Os carboidratos presentes nos glicoconjugados apresentam alto grau de complexidade e diversidade estrutural, desempenhando um importante papel em diversos processos biológicos. As glucosidases, enzimas responsáveis pela clivagem de ligações O-glicosídicas em oligossacarídeos e glicoconjugados, participam de processos bioquímicos fundamentais do metabolismo e também estão envolvidas na biossíntese de glicoproteínas e glicoesfingolipídeos. Diversos inibidores de glucosidases de origem natural ou sintética têm sido descritos, como por exemplo: acarbose (1), miglitol (2), voglibose (3) e N-butil-desoxi-nojirimicina (4); sendo 1, 2 e 3 indicados para tratamento de diabetes mellitus tipo II e 4 para o controle da doença de Gaucher. Considerando a importância do planejamento e da síntese de novos inibidores de glucosidases, bem como a necessidade de obtenção de modelos tridimensionais para glucosidases, os objetivos deste trabalho foram: i) sintetizar carba-açúcares e pseudodissacarídeos potencialmente anti-glucosidase, ii) avaliar suas atividades inibitórias empregando a enzima ?-D-glucosidase de Saccharomyces cerevisiae e iii) aplicar técnicas de bioinformática e modelagem molecular na construção de um modelo estrutural 3D por homologia da sacarase intestinal de rato e realizar estudos de relação estrutura-atividade baseado no padrão farmacofórico calculado para os inibidores descritos. Neste sentido, a partir do precursor-chave (3/2,4)-2,3,4-tri-O-benzil-5-hidroxi-cicloexanona (12), obtido em 6 etapas, foram sintetizados diferentes carba-açúcares. Adicionalmente, reações de aminação redutiva, rearranjo alílico e \"click chemistry\" foram empregadas na síntese dos pseudodissacarídeos inéditos 3-(2,4-dibenziloxi-fenilamino)-2,4,6-tri-O-benzil-3-desoxi-?-D-glucopiranosídeo de metila (81), 1-(2\',3\',4\'-tri-O-benzil-5\'-oxo-cicloexanil)-4,6-di-O-acetil-2,3-didesoxi-hex-2-enopiranosídeo (89) e 2-{4-[(1H-1,2,3-triazol-4-il)metoxi]-2,4-di-O-benzil-fenila}-1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-desoxi-?-D-glucopiranosídeo (99), respectivamente. O composto (3/2,4)-2,3,4,5-tetraidroxi-cicloexanona (46) foi submetido a estudos de inibição enzimática e apresentou moderada atividade de inibição da enzima ?-D-glucosidase. As simulações de docking com o modelo construído da sacarase de rato bem como a determinação do padrão farmacofórico forneceram novas informações estruturais sobre o sítio ativo desta enzima e do modo de ligação de diferentes inibidores. Portanto, as estratégias sintéticas, os estudos de cinética enzimática e de modelagem molecular realizados durante o trabalho resultaram em contribuições relevantes no que diz respeito à química de carboidratos, permitindo avaliar potenciais inibidores da enzima ?-glucosidase in silico, os quais poderão ser sintetizados e submetidos a novos ensaios enzimáticos. / Carbohydrates of glycoconjugates display high degree of complexity and structural diversity, playing a central role in biological processes. Glucosidases are enzymes that catalyze the cleavage of glycosidic bonds in oligosaccharides or glycoconjugates, being essentials in several metabolic pathways and in the biosynthesis of glycoproteins and glycosfingolipids. Several glucosidase inhibitors from natural and synthetic sources have been described, such as: acarbose (1), miglitol (2), voglibose (3) and N-butyl-desoxy-nojirimycin (4). Compounds 1, 2 and 3 are used in the treatment of type II diabetes mellitus and 4 for patients with Gaucher\'s disease. Concerning to the importance of the design and synthesis of new glucosidase inhibitors, as well as the need of 3D models for glucosidases, the aims of this work were: i) the synthesis of potentially anti-glucosidase carba-sugars and pseudodisaccharides, ii) the evaluation of its inhibitory activities by using ?-D-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae and iii) the use of bioinformatics and molecular modeling techniques for creation of a 3D structural homology model of rat intestinal sucrase to accomplish the structure-activity relationships studies concerning to the pharmacophoric pattern of the reported inhibitors. Thus, starting with the key precursor 12, prepared in six steps, different carba-sugars were synthesized. Additionally, reductive amination reactions, allylic rearrangement and \"click chemistry\" were applied on the synthesis of novel pseudosaccharides 81, 89 and 99, respectively. Compound 46 was assayed for enzymatic inhibition and demonstrated reasonable activity for the inhibition of ?-D-glucosidase. Docking simulations by using the rat sucrase model and the determination of pharmacophoric pattern provided significant information concerning to the enzyme\'s active site and the inhibitor\'s binding pattern. Therefore, the synthetic strategies, enzymatic kinetic assays and molecular modeling studies performed in this work resulted in relevant contributions to the carbohydrate chemistry, making possible for our research group to evaluate potential ?-glucosidase inhibitors in silico, which can be synthesized and assayed for enzymatic activity in the future.

