Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης ανήκει στην υπερ-οικογένεια των ιοντικών διάυλων ενεργοποιούμενων μέσω προσδέτη (ligand-gated ion channels). Οι υπομονάδες των υποδοχέων που ανήκουν στην οικογένεια αυτή, φέρουν στο αμινοτελικό τους άκρο τη χαρακτηριστική κυστεϊνική θηλιά (Cys-loop) μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης, οι οποίες συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό. Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι μεγάλες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες και χωρίζονται σε δυο κατηγορίες, τους νευρικούς και τους μυϊκούς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, καθώς και σε μη-νευρικούς ιστούς, όπως τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Επιπλέον, χωρίζονται σε δύο υποκατηγορίες, τους ετεροπενταμερείς, όπως είναι η (α4)x(β2)y, και τους ομοπενταμερείς, όπως η (α7)5. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών και εμφανίζουν στοιχειομετρία (α1)2β1γδ (στα έμβρυα) ή (α1)2β1εδ (στους ενήλικες). Ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης σε σχέση με τα υπόλοιπα μέλη της υπερ-οικογένειας, είναι ο καλύτερα μελετημένος ως προς τα χαρακτηριστικά και τη λειτουργία του. Ένας από τους κύριους παράγοντες που συνέβαλε στον εκτεταμένο χαρακτηρισμό του μυϊκού υποδοχέα είναι η δυνατότητα απομόνωσης, σε μεγάλες ποσότητες και σε λειτουργική μορφή, υποδοχέων της ακετυλοχολίνης παρόμοιων με αυτούς της νευρομυϊκής σύναψης από τα ηλεκτρικά όργανα των ψαριών Torpedo και Electrophorus. Οι πρώτες πληροφορίες για την τρισδιάστατη δομή του υποδοχέα δόθηκαν από ένα μοντέλο ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, από υποδοχέα που απομονώθηκε από το ηλεκτρικό όργανο του ψαριού Torpedo marmorata. Στη συνέχεια, η λύση της δομής ενός ομολόγου του εξωκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα, της acetylcholine binding protein (AChBP) από το σαλιγκάρι Lymnaea stagnalis έφερε και τις πρώτες πληροφορίες υψηλής ανάλυσης. Η AChBP είναι μια υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη, η οποία σχηματίζει σταθερά ομοπενταμερή, με ομολογία 20%-24% με το εξωκυτταρικό τμήμα των υπομονάδων του υποδοχέα. Πρόσφατα, η λύση της δομής της εξωκυτταρικής περιοχής της α1 υπομονάδας του υποδοχέα ποντικού, στην οποία είχε προσδεθεί ο ανταγωνιστής της ακετυλοχολίνης α-μπουγκαροτοξίνη, προσέφερε επιπλέον πληροφορίες για τα χαρακτηριστικά του υποδοχέα, όπως είναι η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR) και η συντηρημένη Cys-loop περιοχή. Παρόλα αυτά δεν έχουν δημοσιευτεί υψηλής ανάλυσης πληροφορίες για τη δομή του ανθρώπινου υποδοχέα. Επιπλέον από το φυσιολογικό ρόλο του μυϊκού υποδοχέα, ο οποίος είναι άμεσα υπεύθυνος για τη διαβίβαση της ώσης στη νευρομυϊκή σύναψη, παράλληλα ο υποδοχέας αυτός αποτελεί και στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, στα οποία ανήκει και το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στη νόσο αυτή, αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα προκαλούν μείωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη με συνέπεια να παρεμποδίζεται η δράση της ακετυλοχολίνης. Αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης εντοπίζονται στο 80%-90% των μυασθενών και η παρουσία τους θεωρείται ο κύριος παθογόνος παράγοντας για τη μυασθένεια. Ο σημαντικός ρόλος λοιπόν του υποδοχέα σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, τον καθιστά αντικείμενο εντατικής έρευνας. Η λεπτομερής ανάλυση της δομής και της λειτουργίας του θα μπορούσε να συμβάλλει στην κατανόηση της δομής και της λειτουργίας των υπόλοιπων υποδοχέων-μελών της υπερ-οικογένειας καθώς επίσης και στην εξιχνίαση του αυτοάνοσου μηχανισμού της μυασθένειας. Ωστόσο, το μεγάλο μέγεθος του μορίου του υποδοχέα, ο υδρόφοβος χαρακτήρας του και η αδυναμία απομόνωσής του από φυσικές πηγές, δυσχεραίνει την πραγματοποίηση δομικών μελετών. Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο να προκύψουν πρωτεϊνικά μόρια με δομή η οποία να πλησιάζει αρκετά τη φυσική διαμόρφωση του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης και σε ποσότητες ικανές ώστε να είναι εφικτές οι δομικές μελέτες τους. Προηγούμενα, είχαν εκφραστεί στο εργαστήριό μας οι εξωκυτταρικές περιοχές (ΕΚΠ) των υπομονάδων α1, β1, γ και ε (α1ΕΚΠ, β1ΕΚΠ, γΕΚΠ και εΕΚΠ) του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα, χρησιμοποιώντας ως σύστημα έκφρασης το ζυμομύκητα Pichia pastoris. Οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, απομονώθηκαν σε διαλυτή και γλυκοζυλιωμένη μορφή, αναγνωρίζονταν από μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της κάθε υπομονάδας, αλλά και από αντισώματα προερχόμενα από ορούς μυασθενών. