- / -

- / -

- / -

Στόχος: Ο υποδοχέας του γλουταμινικού οξέος ΝMDA (N-methyl-D-aspartate), αποτελεί μόριο-κλειδί που διαμεσολαβεί πολλούς τύπους συναπτικής πλαστικότητας στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Στο οπτικό σύστημα η πλαστικότητα ξεκινά στο επίπεδο του αμφιβληστοειδούς χιτώνα. Κατά την ανάπτυξη του αμφιβληστροειδούς οι υποδοχείς NMDA συμμετέχουν σε φαινόμενα πλαστικότητας εξαρτώμενα από την εμπειρία όπως ο λειτουργικός διαχωρισμός των ON και OFF μονοπατιών. Η ανάπτυξη και η οπτική αποστέρηση επηρεάζουν επίσης τις ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες των υποδοχέων NMDA στον αμφιβληστροειδή του επίμυος καθώς και την έκφραση των υπομονάδων του NR1 και NR2. Η βασική υπομονάδα NR1 υφίσταται εναλλακτικό μάτισμα με αποτέλεσμα να εμφανίζεται σε οκτώ διαφορετικές ισομορφές που προσδίδουν μοριακή ποικιλότητα στον υποδοχέα. Το ερώτημα που ετέθη ήταν εάν η έκφραση των ισομορφών της υπομονάδας NR1 ρυθμίζεται κατά την ανάπτυξη του αμφιβληστροειδούς χιτώνα του επίμυος και εάν μεταβάλλεται από την οπτική εμπειρία. Μέθοδος: Χρησιμοποιήθηκαν αμφιβληστροειδείς επίμυων (Wistar) που μεγάλωσαν είτε σε φυσιολογικό ημερήσιο κύκλο 12 ώρες φως/12 ώρες σκοτάδι [normal-reared (NR)], είτε σε διαρκές σκοτάδι [dark-reared (DR)] από την 9η έως την 60η ημέρα μετά τη γέννηση. Η μελέτη της έκφρασης των ισομορφών του αμινοτελικού (NR1a, NR1b) και του καρβοξυτελικού (NR1-1, NR1-2, NR1-3, NR1-4) άκρου της υπομονάδας NR1 έγινε με τη μέθοδο της real-time PCR. Αποτελέσματα: Το αναπτυξιακό προφίλ όλων των ισομορφών εμφάνισε διαφορετική αύξηση κατά τη διάρκεια της δεύτερης και τρίτης εβδομάδας, με μέγιστη έκφραση στο τέλος της τρίτης εβδομάδας. Μεταξύ των ισομορφών του αμινοτελικού άκρου, η NR1b εκφραζόταν σταθερά σε υψηλότερα επίπεδα σε σχέση με την NR1a, ενώ μεταξύ των ισομορφών του καρβοξυτελικού άκρου, η NR1-2 εκφραζόταν σε υψηλότερα επίπεδα από την NR1-4, ενώ τόσο η NR1-1 όσο και η NR1-3 εκφράζονταν σε χαμηλά επίπεδα. Η ανάπτυξη στο σκοτάδι μείωσε την έκφραση όλων των ισομορφών σε πολλά αναπτυξιακά στάδια και στο ενήλικο ζώο. Σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ ηλικίας και οπτικής εμπειρίας προέκυψε για τις ισομορφές NR1a, NR1-2 και NR1-4. Συμπεράσματα: Η έκφραση όλων των ισομορφών της υπομονάδας NR1 μεταβάλλεται κατά την ανάπτυξη του αμφιβληστροειδούς του επίμυος, ενώ ορισμένες (NR1a, NR1-2 and NR1-4) ρυθμίζονται τόσο από την ηλικία όσο και από την οπτική εμπειρία. Τέτοιες μεταβολές μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο σε φαινόμενα πλαστικότητας που λαμβάνουν χώρα στον αμφιβληστροειδή χιτώνα. / Purpose: The N-methyl-D-aspartate (NMDA) type of glutamate ionotropic receptor is a key molecule mediating plasticity related processes in the central nervous system. Visual system plasticity begins in the retina. During postnatal retinal development NMDA receptor has been shown to be involved in experience dependent plasticity such as the functional segregation of ON and OFF pathways. Development and visual deprivation have been found to affect the kinetics of NMDA receptor in rat retina and the expression of its main subunits NR1 and NR2. The NR1 fundamental subunit of NMDA receptor exists in eight distinct splice isoforms. Knowing that alternative splicing of the NR1 subunit offers a further