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Master of Science / Department of Animal Sciences and Industry / Timothy G. Rozell / Follicle stimulating hormone (FSH) is known as the key hormone capable of causing proliferation of granulosa cells in the ovary. The classical receptor belongs to the G protein-coupled superfamily and is designated FSHR-1. A variant in the FSH receptor has been shown to be functional in mouse ovaries. The variant receptor is designated as FSHR-3, and when bound by FSH activates a pathway that shares similar characteristics to the growth factor type I receptor pathway, with no increase in cAMP. The FSHR-3 variant activates MAPK upon binding to FSH, and causes proliferation of cells on which it is known to be expressed. For example ID8 mouse ovarian surface epithelium cells (MOSEC), a cell line that when introduced in immunocompetent mice causes tumors similar to human ovarian cancer and which also express FSHR-3, proliferated in response to FSH. The present study explored the potential for decreasing expression of FSHR-3 protein. The RNA interference (RNAi) technique was used to insert small inhibitory RNA(siRNA) segments corresponding specifically to the R3 variant of the FSH receptor in ID8 MOSEC. Transfected cells were lysed and FSHR-3 protein was visualized using SDS Page and Western blotting analysis. A reduction in expression of FSHR-3 was observed in two of the transfection groups, with the greatest down-regulation of FSHR-3 being 30.1%. From these preliminary results we conclude that the FSHR-3 is expressed on ID8 cells, and that siRNA may be useful to reduce its expression. Thus, it may be possible to slow the growth of FSH-responsive tumors using siRNA to target the FSHR-3 receptor.

La métastase et la chimiorésistance sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints d’un cancer. La compréhension des mécanismes moléculaires régissant ces deux processus devient donc un domaine de recherche important pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ma thèse, je me concentre sur la compréhension du rôle du facteur d’initiation de la traduction chez les eucaryotes 4E (eIF4E) dans l’invasion du cancer, et je décris un nouveau mécanisme de résistance que nous avons découvert en étudiant le développement de la résistance à un inhibiteur connu d’eIF4E, la ribavirine. eIF4E est un puissant oncogène qui est connu pour être élevé dans une multitude de cancers comprenant entre autres les sous-types M4 / M5 de la leucémie myéloïde aiguë (AML). Il fonctionne dans la traduction et l'exportation nucléocytoplasmique d'ARNm en se liant à la coiffe m7G des ARNm possédant des codes USER spécifiques dans leur région UTR 5' et/ou 3'. En reconnaissant ces codes USER, le complexe dans lequel se trouve eIF4E régule de manière coordonnée l'expression de gènes essentiels à la croissance, à la prolifération et à la survie, et ainsi, eIF4E a été placée en tant que nœud central d'un régulon d'ARN régissant la prolifération. En analysant les voies dans lesquelles l’export est régulé de façon coordonnée par eIF4E et les effets physiologiques qui en découlent, j'ai trouvé un enrichissement de la voie biosynthétique de l'acide hyaluronique (HA) et de son principal récepteur CD44 qui sont des médiateurs clés connus des métastases cancéreuses. J’ai également démontré que l'élévation d’eIF4E modifie la surface des cellules cancéreuses en les recouvrant de protrusions riches en HA de type microvillus et enrichies d'armes de destruction métastatique. Heureusement, en dégradant le manteau HA ou en utilisant des inhibiteurs de CD44 en combinaison avec la ribavirine, nous pouvons alors nous défendre. Compte tenu de l'avantage prolifératif que confère la surexpression d’eIF4E, il est devenu un talon d'Achille attrayant pour le traitement de cancers ayant un niveau élevé d'eIF4E. En effet, lors d'un essai clinique de phase II parmi des patients atteints de leucémie myéloïde aiguë M4 / M5 réfractaire et récidivante, la ribavirine a conduit au ciblage d'eIF4E et a donné lieu à des réponses cliniques significatives, incluant des réponses complètes ou partielles. Cependant, tel qu’attendu lors d’un traitement monothérapique, les patients ayant répondu finissent par développer une résistance au médicament. Mon analyse a révélé que cette résistance est due à un mécanisme nouveau caractérisé par l'élévation du facteur de transcription Sonic Hedgehog GLI1 qui conduit à la glucuronidation du médicament et donc à la perte de l'interaction entre la drogue et sa cible. Heureusement, ce mécanisme peut être inversé en utilisant des inhibiteurs de la voie Hedgehog. En conclusion, ces découvertes fournissent de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des cellules cancéreuses agressives et résistantes. / Metastasis and chemoresistance are the leading cause of mortality among cancer patients. The discovery of molecular mechanisms governing these two processes is becoming an important area of research for the design of novel therapeutic strategies. In my thesis, I focus on understanding the role of the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) in cancer invasion and describe a novel mechanism of resistance that we discovered while studying the development of resistance to a known eIF4E