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα δεν ήταν ικανοποιητικά για δομικές μελέτες. Παρόλα αυτά, οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς για μια καινούρια αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, η οποία έγκειται στην ειδική αφαίρεση των αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, χρησιμοποιώντας τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες ως ανοσοπροσροφητές. Η χρήση της α1ΕΚΠ του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητή, είχε ως αποτέλεσμα την αφαίρεση μεγάλου ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα με τη χρήση των εξωκυτταρικών τμημάτων των υπομονάδων β1, γ και ε ως ανοσοπροσροφητές. Ωστόσο, με τον τρόπο αυτό δεν επιτυγχάνεται πλήρης απομάκρυνση των παθογόνων αυτοαντισωμάτων. Η παρούσα εργασία είχε στόχο τη βελτίωση της δομής, της διαλυτότητας και των επιπέδων έκφρασης των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, έτσι ώστε να είναι κατάλληλες για δομικές μελέτες και κυρίως για να συμβάλλουν στις προσπάθειες βελτίωσης της αντιγονοειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια. Ειδικότερα, το πρώτο μέρος αφορά μελέτες σχετικές με την έκφραση της γΕΚΠ, η οποία σχημάτιζε ολιγομερή και είχε πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Σχεδιάστηκαν λοιπόν 4 μεταλλάγματα, με την προοπτική να προκύψουν πιο διαλυτά και υδρόφιλα μόρια. Οι μεταλλάξεις που σχεδιάστηκαν αφορούσαν στην αντικατάσταση συγκεκριμένων κυστεϊνών, που θα μπορούσαν να σχηματίζουν ακατάλληλους ένδο- ή δια-μοριακούς δεσμούς (μέσω δισουλφιδικών δεσμών), καθώς επίσης και στην αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής με την αντίστοιχη, πιο υδρόφιλη της AChBP. Στα δύο μεταλλάγματα που έφεραν τη Cys-loop περιοχή της AChBP, παρατηρήθηκε δραματική βελτίωση στα επίπεδα έκφρασης και στη διαλυτότητα των μορίων, ενώ ακόμη προσεγγίστηκε το αναμενόμενο μοριακό μέγεθος, όπως φανέρωσαν τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης καθώς και οι μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός. Όταν τα δύο βελτιωμένα μεταλλάγματα χρησιμοποιήθηκαν ως ανοσοπροσροφητές για την αντιγονοειδική θεραπεία που προαναφέρθηκε, παρουσίασαν βελτιωμένη ικανότητα πρόσδεσης αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, συγκριτικά με την αγρίου τύπου γΕΚΠ. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι η υδρόφοβη Cys-loop περιοχή της αγρίου τύπου γΕΚΠ συμβάλλει σημαντικά στη δημιουργία συσσωματωμάτων κατά την έκφραση της ΕΚΠ και για το λόγο αυτό ακολούθησε η αντικατάσταση αυτής της περιοχής και στις υπόλοιπες ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα. Προκειμένου να βελτιωθεί περαιτέρω η αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες να συνεκφραστούν όλες οι ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, με σκοπό να δημιουργηθούν σύμπλοκα που διαθέτουν και τις διεπιφάνειες μεταξύ των ΕΚΠ του υποδοχέα, οι οποίες πιστεύεται ότι είναι και αυτές ανοσογόνες. Στις προσπάθειες αυτές χρησιμοποιήθηκαν οι μεταλλαγμένες ΕΚΠ των υπομονάδων που φέρουν τη Cys-loop περιοχή της AChBP. Οι αρχικές συνεκφράσεις των ΕΚΠ όλων των υπομονάδων του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ήταν ανεπιτυχείς όσον αφορά στη δημιουργία συμπλόκων. Προκειμένου λοιπόν, να πραγματοποιηθεί ο συνδυασμός όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων και η δημιουργία ενός λειτουργικού μορίου, το επόμενο βήμα ήταν η σύνδεση των υπομονάδων με ένα πεπτιδικό συνδέτη επαναλαμβανόμενων αμινοξέων. Ο συνδέτης που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από οκτώ επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)8. Αρχικά κατασκευάστηκαν όλα τα ζεύγη (συγκαταμερή) που χρειάζονται, για να επακολουθήσουν πολλαπλά στάδια υποκλωνοποιήσεων, προκειμένου να σχηματιστεί το πενταμερές. Όλα τα συγκαταμερή παρουσίασαν το αναμενόμενο μοριακό βάρος όπως φάνηκε από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE), γεγονός που σημαίνει ότι ο συνδέτης δεν πρωτεολύεται και είναι ικανός να συγκρατεί τις υπομονάδες ενωμένες. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης που παρουσίασαν τα συγκαταμερή ήταν ικανοποιητικά και όλα τα συγκαταμερή που έφεραν την α1ΕΚΠ διατήρησαν την ικανότητα να προσδένουν σημασμένη α-μπουγκαροτοξίνη, η οποία προσδένεται ειδικά στην α1ΕΚΠ με υψηλή συγγένεια. Ωστόσο, τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης, φανέρωσαν ότι όλα τα συγκαταμερή εκλούονται δίνοντας ένα ευρύ φάσμα μοριακών βαρών, από μονομερή μέχρι ολιγομερή και συσσωματώματα. Τέλος, η α1ΕΚΠ-(AGS)8-γΕΚΠ παρουσίασε αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης 125Ι-α-Βgt συγκριτικά με την γΕΚΠ-(AGS)8-α1ΕΚΠ, γεγονός που σημαίνει ότι η σειρά με την οποία συνδέονται οι υπομονάδες, παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση των μορίων. Στην προσπάθεια βελτίωσης της διαμόρφωσης και των χαρακτηριστικών των συγκαταμερών, έγινε χρήση ενός μεγαλύτερου συνδέτη, αποτελούμενου από έντεκα επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)11, ωστόσο δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα τελικά προϊόντα έκφρασης. Όσον αφορά στη χρήση των συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα συγκαταμερή διατήρησαν πλήρως την ικανότητα να προσδένουν αυτοαντισώματα από τους ορούς των μυασθενών, αν και δε βελτίωναν περαιτέρω την ικανότητα ανοσοπροσρόφησης των επιμέρους ΕΚΠ. Συμπερασματικά λοιπόν, καταλήγουμε ότι η αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής των ΕΚΠ των υπομονάδων με την αντίστοιχη, υδρόφιλη περιοχή του ομολόγου AChBP, οδηγεί στη δημιουργία μορίων με βελτιωμένα χαρακτηριστικά, όπως είναι τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα των μορίων. Τα μόρια αυτά μπορούν στη συνέχεια να συνδεθούν με ένα πεπτιδικό συνδέτη και να παραχθούν συγκαταμερή με σωστή διαμόρφωση, τα οποία διατηρούν τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τους, όπως είναι η πρόσδεση σημασμένης α-μπουγκαροτοξίνης και η πρόσδεση αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν την πεποίθηση ότι είναι εφικτή η κατασκευή του ετεροπενταμερούς του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα που θα αποτελείται μόνο από τις ΕΚΠ των υπομονάδων του. / The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) belongs to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGIC), also