Η έρευνα για τα καρδιαγγειακά νοσήματα έχει εστιάσει την προσοχή της σε νέους ελάχιστα επεμβατικούς τρόπους επαναιμάτωσης, όπως είναι η θεραπευτική αγγειογένεση, η οποία αποτελεί μία νέα δυναμική θεραπευτική μέθοδο που επάγει τη δημιουργία νέων αιμοφόρων αγγείων σε ασθενείς με στεφανιαία νόσο. Η θρομβίνη, εκτός από τον κεντρικό της ρόλο στον καταρράκτη της πήξης του αίματος, ασκεί ένα ευρύ φάσμα δράσεων στα κύτταρα του ενδοθηλίου και μπορεί να συμβάλλει στη ρύθμιση πολλών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης. Αρχικά ο σκοπός της συγκεκριμένης ερευνητικής δουλειάς ήταν να ταυτοποιηθεί ένα πειραματικό μοντέλο διαδερμικής πρόκλησης οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου σε κόνικλους με εφαρμογή επεμβατικών ακτινολογικών τεχνικών υπό ακτινοσκοπική καθοδήγηση, καθώς και σύγκριση αυτής με την κλασσική χειρουργική τεχνική απολίνωσης της στεφανίαιας αρτηρίας. Η ανωτέρω μεθοδολογία επιτρέπει μέσω διωτιαίας προσπέλασης τον μη χειρουργικό υπερεκλεκτικό καθετηριασμό των στεφανιαίων αγγείων και την πρόκληση μυοκαρδιακού εμφράκτου με τοποθέτηση ειδικού σπειράματος (coil) στον πρόσθιο κατιόντα κλάδο. Ο εμβολισμός στη θέση αυτή φαίνεται ότι προκαλεί οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου, που αναγνωρίζεται όχι μόνο ηλεκτροκαρδιογραφικά και ιστολογικά, αλλά και αιμοδυναμικά, ενζυμικά και απεικονιστικά. Με την διωτιαία διαδερμική μυοκαρδιακή ισχαιμία μπορεί να αποφευχθεί η θωρακοτομή, περικαρδιακή τομή και άλλες τοπικές και συστηματικές ανεπιθύμητες ενέργειες μίας μείζονος χειρουργικής επέμβασης και μπορεί να επιτευχθεί ως εκ τούτου ένα πιο φυσιολογικό μοντέλο μυοκαρδιακής ισχαιμίας, χωρίς να παρατηρείται στατιστικά σημαντική διαφορά στα βιοχημικά, υπερηχογραφικά και ιστολογικα δεδομένα σε σχέση με το κλασσικό χειρουργικό μοντέλο. Επόμενος σκοπός της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η πρόκληση αγγειογένεσης σε ίσχαιμο μυοκάρδιο με τη χρήση θρομβίνης, η οποία αποτελεί έναν αποδεδειγμένο ενεργοποιητή της αγγειογένεσης σε άλλα όργανα–στόχους και της οποίας η αγγειογενετική δράση δεν έχει μελετηθεί στο μυοκάρδιο. Μελετήσαμε αρχικώς τις αγγειογενετικές ιδιότητες της θρομβίνης μετά από ενδομυοκαρδιακή χορήγηση, σε ένα μοντέλο οξέος εμφράγματος κονίκλου και δείξαμε για πρώτη φορά ότι η εξωγενής χορήγηση θρομβίνης ενισχύει το σχηματισμό νέων λειτουργικών και σταθερών παράπλευρων αγγειακών δικτύων και αποκαθιστά την αιματική άρδευση του ίσχαιμου μυοκαρδίου, καθώς μια στατιστικά σημαντική αύξηση στην πυκνότητα των αγγείων στην μεταβατική ζώνη, όπως εκτιμήθηκε με την CD31 ανοσοϊστοχημεία, παρατηρήθηκε στην ομάδα χορήγησης θρομβίνης σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η βελτίωση της μυοκαρδιακής αιμάτωσης συνοδεύονταν από βελτίωση της καρδιακής λειτουργίας, όπως εκφράζονταν από την στατιστικά σημαντική μείωση της LVEDP την ημέρα της ευθανασίας σε σύγκριση με τις αυξημένες μετεμφραγματικές τιμές αυτής στην ομάδα θρομβίνης. Μετέπειτα, μελετήσαμε την αγγειογενετική δράση της θρομβίνης σε μοντέλο χρόνιας ισχαιμίας μυοκαρδίου σε κονίκλους. Παρατηρήθηκε ότι μία ενδοπερικαρδιακή χορήγηση προάγει την ανάπτυξη παράπλευρου μυοκαρδιακού δικτύου και συμβάλλει στην αποκατάσταση της καρδιακής λειτουργίας. Επομένως η παρούσα μελέτη παρέχει τα πρώτα επιστημονικά δεδομένα για την αγγειογενετκή δράση της θρομβίνης σε ισχαιμικό μυοκάρδιο. Η ανάδειξη της θετικής αγγειογενετικής δράσης της θρομβίνης σε ίσχαιμο μυοκάρδιο, καθιστά την εξωγενή χορήγηση της μια πιθανή νέα θεραπευτική επιλογή σε ασθενείς με στεφανιαία νόσο. / Therapeutic angiogenesis is based on the premise that the development of new blood vessels can be augmented by exogenous administration of the appropriate growth factors and is a rapidly evolving field of modern research in the cardiovascular system. Since a variety of angiogenic factors have been tested with inconsistent so far clinical results, the challenge remains in identifying the factor that will stimulate functional neovascularization. Thrombin is a potent activator of angiogenesis, apart from its central role in blood coagulation. The aim of the present study was to