inhibitor, ribavirin. eIF4E is a potent oncogene that is known to be elevated in a multitude of cancers including M4/M5 subtypes of acute myeloid leukemia (AML). It functions in mRNA translation and nucleocytoplasmic export by binding to the m7G cap of mRNAs possessing specific USER codes in their 5’ and/or 3’ UTRs. By recognizing these USER codes, eIF4E complex coordinately regulates the expression of genes essential for growth, proliferation and survival and as such has been placed as a central node of an RNA regulon governing proliferation. When analyzing which pathways have their export coordinately regulated by eIF4E and what physiological effects arise from it, I found an enrichment in the hyaluronic acid (HA) biosynthetic pathway as well as its major receptor CD44 which are known key mediators of cancer metastasis. I demonstrate that eIF4E elevation changes the surface of cancer cells sugar-coating them with HA-rich microvillus-like protrusions that are enriched with weapons of metastatic destruction. Luckily, through degrading the HA-coat or using inhibitors of CD44 in combination with ribavirin we can strike back. Given the proliferative advantage that eIF4E overexpression conveys, this rendered it as an attractive Achilles heel for the treatment of cancers where eIF4E levels are high. Indeed, in a phase II clinical trial in refractory and relapsed poor prognosis M4/M5 AML patients, ribavirin led to eIF4E targeting and resulted in significant clinical responses including complete and partial remissions. However, as it is expected for monotherapy treatment, all responding patients eventually developed resistance to the drug. My analysis revealed that resistance is due to a novel mechanism characterized by elevation of the Sonic Hedgehog transcription factor GLI1 which leads to drug glucuronidation and the subsequent loss of drug-to-target interaction. Fortunately, this mechanism can be reversed using Hedgehog pathway inhibitors. Taken together, these findings provide novel therapeutic venues for the treatment of aggressive and resistant cancer cells.

L’adénocarcinome épithélial de l’ovaire (CEO) est le cancer gynécologique le plus mortel. La recherche de nouvelles thérapies repose principalement sur des modèles précliniques 2D et in vivo avec des lignées cellulaires (LC) pour générer les évidences nécessaires à l’initiation d’essais cliniques. Ce processus requiert des fonds substantiels en recherche/santé qui est associé à un taux d’attrition élevé laissant supposer des lacunes dans le modèle actuel. Nos publications antérieures suggèrent que la sensibilité in vitro de nos LC du CEO à la chimiothérapie carboplatin varie en 2D ou 3D. Il reste à élucider lequel de ces modèles est le plus représentatif de la réponse in vivo. De ce fait, nous avons émis l’hypothèse que le modèle 3D refléterait plus étroitement la sensibilité in vivo. L’objectif de cette étude était de caractériser la réponse au carboplatin de nos LC du CEO en monocouches et en sphéroïdes (3D), puis de les comparer à leur réponse in vivo (xénogreffes). Un total de 6 LC du CEO a été injecté dans des souris qui ont reçues trois différentes concentrations de carboplatin. Leurs réponses ont été évaluées/classées selon leurs mesures de volume tumoral et l’immunofluorescence. Ces mêmes LC ont été ensemencées dans des plaques à très faible adhérence pour former des sphéroïdes et les traiter. Des analyses de cytométrie en flux ont été effectuées afin de classer les LC selon leur concentration inhibitrice médiane (CI50). Nous avons comparé le tout aux résultats 2D (CI50) précédemment publiés. Nos résultats montrent que le système 3D démontre la meilleure concordance avec le modèle in vivo. Notamment, notre LC ultra-résistance en 2D devient plus sensible en modèle murin ou encore en 3D. Inversement, une LC ultra-sensible en 2D est plus résistante en xénogreffe et en sphéroïde. Les résultats découlant de notre étude sont importants à considérer lors d’investissement de temps et de fonds dans les études de criblage et de prédiction de réponses thérapeutiques. / Epithelial ovarian adenocarcinoma (EOC) is the most lethal gynecological cancer. The drug discovery pipeline is heavily based on preclinical models. Typically, 2D cell line (CL)-based models are used to screen compounds followed by validation in animal models to generate the evidence needed to design clinical trials. This process incurs a high cost to the research pipeline and still results in high drug attrition rates. This may in part reflect the poor translation of preclinical to clinical results and points to deficiencies in modeling. Previous work from our laboratory shows that the sensitivity of our EOC CLs to carboplatin therapy varies between 2D and 3D in vitro models, however it is unclear how these differences align with the in vivo response. We hypothesize that 3D models will more closely reflect therapeutic in vivo response. The objective of this study was to characterize the carboplatin sensitivity of EOC CLs in 2D and 3D-spheroids and compare them to in vivo response using mouse xenografts. We injected mice with 6 different EOC CLs that were treated with 3 different carboplatin concentrations. Tumor volume measurements and immunofluorescence viability stains were used to categorize CLs by their sensitivity. The same CLs were seeded in low attachment plates to form, and thereafter treat, spheroids. Flow cytometry analysis was used to classify CLs by their 50% inhibitory response (IC50). The 2D response (IC50) for these CLs has previously been published. Our results show that therapeutic response changes significantly for a single CL between different systems, and the 3D model was most concordant with the in vivo model. Our ultra-resistant CL in 2D became more sensitive in 3D/mouse models. In contrast, the highly 2D sensitive CL became more resistant in our xenograft/spheroid models. The results are important to consider when investing time/funds in drug screening and therapeutic response prediction studies.