No lúmen do intestino médio da larva de Tenebrio molitor existem 4 β-glicosidases (denominadas 1, 2, 3a e 3b), que não estão presentes na comida do animal. Elas foram purificadas usando-se técnicas de eletroforese e cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica. A β-Glicosidase 1 (Mr 59.000) é instável a 30°C mas é estabilizada na presença do substrato. Ela praticamente não tem atividade sobre galactosídeos e cliva di- e oligossacarídeos. A enzima possui apenas 1 sítio ativo que apresenta 4 subsítios para ligação de glicose. Seu papel fisiológico deve ser o da clivagem de oligo- e principalmente dissacarídeos. A β-Glicosidase 2 (Mr 67.000) é muito instável a 30°C e hidrolisar com maior eficiência galactosídeos sintéticos, cliva muito mal lactose e é incapaz de clivar glucosídeos. Ela apresenta dois sítios ativos sendo que um deles cliva MUβDgal e lactose, que é ativado por Triton X-100, enquanto o outro não é ativado pelo detergente e hidrolisa NPβDgal e NPβDfuc. O papel fisiológico para esta enzima não está claro, mas imagina-se que ela esteja envolvida na digestão de galcatolipídeos. As β-Glicosidases 3a e 3b (Mr 59.000) parecem ser isoformas, uma vez que elas têm parâmetros cinéticos semelhantes, perfis de eluição, de peptídeos gerados por clivagem proteolítica, em HPLC idênticos e a mesma seqüência de aminoácidos para um peptídeo interno comum. Um anticorpo específico produzido contra a β-Glicosidase 3a reconhece a β-Glicosidase 3b, mas não reconhece as β-Glicosidases 1 e 2. Dois clones foram obtidos usando esse anticorpo para selecionar uma biblioteca de cDNA obtida dos rnRNAs do intestino médio de Tenebrio molitor. O resultado final mostrou um cDNA de 1.570 pb codificando para uma proteína madura de 485 aminoácidos. As proteínas codificadas pelos dois cDNAs têm somente 4 aminoácidos de diferentes e podem corresponder às β-Glicosidases 3a e 3b. As seqüências mostraram uma alta similaridade com proteínas da família 1 de glicosídeo hidrolases e codificam todos os peptídeos seqüenciados a partir da clivagem das β-Glicosidases 3a e 3b purificadas. Através de imunocitolocalização usando o anticorpo que reconhece as β-Glicosidases 3a e 3b, foi mostrado que essas são secretadas na parte posterior do intestino médio por uma via exocítica. Essas enzimas tem quatro subsítios para a ligação da glicose e podem hidrolisar di- e oligossacarídeos, alquil glicosídeos e glicosídeos tóxicos de plantas. Experimentos de competição entre substratos, mostraram que elas têm só um sítio ativo responsável para a hidrólise de todos os substratos. Seu papel deve ser principalmente a digestão intermediária de hemiceluloses e celulose. / In the midgut lumen of Tenebrio molitor larvae there are 4 β-glycosidases (named 1, 2, 3a and 3b), not present in the animal food. They were purified with electrophoresis, ion exchange and hydrophobic chromatographies. β-glycosidase 1 (relative molecular weight - Mr 59,000) is unstable at 30°C but is stabilized by substrates. The enzyme hydrolyses di- and oligoglucosides and has a residual activity against galactosides. It has 4 subsites for glucose binding in the active site and its physiological role is the hydrolysis of oligo- and mainly disaccharides. β-glycosidase 2 (Mr 67,000) is unstable at 30°C and hydrolyses efficiently only synthetic galactosides, has poor activity against lactose and is unable to use glucosides as substrates. This enzyme has two active sites. One of them is activated by Triton X-100 and hydrolyses MUβDgal. The other active site is not activated by the detergent and act upon NPβDgal and NPβDfuc. The physiological role ofthis enzyme may be the digestion of galactolipids. The β-glycosidases 3a and 3b (Mr 59,000) are likely isoforms, since they have similar kinetic parameters, identical HPLC peptide elution patterns after proteolytic cleavage and the same amino acid sequence of an internal peptide. A specific antibody raised against β-glycosidase 3a recognizes β-glycosidase 3b, but not β-glycosidase 1 and 2. Two clones were obtained screening a cDNA library, trom Tenebrio molitor midgut mRNA, with this antibody. The final result showed a cDNA of 1,570 pb coding for 485 amino acids in mature protein. The protein sequences showed high similarity with family 1 glycoside hydrolases and have the same amino acid sequence determined for peptides obtained after proteolytic hydrolysis of β-glycosidase 3a and 3b. The immunocytolocalization with this antibody showed that β-glycosidase 3a and 3b are secreted by exocytosis of small vesicles present in posterior midgut. These enzymes have four subsites for glucose binding and can hydrolyse di- and oligosaccharides, alkyl glucosides and toxic plant glucosides. Substrate competition experiments showed that they have only one active site responsible for the hydrolysis of all substrates. Their role may be mainly the intermediate digestion of hemicelluloses and cellulose.

A celulose é a mais abundante fonte de carbono presente na madeira e nos resíduos agrícolas, e a sua hidrólise completa é realizada pela ação sinergística de diferentes enzimas, como: as endo-1,4-ß-D-glucanase, exo-1,4-ß-glucanase e ß-glucosidase ou celobiase. O presente trabalho descreve algumas propriedades fisiológicas e bioquímicas do sistema ß-glucosidásico do fungo termofílico Scytalidium thermophilum. Tal fungo foi isolado originalmente do solo da Índia e gentilmente cedido pelo Dr. G. Straastma (Holanda). O meio M8 favoreceu a produção das ß-glucosidases. Entre os açúcares testados como fonte de carbono, avicel e celobiose foram os melhores indutores das ß-glucosidases extracelular e micelial. Quando o fungo foi crescido em dois estágios, observou-se inicialmente a repressão da síntese por glicose e a indução por avicel ou celobiose. Utilizando-se ciclo-heximida, observou-se a síntese \"de novo\" das proteínas. A ß-glucosidase extracelular foi purificada utilizando-se um fracionamento protéico e uma coluna de troca-iônica DEAE-celulose, de onde foram obtidos duas atividades enzimáticas denominadas ß-glucosidases I