Η Εκλυτική ορμόνη της Ωχρινοτρόπου Ορμόνης των θηλαστικών (GnRH-I ή GnRH) είναι ένα δεκαπεπτίδιο το οποίο εκκρίνεται από τον υποθάλαμο κατά ώσεις. Η GnRH είναι δυνατό να δρα σαν ρυθμιστής διαφόρων συστημάτων τα οποία, για τη λειτουργία τους, απαιτούν την έκκριση της LH και της FSH. Πράγματι, η GnRH και τα ανάλογα της χρησιμοποιούνται εκτεταμένα για τη θεραπεία ενός μεγάλου αριθμού ασθενειών οι οποίες σχετίζονται με τις φυλετικές ορμόνες. Η χρόνια χορήγηση αναλόγων της GnRH προκαλεί απευαισθητοποίηση των υποδοχέων το οποίο οδηγεί στην παύση της έκκρισης γοναδοτροπινών και κατά συνέπεια στην καταστολή της λειτουργίας των ωοθηκών και των όρχεων (chemical castration). Εκτός από την υπόφυση οι υποδοχείς της GnRH εκφράζονται σε αρκετούς φυσιολογικούς και διάφορους καρκινικούς ιστούς, συμπεριλαμβανομένων του μαστού, του ωοθηκών, του ενδομητρίου και του προστάτη. Ο ρόλος της GnRH και των υποδοχέων της σε αυτούς τους εξωϋποθαλαμικούς ιστούς δεν έχει ξεκάθαρος. Ωστόσο, έχει δειχθεί ότι σε διάφορα είδη καρκινικών κυττάρων συμπεριλαμβανομένων και των PC3 και LNCaP τα ανάλογα της GnRH αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό ή οδηγούν σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση). Η lamprey Εκλυτική Ορμόνη της Ωχρινοτρόπου Ορμόνης (lGnRH-III) είναι η τρίτη μορφή της GnRH η οποία έχει απομονωθεί από τα ψάρια του είδους lamprey (το γένος Petromyzon marinus). Αυτό το δεκαπεπτίδιο το οποίο διαφέρει από τη GnRH των ανθρώπων (GnRH-I) στα αμινοξέα των θέσεων 5-8, διεγείρει την απελευθέρωση οιστραδιόλης και της προγεστερόνης στα ενήλικα θηλυκά lamprey αλλά έχει αμελητέα ενδοκρινή δράση στα συστήματα των θηλαστικών. Την τελευταία δεκαετία έχουν δημοσιευτεί στοιχεία τα οποία υποστηρίζουν την απευθείας αντικαρκινική δράση της lGnRH-III. Τα παραπάνω οδηγούν στο χαρακτηρισμό της lGnRH-III ως ένα εξαιρετικό μόριο-οδηγό για την ανάπτυξη αναλόγων της GnRH με αυξημένη και πιθανώς εκλεκτική αντικαρκινική δράση. Οι πιο πρόσφατες αναφορές για απευθείας δράση των αναλόγων της GnRH στην αναστολή του πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων τα οποία παράγουν τη φυσική ορμόνη και εκφράζουν τους υποδοχείς της εγκαινιάζουν ένα νέο πεδίο έρευνας και προσφέρουν νέα ώθηση στο σχεδιασμό και τη σύνθεση νέων αναλόγων της GnRH. Μελέτες οι οποίες διερευνούν τη σχέση δομής-δραστικότητας της GnRH-Ι και ιδιαιτέρως της lGnRH-III και των αναλόγων τους στο εξωϋποθαλαμικό σύστημα είναι περιορισμένες. Η ανάγκη διερεύνησης του πεδίου αυτού θεωρείται μείζονος σημασίας καθώς ο πληθυσμός των καρκινοπαθών αυξάνει συνεχώς και η πάθηση κατατάσσεται μεταξύ των σημαντικότερων πεδίων ερευνητικής μελέτης. Ανάλογα της GnRH χορηγούνται σε ασθενείς με ορμονοεξαρτώμενους όγκους με στόχο την αναστολή των γοναδοτροπινών και την παύση της έκκρισης των φυλετικών ορμονών. Η προσέγγιση του πεδίου με χρήση αναλόγων της GnRH με ενδεχόμενη κυτταροστατική δράση αποτελεί μια σύγχρονη και πολλά υποσχόμενη προοπτική. Από τη άλλη μεριά, ένα από τα μεγαλύτερα προβλήματα το οποίο εμφανίζεται στα φάρμακα πεπτιδικής φύσης είναι η γρήγορη και εκτεταμένη αποικοδόμηση τους από διάφορα ένζυμα. Προκειμένου να βελτιωθεί η βιοδιαθεσιμότητα των αναλόγων της GnRH έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες προσεγγίσεις. Η εισαγωγή N-μεθυλιωμένων-αμινοξέων περιορίζει διαμορφωτικά τον πεπτιδικό σκελετό και χρησιμοποιείται συχνά για την αύξηση της πρωτεολυτικής σταθερότητας των φαρμάκων πεπτιδικής φύσης. Μια πιο ολοκληρωμένη προσέγγιση είναι αυτή η οποία συνδυάζει την σταθερότητα έναντι της ενζυμικής αποικοδόμησης με τη διατήρηση της βιολογικής δράσης. Στόχος της ∆ιατριβής είναι η συμβολή στο πεδίο των σχέσεων δομής-δραστικότητας της GnRH μέσω του ορθολογικού σχεδιασμού, της ανάπτυξης και του ελέγχου νέων συνθετικών αναλόγων της. Συγκεκριμένα, συνθέσαμε δώδεκα νέα ανάλογα τα οποία περιλαμβάνουν διαμορφωτικά περιορισμένα