molecular diversity to the receptor, we have addressed the question of whether the alternative splicing of NR1 subunit of the NMDA receptor is regulated during postnatal retinal development and whether this regulation is altered by visual experience. Methods: Retinas were dissected from eyes of Wistar rats raised either in normal 12-hour light/12-hour dark cycle [normal-reared (NR)], or in complete darkness [dark-reared (DR)] at postnatal days 9 to 60. Real-time PCR was performed in order to assess the mRNA expression of NR1 isoforms using oligonucleotide primers specific for N- terminal (NR1a, NR1b) and C-terminal splice variants (NR1-1, NR1-2, NR1-3, NR1-4). Results: The developmental profiles of mRNA expression levels of both N- and C-terminal NR1 isoforms showed differential increases during the second and third postnatal weeks, while their expression peaked at the end of the third week. Among N-terminal isoforms NR1b was constantly expressed at higher levels compared to NR1a and among the C-terminal isoforms, NR1-2 was expressed at higher levels than NR1-4, while both NR1-1 and NR1-3 were expressed at low levels. Dark-rearing led to reductions in both N- and C-terminal NR1 variants in several developmental ages and in adult retina. A significant age and experience interaction was observed at NR1a N-terminal isoform, and at the most abundant C-terminal isoforms NR1-2 and NR1-4. Conclusions: Our results have demonstrated that all NR1 splice isoforms are developmentally regulated in rat retina and some of them (NR1a, NR1-2 and NR1-4) are also bidirectionally regulated by age and visual experience. Such changes may play an important role in the plastic and activity-dependent events taking place in retina.

Σκοπός της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας είναι η ανάπτυξη συγκεκριμένης μεθοδολογίας και αλγορίθμων ψηφιακής επεξεργασίας εικόνων για την αυτόματη εκτίμηση των διαμέτρων αγγείων σε οφθαλμολογικές εικόνες. Η συγκεκριμένη μέτρηση της διαμέτρου των αγγείων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην έγκαιρη διάγνωση παθήσεων καθώς έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει συσχετισμός μεταξύ των μεταβολών των τιμών των εν λόγω διαμέτρων και της εμφάνισης αλλοιώσεων στον αμφιβληστροειδή. Στα πλαίσια της εργασίας, υλοποιήθηκαν δύο μεθοδολογίες για τον υπολογισμό των διαμέτρων αγγείων οφθαλμολογικών εικόνων, οι οποίες συλλέγονται με χρήση κάμερας πυθμένα (fundus camera). Η πρώτη μεθοδολογία στηρίζεται στην εύρεση των σημείων που αποτελούν τους κεντρικούς άξονες των υπό εξέταση αγγείων με χρήση διαφορικού λογισμού. Ακολούθως, σε κάθε σημείο που ανήκει σε κεντρικό άξονα αγγείου, υπολογίζονται οι παράμετροι μιας συνάρτησης. Η εν λόγω συνάρτηση περιγράφει βέλτιστα τα επίπεδα φωτεινότητας της εικόνας κατά μήκος του ευθύγραμμου τμήματος που διέρχεται από το σημείο και είναι κάθετο στο αγγείο. H εύρεση των παραμέτρων της συνάρτησης πραγματοποιείται με χρήση τεχνικών βελτιστοποίησης. Το τελικό βήμα της μεθοδολογίας είναι η εκτίμηση της διαμέτρου των αγγείων από τις τιμές των παραμέτρων που έχουν υπολογιστεί. Η δεύτερη μεθοδολογία στηρίζεται στον αλγόριθμο που προτείνει ο P.H. Gregson. Αρχικά, πραγματοποιείται κατάτμηση της εικόνας με κατωφλίωση και εφαρμόζονται μορφολογικοί τελεστές συστολής και διαστολής