known as the Cys-loop receptor family. The subunits of the receptors belonging to this superfamily carry at their N-terminal domain characteristic, highly conserved Cys-loop region, a string of 13 amino acids linked by a disulfide bond. AChRs are large, transmembrane glycoproteins, which are composed of five homologous subunits, arranged around a central ion channel and they are divided into two subgroups, the neuronal and the muscle type. The neuronal receptors are expressed mainly in the central and the peripheral nervous system, as well as in non-neuronal tissues, such as epithelial and immune cells. Moreover, the neuronal receptors are further subdivided into two categories, the heteropentamers, such as (α4)x(β2)y, and the homopentamers, such as (α7)5. The muscle AChRs are located on the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction and have the subunit composition α2βγδ (embryonic) or α2βεδ (adult). The muscle AChR is the best studied model from the superfamily of the LGICs, as far as its characteristics and function are concerned. One of the major reasons which contributed to its extensive characterization is the ability to isolate, in great amounts and in a functional form, AChRs similar to these of the neuromuscular junction from the electric organs of the fishes Torpedo and Electrophorus. An electron microscopy model of the Torpedo marmorata, purified from the electric organ of the electric ray, provided the first information about the three-dimensional structure of the AChR. The first high resolution insight was provided by the solved crystal structure of the AChBP from the snail Lymnaea stagnalis, a homologue of the extracellular domain (ECD) of the AChR. The AChBP is a soluble protein, which forms stable homopentamers and shares high homology with the ECDs of the AChR (20%-24%). Recently, the solved crystal structure of a mutated mouse α1ECD bound to α-bungarotoxin provided further information for a number of receptor-specific elements, including the main immunogenic region (MIR) and the Cys-loop. Nevertheless, high resolution information about the three-dimensional structure of the human AChR has not been reported so far. In addition to the physiological role of the muscle AChR, which is responsible for mediating the neuromuscular transmission, the muscle AChR is the target for a number of acquired and hereditary diseases, including the autoimmune disease myasthenia gravis (MG). In MG, autoantibodies against the AChR cause loss of the available and functional AChRs in the neuromuscular junction, and as a consequence, the action of acetylcholine is blocked. Autoantibodies against AChR are found in nearly 80%-90% of patients with generalized MG and are considered the main pathogenic factor in MG. The important pathophysiological roles of the AChRs made them subject to intensive research. The detailed analysis of the structure and function of the AChR could contribute to the understanding of the structure and function of the rest of the members of the superfamily, as well as to the comprehension of the pathogenic mechanism of MG. However, the fact that the AChR is a big, hydrophobic molecule, difficult to purify from natural sources, make the accomplishment of structural studies hard. It is necessary to generate recombinant molecules with conformation similar to that of the native AChR, in efficient amounts, in order to perform structural studies. We have previously expressed the human muscle AChR α1, β1, γ and ε ECDs using the yeast Pichia pastoris. These recombinant proteins were purified in a soluble and glycosylated form, recognizable by both monoclonal antibodies and a considerable percentage of anti-subunit antibodies in positive sera from MG patients. However, both the expression yield and the solubility of these proteins were not satisfactory for structural studies. Nevertheless, they were successfully used for a novel, antigen-specific therapeutic approach against MG, regarding the specific removal of the autoantibodies from MG sera, using these proteins as immunoadsorbents. The use of the human α1ECD as an immunoadsorbent resulted in the removal of a great percentage of autoantibodies from sera derived from MG patients. The results were similar when the β1, γ and ε ECDs were used as immunoadsorbents. However, the complete removal of the pathogenic autoantibodies from the MG sera was not achieved. We aimed at the improvement of the structure, solubility and expression yield of the ECDs of the muscle AChR, in order to render them suitable for structural studies and mainly to use them for the amelioration of the antigen-specific therapeutic approach against MG. For this, we selected the γECD, which formed oligomers and displayed a low expression yield and constructed four mutants of the protein. The mutations were concerning the replacement of certain cysteines, which could form inappropriate intra- or inter-molecular bonding and thus aggregation, as well as the substitution of the hydrophobic Cys-loop region by its counterpart, more hydrophilic AChBP Cys-loop. The two mutants which carried the Cys-loop of the AChBP displayed a dramatic improvement at the expression yield and solubility, while they approached the expected molecular size, according to the results from gel filtration and dynamic light scattering. When these two improved mutants were used as immunoadsorbents, they exhibited an increased ability to bind autoantibodies from MG