e II. A ß-glucosidase I foi aplicada em coluna de troca iônica CM-celulose, enquanto que a ß-glucosidase II foi aplicada em Sephadex G-100. A ß-glucosidase I foi purificada 2 vezes com 4.0% de recuperação, ao passo que a ß-glucosidase II foi purificada 2,4 vezes com 2.0% de recuperação. A ß-glucosidase micelial foi purificada utilizando-se um choque térmico, fracionamento protéico, coluna de filtração Sephadex G-100 e uma coluna troca-iônica DEAE-celulose. Foi purificada 23 vezes com recuperação de 25%. A ß-glucosidases extracelular I e micelial apresentaram um temperatura ótima aparente de 70 e 60°C e um pH de 5.5 e 6.0, respectivamente. Ambas enzimas foram inibidas por Ag+2 e Hg+2. A ß-glucosidases extracelular I e micelial possuem um peso molecular de 40.7 kDa e 39kda (SDS-Page) e 57 kDa e 33,8 kda (Sephadex G-100), respectivamente. A ß-glucosidase extracelular I foi capaz de hidrolisar PNP-glu, PNP-xil, celobiose, xilana e CMC, enquanto que a ß-glucosidase micelial hidrolisou PNP-glu, PNP-fuc, PNP-xil, PNPgal, ONPG e lactose. Ambas enzimas foram ativadas por glicerol a 1M. A ß-glucosidase extracelular I foi ativada por xilose, frutose e lactose, e se mostrou resistente a glicose 50mM, enquanto que a ß-glucosidase micelial foi ativada por glicose e xilose. ß-glucosidases extracelular I e micelial apresentaram um PI de 4.0 e 6.5, respectivamente. Os parâmetros cinéticos estimados para a ß-glucosidase extracelular I foram de Km 4,33 e 0,342mM e Vmáx de 5,37 e 2,0µmoles/min/mg prot. para celobiose e PNP-glu, respectivamente. O valor de Ki (Constante de Inibição) foi de 71mM para glicose. Para a ß-glucosidase micelial, os valores de Km e Vmáx foram de 0,29mM e 13,27µmoles/min/mg prot; 0,5 mM e 7,25µmoles/min/mg prot e 1,61 mM e 4,12µmoles/min/mg prot para os substratos PNP-glu, PNP-fuc e celobiose, respectivamente. Na presença de glicose e xilose os valores de Km e Vmáx foram de 1,26mM e 40,04 µmoles/min/mg.prot, e 1,33mM, e 30,49 µmoles/min/mg prot, respectivamente para o PNP-glu. O valor de Ki (Constante de Inibição) foi de 1,32mM para celobiose. A análise dos produtos de hidrólise das ß-glucosidases extracelular I e micelial foram anlisadas em TLC, e revelaram que ambas enzimas realizam hidrólise quando celobiose foi utilizada a 10mM, e transglicosilação quando celobiose foi utilizada a 250mM. Os resultados aqui apresentados demonstram importante papel importante do Scytalidium como produtor de ß-glucosidase com potencial na sacarificação enzimática da celulose. / Cellulose is the most abundant carbon source found in woods and waste residues. In nature the complete hidrolysis of cellulose occurs by the sinergistic action of several enzymes such endo-1,4-ß-D-glucanase, exo-1,4-ß-glucanase e ß-glucosidase or cellobiase. The present work describe some physiological and biochemical properties of ß-glucosidase system from thermophilic fungus Scytalidium thermophilum. The fungus was gift to Dr. Straastma (Mushroom Experimental Station, The Netherlands). The culture medium M8 enhance the production of ß-glucosidase. Among carbohydrates tested as carbon source, avicel and cellobiose were the best inducers of ß-glucosidase extracellular and mycelial. When the fungus was grown in two stages, observed the repression by glucose, and induction by avicel or cellobiose. The presence of cycloheximide inhibited the syntesis of ß-glucosidase, suggesting that the enzyme produced in the presence of indutors required \"de novo\" synthesis. Extracellular ß-glucosidase was purified using the precipitation with 75% amonium sulfate, ion exchange cromatography column DEAE-cellulose, and were obtained two activities: ß-glucosidase extracellular I and II. The ß-glucosidase I was applied to a CM-cellulose colunm, while ß-glucosidase II was applied to a Sephadex G-100 colunm. The ß-glucosidase II was purified two times and 4% yield, and the ß-glucosidase II was purified 2,4 times and 2% yield. The mycelial ß-glucosidase was purified using the termic treatment, a precipitation with 75% amonium sulfate followed by Sephadex G-100 and DEAEcellulose. The enzyme was purified 23 time with 23% yield. The ß-glucosidase extracellular II and mycelial shown optima of temperature and pH of 60°C and 70°C, 4.4 and 6.0, respectively. Hg+2 and Ag+2 ions were strong inhibitors of ß-glucosidase extracellular I and mycelial. The molecular weight of ß-glucosidase extracellular I and mycelial was stimated as 40.7 KDa and 39KDa (SDS-PAGE) and 57kDa and 33.8 kDa (Sephadex G-100). The ß-glucosidase extracellular I hydrolyzed PNP-glu, PNP-xyl, cellobiose,xylan and CMC, while ß-glucosidase mycelial hydrolyzed PNP-fuc, PNP-xyl, PNP-gal, ONPG and lactose. Both enzymes were activeted by glycerol 1M. The ß-glucosidase extracellular I was activeted by xylose, fructose and lactose, and show strong at glucose 50mM. The ß-glucosidase mycelial was activeted by glucose and xylose. ß-glucosidase extracellular I and mycelial shows PI 4.0 and 6.5, respectively. The kinects studies reveled for ß-glucosidase extracellular I a Km of 4,33 and 0,342mM and Vmáx of 5,37 and 2,0µmoles/min/mg prot for cellobiose and PNP-glu, respectively. The Ki values obtained from Dixon plots was 71mM for glucose. To ß-glucosidase mycelial the Km and and Vmáx were 0,29mM e 13,27µmoles/min/mg prot; 0,5 mM e 7,25µmoles/min/mg prot and 1,61 mM and 4,12µmoles/min/mg prot for PNP-glu, PNPfuc and cellobiose, respectively. Using xylose or glucose the Km and Vmáx was 1,26mM e 40,04 µmoles/min/mg.prot, and 1,33mM, e 30,49 µmoles/min/mg prot, respectively for PNP-glu. The Ki values obtained from Dixon plots was 1,32mM using cellobiose. The products of hydrolisis of cellobiose by the action of purified enzymes glucosidase extracellular I and mycelial were analised in thin-layer-cromatography, and show hydrolisis of cellobiose at 10mM,and transglycosilation reaction when cellobiose was using at 250mM. The intrinsic biochemical and regulatory properties the ß-glucosidase system of Scytalidium support the idea that organism may be useful for biotechnological applications.