establish a closed-chest, solely percutaneous, minimally invasive technique in order to induce experimental myocardial infarction by employing interventional catheterization techniques and involving fluoroscopy-guided percutaneous transauricular intra-arterial access, superselective catheterization of the left coronary artery of the rabbit heart and distal coronary embolization with a micro-coil. This model of percutaneous transauricular myocardial ischemia in the rabbit was compared with the gold standard of experimental myocardial infarction as induced by coronary ligation with a plain suture. The presented model avoids major surgery and thoracotomy and may be an equally reliable and reproducible platform for the experimental study of myocardial ischemia, with a pathophysiology similar to human pathology without statistically significant difference in troponin increase, LVEDP measurement and histopathologic results in comparison with surgical model. The next aim of this study was to investigate the angiogenic action of thrombin in a rabbit model of ischemic myocardium, as it is proven activator of angiogenesis in other target tissues. Firstly, we investigated the effects of direct intramyocardial administration of thrombin and the ability to induce vessel growth in a rabbit model of myocardial ischemia. It enhanced the angiogenic response to ischemia with a significant increase of regional collateralization, as a statistically significant increase in the vascular density at the infarct border zone, as evaluated by CD31 immunohistochemistry, was observed in the thrombin treated group compared to the control group. These benefits were accompanied by improvements in cardiac function in the ischemic territory as the thrombin treated animals also showed a statistically significant reduction in LVEDP values on the day of euthanasia compared to the postinfarct day. Afterwards, we examined the angiogenic action of thrombin in a model of chronic myocardial ischemia. A single intrapericardial administration of thrombin seems to promote the development of mature functional blood vessels and improve cardiac function. This is the first study investigating, in our knowledge, the angiogenic action of thrombin in ischemic myocardium. These results provide new insights in understanding the involvement of thrombin in vascular formation and point to a novel role of thrombin in angiogenesis. The present investigation raises the possibility that such an intervention might eventually be applied clinically for achieving optimal therapeutic angiogenesis

Η Πακλιταξέλη αποτελεί ένα από τα πιο ευρέως διαδεδομένα χημειοθεραπευτικά φάρμακα και ενδείκνυται κυρίως σε καρκίνο του πνεύμονα, του μαστού, των ωοθηκών, καθώς και σε σάρκωμα Kaposi ασθενών με AIDS. Ωστόσο, η χρήση της συνδέεται με αρκετές παρενέργειες, γεγονός που επέβαλε την τροποποίησή της σε Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης (DDS). Τα συγκεκριμένα συστήματα επιτρέπουν την εκλεκτική μεταφορά του φαρμάκου στον καρκινικό ιστό με μηχανισμούς παθητικής ή ενεργητικής στόχευσης, καθώς και τον έλεγχο του φαρμακοκινητικού προφίλ. Ιδιαίτερα ελπιδοφόρα φαίνεται να είναι η ενσωμάτωση της PTX σε πολυμερικές νανοκάψουλες. Η δομή πυρήνα - κελύφους των νανοκαψακίων καλύπτει τη χορήγηση μίας μεγάλης ποικιλίας ενεργών συστατικών, με το ενδιαφέρον να εστιάζεται σε αντινεοπλασματικά, αντιφλεγμονώδη, αντιικά και ανοσοκατασταλτικά. Η εισαγωγή των φαρμάκων στα νανοκαψάκια μπορεί να οδηγεί σε αύξηση της αποτελεσματικότητας και σταθερότητας των δραστικών ουσιών, καλύτερη in vivo συμπεριφορά και υψηλότερη ενδοκυτταρική πρόσληψη. Ορισμένες μελέτες προτείνουν την εγκαψακίωση νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) σε συστήματα χορήγησης φαρμάκων, τα οποία έχουν αποδειχθεί πολύτιμα εργαλεία τόσο στον τομέα της διάγνωσης (μαγνητική τομογραφία πυρηνικού συντονισμού), όσο και της θεραπείας. Με εφαρμογή εξωτερικού εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου καθίσταται εφικτή η συσσώρευση των μαγνητικών νανοφορέων στον ιστό - στόχο (μαγνητική στόχευση), ενώ η θεραπεία επέρχεται μέσω