του λάρυγγα. Περαιτέρω έρευνα απαιτείται για την αποσαφήνιση του ζητήματος. / Introduction: Laryngeal cancer, especially in the advanced stages, is a highly devastating disease, characterized by increased invasiveness and high rates of metastasis. The identification of reliable tumour marker for prompt diagnosis, surveillance and prognosis would be highly desirable. There is a growing body of evidence with regard to the prognostic value of gelatinases and their possible role as tumour markers. Aim: To identify the pattern of alteration of serum gelatinases A and B in patients with laryngeal cancer following treatment, and a possible correlation with various clinicopathological parameters prior to and past treatment. Materials and methods: Forty nine patients and 8 healthy controls were included in the study. Pre-treatment and post-treatment serum samples were collected and processed by gelatin zymography. The presence of gelatinases was verified by western blotting. The zymograms were scanned by a digital scanner and the lysis bands were quantified by Scion Image PC. Analysis of the quantitative results was performed by using SPSS 17 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Results: Only the latent forms of MMP-2 and -9 (proforms) were identified. Both gelatinases were increased in the serum of laryngeal cancer patients compared to healthy individuals. Patients with supraglottic tumours and active smokers had significantly higher pre-treatment levels of proMMP-2 than patients with glottic tumours and ex-smokers, respectively. Patients with primary disease and patients with lymph node involvement showed lower proMMP-9 pre-treatment levels than patients with recurrence and patients without neck disease, respectively. During the follow-up period the proMMP-2 serum levels increased significantly in the first ten to fifteen days after treatment, gradually decreasing over the following months. Smokers showed a very high decrease rate of proMMP-2 levels during the follow-up period, whereas in ex-smokers proMMP-2 levels significantly increased. Stage II patients showed significantly lower levels of circulating enzyme compared to patients with more advanced disease five to eight months past treatment. Similarly, conservative management was associated with lower levels of serum proMMP-2 compared to surgical management five to eight months following treatment. The proMMP-9 serum levels also showed a gradual decrease after treatment, which was statistically significant. Significant alterations in the rate of decrease developed among groups with regard to stage, grade, location, type of disease (primary or recurrence), regional disease, treatment modality and alcohol consumption. Nevertheless those differences were not maintained five to eight months past treatment, with the exception of patients who underwent surgery and who maintained higher levels of proMMP-9. An increase to the levels of both gelatinases were observed in patients with recurrent disease after having been treated for a primary compared to patients who did not develop a recurrence. However, the small sample of patients with recurrent disease during the follow-up period does not allow extrapolating sound conclusions. Conclusions: Although as yet normal values have not been established in the literature, the post-treatment alteration pattern of proMMP-9 serum levels indicates that this enzyme might play a role as a tumour marker. Nevertheless this study provides evidence that both gelatinases might be useful for surveillance on strictly individual basis in laryngeal cancer patients. Further research is necessary to clarify the contribution of both gelatinases to the disease progress and determine their role as prognostic factors and tumour markers.