sera, compared with the wild type γECD. These results indicate that the hydrophobic Cys-loop region of the γECD importantly contributes to the formation of aggregates during the expression of the ECD, and consequently followed the replacement of this region at the rest ECDs of the muscle AChR. In order to further ameliorate the antigen-specific therapeutic approach against MG, we carried out efforts to co-express all of the ECDs of the muscle AChR, targeting to create complexes which would carry the interfaces between the ECDs, which are thought to be also immunogenic. At these efforts, the mutant forms of the ECDs which carried the Cys-loop of the AChBP were used. These initial co-expressions of the ECDs were not successful, with the respect to the creation of complexes. In order to combine the ECDs of all the subunits and construct a functional molecule, the next step was the binding of these ECDs with a linker of repeated amino acids. The linker that was used, was consisted of eight repeated triplets of the amino acids alanine-glycine-serine (AGS)8. At the beginning were constructed the pairs (concatamers) which were needed in order to follow subclonings, preparative to form the pentamer. All of the concatamers displayed the expected molecular weight, according the results of the SDS-PAGE. This fact suggests that the linker does not undergo proteolysis, and thus is capable of retaining the subunits conjoint. Furthermore, the expression yield of the concatamers was satisfactory and they retained their ability to bind radiolabelled α-bungarotoxin, which is specifically binds to the α1ECD with high affinity. However, the results from the gel filtration indicated that all the concatamers eluted in a broad spectrum of molecular weights, from monomers to oligomers. In an effort to improve the conformation and the characteristics of the concatamers, a bigger linker which was consisted of eleven repeated triplets of the amino acids alanine-glycine-serine (AGS)11 was used, but the final products where shown to be similar. With respect to the use of the concatamers at the therapeutic approach against MG, the results showed that all the concatamers retain the ability to bind autoantibodies from MG sera, although there was no further improvement in the immunoadsorbing ability of the single ECDs. Conclusively, the substitution of the hydrophobic Cys-loop of the ECDs by the corresponding, more hydrophilic of the AChBP, results in the construction of molecules with improved characteristics, such as the expression yield and the solubility. The molecules are able to be linked together and form concatamers with the appropriate conformation, retaining their functionality, such as the binding of radiolabelled α-bungarotoxin and autoantibodies from MG sera. These results demonstrate that it is feasible to construct the heteropentamer of the human muscle AChR, which will consist only of the ECDs.

Tesis (Magister en Derecho con mención en derecho penal) / Actividad formativa equivalente a Tesis (AFET)

La thèse présente est une étude canonique traitant la question de l’obligation canonique du célibat des ministres vers l’an 380 en Occident et en Orient. De fait, une comparaison entre les Traditions orientales et occidentales est effectuée. La recherche est centralisée sur l’interprétation de la péricope 1 Cor. 7, 1-9 de l’Apôtre Paul, qui fut interprétée inexactement par les papes et influença beaucoup la teneur de leurs Décrétales. Puis une analyse est faite de tous les canons orientaux du IVe siècle par les Conciles particuliers et le Concile œcuménique de Nicée comme aussi des lettres canoniques des Pères grecs. Ce matériel est une partie du droit canonique oriental. Les Conciles sont divisés en deux parties, avant et après le 380. Ensuite une approche canonique des décisions conciliaires occidentales est réalisée à travers les Conciles particuliers du IVe siècle. Ces canons présentent la première imposition de l’obligation canonique du célibat au niveau local. L’étude continue à analyser le contenu des Décrétales des trois papes : Damase, Sirice et Innocent I, qui imposent le célibat après 380, d’une manière officielle et au niveau universel en utilisant l’autorité (auctoritas) et le pouvoir (potestas) du Siège de Rome. / This thesis is a canonical study which treats the question of the canonical obligation of the celibacy of priests in 380 in West and at East. It is a comparison between the eastern and western Tradition. The Research is using as important basis the extract of 1 Cor. 7, 1-9 from Apostle Paul’s Letter. This extract was misunderstood by the popes and influenced a lot their Decrees. It has been done an analysis of all the oriental canons of 4th century of the First Ecumenical Council, of the local Councils and also of the canonical Letters of the Holy Fathers. This material is a part of the eastern canon law. The Councils are devised in two parts, before and after 380.In accordance to this there is a canonical approach to the decisions of the western councils, through the local Councils of the 4th century. Those canons present the first imposition of the canonical obligation of celibacy in a local level. The study continues by analysing the contest of the Decrees of three popes: Damasus, Siricius and Innocent I, who imposed the celibacy after 380 in an official way and in a universal level by using the authority (auctoritas) and the power (potestas) of the See of Rome.