επαγωγής μαγνητικής υπερθερμίας. Η εν λόγω μεταπτυχιακή διατριβή πραγματεύεται την εγκαψακίωση της ΡΤΧ και των SPIONs σε πολυμερικές νανοκάψουλες, παρασκευασμένες από το συμπολυμερές πολυ(γαλακτικού οξέος) – πολυ(αιθυλενογλυκόλης) (PLA-PEG). Το PLA αποτελεί ένα βιοαποικοδομήσιμο πολυμερές, το οποίο δημιουργεί έναν πυρήνα, ικανό να εγκαψακιώσει και να προστατέψει υδρόφοβες ουσίες. Από την άλλη μεριά, το PEG είναι ένα υδρόφιλο, βιοσυμβατό πολυμερές, το οποίο προσδίδει στερεοχημική σταθεροποίηση στα συστήματα και παρατείνει το χρόνο κυκλοφορίας τους. Πιο συγκεκριμένα, παρασκευάστηκαν μαγνητικά νανοκαψάκια με συμπολυμερή PLA-PEG, διαφορετικού μοριακού βάρους, με τη μέθοδο της καθίζησης (nanoprecipitation). Οι μαγνητικοί νανοκρυσταλλίτες συντέθηκαν με την τεχνική της θερμικής αποικοδόμησης, ενώ ως πρόδρομη ένωση χρησιμοποιήθηκε ελαϊκός σίδηρος [Fe(Olate)3]. Διερευνήθηκαν διάφορες παράμετροι σχετικά με την σύνθεση (ποσότητα SPIONs, αναλογία πολυμερούς/ελαίου, ποσότητα φαρμάκου), έτσι ώστε να δημιουργηθούν βέλτιστοι νανοφορείς. Επιπλέον, εξετάστηκε η σταθερότητα των διασπορών τόσο στο χρόνο, όσο και στην παρουσία ηλεκτρολυτών (NaCl) με μέτρηση της υδροδυναμικής διαμέτρου και του επιφανειακού φορτίου, χρησιμοποιώντας την τεχνική της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Ακολούθησε μορφολογική εκτίμηση των νανοκαψακίων με τη βοήθεια ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διάδοσης (ΤΕΜ) και δομικός χαρακτηρισμός τους μέσω φασματοσκοπίας FTIR. Σε επόμενο στάδιο, μετρήθηκε το ποσοστό φόρτωσης της ΡΤΧ με χρήση υγρής χρωματογραφίας (HPLC) και πραγματοποιήθηκαν μελέτες αποδέσμευσης, παρουσία και μη εξωτερικού εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου, σε διάλυμα φωσφορικών (pH =7.4) στους 37 oC για 24 h. Τέλος, εξετάστηκε η κυτταροτοξικότητα των «φορτωμένων» (με ΡΤΧ) μαγνητικών νανοκαψακίων και συγκρίθηκε με εκείνη των «κενών» νανοφορέων, αλλά και του φαρμάκου. Ο έλεγχος αυτός πραγματοποιήθηκε με χρώση καρκινικών κυττάρων (σειρά Α549) από ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) και μέτρηση του φθορισμού των νεκρών κυττάρων από κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα ήταν ιδιαιτέρως ικανοποιητικά, καθώς οι νανοφορείς παρουσιάζουν σταθερότητα στο χρόνο (έλεγχος περιόδου ενός μηνός), αλλά και παρουσία ηλεκτρολυτών. Το ποσοστό φόρτωσης της ΡΤΧ υπολογίστηκε ~1.2 %, ενώ η απόδοση εγκαψακίωσης κυμαινόταν από 15 - 25 %. Επίσης, παρουσίασαν υψηλή απόδοση εγκαψακίωσης SPIONs (~65 %), εξαρτώμενη από την πολυμερική σύνθεση των νανοφορέων. Οι μελέτες απελευθέρωσης παρουσίασαν παρατεταμένη αποδέσμευση της πακλιταξέλης, η οποία αποκρίνεται σε παρουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Τέλος, τα «κενά» (χωρίς φάρμακο) μαγνητικά νανοκαψάκια δεν παρουσίασαν κυτταροτοξικότητα, σε αντίθεση με τα «φορτωμένα» με φάρμακο, τα οποία προκάλεσαν μεγαλύτερη τοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα και από το ελεύθερο φάρμακο. Τα παραπάνω αποτελέσματα δικαιολογούν την περαιτέρω διερεύνηση της πιθανής χρησιμοποίησης των PLA-PEG μαγνητικών νανοκαψακίων ως φορείς στοχευμένης χορήγησης της Πακλιταξέλης. / Paclitaxel is one of the most widely used chemotherapeutic drugs and is particularly suitable to lung, breast, ovarian cancer and AIDS - related Kaposi sarcoma. However, its use is associated with several side effects, certain of them attributable to the formulation used clinically today, which imposed its formulation in Targetable Drug Delivery Systems (TDDS). These systems allow selective delivery of drug in the tumor tissue by passive or active targeting mechanisms and control of the pharmacokinetic profile. Particularly promising appears to be the encapsulation of PTX in polymeric nanocapsules. The core - shell structure of the nanocapsules covers the delivery of a wide variety of active ingredients, with interest focused on anti-neoplastic, anti-inflammatory, antiviral and immunosuppressive. The nanoencapsulation of drugs can increase the efficiency and the stability of active substances, while allowing better in vivo behavior and higher intracellular uptake. Some studies