Θεωρητικό υπόβαθρο: Το οξειδωτικό στρες (ΟΣ) ορίζεται ως το παθολογικό αποτέλεσμα που προκύπτει από τη διαταραχή της ισορροπίας των κυτταρικών συγκεντρώσεων των οξειδωτικών, δραστικών ενώσεων και των αντιοξειδωτικών μορίων. Εκτός από τη βλάβη που υπόκεινται οι πρωτεΐνες και τα λιπίδια, το ΟΣ μπορεί επίσης να προκαλέσει μεταλλάξεις και επιγενετικές μεταβολές καταστρέφοντας τόσο το DNA όσο και τις πρωτεΐνες που τροποποιούν τη χρωματίνη. Παρ' όλα αυτά, στα θυρεοειδικά θυλακικά κύτταρα παράγονται σε καθημερινή βάση υψηλές ποσότητες υπεροξειδίου του υδρογόνου (H2O2), οξειδωτικής ουσίας απαραίτητης για την πραγματοποίηση της θυρεοειδικής ορμονογένεσης. Δεδομένου ότι ένα ελάχιστο ποσό οξειδωτικού φορτίου αποτελεί προϋπόθεση αφ’ενός για τη φυσιολογική λειτουργία των θυλακικών κυττάρων και αφ’ετέρου για την ανάπτυξη του θυρεοειδούς αδένα, πρόσφατα αποδείχτηκε ότι ο θυρεοειδής αδένας παρουσιάζει αυξημένη αμυντική ανταπόκριση έναντι του ΟΣ. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους τα θυλακικά κύτταρα αντιλαμβάνονται και απαντούν στο ΟΣ παραμένουν ασαφείς. Ο NFE2-related factor 2 (Nrf2), ο οποίος κωδικοποιείται από το γονίδιο NFE2L2, είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας ο οποίος απαντά σε σήματα κυτταρικού στρες και ανταποκρίνεται επιδρώντας στη μεταγραφή γονιδίων σε διάφορους τύπους ιστών. Σε βασικές συνθήκες, ο Nrf2 οδηγείται σε πρωτεασωματική αποικοδόμηση μέσω του κυτταροπλασματικού του αναστολέα, Keap1, ενώ σε συνθήκες ΟΣ, η αποικοδόμηση του Nrf2 δεν είναι δυνατή και ο Nrf2 εισέρχεται στον πυρήνα ώστε να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή αντιοξειδωτικών γονιδίων όπως του γονιδίου Nqo1. Καθώς η οξειδοαναγωγική ομοιοστασία κατέχει κεντρικό ρόλο στην φυσιολογία του θυρεοειδούς αδένα και ο Nrf2 πρόσφατα χαρακτηρίσθηκε ως μεσολαβητής στην αντίσταση θυρεοειδικών καρκινικών κυτταρικών σειρών σε πρωτεασωμικούς αναστολείς, το αντιοξειδωτικό μονοπάτι Nrf2 μπορεί να θεωρηθεί ως εξαιρετικός υποψήφιος της διαμεσολάβησης της απόκρισης του θυρεοειδούς αδένα στο ΟΣ. Παρ 'όλα αυτά, ο ρόλος του μονοπατιού Nrf2 στον ανθρώπινο θυρεοειδικό καρκίνο παραμένει άγνωστος. Στόχος: Στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση της δραστηριότητας του μονοπατιού Νrf2 στο διαφοροποιημένο καρκίνωμα του θυρεοειδούς αδένα και η διερεύνηση σωματικών μεταλλάξεων των γονιδίων NFE2L2 και Keap1. Yλικά και Μέθοδοι Ασθενείς: Στη μελέτη συμμετείχαν 90 περιστατικά εκ των οποίων τα 42 αφορούσαν θηλώδη καρκινώματα (papillary thyroid carcinomas, PTCs), τα 6 θυλακιώδη καρκινώματα (follicular thyroid carcinomas, FTCs) και τα υπόλοιπα 42 καλοήθεις όγκους (24 αδενώματα και 18 οζώδης υπερπλασία). Κυτταρικές σειρές: Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές σειρές PTC (K1, TPC-1, XTC-1), κυτταρική σειρά φτωχά διαφοροποιημένου PTC (T243), κυτταρικές σειρές αδιαφοροποίητου καρκινώματος (C643, 8505C, Hth74) και τέλος κυτταρικές σειρές αναπλαστικού καρκινώματος (T235 , T241, T238). Μέθοδοι: Αναδρομική ανοσοϊστοχημική ανάλυση δειγμάτων PTC και FTC, παρακείμενου φυσιολογικού ιστού και καλοηθών βλαβών. Ανάλυση αλληλουχίας DNA των κυτταρικών σειρών και PTC δειγμάτων. Κύριες μετρήσεις και υπολογισμοί: Αξιολογήθηκε η ένταση της ανοσοαντίδρασης των δειγμάτων των ιστών σε αντισώματα για τα Nrf2, Nqo1, Keap1 και 4-HNE. Μελετήθηκε η αλληλουχία του εξονίου 2 του γονιδίου NFE2L2 καθώς και του γονιδίου Keap1. Αποτελέσματα: O μεταγραφικός παράγοντας Nrf2 καθώς και ο στόχος του, η πρωτεΐνη Nqo1 ήταν μη ανιχνεύσιμα σε φυσιολογικό ιστό θυρεοειδούς αδένα. Τα επίπεδά τους ήταν σημαντικά υψηλότερα στα PTC δείγματα από ό,τι στα δείγματα καλοηθών βλαβών. Η έκφραση του Keap1 εμφάνισε διακύμανση στα δείγματα PTC με τα επίπεδά του να μην εμφανίζουν συσχέτιση με τα αντίστοιχα του Nrf2, ενάντια στη θεωρία πως τα μειωμένα επίπεδα του Κeap1 συνιστούν μηχανισμό ενεργοποίησης του Nrf2. Ο δείκτης ΟΣ, 4-HNE βρέθηκε αυξημένος στη πλειοψηφία των δειγμάτων PTC σε σχέση με το φυσιολογικό ιστό αναδεικνύοντας την ύπαρξη αυξημένου ΟΣ στο PTC. Επιπλέον, όσον αφορά τα δείγματα FTC, ο μεταγραφικός παράγοντας Nrf2 και η πρωτεΐνη Nqo1 ήταν ανιχνεύσιμα σε όλα τα δείγματα, ενώ τα επίπεδα του 4-ΗΝΕ ήταν αυξημένα. Όσον αφορά την ανάλυση αλληλουχίας DNA στις καρκινικές σειρές και σε 11 δείγματα PTC με υψηλή έκφραση Nrf2, καμία μετάλλαξη δεν ανευρέθηκε στο εξόνιο 2 του γονιδίου NFE2L2 και στο γονίδιο Keap1. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα της μελέτης μας σε συνδυασμό με περαιτέρω μελέτες από το εργαστήριο Ενδοκρινολογίας και Ανατομικής του Πανεπιστημίου Πατρών καθώς και από το BC κέντρο έρευνας καρκίνου (Vancouver, Canada) αποδεικνύουν ότι το μονοπάτι Nrf2 ενεργοποιείται σε PTC και κατέχει ρυθμιστικό ρόλο στην αντιοξειδωτική απόκριση και τη βιωσιμότητα των θυρεοειδικών καρκινικών κυττάρων. Συνεπώς, αναδεικνύεται το Nrf2 μονοπάτι ως νέο “σήμα κατατεθέν” του PTC. Παρά το γεγονός ότι δεν ήταν δυνατή η πραγματοποίηση στατιστικών συσχετίσεων στη μελέτη του FTC λόγω του περιορισμένου αριθμού δειγμάτων, το μονοπάτι Nrf2 φαίνεται να ενεργοποιείται επίσης στο FTC. Η σταθερή ενεργοποίηση του Nrf2 στο PTC και ενδεχομένως στο FTC δίνει το έναυσμα για περαιτέρω διερεύνηση του μονοπατιού αυτού σε όλα τα είδη θυρεοειδικού καρκίνου καθώς και της πιθανής διαγνωστικής, προγνωστικής, και/ή θεραπευτικής χρησιμότητας του μονοπατιού στο διαφοροποιημένο καρκίνο του θυρεοειδούς αδένα. / Scientific background: Oxidative stress (ΟS) is experienced by cells when pro-oxidant and electrophilic reactive species overwhelm the cell’s antioxidant and detoxification proteins. In addition to causing protein and lipid damage, oxidative stress can cause mutations and epigenetic perturbation by damaging DNA and proteins that modify chromatin. Nevertheless, in thyrocytes a daily basis high amounts of the oxidant hydrogen hyperoxide (H2O2) was generated due to the fact that H2O2 is a reactive oxygen species required for thyroid hormonogenesis. A minimal oxidative load is a prerequisite for normal thyroid cell function and development and it was recently shown that the thyroid has increased capacity for defending itself against OS. However, precise mechanisms by which thyrocytes sense and respond to OS remain obscure. NFE2-related factor 2 (Nrf2), encoded by NFE2L2 gene, is a transcription factor that integrates cellular stress signals and responds by directing transcriptional program in various tissues. In basal conditions, Nrf2 is targeted for proteasomal degradation by its cytoplasmic inhibitor, Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), while in oxidative stress Nrf2 degradation is abolished and Nrf2 accumulates in the nucleus where it transactivates protective genes such as NAD(P)H dehydrogonase quinone 1 (Nqo1). As redox homeostasis plays a principal role in thyroid gland’s physiology, and Nrf2 has recently been characterised as mediator of thyroid cancer cell lines’ resistance to proteasome inhibitors, the Nrf2 antioxidant pathway seems to be an excellent candidate for mediating the antioxidant response of the thyroid gland. Nevertheless, the activity status of the Nrf2 pathway in human thyroid cancer remains unknown. Objective: The aims of this study were to assess the activity status of the Nrf2 pathway in differentiated thyroid carcinoma and investigate somatic mutations in NFE2L2 and Keap1 genes. Μethods and Materials Patients: The study included 90 individual samples; 42 papillarz thyroid carcinomas (PTCs), 6 follicular thyroid carcinomas (FTCs) and 42 benign lesions (24 adenomas and 18 nodular hyperplasias). Cell lines: Ten thyroid cell lines are used for this study: The PTC cell lines, K1, TPC-1 and XTC-1; the poorly differentiated PTC cell line, T243; the