αμινοξέα στις θέσεις 4 και 6 και μελετήσαμε τις δομικές αλλαγές οι οποίες προκύπτουν από τις αλλαγές αυτές με φασματοσκοπία NMR, τη σταθερότητα έναντι της ενζυμικής αποικοδόμησης από την α-χυμοθρυψίνη και τη σουμπτιλισίνη και την δράση τους επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων PC3 και LNCaP. Η NMeSer εισήχθη στη θέση 4 του μορίου αντικαθιστώντας τη Ser και η Gly6 αντικαταστάθηκε από διάφορα D- αμινοξέα (DLys, Nε- τροποποιημένη DLys, Glu, DGlu). Το Ν-τελικό γλυκιναμίδιο έχει επαλειφθεί και στη θέση του έχει γίνει εισαγωγή της αιθυλ-ομάδας (Fujino modification), όπως στο μόριο του Λεουπρολιδίου. Συνθέσαμε επίσης είκοσι δύο νέα ανάλογα της lGnRH-III με τροποποιήσεις σε διάφορες θέσεις του μορίου και μελετήσαμε τη δράση τους επί του πολλαπλασιασμού των PC3 και LNCaP κυττάρων. Η Asp6 της lGnRH-III αντικαταστάθηκε από Asn, Asn(OMe), Glu ή Gln, η Trp3,7 από DTrp ή L/D-Tic, το pGlu1 αντικαταστάθηκε από Glu ή Ac-Glu και η His5 με την Lys8 άλλαξαν μεταξύ τους θέσεις. Επιπλέον, συνθέσαμε και τέσσερα κυκλικά ανάλογα της lGnRH-III καθώς τα κυκλικά πεπτίδια συχνά χαρακτηρίζονται από μεγαλύτερη μεταβολική σταθερότητα και δραστικότητα σε σχέση με τα ευθύγραμμα. Τέλος, μελετήσαμε τη δομή της lGnRH-III με τη χρήση ΝΜR φασματοσκοπίας και τα χαρακτηριστικά της παρουσιάζονται σε σύγκριση με αυτά της GnRH-I. Για τη σύνθεση των αναλόγων της GnRH-I σαν στερεό υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκε η [3-(αιθυλ-Ν-Fmoc-αμινομέθυλ)ινδολ-1- υλ] ακετυλ ΑΜ ρητίνη για την παραλαβή αμιδίων ενώ, για τη σύνθεση της GnRH-I, της lGnRH-III και των αναλόγων της lGnRH-III χρησιμοποιήθηκε η ρητίνη του Sieber χρησιμοποιώντας την Fmoc/tBu μεθοδολογία. Η ενζυμική σταθερότητα των αναλόγων της GnRH-I προσδιορίστηκε έπειτα από επώαση των πεπτιδίων με την α-Chymotrypsin και τη Subtilisin ενώ, η δράση έναντι του κυτταρικού πολλαπλασιασμού της GnRH-I, της lGnRH-III και των αναλόγων τους μελετήθηκε με ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη (PC3 και LNCaP). Το πρωτόκολλο σύνθεσης το οποίο ακολουθήθηκε οδήγησε στην παραλαβή πεπτιδίων σε μεγάλες αποδόσεις και υψηλή καθαρότητα. Η μελέτη της επίδρασης των νέων αναλόγων της GnRH στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη εγκαινιάζει το πεδίο σε επίπεδο σχέσεων δομής-δραστικότητας και συνεισφέρει στην αδιάκοπη έρευνα των δομικών απαιτήσεων των αναλόγων της GnRH προσφέροντας νέες προοπτικές στον σχεδιασμό δραστικών αναλόγων της GnRH. Tέλος, προέκυψαν πεπτιδικά ανάλογα της ορμόνης τα οποία σε σχέση με το Λεουπρολίδιο, το οποίο αποτελεί δραστικό συστατικό φαρμάκων για την αντιμετώπιση των ανωτέρω ασθενειών και με τη lGnRH-III, εμφανίζονται στις βιολογικές δοκιμές στις οποίες εξετάστηκαν δραστικότερα και με αυξημένη πρωτεολυτική σταθερότητα και συνεπώς αποτελούν καλές, υποψήφιες για περαιτέρω βιολογική/κλινική μελέτη, ενώσεις. Σε επίπεδο σχέσεων δομής-δραστικότητας οι τελευταίες είναι δυνατόν να αποτελέσουν τη βάση για τον μελλοντικό σχεδιασμό νέων αναλόγων της GnRH με υψηλή δραστικότητα και ενδεχόμενη φαρμακευτική εφαρμογή. / Mammalian Gonadotropin-releasing hormone (GnRH-I or GnRH) is a neuroendocrine decapeptide secreted from the hypothalamus in a pulsatile manner. Due to its hypophysiotropic actions, GnRH may act as a modulator of the activity of diverse systems that require LH and FSH secretion for their function. Indeed, GnRH and its analogs are used extensively for the treatment of a wide range of hormone-dependent diseases, including steroid-dependent tumors. Chronic administration of GnRH analogs desensitizes GnRH pituitary receptors, results in arrest of gonadotropin secretion, and thereby suppresses ovarian and testicular function (chemical castration). In addition to its pituitary expression, the GnRHR is expressed in several normal tissues and in a number of malignant tumors, including cancers of