suggest the encapsulation of iron oxide nanoparticles (SPIONs) in such systems, which have been proven valuable tools in both diagnosis (through nuclear magnetic resonance imaging) and therapy. The application of an external alternating magnetic field permits the accumulation of magnetic nanocarrier in target-tissue (magnetic targeting), while the treatment occurs by inducing magnetic hyperthermia. This thesis discusses the encapsulation of PTX and SPIONs in polymeric nanocapsules, prepared from biocompatible poly (lactic acid) - poly (ethylene glycol) (PLA-PEG) copolymers. The PLA is a biodegradable polymer, which generates a core capable to encapsulate and protect hydrophobic substances. On the other hand, the PEG is a hydrophilic, biocompatible polymer, which gives steric stabilization systems and prolong their circulation time after intravenous administration. Specifically, magnetic nanocapsules were synthesized with varying molecular weight of copolymers PLA-PEG through the nanoprecipitation method, while the magnetic nanoparticles were composed through thermal decomposition and oleate iron [Fe (Olate) 3] was used as a precursor. The optimum parameters were determined, conferring to the nanocapsules high stability. In addition, they were characterized with regard to their size and zeta potential at different salt concentrations (up to 2M NaCl) using dynamic light scattering (DLS). Then, the morphological characteristics of nanocapsules were evaluated by transmission electron microscopy (TEM) and their structural characterization by spectroscopy FTIR. In the next step, the Paclitaxel loading was determined with liquid chromatography (HPLC) and release studies were conducted in phosphate buffer (pH = 7.4) at 37 oC for 24 h, including triggered drug-release by application of AC magnetic field. Finally, the cytotoxicity of drug-loaded (with PTX) magnetic nanocapsules was tested and compared to that of blank (without drug) nanocarriers and free drug. For these studies the cancer cell line A549 was used and after their incubation with the nanocapsules or the free drug, the dead cells were stained by propidium iodide (PI) and measured by flow cytometry. The obtained results were particularly satisfactory, as nanocarriers show stability over time (up to one month) and at high salt concentrations, much higher than the physiologic one. The loading of PTX was measured to be 1.2%, for a theoretical loading of 1.9 %, and the yield of encapsulation ranged from 15-25%. The nanocapsules also showed high encapsulation efficiency for SPIONs (~ 65%), depending on the polymeric composition of nanocarriers. Drug release studies showed that the nanocapsules exhibited controlled release properties. Furthermore, the release appeared to respond to the presence of external magnetic field. Finally, the «blank» magnetic nanocapsules did not exhibit cytotoxicity, whereas the «loaded» nanocarriers caused higher toxicity than the free drug. These results justify further investigation of the PLA-PEG magnetic nanocapsules as drug delivery systems of Paclitaxel.

Η σισπλατίνη αποτελεί ένας ευρέως διαδεδομένο αντικαρκινικό φάρμακο. Ωστόσο προκαλεί σοβαρές παρενέργειες εξαιτίας της έλλειψης εκλεκτικότητας που παρουσιάζει. Για αυτόν το λόγο, γίνεται προσπάθεια ενκαψακίωσης της σισπλατίνης σε νανοφορείς ώστε να επιτευχθεί η εκλεκτική μεταφορά της στον καρκινικό ιστό με μηχανισμούς παθητικής ή ενεργητικής στόχευσης. Στην παρούσα εργασία, παρασκευάστηκαν μαγνητικοί νανοφορείς σισπλατίνας και ελέγχθησαν οι ιδιότητες φόρτωσης με σισπλατίνη και αποδέσμευσης, η κολλοειδής σταθερότητα και η in vitro αντικαρκινική δραστικότητα. Τα νανοσωματίδια (οι μαγνητικοί νανοφορείς) συντέθηκαν με τη σύνδεση του συμπολυμερούς πολυμεθακρυλικό οξύ – πολυαιθυλενογλυκόλη (poly(methacrylic acid)-graft-poly(ethyleneglycol methacrylate)) σε μαγνητικούς νανοκρυσταλλίτες. Ενώ το πολυμεθακρυλικό οξύ παρέχει τις απαραίτητες καρβοξυλομάδες στο σύστημα για τη σύνδεση της σισπλατίνης, οι αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης προσφέρουν στερεοχημική σταθεροποίηση στα νανοσωματίδια. Αρχικά παρασκευάστηκαν μαγνητικοί νανοφορείς με διαφορετικούς τύπους p(MAA-g-EGMA) συμπολυμερών τα οποία διέφεραν ως προς το μήκος και την πυκνότητα των αλυσίδων PEG. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο της υδρολυτικής, αλκαλικής καταβύθισης από μία πρόδρομη ένωση δισθενούς σιδήρου παρουσία των παραπάνω συμπολυμερών. Οι νανοφορείς σε επόμενο στάδιο φορτώθηκαν με τη σισπλατίνη μετά από επώαση τους με το φάρμακο. Επιπλέον διερευνήθηκε η επίδραση του pH στην φόρτωση της σισπλατίνης. Οι νανοφορείς χαρακτηρίστηκαν ως προς την υδροδυναμική τους διάμετρο και το επιφανειακό τους φορτίο μέσω της τεχνικής της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) και μικροηλεκτροφόρησης αντίστοιχα. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες αποδέσμευσης του φαρμάκου από τους νανοφορείς σε διάλυμα φωσφορικών (pH=7.4) στους 37°C. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε η επίδραση της εφαρμογής εξωτερικού εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου (400 kHz) στην αποδέσμευση της σισπλατίνης από τους νανοφορείς μέσω της πρόκλησης υπερθερμίας. Τέλος, εκτιμήθηκε η κυτταροτοξικότητα των φορτωμένων με σισπλατίνη νανοφορέων και συγκρίθηκε με την κυτταροτοξικότητα των κενών νανοσωματίδιων και του φαρμάκου. Ο έλεγχος κυτταροτοξικότητας πραγματοποιήθηκε μέσω της τεχνικής της κυτταρομετρίας ροής, μετά από χρώση των κυττάρων (Α549, καρκινικά κύτταρα πνεύμονα) με τη χρωστική του ιωδιούχου προπιδίου (PI). Οι p(MAA-g-EGMA) μαγνητικοί φορείς σισπλατίνης που παρασκευάστηκαν στην παρούσα εργασία παρουσίασαν μεγάλη σταθερότητα στο χρόνο ως προς την υδροδυναμική τους διάμετρο και το επιφανειακό τους φορτίο. Επιπλέον παρουσίασαν ικανοποιητική φόρτωση φαρμάκου (6-8%). Η αύξηση του pH (μέχρι 10), η αύξηση των ανιονικών θέσεων (καρβοξυλομάδες) και η μείωση του PEG βρέθηκε να οδηγούν σε αύξηση της φόρτωσης της σισπλατίνης στους νανοφορείς. Παρατηρήθηκε παρατεταμένη αποδέσμευση του φαρμάκου (σισπλατίνης) από τους νανοφορείς, με τον ρυθμό αποδέσμευσης να επηρεάζεται από την πολυμερική σύνθεση των νανοφορέων. Τέλος, οι νανοφορείς παρουσίασαν χαμηλή κυτταροτοξικότητα ενώ οι νανοφορείς φορτωμένοι με σισπλατίνη παρουσίασαν τοξικότητα συγκρίσιμη με αυτήν του φαρμάκου. Με βάση τα ληφθέντα αποτελέσματα, οι p(MAA-g-EGMA) μαγνητικοί νανοφορείς σισπλατίνης έχουν ικανοποιητικές ιδιότητες κολλοειδούς σταθερότητας, φόρτωσης σε φάρμακο και αποδέσμευσης, γεγονός που δικαιολογεί την περαιτέρω διερεύνηση της πιθανής χρησιμοποίησης τους ως φορείς στοχευμένης χορήγησης σισπλατίνας. / Cisplatin is a potent anticacer agent. However, it exhibits serious side effects due to lack of selectivity. Therefore, a more selective cisplatin delivery to tumors is pursued by incorporating cisplatin in targetable nanocarriers. In this work, hybrid magnetic nano-asssemblies loaded with ciplatin were prepared and evaluated in vitro. The nano-assemblies were synthesized through grafting of poly(methacrylic acid)-graft-poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(MAA-g-EGMA) on magnetite nanocrystallites. Poly(ethylene glycol) chains confer to the nanocarriers bio-repellent properties. The formation of a distinct second inner polymeric corona with an abundance of carboxylate groups provides the binding sites for cisplatin molecules. Different types of p(MAA-g-EGMA) copolymers with varying length and density of PEG chains were synthesized. Core-shell magnetic nano-assemblies were prepared by hydrolytic alkaline precipitation from a single ferrous molecular precursor in the presence of the above p(MAA-g-EGMA) copolymers . The nano-assemblies were loaded with cisplatin by incubating them with cisplatin solutions of different cisplatin concentration. The nano-assemblies were characterized with regard to their size and zeta potential at different salt concentrations using dynamic light scattering (DLS). The effect of pH on cisplatin loading was investigated. Drug release studies were performed spectrophotometrically in phosphate buffered saline (pH 7.4) at 37°C. The influence of applying an AC magnetic field on the release profile of cisplatin