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La radiothérapie est une modalité importante dans le traitement de néoplasie telle que le cancer pulmonaire. Cependant, les poumons sont susceptibles à des toxicités radio-induites comme la pneumonie radique et la fibrose pulmonaire radique. Plusieurs patients souffrant du cancer pulmonaire ont aussi des comorbidités tel la maladie obstructive pulmonaire chronique, qui affecte déjà leur fonction respiratoire. Actuellement, la planification de la radiothérapie tient compte de l’anatomie mais non de la fonction différentielle des poumons. La planification de la radiothérapie guidée par la fonction aurait pour but d’inclure cette fonction différentielle dans le processus de planification, évitant l’irradiation du parenchyme sain et améliorant le profil de toxicités du traitement. Différentes techniques d’imagerie fonctionnelle sont présentement à l’étude. La tomodensitométrie à double-énergie (DECT, dual-energy computed tomography) est une technique qui utilises des rayons-X d’énergie différente, permettant une meilleure différentiation du matériel. L’article présenté dans ce mémoire étudie une technique préalablement décrite de décomposition de matériaux qui utilise des cartographies d’iodine dérivées des images de DECT avec contraste. Nous avons réalisé une étude longitudinale de la perfusion pulmonaire, un indicateur de la fonction respiratoire. Des patients avec un cancer pulmonaire traités avec radiothérapie stéréotaxique ou conventionnelle ont été recrutés de façon prospective et ont eu un DECT avec contraste avant le début des traitements et 6 et 12 mois post-traitement. Des réponses fonctionnelles normalisées ont été calculées à 6 et 12 mois pour 3 catégories de dose d’irradiation : moins de 5 Gray, 5-20 Gray et plus de 20 Gray. Aux analyses statistiques, nous avons observé une corrélation de cette réponse avec la dose de radiation reçue. Les régions qui ont reçu le plus de dose ont démontré une plus grande baisse de fonction. La réponse fonctionnelle normalisée est également corrélée avec le temps écoulé post-radiothérapie. Nous avons conclu que la cartographie d’iodine dérivée du DECT permet d’évaluer l’effet de la dose de radiation sur les changements fonctionnels du parenchyme pulmonaire post-radiothérapie. Ainsi, le DECT permet d'évaluer les changements de fonction pulmonaire post-radiothérapie et pourrait être utilisé pour évaluer les dommages post-radiques. / Radiotherapy is an important modality in the treatment of malignancies such as lung cancer. However, the lungs are susceptible to radiation-induced lung injury such as radiation pneumonitis and radiation fibrosis. In addition, many lung cancer patients also suffer from comorbidities such as chronic obstructive lung disease, which affect their baseline respiratory function. Current standard of care for radiotherapy planning considers the anatomy but not the differential function of the lungs. Function-guided radiotherapy planning would seek to include the differential function of the lungs, avoiding the irradiation of healthy parenchyma, therefore improving the toxicity profile of the treatment. Currently, different functional imaging techniques are being studied for this purpose. Dual-energy computed tomography (DECT) is a technique which uses two X-rays of different energy, allowing improved material differentiation. The article presented in this thesis studies the use of a previously described 2-material decomposition technique using iodine maps derived from contrast-enhanced DECT images. This allows for the longitudinal evaluation of lung perfusion, a surrogate for respiratory function. Lung cancer patients who were treated with stereotactic radiotherapy or conventional radiotherapy were prospectively enrolled and underwent a contrast-enhanced DECT before the treatment and at 6 and 12 months post-treatment. Normalized functional responses were calculated at 6 and 12 months for three dose ranges: less than 5 Gray, 5-20 Gray and more than 20 Gray. This normalized functional response was found to correlate with the dose received. The regions receiving the most radiation dose demonstrate the greatest decrease in function. It was also found be correlated with the time elapsed after radiotherapy. We concluded that DECT-derived iodine maps can be used to evaluate the dose-response effect of radiation on lungs. DECT can therefore be an interesting technique to study post-treatment pulmonary parenchymal changes and can be used to assess post-radiation damage.