the breast, ovary, endometrium and prostate. The specific function of GnRH and its receptor in these extrapituitary sites is not entirely clear. However, it was demonstrated that in many cancer cells including PC3 and LNCaP GnRH analogs inhibit cell proliferation or lead to a programmed cell death (apoptosis). Lamprey gonadotropin-releasing hormone III (lGnRH-III) is the third isoform of GnRH isolated from the sea lamprey (Petromyzon marinus). This decapeptide that differs in residues 5–8 from human GnRH (GnRH-I), stimulates the release of estradiol and progesterone in the adult female sea lamprey but has negligible endocrine activity in mammalian systems. In the last decade data concerning the superior direct antitumor activity of sea lamprey lGnRH-III have been published. These observations make lGnRH-III an excellent starting compound for the development for the development of constrained peptide analogs with increased and potentially selective anticancer activity. The direct antiproliferative effect of the GnRH analogs in many malignant tissues inaugurates the field and leads to the design of effective GnRH analogs with new perspectives. Information concerning the impact of systematic single amino acid modifications of GnRH-I and especially of lGnRH-III on malignant cells is still lacking. The structural investigation of this field seems to be a very important issue. On the other hand, one of the main problems of peptide drugs is their fast and extensive degradation by several peptidases. In order to improve the availability of GnRH analogs, various approaches have been adopted. Incorporation of N-methylated amino acids in peptides results in conformational constrained peptide backbones and is commonly used for increasing proteolytic stability of peptide drugs. In the latter approach, stability against proteolysis should be achieved along with preservation or enhancement of biological activity. The aim of this study was the contribution in the field of the structure-activity relationships based in the rational design, development (modern synthesis) and biological characterization of the new analogs of GnRH. Particularly, we synthesized twelve new GnRH-I analogs containing conformationally restricted amino acids in positions 4 and 6, and studied the structural changes imposed by these modifications through NMR spectroscopy, the stability against enzymatic degradation by α-chymotrypsin and subtilisin and their direct antiproliferative effect on prostate cancer cells PC3 and LNCaP. NMeSer was inserted in position 4 of the peptide sequence, replacing Ser4 and Gly6 was substituted by several D- amino acids (DLys, Nε- modified DLys, Glu, DGlu). The synthesized GnRH-I analogs lack the carboxy-terminal Gly10-amide of GnRH-I and an ethylamide residue has been added to Pro9 (Fujino modification), as in Leuprolide structure. We also synthesized twenty two lGnRH-III analogs with modifications in several positions of lGnRH-III and studied their effect on PC3 and LNCaP prostate cancer cell proliferation. Asp6 of lGnRH-III was substituted by Asn, Asn(OMe), Glu or Gln, Trp3,7 by DTrp or L/D-Tic, pGlu1 was replaced by Glu or Ac-Glu and His5 and Lys8 switched places. Cyclopeptides are of great importance both in pharmaceutical and chemical respect. These molecules often exhibit increased biological activity and selectivity. Furthermore, they are more stable in metabolism than the parent linear molecules. Taking into consideration of these potentials we synthesized four cyclic analogs of lGnRH-III as well. The new analogs of GnRH-I were assembled on a [3-((Ethyl-Fmoc-amino)- methyl)-1-indol-1-yl]-acetyl AM resin to provide the peptide amide while, GnRH-I, lGnRH-III and lGnRH-III analogs were assembled on a Sieber Amide resin using Fmoc/tBu methodology. The enzymatic stability of GnRH-I