was also investigated using a home-made AC (400 kHz) magnetic field generator 5 mT. The cytotoxicity of blank and cisplatin-loaded nano-assemblies against A549 human lung cancer cell line was assessed by flow cytometric measurement of cellular fluorescence after staining with propidium iodide (PI). The nanocarriers had suitable size properties for intravenous administration and accumulation to tumors based on the enhanced permeability and retention phenomenon (EPR effect). They also were found to exhibit very good colloidal stability, satisfactory cisplatin loading efficiency (around 6% w/w at optimum experimental conditions) and sustained drug release properties, with the rate of release to be significantly increased in response to external AC magnetic fields. Furthermore, the blank nanocarriers did not exhibit cytotoxicity whereas the cisplatin-loaded nanocarriers exhibited comparable to the free ciplatin cytotoxicity against A549 cancer cells. The obtained results justify further evaluation of p(MAA-g-EGMA) nanocarriers as targeted drug delivery system of cisplatin.

Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η χρήση ελαστικών λιποσωμάτων στη διαδερμική χορήγηση υδατοδιαλυτών ουσιών και πραγματοποιήθηκαν επίσης μελέτες προ-μορφοποίησης αντιϋπερτασικών βιοδραστικών ενώσεων για διαδερμική χορήγηση. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν μελέτες της φυσιολογίας του δέρματος με τεχνικές μικροσκοπίας και μέτρησης της απώλειας ύδατος μέσω της επιδερμίδας (TEWL) με σκοπό να διαπιστωθεί η λειτουργία του φραγμού της κεράτινης στοιβάδας, καθώς και η ορθότητα χρήσης των σχετικών τεχνικών προετοιμασίας των δειγμάτων δέρματος που χρησιμοποιήθηκαν. Η οπτική μικροσκοπία ειδικά μας έδωσε πληροφορίες ως προς τη δομή της επιδερμίδας και ως προς τον πιθανό μηχανισμό μεταφοράς ουσιών μέσω της χρήσης λιποσωμάτων. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη και σύγκριση των διαφόρων φυσικοχημικών χαρακτηριστικών ελαστικών λιποσωμάτων που μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως πρώτοι δείκτες για πρόγνωση της διαδερμικής απορρόφησης (in vivo) των υδρόφιλων βιοδραστικών ενώσεων. Ως μοντέλα υδρόφιλων βιοδραστικών ενώσεων χρησιμοποιήθηκαν οι φθορίζουσες χρωστικές καλσεΐνη και καρβοξυφλουορεσκεΐνη. Όλες οι λιποσωμικές διασπορές (τόσο τα συμβατικά λιποσώματα-CLs, όσο και τα ελαστικά λιποσώματα τύπου transfersome-TRs και τύπου invasomes-INVs) χαρακτηρίστηκαν ως προς τα εξής φυσικοχημικά χαρακτηριστικά: Την κατανομή μεγέθους, το ζ-δυναμικό, το σφαιρικό σχήμα και τη μορφολογία τους, την ικανότητα εγκλωβισμού υδρόφιλων ουσιών, τη σταθερότητά τους (ως προς τα μορφολογικά χαρακτηριστικά, τη διασπορά μεγέθους και το φορτίο επιφανείας, και τη συγκράτηση της εγκλωβισμένης σε αυτά ουσίας) σε σχέση με το χρόνο, την ελαστικότητα και τέλος ως προς τη δυνατότητα διαπέρασης εγκλωβισμένων σε αυτές υδρόφιλων ουσιών μέσω ανθρώπινου δέρματος in vitro. Το μέγεθος των λιποσωμάτων ήταν παρόμοιο και αρκετά ομοιογενές, ενώ η προσθήκη διαφορετικών τύπων ενισχυτικών διαπέρασης στα ελαστικά λιποσώματα, στα συνήθη εύρη συγκεντρώσεων που χρησιμοποιούνται, δεν επηρεάζει καθόλου το επιφανειακό φορτίο των παραχθέντων λιποσωμάτων. Αύξηση του μεγέθους και αστάθεια ως προς τη συγκράτηση της εγκλωβισμένης ουσίας παρατηρήθηκε στην περίπτωση προσθήκης μεγαλύτερης ποσότητας ενισχυτικού διαπέρασης, η οποία αλλάζει και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των λιποσωμάτων. Τα TRs που περιείχαν χολικό νάτριο ήταν πιο ελαστικά από τα αντίστοιχα με Tween 80, τα οποία είχαν συγκριτικά χαμηλές τιμές ελαστικότητας (<40mg/s∙cm2). Οι υψηλότερες τιμές ελαστικότητας από όλους τους τύπους ελαστικών λιποσωμάτων που παρασκευάστηκαν στα πλαίσια αυτής της διατριβής, παρατηρήθηκε στην περίπτωση των INVs με 1% w/w PE και 1% w/w LIM. Επιπλέον, τα περισσότερα λιποσώματα τύπου INVs είχαν υψηλότερες τιμές ελαστικότητας σε σχέση με τα αντίστοιχα χωρίς τερπένια (INVs αναφοράς), εκτός από την περίπτωση των INVs με citral και cineol, όπου η ελαστικότητα σημείωσε μείωση σε σχέση με τα INVs χωρίς τερπένια. Οι διάφοροι τύποι λιποσωμάτων φαίνεται να μεταβάλλουν