Introduction L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques est un traitement avec un potentiel curatif chez une minorité de patients ayant un diagnostic myélome multiple. Malheureusement, ce traitement est associé à un taux élevé de complications, incluant une probabilité élevée de rechute et/ou de GVH chronique limitant. L’objectif principal de cette étude est de déterminer si un entretien au bortezomib (BTZ) post-allogreffe permet de diminuer l’incidence et la sévérité de la maladie du greffon contre l’hôte (GVH) chronique. Les objectifs secondaires étaient d’évaluer la prise d’immunosuppresseur, de déterminer l’atteinte d’organe et la survie (OS et PFS) chez les patients ayant reçu ou pas du BTZ en entretien. Méthodes Dans cette étude rétrospective, nous avons comparé 46 patients ayant reçu du BTZ en entretien post-allogreffe à 61 patients n’ayant pas reçu d’entretien. Nous avons étudié l’impact du BTZ sur l’incidence et la sévérité de la GVH chronique en utilisant les critères du NIH de 2014. Résultats À 2 ans, l’incidence globale (61.2% vs 83.6%, p=0.001) et modérée/sévère (44.5% vs 77.0%, p=0.001) de GVH chronique était significativement inférieure chez les patients ayant reçu du BTZ en entretien. Les atteintes buccale (43% vs 67%, p=0.018) et ophtalmique (9% vs 41%, p=0.001) étaient diminuées de manière significative lors du diagnostic initial de la GVH chronique chez ces patients ayant reçu un entretien post-allogreffe. Une diminution de l’usage des immunosuppresseurs, dont les corticostéroïdes systémiques (45.1% vs 76.4%, p<0.001), du mycophenolate mofetil (15.5% vs 28.2%, p=0.031) et du tacrolimus (34.5% vs 70.6%, p<0.001) a été observée chez les patients ayant reçu le BTZ. La probabilité d’être vivant et sans immunosuppresseur à 3 ans post-allogreffe était de 77% chez les patients de la cohorte BTZ et 56% dans la cohorte contrôle (p=0.046). Conclusion En conclusion, un entretien avec du BTZ post-allogreffe permet de diminuer l’incidence et la sévérité de la GVH chronique. Ceci devrait donc être considéré comme une option valide chez les patients avec un myélome multiple traités avec une allogreffe. / Background Allogeneic hematopoietic cell transplant (HCT) has curative potential in myeloma but remains hampered by high rates of relapse and chronic GVHD. The primary endpoint of this study was to determine if BTZ maintenance decreases the incidence and severity of chronic GVHD using NIH criteria. The secondary endpoints were to determine the immunosuppression burden, organ involvement and survival (OS, PFS) in patients receiving or not BTZ. Study Design In this retrospective study, we compared the outcome of 46 myeloma patients who received BTZ after upfront tandem auto-allo HCT to 61 patients without maintenance. We explored the impact of bortezomib (BTZ) maintenance on incidence and severity of chronic GVHD using the 2014 NIH criteria. Results At 2 years, incidences of overall (61.2% vs 83.6%, p=0.001) and moderate/severe chronic GVHD (44.5% vs 77.0%, p=0.001) were significantly lower in BTZ recipients who had less mouth (43% vs 67%, p=0.018) and eyes (9% vs 41%, p=0.001) involvement at initial diagnosis. We report a lower use of systemic steroids (45.1% vs 76.4%, p<0.001), mycophenolate mofetil (15.5% vs 28.2%, p=0.031) and tacrolimus (34.5% vs 70.6%, p<0.001) in BTZ recipients. Probability of being alive and off systemic immunosuppressants at 3 years was 77% in BTZ recipients and 56% in controls (p=0.046). Conclusion In summary, BTZ maintenance improved incidence and severity of chronic GVHD and should be considered as a valid option in myeloma patients receiving upfront tandem auto-allo HCT.