analogs were determined after incubation with α-Chymotrypsin and Subtilisin while the antiproliferative activity of GnRH-I, lGnRH-III and their analogs was performed with human prostate cancer cell lines (PC3 and LNCaP). Modern peptide synthesis afforded us peptides in high yields which could be easily purified. This study provides information which can be used in the design of new GnRH analogs with improved enzymatic stability and high antiproliferative activity on PC3 and LNCaP prostate cancer cell proliferation. This structure-activity relationship study of GnRH analogs contributes to the on-going research for more potent GnRH analogs with prolonged and selective activity.

Η προκλητή δοκιμασία με GHRH + GHRP-6 είναι ένα από τα πιο ισχυρά ερεθίσματα για την έκκριση της GH. Προκειμένου να εκτιμηθεί η διαγνωστική της ικανότητα σε παιδιά με κλασσική ανεπάρκεια GH (Growth Hormone Deficiency, GHD) αλλά και με νευροεκκριτική δυσλειτουργία της GH (GH Neurosecretory Dysfunction, GHND), 35 παιδιά με μέγιστη απάντηση της GH < 10 μg/L μετά από πρόκληση με levo-dopa/κλονιδίνη (GHD), 15 με φυσιολογική απάντηση στις προκλητές εξετάσεις αλλά παθολογική αυτόνομη 24ωρη έκκριση της GH (GHND) και 20 φυσιολογικοί μάρτυρες έλαβαν 1 μg/kg GHRH και GHRP-6 i.v. και η GH μετρήθηκε στο χρόνο -15΄, 0΄, 5΄, 10΄, 15΄, 30΄, 45΄, 60΄. Έξι ασθενείς δεν απάντησαν στην συνδυασμένη προκλητή εξέταση με GHRH και GHRP-6 (μη αποκριτές), με σημαντικά χαμηλότερη μέγιστη τιμή GH: 20.7 μg/L (7.8-31.8) από τους μάρτυρες και τους υπόλοιπους ασθενείς (αποκριτές). Η απάντηση της GH (μg/L) ήταν παρόμοια μεταξύ των προεφηβικών μαρτύρων: 167±88, των προεφηβικών παιδιών με κλασσική ανεπάρκεια: 202±110 και των προεφηβικών παιδιών με νευροεκκριτική δυσλειτουργία της GH: 155±83. Οι εφηβικοί μάρτυρες είχαν υψηλότερη απάντηση: 328±149 από τους εφηβικούς ασθενείς με GHD: 203±105 και GHND: 186±105. Ενώ οι εφηβικοί μάρτυρες είχαν υψηλότερη απάντηση GH από τους προεφηβικούς, οι εφηβικοί και προεφηβικοί ασθενείς και των δύο ομάδων (GHD και GHND) είχαν παρόμοια μέγιστη απάντηση GH. Tα δεδομένα της μελέτης επιβεβαιώνουν ότι ο συνδυασμός GHRH και GHRP-6 είναι ένα ισχυρό ερέθισμα για την έκκριση της GH που μπορεί να κινητοποιήσει τα υποφυσιακά αποθέματα αυξητικής ορμόνης σε παιδιά που παρουσιάζουν τόσο κλινικά, όσο και βιοχημικά χαρακτηριστικά ανεπάρκειας αυξητικής ορμόνης. Πρόκειται για μία ασφαλή και σύντομη δοκιμασία χωρίς ανεπιθύμητες ενέργειες για τα παιδιά, η οποία μπορεί να διακρίνει τους ασθενείς με σημαντική έκπτωση των υποφυσιακών αποθεμάτων αλλά και εκκριτικής ικανότητας της GH, που παρουσιάζουν και την πιο σημαντική ανεπάρκεια στην αύξηση. Είναι πιθανό οι ασθενείς «αποκριτές» να παρουσιάζουν υποθαλαμική δυσλειτουργία στη νευρορύθμιση της έκκρισης της GH και να μπορούν να απαντήσουν θεραπευτικά σε συνθετικά εκλυταγωγά της GH.Κατά συνέπεια, η εξέταση με GHRH+GHRP-6 μπορεί να χρησιμεύσει στην επιλογή ασθενών όχι μόνο με ανεπάρκεια GH αλλά και με άλλες διαταραχές της αύξησης με θεραπευτική ένδειξη τη χορήγηση GH, οι οποίοι θα μπορούσαν να απαντήσουν στη χορήγηση συνθετικών εκλυταγωγών της GH. Περαιτέρω μελέτες χρειάζονται για να απαντήσουν στα πολύ σημαντικά αυτά κλινικά ερωτήματα. / The combined growth hormone-releasing hormone and growth hormone-releasing peptide-6 (GHRH + GHRP-6) test is most potent in evaluating GH secretion. The aim of this research was to assess its capability in children with GH deficiency and low spontaneous GH secretion (GH neurosecretory dysfunction). Thirty-five children with GH <10 ng/ml after levo-dopa/clonidine (GHD), 15 with normal provocative tests but abnormal 24-hour spontaneous GH secretion (GHND), and 20 controls (C) were given 1 μg/kg of GHRH and GHRP-6 i.v. and GH (ng/ml) was measured at -15, 0, 5, 10, 15, 30, 45 and 60 min. Six were non-responders to the combined test, with significantly