Os carboidratos presentes nos glicoconjugados apresentam alto grau de complexidade e diversidade estrutural, desempenhando um importante papel em diversos processos biológicos. As glucosidases, enzimas responsáveis pela clivagem de ligações O-glicosídicas em oligossacarídeos e glicoconjugados, participam de processos bioquímicos fundamentais do metabolismo e também estão envolvidas na biossíntese de glicoproteínas e glicoesfingolipídeos. Diversos inibidores de glucosidases de origem natural ou sintética têm sido descritos, como por exemplo: acarbose (1), miglitol (2), voglibose (3) e N-butil-desoxi-nojirimicina (4); sendo 1, 2 e 3 indicados para tratamento de diabetes mellitus tipo II e 4 para o controle da doença de Gaucher. Considerando a importância do planejamento e da síntese de novos inibidores de glucosidases, bem como a necessidade de obtenção de modelos tridimensionais para glucosidases, os objetivos deste trabalho foram: i) sintetizar carba-açúcares e pseudodissacarídeos potencialmente anti-glucosidase, ii) avaliar suas atividades inibitórias empregando a enzima ?-D-glucosidase de Saccharomyces cerevisiae e iii) aplicar técnicas de bioinformática e modelagem molecular na construção de um modelo estrutural 3D por homologia da sacarase intestinal de rato e realizar estudos de relação estrutura-atividade baseado no padrão farmacofórico calculado para os inibidores descritos. Neste sentido, a partir do precursor-chave (3/2,4)-2,3,4-tri-O-benzil-5-hidroxi-cicloexanona (12), obtido em 6 etapas, foram sintetizados diferentes carba-açúcares. Adicionalmente, reações de aminação redutiva, rearranjo alílico e \"click chemistry\" foram empregadas na síntese dos pseudodissacarídeos inéditos 3-(2,4-dibenziloxi-fenilamino)-2,4,6-tri-O-benzil-3-desoxi-?-D-glucopiranosídeo de metila (81), 1-(2\',3\',4\'-tri-O-benzil-5\'-oxo-cicloexanil)-4,6-di-O-acetil-2,3-didesoxi-hex-2-enopiranosídeo (89) e 2-{4-[(1H-1,2,3-triazol-4-il)metoxi]-2,4-di-O-benzil-fenila}-1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-desoxi-?-D-glucopiranosídeo (99), respectivamente. O composto (3/2,4)-2,3,4,5-tetraidroxi-cicloexanona (46) foi submetido a estudos de inibição enzimática e apresentou moderada atividade de inibição da enzima ?-D-glucosidase. As simulações de docking com o modelo construído da sacarase de rato bem como a determinação do padrão farmacofórico forneceram novas informações estruturais sobre o sítio ativo desta enzima e do modo de ligação de diferentes inibidores. Portanto, as estratégias sintéticas, os estudos de cinética enzimática e de modelagem molecular realizados durante o trabalho resultaram em contribuições relevantes no que diz respeito à química de carboidratos, permitindo avaliar potenciais inibidores da enzima ?-glucosidase in silico, os quais poderão ser sintetizados e submetidos a novos ensaios enzimáticos. / Carbohydrates of glycoconjugates display high degree of complexity and structural diversity, playing a central role in biological processes. Glucosidases are enzymes that catalyze the cleavage of glycosidic bonds in oligosaccharides or glycoconjugates, being essentials in several metabolic pathways and in the biosynthesis of glycoproteins and glycosfingolipids. Several glucosidase inhibitors from natural and synthetic sources have been described, such as: acarbose (1), miglitol (2), voglibose (3) and N-butyl-desoxy-nojirimycin (4). Compounds 1, 2 and 3 are used in the treatment of type II diabetes mellitus and 4 for patients with Gaucher\'s disease. Concerning to the importance of the design and synthesis of new glucosidase inhibitors, as well as the need of 3D models for glucosidases, the aims of this work were: i) the synthesis of potentially anti-glucosidase carba-sugars and pseudodisaccharides, ii) the evaluation of its inhibitory activities by using ?-D-glucosidase from Saccharomyces cerevisiae and iii) the use of bioinformatics and molecular modeling techniques for creation of a 3D structural homology model of rat intestinal sucrase to accomplish the structure-activity relationships studies concerning to the pharmacophoric pattern of the reported inhibitors. Thus, starting with the key precursor 12, prepared in six steps, different carba-sugars were synthesized. Additionally, reductive amination reactions, allylic rearrangement and \"click chemistry\" were applied on the synthesis of novel pseudosaccharides 81, 89 and 99, respectively. Compound 46 was assayed for enzymatic inhibition and demonstrated reasonable activity for the inhibition of ?-D-glucosidase. Docking simulations by using the rat sucrase model and the determination of pharmacophoric pattern provided significant information concerning to the enzyme\'s active site and the inhibitor\'s binding pattern. Therefore, the synthetic strategies, enzymatic kinetic assays and molecular modeling studies performed in this work resulted in relevant contributions to the carbohydrate chemistry, making possible for our research group to evaluate potential ?-glucosidase inhibitors in silico, which can be synthesized and assayed for enzymatic activity in the future.

Le présent travail rend compte des études phytochimiques et biologiques d'extraits non volatils de quatre plantes utilisées au Bénin dans le traitement du diabète. La première partie passe en revue la bibliographie sur les plantes sujettes à notre étude. Dans cette partie, la systématique, l'importance en pharmacopée ainsi que les travaux déjà effectués sur ces plantes ont été présentés. La deuxième partie présente le mode d'extraction et les études chimiques des extraits et les résultats obtenus. La spectrophotométrie a permis de déterminer quelques grandes familles de composés présents dans les extraits : les polyphénols totaux, les flavonoïdes et les tanins tandis que la GC/MS et la LC/MS ont servi à mettre en exergue la présence de composés volatils et non volatils. La troisième partie décrit les tests biologiques in vitro et ex vitro effectués sur les extraits. Les extraits ont montré de manière générale des activités : inhibitrice de l' α-glucosidase, antioxydantes (DPPH, FRAP, ORAC), antimicrobiennes et l'une (Bridelia ferruginea) une activité cytotoxique sur les cellules cancéreuses (PA1, MCF7, PC3, DU-145), avec une efficacité variable d'une plante à une autre. La quatrième partie discute de manière générale des résultats issus des études phytochimiques et des tests biologiques. Parmi les quatre échantillons de plantes sélectionnées pour notre étude, seul l'extrait semi-éthanolique des racines de Ceiba pentandra a une faible teneur en familles de composés dosés et présente des activités biologiques (ci-dessus citées) faibles comparativement aux extraits de Bridelia ferruginea, de Pseudocedrela kotschyi et de Polygonum senegalensis. L'ensemble des résultats tant sur le plan chimique que biologique met en évidence les potentialités des extraits de plantes étudiées, pour une exploitation à des fins thérapeutiquesfutures. / The present work had reported on the phytochemical and biological studies of non-volatile extracts of four plants used in Benin for diabetes treatment. The first part reviewed the bibliography of investigated plants in our study. In this part, the systematic, the importance in the pharmacopoeia and the previous works done on these plants were presented. The second part has presented the extraction method and chemical studies of the extracts and results obtained. The spectrophotometry has permitted to identify some important families of compounds in the extracts: the total polyphenols, flavonoids and tannins whereas the GC / MS and LC/MS were used to highlight the presence of volatile and non-volatile compounds. The third part described the biological tests in vitro and ex vitro carried out on the extracts. The extracts showed in general activities: α-glucosidase inhibition, antioxidant (DPPH, FRAP, ORAC), antimicrobial, and one of them (Bridelia ferruginea) were cytotoxic on cancer cells (PA1, MCF7, PC3, DU-145), with a variable efficiency from one plant to another. The fourth part had discussed in general about the results obtained from phytochemical studies and biological tests. Among the four plants samples selected for our study, only the semi-alcoholic extract of Ceiba pentandra roots had a low-dosed compounds families and presented of this biological activities (cited below) low comparatively to Bridelia ferruginea, Pseudocedrela kotschyi and Polygonum senegalensis extracts. Both of the chemical and biological results highlight the potential of certain species for future exploitation of their non-volatile extract for therapeutic purposes.