undifferentiated carcinoma cell lines, C643, 8505C and Hth74; and the anaplastic carcinoma cell lines, T235, T241 and T238. Methods: We conducted retrospective immunohistochemical analyses of PTC and FTC specimens, adjacent normal tissue, and benign lesions; DNA sequencing in cell lines and PTC samples. Main Outcome Measures: We assessed the abundance of Nrf2, Nqo1, Keap1, and 4HNE; and the sequence of NFE2L2 gene’s exon 2 and of KEAP1 gene. Results: Nrf2 and its target Nqo1 were undetectable in normal tissue; their levels were significantly higher in PTC than in benign lesions. The Nrf2 inhibitor, Keap1 was variably abundant in PTC, and its levels did not correlate with Nrf2, arguing against decreased levels as the mechanism for Nrf2 activation. The oxidized lipid 4HNE was more abundant in PTC than normal tissue indicating oxidative stress. In addition, as far as FTC samples are concerned, Nrf2 and Nqo1 were detectable in all samples as well as the levels of 4-HNE were significantly high. No mutations were detectable in exon 2 of NFE2L2 gene and in Keap1 gene. Conclusions: Our study’s results supported by further studies in laboratories of Endocrinology and Anatomy at University of Patras and BC Cancer Research Center (Vancouver, Canada) demonstrate that the Nrf2 pathway is commonly activated in PTC and that it regulates antioxidant responses and viability of cancer cells. Thus, Nrf2 is highlighted as a new hallmark of PTC. Although, statistic correlations were not possible in FTC samples’ study because of small sample size, the Nrf2 pathway seems to be also activated in FTC. The high activity of Nrf2 in PTC and possibly in FTC warrants further exploration of this pathway’s potential diagnostic, prognostic, and/or therapeutic utility in differentiated thyroid carcinoma.

Τα υπολογιστικά συστήματα υποβοήθησης ανίχνευσης και διάγνωσης αλλοιώσεων του μαστού έχουν προταθεί στις διάφορες απεικονιστικές τεχνικές «ως δεύτεροι αναγνώστες» με σκοπό να αυξήσουν τη διαγνωστική ακρίβεια του ακτινολόγου και να μειώσουν τη μεταβλητότητα μεταξύ και ενδο-παρατηρητή κατά την ερμηνεία της μαστογραφικής εικόνας. Η αυτόματη διάγνωση των ομάδων μικροαποτιτανώσεων αποτελεί ανοικτό ερευνητικό ζήτημα. Τα προταθέντα συστήματα ψηφιακής υποβοήθησης διάγνωσης ομάδων μικροαποτιτανώσεων ακολουθούν δύο βασικές προσεγγίσεις: (α) ανάλυση μορφολογίας των μεμονωμένων μικροαποτιτανώσεων της ομάδας και (β) ανάλυση υφής των περιοχών ενδιαφέροντος της μαστογραφικής εικόνας που περικλείει την ομάδα μικροαποτιτανώσεων. Τα συστήματα αυτά διατυπώνουν μαθηματικά το κλινικό ερώτημα αξιοποιώντας μεθόδους επεξεργασίας και ανάλυσης εικόνας με σκοπό την ποσοτικοποίηση δομικών και λειτουργικών παραμέτρων του απεικονιζόμενου ιστού. Στην παρούσα εργασία περιγράφονται οι τρέχουσες προσεγγίσεις στην μεθοδολογία ανάπτυξης συστημάτων υποβοήθησης διάγνωσης ομάδων μικροαποτιτανώσεων στην μαστογραφία ακτίνων-Χ. Σκοπός είναι η ανάδειξη των πλεονεκτημάτων, μειονεκτημάτων και προκλήσεων των διαφορετικών προσεγγίσεων της ψηφιακής υποβοήθησης διάγνωσης, η καταγραφή των εξελίξεων και αναδυόμενων μεθόδων καθώς και η διερεύνηση και αποτύπωση των μελλοντικών ερευνητικών βημάτων. / Computer-aided detection and diagnosis schemes have been proposed across breast imaging modalities to improve diagnostic accuracy and reduce inter- and intra-observer variability in image interpretation. Computer-aided diagnosis schemes for microcalcification clusters in mammography are based on morphology analysis of individual microcalcifications and on texture analysis of the depicted breast tissue. The current study reviews major approaches in the development of computer-aided diagnosis schemes for microcalcification clusters in mammography, while recent advances and challenges of each methodological approach are highlighted.