lower peak GH 20.7 (7.8-31.8) than C and the rest of the patients (responders). Peak GH was similar between prepubertal (PP) controls 167 +/- 88, GHD 202 +/- 110 and GHND 155 +/- 83. Pubertal (P) controls had higher peak GH 328 +/- 149 than P-GHD 203 +/- 105 and P-GHND 186 +/- 105. While P-C had higher peak GH than PP-C, PP and P children had similar responses within the GHD and GHND groups. The GHRH + GHRP-6 test detects children with severe GH insufficiency. Patients with GHD respond similarly to those with GHND, indicating a possible hypothalamic GH neuroregulatory dysfunction in GHD. Responders to the combined test may be eligible for treatment with a synthetic GH secretagogue.

Η Αυξητική ορμόνη παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγεννητική κατά μήκος αύξηση, στη σκελετική ανάπτυξη, στο μεταβολισμό των πρωτεϊνών, των λιπών και των υδατανθράκων, στην οστική ανακύκλωση και την ανοσιακή λειτουργία. Διαταραχή στην έκκριση ή στη δράση της ορμόνης στα παιδιά προκαλεί, μεταξύ άλλων, ανεπάρκεια αύξησης. Έχουν περιγραφεί αρκετές κλινικές οντότητες ανεπάρκειας αύξησης, που οφείλονται κυρίως σε διαταραχές στην υποφυσιακή έκκριση GH, στην 24ωρη αυθόρμητη έκκριση της GH, στον αριθμό ή τη λειτουργία των υποδοχέων GHR, στη μετά τον υποδοχέα μεταβίβαση του σήματος της GH και στη σύνθεση ή δράση του IGF-I. Η παρούσα μελέτη εξέτασε έναν ασθενή με Διαταραχή στη Μεταγωγή του Σήματος της GH (Growth Hormone Transduction Defect/GHTD). Η οντότητα αυτή χαρακτηρίζεται από σοβαρό κοντό ανάστημα με φυσιολογικές δοκιμασίες φαρμακολογικής πρόκλησης, φυσιολογικές τιμές 24ωρης έκκρισης GH, χαμηλά επίπεδα IGF-I, διαταραχή στη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα STAT3 και υπερέκφραση του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου p21. Επιπλέον, οι ασθενείς με GHTD παρουσιάζουν σημαντικά αυξημένα επίπεδα IGF-I μετά από επαγωγή με hGH κατά τo IGF-I generation test και σημαντική αναπλήρωση αύξησης μετά από θεραπεία με hGH. Επίσης, χαρακτηρίζονται από απουσία μεταλλάξεων στην πρωτεΐνη STAT3, στον υποδοχέα GHR και στο γονίδιο GH1. Χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών από ούλα του προς μελέτη ασθενή κι ενός μάρτυρα. Μελετήθηκαν σηματοδοτικά μόρια του μεταγωγικού μονοπατιού της GH και του μονοπατιού αρνητικής ρύθμισης, και διερευνήθηκε ο ρόλος της πρωτεΐνης CIS στην παθολογική μεταβίβαση του σήματος της GH στον ασθενή, καθώς και η επίδραση της καταστολής του γονιδίου CIS στη σηματοδότηση της GH. Επίσης, διερευνήθηκε η πιθανή διασυνομιλία ανάμεσα στα σηματοδοτικά μονοπάτια της GH και του EGF, καθώς και ο ρόλος της διασυνομιλίας αυτής στην αποκατάσταση της φυσιολογικής σηματοδότησης της GH και, κατ’επέκταση, στην κλινική ανταπόκριση μετά από θεραπεία με εξωγενώς χορηγούμενη ανθρώπινη βιοσυνθετική ορμόνη, παιδιών με GHTD. Η πρωτεϊνική έκφραση των μελετηθέντων πρωτεϊνών μελετήθηκε με ανοσοαποτύπωση κατά Western, η κυτταρική εντόπισή τους με ανοσοφθορισμό και η διαντίδραση ορισμένων από τις πρωτεΐνες με ανοσοσυγκατακρήμνιση. Τα ευρήματα της εργασίας στοιχειοθετούν την αρχική υπόθεση ότι η διαταραγμένη μεταβίβαση του σήματος της GH στα παιδιά με GHTD διαμεσολαβείται μέσω της υπερέκφρασης της ουβικουιτινυλιωμένης μορφής της πρωτεΐνης CIS, η οποίθα προκαλεί ραγδαία και εκσεσημασμένη μεταφορά του GHR στο πρωτεάσωμα για αποδόμηση. Τα αποτελέσματα επίσης έδειξαν ότι η αποκατάσταση της φυσιολογικής σηματοδότησης της GH μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS περιλαμβάνει την επαναφορά του GHR στην κυτταροπλασματική μεμβράνη για φυσιολογική ενεργοποίηση από την GH, καθώς και την ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του EGFR. Επιπροσθέτως, υπάρχει έντονη διασυνομιλία μεταξύ των σηματοδοτικών μονοπατιών της GH και του EGF κατά τη χορήγηση εξωγενούς hGH στα παιδιά με GHTD, με αποτέλεσμα την επιτάχυνση της αύξησης που