A celulose é a mais abundante fonte de carbono presente na madeira e nos resíduos agrícolas, e a sua hidrólise completa é realizada pela ação sinergística de diferentes enzimas, como: as endo-1,4-ß-D-glucanase, exo-1,4-ß-glucanase e ß-glucosidase ou celobiase. O presente trabalho descreve algumas propriedades fisiológicas e bioquímicas do sistema ß-glucosidásico do fungo termofílico Scytalidium thermophilum. Tal fungo foi isolado originalmente do solo da Índia e gentilmente cedido pelo Dr. G. Straastma (Holanda). O meio M8 favoreceu a produção das ß-glucosidases. Entre os açúcares testados como fonte de carbono, avicel e celobiose foram os melhores indutores das ß-glucosidases extracelular e micelial. Quando o fungo foi crescido em dois estágios, observou-se inicialmente a repressão da síntese por glicose e a indução por avicel ou celobiose. Utilizando-se ciclo-heximida, observou-se a síntese \"de novo\" das proteínas. A ß-glucosidase extracelular foi purificada utilizando-se um fracionamento protéico e uma coluna de troca-iônica DEAE-celulose, de onde foram obtidos duas atividades enzimáticas denominadas ß-glucosidases I e II. A ß-glucosidase I foi aplicada em coluna de troca iônica CM-celulose, enquanto que a ß-glucosidase II foi aplicada em Sephadex G-100. A ß-glucosidase I foi purificada 2 vezes com 4.0% de recuperação, ao passo que a ß-glucosidase II foi purificada 2,4 vezes com 2.0% de recuperação. A ß-glucosidase micelial foi purificada utilizando-se um choque térmico, fracionamento protéico, coluna de filtração Sephadex G-100 e uma coluna troca-iônica DEAE-celulose. Foi purificada 23 vezes com recuperação de 25%. A ß-glucosidases extracelular I e micelial apresentaram um temperatura ótima aparente de 70 e 60°C e um pH de 5.5 e 6.0, respectivamente. Ambas enzimas foram inibidas por Ag+2 e Hg+2. A ß-glucosidases extracelular I e micelial possuem um peso molecular de 40.7 kDa e 39kda (SDS-Page) e 57 kDa e 33,8 kda (Sephadex G-100), respectivamente. A ß-glucosidase extracelular I foi capaz de hidrolisar PNP-glu, PNP-xil, celobiose, xilana e CMC, enquanto que a ß-glucosidase micelial hidrolisou PNP-glu, PNP-fuc, PNP-xil, PNPgal, ONPG e lactose. Ambas enzimas foram ativadas por glicerol a 1M. A ß-glucosidase extracelular I foi ativada por xilose, frutose e lactose, e se mostrou resistente a glicose 50mM, enquanto que a ß-glucosidase micelial foi ativada por glicose e xilose. ß-glucosidases extracelular I e micelial apresentaram um PI de 4.0 e 6.5, respectivamente. Os parâmetros cinéticos estimados para a ß-glucosidase extracelular I foram de Km 4,33 e 0,342mM e Vmáx de 5,37 e 2,0µmoles/min/mg prot. para celobiose e PNP-glu, respectivamente. O valor de Ki (Constante de Inibição) foi de 71mM para glicose. Para a ß-glucosidase micelial, os valores de Km e Vmáx foram de 0,29mM e 13,27µmoles/min/mg prot; 0,5 mM e 7,25µmoles/min/mg prot e 1,61 mM e 4,12µmoles/min/mg prot para os substratos PNP-glu, PNP-fuc e celobiose, respectivamente. Na presença de glicose e xilose os valores de Km e Vmáx foram de 1,26mM e 40,04 µmoles/min/mg.prot, e 1,33mM, e 30,49 µmoles/min/mg prot, respectivamente para o PNP-glu. O valor de Ki (Constante de Inibição) foi de 1,32mM para celobiose. A análise dos produtos de hidrólise das ß-glucosidases extracelular I e micelial foram anlisadas em TLC, e revelaram que ambas enzimas realizam hidrólise quando celobiose foi utilizada a 10mM, e transglicosilação quando celobiose foi utilizada a 250mM. Os resultados aqui apresentados demonstram importante papel importante do Scytalidium como produtor de ß-glucosidase com potencial na sacarificação enzimática da celulose. / Cellulose is the most abundant carbon source found in woods and waste residues. In nature the complete hidrolysis of cellulose occurs by the sinergistic action of several enzymes such endo-1,4-ß-D-glucanase, exo-1,4-ß-glucanase e ß-glucosidase or cellobiase. The present work describe some physiological and biochemical properties of ß-glucosidase system from thermophilic fungus Scytalidium thermophilum. The fungus was gift to Dr. Straastma (Mushroom Experimental Station, The Netherlands). The culture medium M8 enhance the production of ß-glucosidase. Among carbohydrates tested as carbon source, avicel and cellobiose were the best inducers of ß-glucosidase extracellular and mycelial. When the fungus was grown in two stages, observed the repression by glucose, and induction by avicel or cellobiose. The presence of cycloheximide inhibited the syntesis of ß-glucosidase, suggesting that the enzyme produced in the presence of indutors required \"de novo\" synthesis. Extracellular ß-glucosidase was purified using the precipitation with 75% amonium sulfate, ion exchange cromatography column DEAE-cellulose, and were obtained two activities: ß-glucosidase extracellular I and II. The ß-glucosidase I was applied to a CM-cellulose colunm, while ß-glucosidase II was applied to a Sephadex G-100 colunm. The ß-glucosidase II was purified two times and 4% yield, and the ß-glucosidase II was purified 2,4 times and 2% yield. The mycelial ß-glucosidase was purified using the termic treatment, a precipitation with 75% amonium sulfate followed by Sephadex G-100 and DEAEcellulose. The enzyme was purified 23 time with 23% yield. The ß-glucosidase extracellular II and mycelial shown optima of temperature and pH of 60°C and 70°C, 4.4 and 6.0, respectively. Hg+2 and Ag+2 ions were strong inhibitors of ß-glucosidase extracellular I and mycelial. The molecular weight of ß-glucosidase extracellular I and mycelial was stimated as 40.7 KDa and 39KDa (SDS-PAGE) and 57kDa and 33.8 kDa (Sephadex G-100). The ß-glucosidase extracellular I hydrolyzed PNP-glu, PNP-xyl, cellobiose,xylan and CMC, while ß-glucosidase mycelial hydrolyzed PNP-fuc, PNP-xyl, PNP-gal, ONPG and lactose. Both enzymes were activeted by glycerol 1M. The ß-glucosidase extracellular I was activeted by xylose, fructose and lactose, and show strong at glucose 50mM. The ß-glucosidase mycelial was activeted by glucose and xylose. ß-glucosidase extracellular I and