Objective: Up-regulated expression of transcription-factor E2F1 in human visceral adipose tissue (VAT) characterizes a dysmetabolic obesity sub-phenotype. An E2F1-miRNA network has been described in multiple cancers. Here we investigated whether elevated VAT-E2F1 in obesity is associated with VAT-miRNA alterations similar to, or distinct from, those described in cancer. Furthermore, we assessed if E2F1-associated miRNA changes may contribute to the link between high- VAT-E2F1 and a dysmetabolic obesity phenotype. Methods: We assembled a cohort of patients with obesity and high-VAT-E2F1, matched by age, sex, ±BMI to patients with low-VAT-E2F1, with and without obesity (8 patients/groupX3 groups). We performed Nanostring -based miRNA profiling of VAT samples from all 24 patients. Candidate E2F1-related miRNAs were validated by qPCR in an independent cohort of patients with extreme obesity, with or without type-2-diabetes (T2DM) (n = 20). Bioinformatic tools and manipulation of E2F1 expression in cells were used to establish the plausibility of the functional VAT-E2F1-miRNA network in obesity. Results: Among n = 798 identified miRNAs, 17 were differentially expressed in relation to E2F1 and not to obesity itself. No evidence for the cancer-related E2F1-miRNA network was identified in human VAT in obesity. In HEK293-cells, overexpression/downregulation of E2F1 correspondingly altered the expression of miRNA-206 and miRNA-210-5p, two miRNAs with reported metabolic functions consistent with those of E2F1. In VAT from both cohorts, the expression of both miRNA-206 and 210-5p intercorrelated, and correlated with the expression of E2F1. In cohort 1 we did not detect significant associations with biochemical parameters. In cohort 2 of patients with extreme obesity, all those with high VAT-E2F1 showed a diabetes-complicated obesity phenotype and higher expression of miRNA-206 and miRNA-210-5p, which also correlated with fasting glucose levels (both miRNAs) and fasting insulin (miRNA-210-5p). Conclusions: Whilst the previously described cancer-related E2F1-miRNA network does not appear to operate in VAT in obesity, miRNAs-206 and 210-5p may link high-E2F1 expression in VAT with diabetes-complicated extreme obesity phenotype.

Axé autour du concept de territoire, ce mémoire est une présentation de ce que cette notion recouvre pour un groupe de chasseurs-cueilleurs de l’ouest canadien. Installés depuis des millénaires sur les contreforts des Montagnes Rocheuses au nord-est de la Colombie-Britannique et en Alberta, les Dane-zaa (« le vrai peuple »), intimement engagés dans cet environnement, ont développé des savoirs et des techniques spécifiques adaptés à une gestion logique et durable du territoire et peaufinés par les générations successives. La relation entretenue recouvre cependant bien plus qu’une exploitation physique puisque les humains et les non-humains, voisins sur un pied d’égalité, interagissent dans un rapport d’échange et de respect. Depuis l’arrivée des Euro-canadiens et la signature du Traité 8 en 1900 lequel ordonna la création d’une réserve, le territoire des Dane-zaa, cet espace de vie, d’histoire et de mémoire, s’est vu fragmenter et est devenu le lieu d’enjeux et d’intérêts politiques et économiques souvent divergents et difficilement conciliables. / Focused on the concept of land, this master’s degree thesis is a presentation of what this notion represents for a group of hunter-gatherers of western Canada. Settled for thousands of years on the foothills of the Rocky Mountains in North-East British-Columbia and in Alberta, the Dane-zaa (“The Real People”), intimately engaged in their environment, have been developing knowledge and technics adapted to a rational and sustainable land management, generation after generation. However, this relationship does not only concern the exploitation of the resources the land provides, but also the bonds between humans and non-humans who share it. Since the arrival of the first euro-Canadians settlers and the signature of Treaty 8 in 1900 which ordered the creation of a reserve, the land of the Dane-zaa, their “home” and a space of history and memory, has been fragmented and has become the site of political and economic stakes and interests often divergent and which can hardly been reconciled.

Le lessivage du lutum (0-2 µm) est un de processus majeurs de la pédogenèse, qui a néanmoins été peu quantifié et modélisé. Ce processus ainsi que la bioturbation ont été quantifiés ici en couplant des différents systèmes isotopiques (137Cs, 210Pb (xs), 10Be atmosphérique, 206/207Pb, δ13C, 14C) à une modélisation numérique par une équation de diffusion-convection à paramètres variables avec la profondeur. Cette méthode originale a été appliquée sur des anthroposéquences de Luvisols développées sur du loess et différantes de par leur utilisation (culture, prairie ou forêt) et leurs pratiques agricoles (travail du sol, apport du fumier). Nos résultats montrent que 91 ± 9 % du 137Cs et 80 ± 9 % du 10Be sont associés au lutum et ainsi peuvent effectivement tracer des transferts verticaux de matière solide dans les sols à pH > 5 et à teneur en carbone organique faible. Le partage du plomb entre les différentes phases solides est plus complexe. En considérant deux compartiments pour les isotopes (macropores ou la matrice de sol), nous avons conçu un modèle multi-isotopique permettant de quantifier la contribution des transferts de matière solide à la distribution verticale de la fraction 0-2 µm actuelle. Le lessivage est responsable de 9 à 66 % de l'accumulation de lutum dans l'horizon Bt. Le coefficient de diffusion permet de quantifier le taux de mélange par la bioturbation. La modélisation multi-isotopique est une méthode de prédilection pour les études modernes de la pédogenèse et des processus de la zone critique. / Clay translocation is one of the major soil forming processes, howeverit is poorly quantified and modeled. We propose to quantify it togetherwith bioturbation by combining different isotopic systems (137Cs , 210Pb (xs),meteoric 10Be, 206/207Pb, δ13C, 14C) with numerical modeling based on a nonlineardiffusion-convection equation with depth dependent parameters. Thisnovel method has been applied on Luvisol anthroposequences developed onloess, differing by their land use (cropping versus grassland or forest) andtheir agricultural practices (reduced tillage, no tillage and manure input).Our results show that as much as 91 ± 9 % and 80 ± 9 % of 137Cs and10Be, respectively, are associated to the clay size fraction (0-2 µm) and canthus effectively trace vertical solid matter transfers in soils with pH > 5 andlow organic carbon. Lead partitioning between different solid phases is morecomplex. Considering two spatial distributions of isotopes (macropores or soilmatrix), we built up a multi-isotopic modelling approach that simulates theexperimental data with the common set of transfer parameters and allowedus to quantify the relative contributions of vertical solid matter transfers topresent-day 0-2 µm vertical distributions. Clay translocation is responsiblefor 9 to 66 % of the clay accumulations in the Bt-horizon. The diffusion coefficientalso quantifies the rate of soil mixing by bioturbation. Modeling of thekinetics of solid matter transfer at multiple spatio-temporal scales should becomea method of predilection in modern pedogenic and critical zone studies.

Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία αξιολογήθηκε η συνδυαστική θεραπευτική φαρμακευτική αγωγή των HIV οροθετικών ασθενών βασιζόμενη σε 2 δείκτες: 1) στο ιϊκό φορτίο VL (Varial Load, copies/ml) που εκφράζει τις συγκεντρώσεις του RNA του HIV στο αίμα και 2) στον αριθμό των CD4 Τ-λεμφοκυττάρων (κύτταρα/mm3) που εκφράζει των αριθμό των κυττάρων τα οποία βοηθούν τον ασθενή να καταπολεμήσει την λοίμωξη. Συγκεντρώθηκαν δεδομένα από 278 ασθενείς και 32 ‘παλιούς’, από όλη την Ελλάδα, για το χρονικό διάστημα 1990-2006 (Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Ρίο). Για καθέναν από τους ασθενείς ελήφθησαν δεδομένα σε φύλλα του excel, μη κατηγοριοποιημένα, και για καθέναν υπήρχαν από 20 έως 100 μετρήσεις. Μια τόσο εκτεταμένη συγκέντρωση δεδομένων για HIV οροθετικούς ασθενείς γίνεται για πρώτη φορά στην Ελλάδα. Η θεραπεία για τον HIV περιλαμβάνει συνήθως 3 ή περισσότερα φάρμακα (HAART). Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 3 κατηγορίες αντιρετροϊκών φαρμάκων: 1. Νουκλεοσιδικοί αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης (NRTIs) (ομάδα πράσινη), (10 φάρμακα) 2. Mη νουκλεοσιδικοί αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης (NNRTIs) (ομάδα κίτρινη), (3 φάρμακα) 3. Αναστολείς των πρωτεασών (PIs) (ομάδα μπλέ) (11 φάρμακα) Οι ασθενείς ανάλογα με την αγωγή της πρώτης θεραπείας τους κατηγοριοποιήθηκαν σε ομάδες (4) και σε υποομάδες με βάση τα επιμέρους φάρμακα κάθε ομάδας: Ομάδα πράσινη (ΝRTIs) (72 ασθενείς) Ομάδα πράσινη- μπλε (ΝRTIs-PIs) (139 ασθενείς)και 8 επιμέρους υποομάδες Ομάδα πράσινη- κίτρινη (ΝRTIs-NΝRTIs) (35 ασθενείς)και 2 επιμέρους υποομάδες Ομάδα πράσινη-κίτρινη-μπλε (ΝRTIs-NΝRTIs- PIs) (3 ασθενείς) Οι ασθενείς των ομάδων και υποομάδων μελετήθηκαν ξεχωριστά, χωρισμένοι σε μη-πεπειραμένους (naïve) και σε πεπειραμένους (experienced). Η αξιολόγηση της θεραπείας των ασθενών (κατά ομάδες και υποομάδες) έγινε με βάση:  το % ποσοστό που πέτυχαν ‘μη-ανιχνεύσιμο’ VL≤50, καθώς και VL≤200 και VL≤500, ανά τρείς μήνες (διαγραμματική παρουσίαση).  Το ποσοστό των ασθενών που δεν πέτυχαν VL≤50.  Τον μέσο χρόνο που πέτυχε VL≤50 το 50% των ασθενών (ταχύτητα ανταπόκρισης στη θεραπεία).  Τη συσχέτιση των τιμών VLέναρξης και CD4έναρξης που είχαν οι επιτυχημένοι ασθενείς κατά την έναρξη της θεραπείας (κατηγοριοποίηση σε κλίμακες), καθώς και του CD4 την στιγμή επίτευξης VL≤50, με ταυτόχρονο υπολογισμό των %μεταβολών των VL και CD4. Με βάση τα παραπάνω προέκυψαν τα ακόλουθα: Η λήψη αποκλειστικά NRTIs (ποσοστό αποτυχίας VL≤50 78,5%) ήταν λιγότερο αποτελεσματική σε σχέση με συνδυαστική αγωγή NRTIs-ΡIs (επιτυχία 81,8%), ή με NRTIs-NNRTIs (επιτυχία 81,6%). Για να δράσει η αγωγή με αποκλειστικά NRTIs, απαιτείται μεγαλύτερο διάστημα, στο οποίο μπορεί η τιμή του VL να ελαττωθεί <500, αλλά είναι λιγότερο πιθανό να πέσει <200. Μεταξύ των NRTIs-PIs & NRTIs-NNRTIs λαμβάνοντας υπόψη και τον χρόνο που πέτυχε το 50% των ασθενών, η αγωγή NRTIs-NNRTIs ήταν πιο αποτελεσματική αφού επιτεύχθηκε VL≤50 σχεδόν στο 1/3 του χρόνου. Όσον αφορά τις επιμέρους υποομάδες (NRTIs-PIs & NRTIs-NNRTIs) οι naïve ασθενείς έφταναν ταχύτερα σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα VL σε σχέση με τους experienced (μικρότερη ταχύτητα ανταπόκρισης), με όλα τα ΡΙs που συνδυαζόταν με NRTIs, και είχαν μικρότερα ποσοστά αποτυχίας. Οι experienced ασθενείς (ποσοστά αποτυχίας 11 έως 87%) είχαν ως πιο επιτυχημένες αγωγές την πράσινο-μπλε4 (NRTIs-NLF), την πράσινο-μπλε3 (NRTIs-IND), ακολουθούμενη από την πράσινο-μπλε5 (NRTIs-SAQ) και λιγότερο επιτυχημένη την πράσινο-μπλε1 (NRTIs-RIT), ενώ για τις πράσινο-μπλε8 (ΝRTIs-ΑΒΤ), πράσινο-μπλε1,2 (ΝRTIs-RIT-ΙΝV) και πράσινο-μπλε1,3 (ΝRTIs-RIT-ΙΝD) δεν προέκυψαν ασφαλή συμπεράσματα. Στους naïve ασθενείς υπήρχαν διαφορές στην ταχύτητα ανταπόκρισης ανάλογα με τον ληφθέντα PI. Ταχύτερη ανταπόκριση παρατηρήθηκε με την αγωγή της πράσινο-κίτρινο (συνδυασμός NRTIs-EFV & NRTIs-VIR). Όσον αφορά την αγωγή NRTIs-ΡΙ, πιο αποτελεσματική ήταν η