παρατηρείται στα παιδιά αυτά μετά από θεραπεία με hGH. / Growth Hormone (GH) plays an important role in postnatal linear growth, skeletal development, protein, lipid and carbohydrate metabolism, bone turnover and immune function. Defects in the GH secretion and function in children can cause growth retardation. Several clinical entities of growth retardation have been described, including defects in pituitary GH secretion, spontaneous 24h GH secretion, GH receptor number or function, post-receptor signaling and IGF-I synthesis or function. In this study, one patient with Growth Hormone Transduction Defect (GHTD) was studied. GHTD is characterized by severe short stature with normal provoked and spontaneous GH secretion, low IGF-I concentrations, impaired phosphorylation of the transcriptional factor STAT3 and overexpression of the cyclin-dependent kinase inhibitor, p21. Furthermore, GHTD patients have significantly increased IGF-I concentrations after induction with hGH during the IGF-I generation test, and significant ‘catch-up’ growth after hGH therapy. No mutations were found in STAT3, GHR and GH1 gene in the GHTD patients. Primary fibroblast cultures were established from gingival biopsies obtained from the GHTD patient and one control. The GH signaling molecules and the negative regulators of GH were studied, as well as the role of protein CIS in the impaired GH signaling and the effect of CIS silencing on GH signaling. Furthermore, the possible crosstalk between the GH and EGF signaling cascades was examined, as well as its role in the restoration of the impaired GH signaling and the clinical response after therapy with exogenous hGH. The protein expression of the studied molecules was studied by Western Immunoblotting, their cellular localization by Immunofluoresence and the protein-protein interactions by Co-immunoprecipitation. The results of this study support the hypothesis that impaired GH signaling in GHTD children is mediated by the overexpression of ubiquitinated CIS, which causes rapid and excessive translocation of the GHR to the proteasomes for degradation. The results also showed that the restoration of physiological GH signaling after the silencing of CIS involves the restoration of the GHR to the plasma membrane for normal activation by GH, as well as the activation of the EGFR pathway. In addition, there is vigorous crosstalking between the GH and EGF signaling pathways during exogenous hGH treatment in the GHTD children, resulting in the accelerated growth seen in these children after hGH therapy.

Η αυξητική ορμόνη (GH) παίζει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο, καθώς προάγει κυρίως τη μεταγεννητική κατά μήκος αύξηση, και ελέγχει το μεταβολισμό των λιπιδίων και των υδατανθράκων, τη σύνθεση των πρωτεϊνών και τη διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος. Η ανεπάρκεια GH (GHD) διαγιγνώσκεται είτε με παθολογικές συγκεντρώσεις της GH στον ορό μετά από πρόκληση με φαρμακολογικούς παράγοντες που διεγείρουν την έκκριση της (κλασσική GHD), είτε με φυσιολογικές προκλητές δοκιμασίες αλλά παθολογικό 24ωρο εκκριτικό ρυθμό της GH (GH νευροεκκριτική δυσλειτουργία, GHND). Οι GHD και GHND ασθενείς έχουν σοβαρή καθυστέρηση αύξησης και ανταποκρίνονται καλά στην εξωγενή θεραπεία με hGH. Κοντό ανάστημα που σχετίζεται με ανεπάρκεια αυξητικής ορμόνης (GHD) μπορεί να είναι σποραδικού τύπου και ιδιοπαθής, αλλά στο 5-30% των περιπτώσεων υπάρχει προσβεβλημένος πρώτου βαθμού συγγενής, που υποδηλώνει γενετική αιτιολογία. Μεταλλάξεις του γονιδίου της GH (GH1) ευθύνονται για την εκδήλωση οικογενούς μεμονωμένης ανεπάρκειας GH (IGHD). Ο εγγύς υποκινητής του GH1 γονιδίου παρουσιάζει υψηλού βαθμού πολυμορφισμό, με τουλάχιστον 16 αναγνωρισμένους πολυμορφισμούς (SNPs) σε έκταση 535 βάσεων, που εκδηλώνονται σε σύνολο 40 απλότυπων, κάποιοι από τους οποίους επηρεάζουν την έκφραση της GH. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανεύρεση αλλαγών στην αλληλουχία του GH1 γονιδίου της αυξητικής ορμόνης (GH) και του εγγύς υποκινητή του σε ασθενείς με οικογενή μεμονωμένη ανεπάρκεια GH (IGHD), αλλά και η ανάλυση του τρόπου κληρονομικότητας αυτών των αλλαγών. Μελετήθηκαν 33 IGHD ασθενείς (29 GHD και 4 GHND), τα μέλη των οικογενειών τους (22 οικογένειες) και 31 μάρτυρες. Απομονώθηκε γονιδιωματικό DNA από λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος και πραγματοποιήθηκε πολλαπλασιασμός του GH1 γονιδίου και του υποκινητή του με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Τα δείγματα αλληλουχήθηκαν και προσδιορίστηκαν αλλαγές της αλληλουχίας με βάση την NCBI, blast- Μ28466.1-βάση δεδομένων. Στους ασθενείς μετρήθηκαν τα επίπεδα IGF-1, τα επίπεδα των άλλων ορμονών του πρόσθιου λοβού του αδένα της υπόφυσης, η μέγιστη τιμή GH μετά από προκλητές δοκιμασίες με κλονιδίνη και L-Dopa, και στους 4 GHND ασθενείς πραγματοποιήθηκε 24ωρη καταγραφή της αυθόρμητης έκκρισης της GH. Οι πολυμορφισμοί (SNPs) που ανιχνεύθηκαν στο GH1 γονίδιο και τον υποκινητή του σε ασθενείς και μάρτυρες, ελέγχθηκαν για τη συχνότητα των γονοτύπων τους, και συσχετίστηκαν με κλινικοεργαστηριακά χαρακτηριστικά, ενώ ο δυνητικός λειτουργικός ρόλος των μεταλλάξεων ελέγχθηκε με λογισμικά προγράμματα. Η αλληλούχιση του GH1 γονιδίου και του υποκινητή του ανέδειξε 18 γνωστούς από τη βιβλιογραφία SNPs στον υπό μελέτη πληθυσμό και τρεις νέες (novel) μεταλλάξεις στις 3 από τις 22 οικογένειες. Ανάλυση με το λογισμικό πρόγραμμα MatΙinspector των 2 ετερόζυγων σημειακών μεταλλάξεων που εντοπίστηκαν στον GH1 υποκινητή, -485G>C and -400G>A, αποκάλυψε θέση πρόσδεσης για τον μεταγραφικό παράγοντα E-twenty six-1 (ETS-1). Ανάλυση της τρίτης ετερόζυγης μετάλλαξης (G>A) στη θέση +300 του εσωνίου 1 του GH1 γονιδίου με τα λογισμικά ESEfinder3 και ASSP αποκάλυψε τη δημιουργία μιας κρυφής θέση ματίσματος και διάσπαση της περιοχής ματίσματος εξωνίου (ESE) ενός ψευδοεξωνίου, μειώνοντας τον αριθμό προσδενόμενων πρωτεϊνών πλούσιων σε σερίνη-αργινίνη (SR). Η στατιστική ανάλυση των συχνοτήτων των γονοτύπων στους πολυμορφισμούς υψηλής συχνότητας, και η συσχέτιση τους με παραμέτρους που σχετίζονται με την αύξηση, την έκκριση της GH, αλλά και την ανταπόκριση στην hGH αγωγή, έδειξε ότι οι GHD ασθενείς πιθανόν να εμφανίζουν διαφορετική μεταγραφική δραστηριότητα στο GH1 γονίδιο λόγω των θέσεων -278, -57 του υποκινητή, -6 της 5΄ UTR περιοχής και της θέσης +1169 του γονιδίου, που έρχεται σύμφωνο και με άλλες μελέτες, αλλά και της θέσης -31, που αναφέρεται για πρώτη φορά. Αυτοί οι πολυμορφισμοί συσχετίστηκαν με μειωμένα επίπεδα IGF-1. Από την άλλη, οι SNPs που αναγνωρίσθηκαν στους GHND ασθενείς, παρόλο που είναι παρόμοιοι με αυτούς των GHD ασθενών, συσχετίστηκαν με παραμέτρους αύξησης και όχι με τα επίπεδα IGF-1. Οι 18 πολυμορφισμοί και οι 3 μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν στους GHD και GHND ασθενείς φαίνεται να συμβάλουν μερικώς και μεμονωμένα ή συνεργικά στη μεταγραφή του GH1 γονιδίου και συνεπώς στην έκκριση της GH, ενώ η διαφορετική συμμετοχή των SNPs στους GHD και GHND ασθενείς πιθανόν αντανακλά και τη διαφορετική εκδήλωση της νόσου. Η κατανόηση της φαινοτυπικής ποικιλότητας των ασθενών με IGHD και των γενετικών αιτιών μπορεί να βοηθήσει στη κατανόηση των μηχανισμών που ενέχονται στον έλεγχο της αύξησης, αλλά και στη βελτίωση της παρακολούθησης και της θεραπείας των ασθενών. / Growth hormone (GH) plays a pivotal role in a number of physiological processes by promoting postnatal longitudinal body growth, lipid and carbohydrate metabolism, protein biosynthesis and activation of the immune system. GH deficiency (GHD) is diagnosed either by subnormal levels of serum GH during two hGH stimulation tests by pharmacological agents that physiologically stimulate