τη διαπέραση της χρωστικής με την εξής σειρά: Διάλυμα<CLs<TRs<<INVs. H διαπερατότητα (permeability), η ροή (flux) και ο λόγος προσαύξησης (ER) δείχνουν ότι τα συμβατικά λιποσώματα αύξησαν ελάχιστα τη ροή της καλσεΐνης, ενώ τα TRs και INVs κατά 1.8 και 7.2 φορές, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν το γεγονός ότι τα συμβατικά λιποσώματα είναι ανεπαρκή συστήματα μεταφοράς υδρόφιλων μορίων μέσω του δέρματος, ενώ παράλληλα δείχνουν ότι τα ελαστικά λιποσώματα με τη μεγαλύτερη τιμή ελαστικότητας είναι πιο αποτελεσματικά στη μεταφορά της ουσίας μέσω του δέρματος. Σε επόμενα πειράματα μελετήθηκε η δυνατότητα διείσδυσης τόσο υδρόφιλων όσο και λιπόφιλων μορίων στις στοιβάδες του δέρματος, σε μια προσπάθεια να διερευνηθεί ο μηχανισμός αύξησης της διαδερμικής διαπέρασης των υδρόφιλων χρωστικών από τους διάφορους τύπους ελαστικών λιποσωμάτων. Ως μοντέλο υδρόφιλης ουσίας χρησιμοποιήθηκε η φθορίζουσα χρωστική καλσεΐνη, ενώ η λιπιδική ροδαμίνη χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο λιπόφιλης ουσίας (που δεν φεύγει από τα λιποσώματα και ουσιαστικά μας δείχνει το βάθος εις το οποίο εισχωρούν μέσα στο δέρμα τα αντίστοιχα είδη λιποσωμάτων). Τα λιποσώματα τύπου TR φαίνεται ότι επάγουν τη διαπέραση με το να βοηθούν τη χρωστική να προχωρά (υπό μορφή λιποσωμάτων που την εγκλωβίζουν) σε βαθύτερα στρώματα της κεράτινης στιβάδας σε σχέση με τα συμβατικά λιποσώματα όπου σε μεγάλο ποσοστό διαρρηγνύονται και απελευθερώνουν την υδρόφιλη ουσία η οποία στη συνέχεια διέρχεται μόνη της, ως ελεύθερο μόριο, στις στιβάδες του χορίου. Αντίθετα, τα λιποσώματα τύπου INV αποδείχτηκε ότι εισδύουν σε βαθύτερες στιβάδες της επιδερμίδας, φθάνοντας σε αρκετά υψηλά ποσοστά σε στιβάδες του χορίου, παρασύροντας μαζί τους και τα μόρια του εγκλωβισμένου σε αυτά υδρόφιλου φαρμάκου. Τέλος, μελετήθηκε η δυνατότητα μορφοποίησης ενός πειραματικού φαρμάκου με ανάλογη δομή γνωστού φαρμάκου προκειμένου για διαδερμική αντιϋπερτασική θεραπεία. Αρχικά, μελετήσαμε το πειραματικό φάρμακο ως προς τις φυσικοχημικές του ιδιότητες (διαλυτότητα σε διάφορα μέσα, σύνδεση με πρωτεΐνες) και στη συνέχεια μελετήσαμε τη δυνατότητα χορήγησης μιας φαρμακοτεχνικής μορφής μέσω του δέρματος σε κατάλληλο σύστημα διαλυτών. Αφού βρέθηκαν οι κατάλληλες συνθήκες, χρησιμοποιήθηκαν ενισχυτικά διαπέρασης στη φαρμακοτεχνική μορφή για να επιταχυνθεί η διαδερμική απορρόφηση του φαρμάκου, όσο είναι δυνατόν, και να ευρεθεί η βέλτιστη φαρμακοτεχνική μορφή. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σύγκρισης μεταξύ του πειραματικού φαρμάκου και γνωστού αντιϋπερτασικού (Los) ως προς τις φυσικοχημικές ιδιότητες και την ικανότητα μεταφοράς τους διαδερμικά. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το ΠΦ παρουσίασε μεγαλύτερη διαπέραση υπό μορφή ουδέτερου μορίου (σε σχέση με την αντίστοιχη του άλατος με TFA (όπως φάνηκε από τα αρχικά πειράματα αυτής της σειράς) ή του μετά Καλίου άλατος (όπως προκύπτει μετά από σύγκριση των σχετικών τιμών Ροής και Συντελεστή Διαπερατότητας (P). Συγκρίνοντας λοιπόν τις τιμές διαπερατότητα και ροής διαμέσου ανθρώπινης επιδερμίδας με τις αντίστοιχες τιμές του φαρμάκου Los θα πρέπει να λάβουμε υπ’ όψη και τις τιμές για το ουδέτερο μόριο. Η διαπέραση του ουδέτερου μορίου του ΠΦ είναι σημαντικά χαμηλότερη από την αντίστοιχη του μετά καλίου άλατος της los. / In this study, we investigated the use of elastic liposomes in transdermal delivery of hydrophilic substances and we studied the possibility of formulating a new antihypertensive drug for transdermal delivery. Primarily, morphological studies of human skin were conducted by the use of optical microscopy and transepidermal water loss measurements (TEWL), in order to assess the barrier function of stratum corneum (SC), and the integrity of the techniques used in this study. By optical microscopy, in particular, data concerning the skin structure and the possible mechanism by which substances can be delivered through / into the skin, were obtained. Secondly, we studied and compared various physicochemical characteristics of two different types of elastic liposomes, which could help us predict the