στην εικόνα. Στη συνέχεια, εφαρμόζεται ο αλγόριθμος λέπτυνσης (thinning algorithm) με σκοπό την εύρεση των κεντρικών αξόνων των αγγείων και τέλος εκτιμάται η διάμετρος σε κάθε σημείο του κεντρικού άξονα με χρήση των επιπέδων του γκρίζου των εικονοστοιχείων που κείνται στην ευθεία που είναι κάθετη στο αγγείο σε κάθε σημείο του. / The scope of this Thesis is the development of a methodology and advance image processing techniques in order to automatically estimate vessel diameters in ophthalmological images. Motivation for the thesis is the fact that the measurement of vessel diameter plays significant role in the seasonable diagnosis of vascular disorders, as it is believed to be a relation between the variation in diameters and the detection of retinal disorders. In this thesis, two methodologies are developed in order to be applied in ophthalmological images that are collected by using a fundus camera. The first methodology is based on the detection of the pixels that constitute the centerlines of vessels, by using differential calculus. Specifically, at each pixel that belongs to a centerline of vessel, the parameters of a specific function are calculated. This function describes as accurately as possible the intensity levels along the segment that passes through the specific pixel and is perpendicular to the vessel. The parameters of this function are estimated using optimization techniques. The final step of the methodology is the assessment of the diameters of vessels using the values of the parameters. The second methodology is based on the algorithm that P.H.Gregson has proposed. At first, the vessels are detected by tresholding and a morphological closing algorithm is applied. Then, a thinning algorithm is used in order to detect the pixels that constitute the centerlines of the vessels and ultimately the diameter at each pixel of the centerlines is assessed using the gray levels of the pixels that constitute the segment that is perpendicular to the vessel at each specific pixel.

Η οπτική συνεκτική τομογραφία με τη χρήση συχνοτήτων ( FD-OCT) είναι μια ενδαγγειακή απεικονιστική μέθοδος που χρησιμοποιεί εγγύς στο υπέρυθρο φως, για να παράγει υψηλής ανάλυσης εικόνες του τοιχώματος του αυλού του αγγείου. Όπως και στην τεχνολογία υπερήχων, εκπέμπεται φωτεινή ενέργεια η οποία ανακλάται και εξασθενεί, σύμφωνα με την υφή του προσπιπτομένου ιστού. Το OCT μπορεί να απεικονίσει, με ανάλυση από 10 έως 20 μm, μικροδομές του αγγειακού τοιχώματος με εξαίσια λεπτομέρεια. Μέχρι σήμερα, η δυνατότητα εφαρμογής της μεθόδου είχε περιοριστεί σε μικρές αρτηρίες διαμέτρου έως 4mm και δεν είχε εφαρμοστεί in vivo στα αγγεία των κάτω άκρων, κάτωθεν του επιπέδου των βουβώνων. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να αναφερθεί για παγκοσμίως πρώτη φορά η ασφάλεια και η σκοπιμότητα της απεικόνισης με Οπτική Συνεκτική Τομογραφία του αρτηριακού άξονα των κάτω άκρων , κάτωθεν του επιπέδου της βουβώνας ( μηροϊγνυακός άξονας και κνημιαία αγγεία), καθώς και οι σχετιζόμενες με το FD-OCT επιπλοκές. Επιπρόσθετα, να διερευνηθούν για πρώτη φορά, με τη χρήση FD-OCT, τα χαρακτηριστικά του αγγειακού τοιχώματος του ανωτέρω άξονα (τόσο πριν όσο και μετά από αγγειοπλαστική ή/και τοποθέτηση stent), η μορφολογία της αθηρωματικής πλάκας, η μορφολογία και η ποσοτικοποίηση