Η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού ακτίνης έχει κρίσιμο ρόλο στη διήθηση και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Οι πρωτεΐνες κοφιλίνη και N-WASP συνδέονται με την ακτίνη και ρυθμίζουν τη δυναμική του κυτταροσκελετού, ενώ η πρωτεΐνη β-παρβίνη εντοπίζεται στις εστιακές συνδέσεις και διαμεσολαβεί τη σηματοδότηση διαμέσου των ιντεγκρινών με επίσης σημαντική επίδραση στον κυτταροσκελετό ακτίνης. Μεταβολή της έκφρασης των παραπάνω πρωτεϊνών έχει παρατηρηθεί σε διάφορα νεοπλάσματα στον άνθρωπο. Η παρούσα μελέτη επιχειρεί να προσδιορίσει το ρόλο τους στον καρκίνο του λάρυγγα. Για αυτό το λόγο μελετήθηκε με ανοσοϊστοχημεία η έκφραση των πρωτεϊνών κοφιλίνη, N-WASP β-παρβίνη σε 72 ιστικά δείγματα ασθενών με πλακώδες καρκίνωμα του λάρυγγα και αξιολογήθηκε η συσχέτιση της έκφρασης τους με κλινικές και παθολογοανατομικές παραμέτρους καθώς και με την επιβίωση. Θετική ανοσοϊστοχημικη έκφραση των πρωτεϊνών κοφιλίνη, N-WASP β-παρβίνη παρατηρήθηκε στο 86,1%, 93,1% και 94,4% των περιπτώσεων καρκινώματος του λάρυγγα αντίστοιχα, σε αντίθεση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό όπου η έκφραση ήταν ασθενής ή απούσα. Η κυταροπλασματική έκφραση της κοφιλίνης έδειξε τάση συσχέτισης με τα προχωρημένα στάδια της νόσου (p=0,063), ενώ η πυρηνική της έκφραση συσχετίστηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (p=0,031) με την προχωρημένη ηλικία (>65 ετών) των ασθενών. Η κυτταροπλασματική έκφραση του N-WASP ήταν μεγαλύτερη στα γλωττιδικά καρκινώματα (p=0,068) και συσχετίστηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό με τα καλά διαφοροποιημένα καρκινώματα (p=0,031). Η κυτταροπλασματική έκφραση της β-παρβίνης συσχετίστηκε σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (p=0,038) με τα προχωρημένα στάδια της νόσου. Παρόλο που οι ασθενείς με υψηλότερη έκφραση του N-WASP εμφάνιζαν καλύτερες επιβιώσεις, δεν επιβεβαιώθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις της έκφρασης των 3 υπό μελέτη πρωτεϊνών με την επιβίωση. Η αυξημένη έκφραση των πρωτεϊνών κοφιλίνη, N-WASP και β-παρβίνη στον καρκίνο του λάρυγγα μπορεί να υποδεικνύει την πιθανή συμμετοχή τους στην παθογένεση της νόσου. Ενώ η υψηλή έκφραση της κοφιλίνης και της β-παρβίνης φάνηκε να ευνοεί την προαγωγή/εξέλιξη του καρκίνου, τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης N-WASP συσχετιστήκαν με ευνοϊκούς προγνωστικούς παράγοντες. / Actin cytoskeleton dynamics are critically implicated in cancer invasion and metastasis. Actin binding proteins cofilin and N-WASP regulate actin filament turnover and the focal adhesion protein β-parvin mediates integrin signaling to actin cytoskeleton. Altered expression of these proteins has been implicated in human malignancies. This study addresses their role in human laryngeal cancer. Protein expression of cofilin, N-WASP and β-parvin were investigated by immunohistochemistry in 72 FFPE samples of human laryngeal squamous cell carcinoma. Correlations with clinicopathological data and survival were evaluated. Positive immunostaining of cofilin, N-WASP and β-parvin were observed in 86.1%, 93,1% and 94,4% cases respectively, in contrast to the weak or absent staining at the non neoplastic adjacent mucosa. Cytoplasmic cofilin immunoreactivity tended to correlate with advanced disease stage (p=0.063), while its nuclear immunoreactivity correlated significantly with advanced (>65 years) patient age (p=0,031). N-WASP immunoreactivity was higher in glottic laryngeal carcinomas (p=0.068) and significantly correlated with low grade tumors (p=0.031). Expression of β-parvin also correlated significantly with advanced disease stage (p= 0.038). Although patients with high N-WASP expression showed higher survival rates no statistical significant correlation between cofilin, N-WASP or β-parvin immunoreactivity and survival was found. Overexpression of cofilin, N-WASP and β-parvin may be implicated in human laryngeal carcinogenesis. While high expression of cofilin and β-parvin seems to favor tumor progression increased levels of N-WASP associated with favorable prognostic factors.