mycelial shows PI 4.0 and 6.5, respectively. The kinects studies reveled for ß-glucosidase extracellular I a Km of 4,33 and 0,342mM and Vmáx of 5,37 and 2,0µmoles/min/mg prot for cellobiose and PNP-glu, respectively. The Ki values obtained from Dixon plots was 71mM for glucose. To ß-glucosidase mycelial the Km and and Vmáx were 0,29mM e 13,27µmoles/min/mg prot; 0,5 mM e 7,25µmoles/min/mg prot and 1,61 mM and 4,12µmoles/min/mg prot for PNP-glu, PNPfuc and cellobiose, respectively. Using xylose or glucose the Km and Vmáx was 1,26mM e 40,04 µmoles/min/mg.prot, and 1,33mM, e 30,49 µmoles/min/mg prot, respectively for PNP-glu. The Ki values obtained from Dixon plots was 1,32mM using cellobiose. The products of hydrolisis of cellobiose by the action of purified enzymes glucosidase extracellular I and mycelial were analised in thin-layer-cromatography, and show hydrolisis of cellobiose at 10mM,and transglycosilation reaction when cellobiose was using at 250mM. The intrinsic biochemical and regulatory properties the ß-glucosidase system of Scytalidium support the idea that organism may be useful for biotechnological applications.

No lúmen do intestino médio da larva de Tenebrio molitor existem 4 β-glicosidases (denominadas 1, 2, 3a e 3b), que não estão presentes na comida do animal. Elas foram purificadas usando-se técnicas de eletroforese e cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica. A β-Glicosidase 1 (Mr 59.000) é instável a 30°C mas é estabilizada na presença do substrato. Ela praticamente não tem atividade sobre galactosídeos e cliva di- e oligossacarídeos. A enzima possui apenas 1 sítio ativo que apresenta 4 subsítios para ligação de glicose. Seu papel fisiológico deve ser o da clivagem de oligo- e principalmente dissacarídeos. A β-Glicosidase 2 (Mr 67.000) é muito instável a 30°C e hidrolisar com maior eficiência galactosídeos sintéticos, cliva muito mal lactose e é incapaz de clivar glucosídeos. Ela apresenta dois sítios ativos sendo que um deles cliva MUβDgal e lactose, que é ativado por Triton X-100, enquanto o outro não é ativado pelo detergente e hidrolisa NPβDgal e NPβDfuc. O papel fisiológico para esta enzima não está claro, mas imagina-se que ela esteja envolvida na digestão de galcatolipídeos. As β-Glicosidases 3a e 3b (Mr 59.000) parecem ser isoformas, uma vez que elas têm parâmetros cinéticos semelhantes, perfis de eluição, de peptídeos gerados por clivagem proteolítica, em HPLC idênticos e a mesma seqüência de aminoácidos para um peptídeo interno comum. Um anticorpo específico produzido contra a β-Glicosidase 3a reconhece a β-Glicosidase 3b, mas não reconhece as β-Glicosidases 1 e 2. Dois clones foram obtidos usando esse anticorpo para selecionar uma biblioteca de cDNA obtida dos rnRNAs do intestino médio de Tenebrio molitor. O resultado final mostrou um cDNA de 1.570 pb codificando para uma proteína madura de 485 aminoácidos. As proteínas codificadas pelos dois cDNAs têm somente 4 aminoácidos de diferentes e podem corresponder às β-Glicosidases 3a e 3b. As seqüências mostraram uma alta similaridade com proteínas da família 1 de glicosídeo hidrolases e codificam todos os peptídeos seqüenciados a partir da clivagem das β-Glicosidases 3a e 3b purificadas. Através de imunocitolocalização usando o anticorpo que reconhece as β-Glicosidases 3a e 3b, foi mostrado que essas são secretadas na parte posterior do intestino médio por uma via exocítica. Essas enzimas tem quatro subsítios para a ligação da glicose e podem hidrolisar di- e oligossacarídeos, alquil glicosídeos e glicosídeos tóxicos de plantas. Experimentos de competição entre substratos, mostraram que elas têm só um sítio ativo responsável para a hidrólise de todos os substratos. Seu papel deve ser principalmente a digestão intermediária de hemiceluloses e celulose. / In the midgut lumen of Tenebrio molitor larvae there are 4 β-glycosidases (named 1, 2, 3a and 3b), not present in the animal food. They were purified with electrophoresis, ion exchange and hydrophobic chromatographies. β-glycosidase 1 (relative molecular weight - Mr 59,000) is unstable at 30°C but is stabilized by substrates. The enzyme hydrolyses di- and oligoglucosides and has a residual activity against galactosides. It has 4 subsites for glucose binding in the active site and its physiological role is the hydrolysis of oligo- and mainly disaccharides. β-glycosidase 2 (Mr 67,000) is unstable at 30°C and hydrolyses efficiently only synthetic galactosides, has poor activity against lactose and is unable to use glucosides as substrates. This enzyme has two active sites. One of them is activated by Triton X-100 and hydrolyses MUβDgal. The other active site is not activated by the detergent and act upon NPβDgal and NPβDfuc. The physiological role ofthis enzyme may be the digestion of galactolipids. The β-glycosidases 3a and 3b (Mr 59,000) are likely isoforms, since they have similar kinetic parameters, identical HPLC peptide elution patterns after proteolytic cleavage and the same amino acid sequence of an internal peptide. A specific antibody raised against β-glycosidase 3a recognizes β-glycosidase 3b, but not β-glycosidase 1 and 2. Two clones were obtained screening a cDNA library, trom Tenebrio molitor midgut mRNA, with this antibody. The final result showed a cDNA of 1,570 pb coding for 485 amino acids in mature protein. The protein sequences showed high similarity with family 1 glycoside hydrolases and have the same amino acid sequence determined for peptides obtained after proteolytic hydrolysis of β-glycosidase 3a and 3b. The immunocytolocalization with this antibody showed that β-glycosidase 3a and 3b are secreted by exocytosis of small vesicles present in posterior midgut. These enzymes have four subsites for glucose binding and can hydrolyse di- and oligosaccharides, alkyl glucosides and toxic plant glucosides. Substrate competition experiments showed that they have only one active site responsible for the hydrolysis of all substrates. Their role may be mainly the intermediate digestion of hemicelluloses and cellulose.