πράσινο-μπλέ4, ακολουθούμενη από την πράσινο-μπλέ5, ενώ αντίθετα οι συνδυασμοί πράσινο-μπλέ8 και πράσινο-μπλέ2 ήταν οι λιγότερο επιτυχημένοι. Υψηλή τιμή του CD4έναρξης και χαμηλή του VLέναρξης βοηθά στην επίτευξη VL≤50. Οι περισσότεροι naïve ασθενείς είχαν χαμηλό VLέναρξης 1.000-10.000 και υψηλό CD4έναρξης (όπως και οι περισσότεροι experienced) 300-550. Οι naïve ασθενείς της πράσινο-μπλε2 (μεγαλύτερα ποσοστά αποτυχίας) είχαν σχετικά χαμηλό VLεν (<50.000) και CD4εν>100. Οι ασθενείς της πράσινο-μπλε4, είχαν τα μεγαλύτερα ποσοστά επιτυχίας πιθανόν λόγω χαμηλού VLεν (1.000-50.000) και υψηλού CD4εν (300-750 και >750). Το 85% των ασθενών της πράσινο-μπλε5 (επιτυχημένη), είχαν VLεν <10.000 και μάλιστα όταν ήταν <1.000 η ταχύτητα ανταπόκρισης ήταν η μισή σε σχέση με όταν ήταν 1.000-10.000. Οι ασθενείς της πράσινο-μπλε8, (επιτυχημένοι ακόμα και στις υψηλές κλίμακες VLεν), είχαν μεγάλο χρόνο ανταπόκρισης. Οι περισσότεροι (n=20) ασθενείς της πράσινο-κίτρινο3, είχαν VLεν 1.000-50.000 και υψηλό CD4εν 300-550 και πέτυχαν σε μεγαλύτερο χρόνο απ’ ότι της πράσινο-κίτρινο1. Για τους experienced ασθενείς της πράσινο-μπλε2, αν και υπήρχαν ευνοϊκές συνθήκες (VLεν 1.000-50.000 και CD4εν 300-550) είχαν μεγάλο ποσοστό αποτυχίας. Οι ασθενείς της πράσινο-μπλε5 (επιτυχημένη) είχαν VLεν<10.000 και όταν το CD4εν ήταν 550-750, η ταχύτητα ανταπόκρισης ήταν 4 φορές μεγαλύτερη. Οι επιτυχημένοι ασθενείς της πράσινης ομάδας κατά την επίτευξη VL≤50 (Μ.Ο.~47 μήνες) είχαν CD4 κατά ~33% αυξημένο σε σχέση με το CD4εν. Οι επιτυχημένοι ασθενείς της πράσινο-μπλε είχαν CD4 όταν VL≤50 (Μ.Ο.~27 μήνες) αυξημένο κατά ~125% σε σχέση με το CD4εν και VLεν~80πλάσιο (Μ.Ο.~86.000). Οι επιτυχημένοι ασθενείς της πράσινο-κίτρινο είχαν επίσης ανάλογο αριθμό CD4εν, αλλά ο Μ.Ο. CD4 όταν VL≤50 ήταν μικρότερος (αυξημένος κατά 21,6% έναντι 125%). Πέτυχαν σε μόλις κατά Μ.Ο. 15 μήνες, έχοντας πολύ υψηλό Μ.Ο. VLεν (~129.000) και με ποσοστό επιτυχίας ανάλογο με αυτό της πράσινο-μπλέ ομάδας (~81,6%). Οι επιτυχημένοι naïve ασθενείς των υποομάδων πράσινο-μπλε, που είχαν τις υψηλότερες τιμές VLεν κατά σειρά αποτελεσματικότητας ήταν: Π-Μπλέ1,3(3 ασθενείς)> Π-Μπλέ1>Π-Μπλέ8. Τα CD4 των επιτυχημένων ασθενών της πράσινο-μπλέ4 την στιγμή που πέτυχαν (Μ.Ο.~22 μήνες), ήταν τα πιο υψηλά (Μ.Ο. 720). Οι επιτυχημένοι ασθενείς της πράσινο-μπλέ5 είχαν τις χαμηλότερες τιμές VLεν (Μ.Ο.~ 7.000) και CD4 την στιγμή που πέτυχαν υψηλά (Μ.Ο. ~600). Οι επιτυχημένοι ασθενείς των υποομάδων πράσινο-κίτρινο, είχαν υψηλές τιμές VL έναρξης (Μ.Ο.~130.000). Οι επιτυχημένοι experienced ασθενείς που είχαν τις υψηλότερες τιμές VLεν ήταν της πράσινο-μπλέ1 (Μ.Ο.~162.000), (αποτυχία~62%), της πράσινο-μπλέ2 (αποτυχία~87%) (Μ.Ο.~90.000), καθώς και των επιτυχημένων πράσινο-μπλέ3 και πράσινο-μπλέ4 (Μ.Ο.~86.000-130.000), ενώ της επιτυχημένης πράσινο-μπλέ5 είχαν χαμηλό VLεν (Μ.Ο.~3.000). / -

This essay deals with the legal norms for compensation for right of usage in the context of estate division due to divorce or separation between cohabitants. An estate division can often times be a lengthy process. In connection to this, it frequently happens that one of the parties moves out of the residence before the estate division is completed and that the other party remains in a home that is wholly or partially owned by the moving party. In such a situation, the question arises as to whether the remaining party is obligated to pay compensation to the moving party for the aforementioned use of his or her property. The legal norms in this area are almost exclusively based on case law, which in turn is considered to diverge significantly. In addition, there is disagreement in the doctrine regarding, among other things, what constitutes applicable law in this regard. In short, the legal situation in this area is perceived as very unclear and diffuse. The overall purpose of this essay is to is to highlight and evaluate whether lex lata in the above-mentioned area is satisfactory and well-functioning from an