της υπερπλασίας του νέου εσωτερικού χιτώνα (neointima) εντός του stent, η επαναστένωση εντός του stent (ISR) και η κακή εναπόθεση (malapposition) των stent struts σε μια σειρά από ασθενείς που πάσχουν από περιφερική αρτηριοπάθεια (PAD). Μελετήθηκαν, με ποσοτική ανάλυση του αυλού τους (Quantitative vascular analysis), αρτηρίες με διάμετρο έως 7 χιλιοστά. Μικτά χαρακτηριστικά από περιοχές πλούσιες σε λιπίδια, εναποθέσεις ασβεστίου και ασβεστοποιημένες πλάκες, νεκρωτικές περιοχές και ίνωση εντοπίστηκαν σε όλες τις απεικονιζόμενες αθηροσκληρωτικές βλάβες. Ωστόσο, με βάση το επικρατέστερο από τα παραπάνω απεικονιστικά χαρακτηριστικά, οι βλάβες στο πλαίσιο της έρευνας ταξινομήθηκαν ως αμιγώς ινωτικές, ως ινοασβεστοποιημένες, ως πλούσιες σε λιπίδια και τέλος ως νεκρωτικές/ασβεστοποιημένες. Συσσώρευση των μακροφάγων εντός της αθηρωματικής πλάκας σημειώθηκε σε μικρό ποσοστό των de novo αθηρωματικών αλλοιώσεων. Ποικίλοι βαθμοί υπερπλασίας του νέου έσω χιτώνα απεικονίσθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις ISR αλλοιώσεων, με καθαρά ινωτικά χαρακτηριστικά και σημαντική νεοαγγείωση σε κάποιες από αυτές. Η νεοαγγείωση συνέπεσε με το επίπεδο της μέγιστης στένωσης του αγγειακού αυλού. Σημαντικού βαθμού διαχωρισμός με μεγάλο περιορισμό του αγγειακού αυλού, τέτοιος ώστε να απαιτηθεί να τοποθετηθεί ενδοαυλικό stent, ανιχνεύθηκε σε αρκετές περιπτώσεις της de novo αθηρωμάτωσης. Η ψηφιακή αφαιρετική αγγειογραφία παρέλειψε να προσδιορίσει μεγάλο ποσοστό των σοβαρών διαχωρισμών μετά από αγγειοπλαστική. Η νεοαθηροσκλήρυνση εντός του νέου έσω χιτώνα των κνημιαίων φαρμακευτικών stents (DES), είναι ένα συχνό εύρημα τόσο στους συμπτωματικούς όσο και στους ασυμπτωματικούς ασθενείς. Μπορούμε να υποθέσουμε ότι, κατά αναλογία με τα εμφυτευμένα DES στα στεφανιαία αγγεία, η ελαττωματική ενδοθηλιοποίηση που προκαλείται από την εκλυόμενη φαρμακευτική ουσία, μαζί με την νεοαγγείωση που αναπτύσσεται μεταξύ των stent struts, μπορούν να υποδαυλίσουν την νεοαθηροσκλήρυνση εντός του νέου έσω χιτώνα των κνημιαίων DES, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε επαναστένωση εντός του stent (ISR) και απώλεια του εμβαδού του αυλού των περιφερικών αρτηριών. Οι παρατηρήσεις της μελέτης αυτής θέτουν σε αμφισβήτηση το παραδοσιακό τρόπο κατανόησης της περιφερειακής επαναστένωσης εντός του stent ως μιας απλής υπερπολλαπλασιαστικής απάντησης στο βαρότραυμα. Η απεικόνιση με FD-OCT είναι ένα βέλτιστο πειραματικό εργαλείο για την αξιολόγηση της εξέλιξης της αθηροσκληρωματικής νόσου και την επαναστένωση του αγγείου. Μπορεί να παρέχει υψηλής ευκρίνειας ενδοαγγειακή απεικόνιση κατά τη διάρκεια αγγειοπλαστικών επεμβάσεων στα κάτω άκρα και θα μπορούσε να αποδειχθεί κλινικά χρήσιμο για τον προσδιορισμό της εντός του stent πρόπτωσης ιστού και του strut malapposition. Παρ 'όλα αυτά, δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για τη συνήθη κλινική πρακτική μέχρι να προκύψουν στοιχεία από περαιτέρω κλινικές δοκιμές για τον καθορισμό των ειδικών ενδείξεων της απεικόνισης με FD-OCT στις περιφερικές αρτηρίες. / Optical coherence tomography (OCT) is a catheter-based imaging method that employs near-infrared light to produce high-resolution intravascular images. OCT can readily visualize vessel microstructure at a 10- to 20-μm resolution with exquisite detail. To