Parmi les ressources d'origines agricole et forestière utilisables aujourd'hui en tant que biomasse à destination énergétique, le miscanthus apparait comme l'une des espèces de graminées les plus prometteuses pour la production de bioéthanol de seconde génération grâce à son haut potentiel en biomasse. Ce procédé dit "2G" convertit la cellulose contenue dans ces biomasses lignocellulosiques en bioéthanol et ce via un procédé intégrant prétraitement physico-chimique, hydrolyse enzymatique et fermentation. Le principal objectif de ce projet de thèse visait à étudier l'impact de l'hétérogénéité tissulaire et structurale du miscanthus sur sa saccharification et s'est décliné en différents volets liés à l'étude de l'efficacité des prétraitements et à l'analyse des performances de différents cocktails enzymatiques de Trichoderma reesei. L'hydrolyse enzymatique est essentiellement limitée par la structure et la porosité des complexes pariétaux qui réduisent l'accessibilité de la cellulose aux cellulases. En plus des constituants hémicelluloses et lignines qui recouvrent la cellulose, les parois cellulaires du miscanthus sont riches en acides hydroxycinnamiques (pCA et FA) qui jouent un rôle important dans la cohésion du réseau pariétal complexe. L'application de prétraitements acide et alcalin sur le miscanthus a ainsi révélé une différence de réactivité en fonction des types cellulaires. Les parois secondaires du sclérenchyme sont plus facilement dégradées par les cellulases fongiques après prétraitement acide. L'étude de la distribution des composés phénoliques au niveau cellulaire par micro spectrophotométrie UV a rapporté une nette diminution de l'absorbance UV dans tous les tissus après chaque prétraitement. Ceci n'expliquant pas totalement les différences de réactivité observées, d'autres facteurs physicochimiques seraient donc impliqués. Une approche visant à évaluer la progression des cellulases au sein des parois par immunocytochimie a également été initiée mais elle s'est heurtée à des problématiques techniques liées à la nature des tissus et aux anticorps employés. Les performances en terme de conversion de la cellulose ont été évaluées avec des cocktails enzymatiques de T. reesei comprenant des activités (hemi-)cellulolytiques variables. Une meilleure efficacité du prétraitement par explosion à la vapeur a ainsi pu être montrée par réduction de la quantité d'enzymes mises en œuvre. Comme c'est le cas pour d'autres graminées, ces travaux ont permis de confirmer le rôle crucial de l'enzyme β-glucosidase, permettant de limiter l'inhibition par le cellobiose et améliorant la cinétique initiale de saccharification. L'amélioration du rendement d'hydrolyse par l'utilisation d'un sécrétome comprenant une bonne activité hémicellulolytique a pu être ensuite démontrée. L'utilisation de cocktails enzymatiques reconstitués à partir d'enzymes pures a enfin permis de définir un mélange "optimal" composé des quatre principales cellulases de T. reesei (CBH1, CBH2, EG1 et EG2) associées à une hémicellulase (XYN1). / Among agricultural and forest resources, the grass specie miscanthus has emerged as one of the most promising feedstock candidates for 2G-biofuel production due to its high biomass yield. The biofuels 2G-production process is based on cellulose conversion into bioethanol via physicochemical pretreatment, enzymatic hydrolysis and fermentation. The main objective of this Ph.D. project was to evaluate the effect of tissue and structure heterogeneity of miscanthus on its saccharification by evaluating pretreatment efficiency and analyzing the performance of different Trichoderma reesei cellulolytic cocktails.Enzymatic hydrolysis is mainly hindered by cell wall structure and porosity which limit cellulose accessibility to cellulase. In addition to hemicelluloses and lignin polymers, miscanthus cell walls, contain high amounts of hydroxycinnamic acids (pCA and FA) that play a significant role in cross-linking polymers into cohesive network. Applying acid and alkali pretreatments on miscanthus revealed a distinctive reactivity depending on cell types. Secondary cell walls of sclerenchyma appeared more digested by fungal cellulases after acid pretreatment. Addressing phenolics distribution (lignin and hydroxycinnamic acids) at cell level by UV micro spectrophotometry highlighted a significant decrease in UV absorbance after both pretreatments irrespective to cell type indicating that other physicochemical and structural features are involved in distinct cell wall reactivity. We have also attempted to evaluate cellulase progression into miscanthus cell walls by immunocytochemistry but we have had many technical problems due to the nature of miscanthus tissues and used antibodies. Cellulose conversion ability was then evaluated using enzymatic cocktails of T. reesei which vary in their (hemi-)cellulolytic activities. Higher efficiency of the steam explosion pretreatment was demonstrated by reducing enzymes loading. As reported previously on other grasses, β-glucosidase plays a crucial role by limiting the inhibiting effect of cellobiose and improving the initial saccharification step. We furthermore showed that the use of hemicellulases-improved cocktails allowed significant increase in saccharification yields. We finally identified an optimal reconstituted enzyme mixture composed of four major cellulases of T. reesei (CBH1, CBH2, EG1 and EG2) and the hemicellulase XYN-1.