transdermal absorption (in vivo) of hydrophilic molecules. Fluorescent markers calcein and carboxyfluorescein were used as hydrophilic model drugs. All liposomal dispersions (conventional liposomes CLs, and elastic liposomes i.e. transfersomes TRs and invasomes INVs) were evaluated in means the following physicochemical properties: size distribution, z-potential, stability upon storage, morphology by cryo-electron microscopy and membrane elasticity. Moreover, their ability to encapsulate and also to retain aqueous soluble markers, was investigated. Finally, the permeation of calcein through human skin was tested and compared by use of elastic and conventional rigid liposomes. The mean diameter was found relatively homogenous, similar for most liposomal dispersions, while the addition of different penetration enhancers during the preparation did not influence z-potential. Increase of size average and instability – as far as the retention of the encapsulated substance is concerned – was observed at higher concentrations of penetration enhancers used. Sodium cholate containing TRs were found more elastic compared to Tween 80 containing TRs, which showed relatively low elasticity values (<40mg/s∙cm2). The highest elasticity values among all types of elastic liposomes prepared, were found in the case of INVs with 1%w/w PE and 1% w/w LIM. Furthermore, most INVs showed higher elasticity values compared to the ones without terpenes (control INVs), except from citral and cineol INVs, where elasticity decreased compared to the control ones. It appears that different types of liposomes can alter fluorescent permeation in the following order: Solution<CLs<TRs<<INVs. Permeability, flux and enhancement ratio (ER) show that conventional liposomes increased slightly calcein flux, while TRs and INVs 1.8 and 7.2 times respectively. These findings confirm the fact that CLs are inefficient drug delivery systems for water soluble molecules through human skin, and show that elastic liposomes having the highest elasticity value are more efficient in delivering CF transdermally. In further experiments, the penetration of both hydrophilic and lipophilic molecules in human skin was studied, in order to investigate the mechanism of action by which liposomes could enhance the drug delivery in skin. Fluorescent marker calcein was used as a hydrophilic drug model, while lipid rhodamine-PE was used as a lipophilic model (it shows us how deeply the liposomes penetrate into the skin). Liposomes TRs seem to enhance skin permeation by helping the marker to penetrate (through liposomes) in deeper stratum corneum layers while conventional liposomes the hydrophilic substance which penetrates the skin layers as a free molecule. In contrast, INV liposomes were proved to be able to penetrate in deeper skin layers, and deliver relatively high amounts of the encapsulated substance. In the end, experiments with a new molecule with similar structure to losartan were conducted. This study aimed at discovering a new formulation for this experimental drug in order to be used as a transdermal antihypertensive. First, we studied the physicochemical properties (solubility in PBS, BSA etc, and protein binding). Secondly, we investigated the possibility of preparing a formulation to be used transdermally. After establishing the techniques and drug properties we used penetration enhancers in order to increase the transdermal absorption as possible and help find the right skin formulation. Last, we compared the experimental drug and losartan in terms of physicochemical properties and their ability to be transported through human skin. The results showed that the experimental drug had better permeation rate as a neutral molecule compared to TFA salt, (as shown in preliminary experiments) or K+ (as shown after comparing P and flux values). Therefore, the values given for the neutral molecule should be taken into consideration when comparing the two drugs. (losartan and experimental drug). The permeation of the neutral molecule nevertheless is significantly lower than the one for losartan.