La leucémie aigüe lymphoblastique de type B (B-LAL) est la principale cause de mortalité par maladie chez les enfants. Bien que la chimiothérapie moderne puisse guérir la majorité des patients, environ 20 % d'entre eux présentent une réponse inadéquate ou vont rechuter. La stratification des patients en sous-types moléculaires distincts grâce à la cytogénétique, à la biologie moléculaire et au profilage transcriptomique est essentielle pour adapter les thérapies en fonction des risques. Le temps nécessaire à l'analyse traditionnelle des échantillons de tumeurs empêche une intervention rapide au début du traitement. Comme alternative aux biopsies tissulaires conventionnelles, nous proposons que les vésicules extracellulaires (VE), particulièrement les exosomes présents dans le sang périphérique, sont des transporteurs potentiels de biomarqueurs tels que l’ARN. Grâce à l'analyse d'une cohorte de patients représentant deux sous-types moléculaires distincts de la B-LAL, des transcrits d'ARN encapsulés dans les exosomes ont été identifiés comme biomarqueurs non invasifs prometteurs. Ces résultats plaident en faveur d'une détection précoce et d'un suivi continu de la B-LAL de l’enfant à l'aide de biopsies liquides basées sur les exosomes. Néanmoins, le processus de purification des exosomes, long et complexe, nécessite une normalisation et une amélioration afin d'établir une crédibilité dans le suivi clinique de la maladie. Nous avons développé une nouvelle approche de capture magnétique sur une puce microfluidique, basée sur l’assemblage de nanoparticules magnétiques (MNP) en suspension pour une séparation magnétique efficace dans les biofluides. Cette technologie innovante a servi d'élément crucial au sein d'un processeur fluidique, automatisant la séparation des VE du sang total basée sur la taille et l'affinité. Au-delà de la simplification du processus, elle améliore considérablement la reproductibilité et la répétabilité de la purification des exosomes. Cette thèse présente une approche multidisciplinaire pour améliorer le pronostic du cancer. Les résultats offrent un premier aperçu du profil transcriptomique des exosomes dans le sang des patients atteints de B-ALL, révélant des biomarqueurs potentiels spécifiques au sous-type. Le dispositif microfluidique répond à un besoin pressant en permettant une purification efficace des VE à partir du sang total, prometteur pour l'application clinique. / B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) stands as the foremost cause of mortality due to disease in children. While modern chemotherapy can cure a majority of patients, around 20% exhibit inadequate response or are susceptible to relapse. Stratifying patients into distinct molecular subtypes through cytogenetics, molecular biology, and transcriptomic profiling is essential for tailoring risk-oriented therapies. However, the time required for traditional tumor sample analysis hampers swift intervention at the onset of treatment. As an alternative to conventional tissue biopsies, we proposed that extracellular vesicles (EVs), notably exosomes present in peripheral blood, are potential carriers of RNA-based biomarkers of B-ALL. Through analysis of a patient cohort representing two distinct molecular B-ALL subtypes, exosome-encapsulated RNA transcripts emerged as promising non-invasive biomarkers. These findings advocate for the early detection and ongoing monitoring of childhood B-ALL using exosome-based liquid biopsies. Nonetheless, the lengthy and intricate exosome purification process necessitates standardization and enhancement to establish credibility in clinical disease monitoring. We then developed a novel magnetic capture approach on a microfluidic chip, employing suspended magnetic nanoparticle (MNP) assemblies for efficient in-flow magnetic separation in biofluids. This innovative technology served as a crucial element within a fluidic processor, automating the purification of exosomes from whole blood through size- and affinity-based separation. Beyond simplifying the process, it significantly heightens the reproducibility and consistency of exosomes purification. This thesis presents a multifaceted approach to enhance cancer prognosis. The results offer a first insight into the transcriptomic landscape of exosomes in the blood of B-ALL patients, revealing potential subtype-specific biomarkers. The microfluidic device addresses a pressing need by enabling efficient exosome purification from whole blood, holding promise for clinical translation.