β-Glucosidase (β-D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) catalyzes the hydrolysis of aryl and alkyl β-D-glucosides as well as glucosides with a carbohydrate moiety such as cellobiose and other beta-linked oligosaccharides. In maize (Zea mays L.), β-glucosidase exists as 120 kD homodimers, but also forms high-molecular-weight (HMW) aggregates in certain maize inbreds (nulls). In this study we show that the null β-glucosidase phenotype is caused by the formation of HMW enzyme aggregates (>1.5 X 10⁶ Daltons), caused by a β-glucosidase aggregating factor (BGAF). BGAF is a 32 kD protein that binds specifically to β-glucosidase and renders it insoluble during extraction. The data unequivocally demonstrate that BGAF is solely responsible for β-glucosidase aggregation and insolubility, and thus, the apparent null phenotype. Additionally, I have isolated the cDNA encoding BGAF and have identified BGAF as a member of the small heat-shock protein (sHsp) family. Interestingly, BGAF binds to both maize β-glucosidase isozymes (Glu1 and Glu2), but does not bind to their sorghum homolog Dhurrinase-1 (Dhr1; Sorghum beta-glucosidase), that shares 70% sequence identity with Glu1 and Glu2. Therefore, these proteins provide an excellent system to study functional differences at nonconserved residues and elucidate the mechanism of enzyme aggregation and insolubility. By examining the behavior of β-glucosidase chimeras in binding assays, I demonstrate that BGAF binding is conformation dependent, highly specific, and reminiscent of antigen-antibody interactions. Additionally, I have identified two disparate polypeptide segments in the primary structure of the maize beta-glucosidase isozyme Glu1 that form a BGAF binding site in the tertiary structure of the enzyme. / Master of Science

A celulose é o biopolímero de maior abundância no mundo e tem potencial para se tornar fonte de energia renovável através de sua transformação em açúcares fermentáveis, que por sua vez serão transformados em etanol. A recalcitrância da celulose, principal dificuldade encontrada no processo, pode ser superada com o auxílio de enzimas (celulases). Ao menos três enzimas celulolíticas são necessárias para a degradação total da celulose, incluindo as celobioidrolases, que hidrolisam as ligações glicosídicas das extremidades redutoras e não redutoras da cadeia, as endoglucanases, que clivam a cadeia de celulose amorfa randomicamente, e as beta-glicosidases, que produzem glicose através dos celo-oligômeros. Mas para que esse processo se torne financeiramente viável é necessário conhecer o funcionamento, otimizar a atividade e aumentar a produção dessas celulases. Com o intuito de avançar na compreensão da função e estrutura dessas enzimas, o presente trabalho teve como objetivo o estudo estrutural de beta-glicosidases da família GH1 e endoglucanases da família GH5. Na primeira parte do trabalho, a expressão da endoglucanase II de Trichoderma reesei não foi alcançada, mesmo utilizando diferentes organismos e condições de expressão. Porém, na segunda etapa, foi obtida a expressão, purificação e os primeiros ensaios de cristalização de 11 beta-glicosidases bacterianas da família GH1 e 8 endoglucanases bacterianas da família GH5. Dentre elas, três beta-glicosidases e uma endoglucanase de Bacillus licheniformis foram cristalizadas e tiveram sua estrutura resolvida. As beta-glicosidases, apesar de possuírem o enovelamente similar, apresentaram variações no tamanho e posição das alças formadoras da fenda catalítica e divergem em relação a um dos aminoácidos importantes para a estabilização do substrato. Essas diferenças podem ajudar a explicar o mecanismo dessas enzimas para reconhecer substratos distintos. A endoglucanase da família GH5, possuindo dois módulos acessórios, foi cristalizada tanto na forma apo quanto complexada ao substrato celotetraose. O segundo módulo acessório possivelmente é um domínio de ligação à celulose (CBM) e seus resíduos aromáticos, que são responsáveis pela interação com o substrato, parecem complementar o sítio catalítico, sendo assim um novo mecanismo de auxílio enzimático de um CBM. O primeiro módulo acessório não possui um aparente sítio de interação com carboidratos e provavelmente funciona como um conector entre domínio catalítico e o CBM. O posicionamento do substrato no sítio de ligação é parecido com outras estruturas já determinadas, porém, suscita algumas dúvidas sobre a função dos resíduos catalíticos que é conservada na família. O carbono anomérico do substrato possui uma densidade eletrônica contínua com o glutamato da fita β4 (que deveria ser o ácido/base) e está mais próximo dele que do glutamato da fita β7 (que deveria ser o nucleófilo). / Cellulose is the most abundant biopolymer in the world and can become a renewable energy source through its transformation in fermentable sugars, which will be converted in bioethanol. The cellulose recalcitrance, main difficulty in the process, can be overcome with the aid of enzymes (cellulases). At least three cellulolytic enzymes are required for complete hydrolysis of cellulose, including cellobiohydrolases for hydrolyzing the glycosidic linkages from the reducing and non-reducing chain ends, endoglucanases for randomly cleaving cellulose chains in the amorphous regions, and beta-glucosidases for producing glucose from the solubilized cello-oligomers. But, to become a financially viable process it is necessary to know the mechanism, optimize the activity and improve the production of these cellulases. In order to advance the understanding of the structure and function of these enzymes, the present work intended to study the structure of beta-glucosidases from family GH1 and endoglucanases from family GH5. In the first part of the work, the expression of endoglucanase II from Trichoderma reesei was not achieved, even using different organisms and expression conditions. However, in the second part, the expression, purification and the crystallization first trials of eleven bacterial beta-glucosidases and eight bacterial endoglucanases were achieved. Among them, three beta-glucosidases and one endoglucanase from Bacillus licheniformis were crystallized and had their structures solved. Beta-glucosidases, although having a similar folding, showed variations in the length and position of the loops that form the catalytic cleft and diverge in relation to one of the amino acids that are important in substrate stabilization. These differences may help explain the mechanism of these enzymes to recognize distinct substrates. The endoglucanase, which has two accessory modules, was crystallized in the apo form and complexed with the substrate celotetraose. The second accessory module probably is a cellulose binding domain (CBM) and its aromatic residues, which are responsible for the substrate interaction, seem to complement the catalytic site. Therefore it can be a new mechanism of CBM assistance in the enzymatic activity. The first accessory module has no apparent interaction site with carbohydrates and probably works as a connector between the catalytic domain and CBM. The positioning of the substrate in the binding site is similar to other structures already solved but raises some questions about the role of the catalytic residues, that are conserved in the family. The anomeric carbon of the substrate has a continuous electron density with glutamate from sheet-β4 (which should be the acid/base) and is closer to it than to glutamate from sheet-β7 (which should be the nucleophile).