date, however, applicability of the method has been limited to small diameter arteries (≤4 mm). To the best of the author’s knowledge, this study is the first worldwide that demonstrates the safety and clinical feasibility of frequency domain Optical Coherence Tomography (FD-OCT) imaging of infrainguinal vessels in vivo during infrainguinal angioplasty procedures. It is also the first study that reports the use of intravascular FD-OCT to detect and characterize in-stent neointimal tissue following infrapopliteal drug eluting stent (DES) placement in patients suffering from critical limb ischemia. Quantitative lumen analysis of arteries with diameter up to 7 mm was performed. High-resolution OCT images provided exquisite two-dimensional axial and longitudinal views of the infrainguinal arteries and allowed thorough investigation of a variety of angioplasty sequela, including and not limited to intimal tears and dissection flaps, white and red thrombus, stent mesh malapposition, and intrastent plaque prolapse. Of interest, OCT identified cases of suboptimal postangioplasty outcome that single-plane subtraction angiography did not recognize and accounted. Mixed features of lipid pool areas, calcium deposits and calcified plaques, necrotic areas, and fibrosis were identified in all of the imaged atherosclerotic lesions. However, based on the predominant baseline imaging findings, lesions under investigation were classified as purely fibrotic, fibrocalcific, mostly lipid-laden and necrotic/calcified. Intraplaque accumulation of macrophages was noted in some of de novo atheromatic lesions. Varying degrees of neointimal hyperplasia were demonstrated in all cases of in stent restenosis (ISR) lesions with purely fibrotic features and considerable neovascularization in some of them. The latter finding coincided with the level of maximum vessel stenosis in all cases. Neoatherosclerosis following infrapopliteal DES placement is a frequent finding in both symptomatic and asymptomatic patients. Our preliminary observations allow us to speculate that analogous to coronary implanted DES, defective endothelialization induced by the eluted drug, along with neovascularization developing between the stent struts, may incite neointimal neoatherosclerosis, which may result in ISR and lumen loss of the peripheral arteries. It also seems that infrapopliteal neoatherosclerosis may be a significant contributing factor for ISR rather than a minor and sporadic process, highlighting the clinical significance of the phenomenon. Our observations put in dispute the traditional way of understanding peripheral in-stent restenosis as a simple hyperproliferative response to barotraumas and may explain the paramount importance of aggressive risk factor modification strategies. Neointimal neoatherosclerosis as identified by FD-OCT may have a role in the development of below-the-knee restenosis and thus warrants further investigation by larger controlled studies. Moreover, it may prove clinically useful for the determination of intrastent tissue prolapse and strut malapposition. FD-OCT should not be utilized as a tool for routine clinical practice until evidence from further clinical trials emerge to determine the specific indications for OCT imaging of the peripheral arteries.