GH secretion (classic form of GHD), or normal serum GH levels, but subnormal 24hr GH profile (Neurosecretory GH deficiency, GHND). Children with GHD and GHND have severe growth retardation and respond to exogenous human GH (hGH) therapy with significant catch-up growth. Short stature associated with isolated GH deficiency (GHD) is both sporadic and idiopathic, but between 5 and 30% have an affected first degree relative consistent with a genetic etiology. Mutations identified on the GH gene (GH1) associate with the manifestation of familial isolated GH deficiency (IGHD). The proximal promoter region of GH1 exerts a highly polymorphic region, with at least 16 single nucleotide polymorphisms (SNPs) identified over a region of 535bp, manifested by a total of 40 haplotypes, some of which affect the GH1 expression. The aim of this study was to identify possible changes in the sequence of the GH1 gene of growth hormone (GH) and its promoter region in patients with familial isolated GH deficiency (IGHD), together with the analysis of the inheritance pattern of such genetic changes. 33 IGHD patients (29 GHD and 4 GHND), their 1st degree relatives (22 families) and 31 controls were investigated. Genomic DNA was extracted from the lymphocytes of the subjects peripheral blood and the GH1 gene was amplified by the Polymerase Chain Reaction (PCR). The samples were sequenced and the changes were identified according to the sequence M28466.1 of the NCBI blast database. The levels of IGF-1 and other hormones of the pituitary were measured in the patients and the highest level of GH during the clonidine and L-Dopa hGH stimulation test were recorded, whereas in the 4 GHND patients a spontaneous 24hr GH profile was conducted. The sequencing results were analyzed for the frequencies of the genotypes of the identified SNPs and for any possible correlations with the clinical or biochemical characteristics of the patients and the controls. Additionally, the possible functional role of the found mutations was assessed using specific programs. The sequencing of GH1 and its promoter revealed 18 SNPs in the whole sample and 3 novel mutations in 3 of the 22 investigated families. Analysis with MatInspector of the 2 heterozygous nucleotide mutations located at the promoter regions -485GC and -400GA, respectively, revealed a binding sequence for the transcription factor E-twenty six-1 (ETS-1). Analysis of the third heterozygous mutation (GA) at the +300 region of intron 1 with ESEfinder3 και ASSP revealed a cryptic splicing position and disruption of the exon splicing enhancement (ESE) region by reducing the binding affinity of serine-arginine proteins (SRs). The frequency and correlation analysis showed that the GHD patients possible exert differential transcriptional activity at the GH1 gene via the SNPs at positions -278, -57 of the promoter, -6 of 5΄ UTR region, +1169 of intron 4, which is in accordance to previous studies, and also the newly reported SNP at -31 region. These SNPs associated also with decreased IGF-1 levels. On the other hand, the SNPs identified in the GHND patients, although similar to the GHD patients, correlated with several growth parameters, irrespective to the IGF-1 levels. The 18 SNPs and 3 mutations identified in the sample seem to contribute partially and individually or in synergy to the transcriptional regulation of GH1 in the GHD and GHND patients. The SNPs contribution is differentially exerted in the GHD patients, when compared to the GHND patients and this possibly reflects the different expression of the disease. The investigation of phenotypic variance in IGHD patients and their genetic predisposition can potentially improve our perception of the underlying mechanisms of growth and offer valuable information for the better therapeutic management of IGHD patients.