internally critical point of view. Furthermore, the essay aims to, based on technical and/or systematic deficiencies identified in the evaluation, propose improvements to the system in the form of new legal rules for compensation for right of usage. To map and evaluate current law, the legal dogmatic method is applied. In order to propose improvements legal political argumentation is used, however with the application of objective arguments. The mapping of lex lata shows that, for situations where there is a court order for right to stay in the residence until the estate division is completed, the applicable law can reasonably be determined. However, for situations where there is not such a court order, the applicable law is possible to strongly indicate but not to determine to a certain degree. All in all, the evaluation shows that lex lata for compensation for right of usage contains tangible and at some points serious technical and systemic deficiencies in the form of incomplete, unclear and ambiguous legal rules as well as gaps in the system. As a result, the aforementioned regulations cannot be said to live up to the legal system's generally accepted internal standards or basic concepts, and thus it cannot be considered to constitute a satisfactory or well-functioning legal system from an internally critical perspective. In order to solve the issue and remedy the identified deficiencies, proposals are made for new legal rules and new legislation. The proposals are based on the already applicable law to the extent it is possible to determine – which is very far indeed, but still not far enough.

The thesis investigates the elements of a consistent strategy for favorable acquisition and utilization of Flight Simulation Training Devices (FSTD), thus Full Flight Simulators (FFS) and Flight Training Devices (FTD). The primary purpose is to determine a knowledge-based strategy for the end-user, acquisition professional, aviation firms and institutions. Hence, it could be possible to shed a light for cooperative groups and main institutions of national innovation system involved in entrepreneurial and innovative efforts regarding complex technologies like FSTD. In the sample study, 114 pilots from varied sources were administered a questionnaire and their FFS and FTD perceptions were statistically tested regarding each &ldquo / technology&rsquo / s usefulness&rdquo / in four types of training. Another variable, each &ldquo / technology&rsquo / s ease of operation and use&rdquo / was also tested additionally via agent-based model whether it had any effect on technologies&rsquo / selection processes. It could be inferred that that aviation institutions and firms could acquire and utilize FTD as a complementary to both aircraft and FFS within a range of 30-60% depending upon type of the training. Moreover, FTD could be acquired and utilized as a substitute to FFS for Instrument Flight Training (IFT). The FTD&rsquo / s usefulness for IFT was rated as 67% by the military pilots. The research also asserts that the aviation institutions and firms as well as cooperative groups and organizations could favor the established strategy and policy during their FSTD related efforts at &ldquo / micro and meso-level&rdquo / . The final aim is to create a collaborative medium and a synergy for those agents.

The thesis deals the design and calculation of handling equipment designed for transport of Bell helicopter between the airport and hangar space. The first part contains an analysis of possible mechanisms applicable to the handling of the helicopter as well as an overview of the overall evaluation of some producers, engaged in the manufacture of this type of device. The second part presents the design, necessary calculations and drawing documentation. Handling equipment is designed for loading kapacity of 2000kg with a minimum 80 mm lift of helicopter to ensure safe transportation to the required distance.