Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-17T15:11:48Z No. of bitstreams: 2 Tese Doutorado Amanda Lucena Rosendo de Lima.pdf: 3032907 bytes, checksum: ea9ba2473dcf60494dff5524bb19ece0 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T15:11:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese Doutorado Amanda Lucena Rosendo de Lima.pdf: 3032907 bytes, checksum: ea9ba2473dcf60494dff5524bb19ece0 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / Lectinas constituem um largo grupo de proteínas ou glicoproteínas que compartilham a propriedade de reconhecer e interagir com glicanos, os quais estão envolvidos nos processos de desenvolvimento e diferenciação celular de neoplasias. O câncer de próstata (CaP) e de colo uterino são tumores malignos de alta incidência em homens e mulheres, respectivamente, e por isso têm sido alvo de inúmeras pesquisas científicas. O objetivo do nosso trabalho foi investigar a capacidade das lectinas de sementes de Cratylia mollis interagirem com o glicocódigo tecidual e sérico de pacientes com patologias prostáticas e de colo uterino. Para o conhecimento da identidade sacarídica dos glicoconjugados celulares foi utilizada a histoquímica com lectinas, as quais conjugadas à peroxidase foram aplicadas em cortes de biópsias de próstata e colo uterino. Para purificação e caracterização parcial de glicoproteínas dos soros de pacientes com alterações prostáticas e indivíduos sadios, a cromatografia de afinidade com Cramoll-1,4 imobilizada e SDS-PAGE foram utilizadas. A histoquímica mostrou que as lectinas de C. mollis ligam-se diferentemente aos glicoconjugados expostos pelas células prostáticas (normal, hiperplasia benigna prostática e câncer de próstata) e do colo do útero (normal, neoplasia intra-epitelial cervical III e carcinoma celular escamoso). Através da cromatografia de afinidade com Cramoll-1,4 imobilizada, os soros de indivíduos normais, com hiperplasia benigna prostática e em diferentes estágios do CaP apresentaram expressão diferencial de glicoproteínas. Os resultados obtidos sugerem que as lectinas de Cratyia mollis são efetivos biomarcadores histoquímicos dos processos de diferenciação celular anormal nos tecidos prostáticos e cervicais uterinos. Essas lectinas também mostraram ser ferramentas para identificar o padrão de expressão de glicoproteínas durante os processos de desenvolvimento patológico prostático.

A modulação da forma e tamanho em órgãos vegetais depende do controle temporal e espacial de divisão e expansão celular. Entretanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos moleculares que regulam este processo durante o desenvolvimento floral. O estudo da via de sinalização de SCI1 (Stigma/style Cell Cycle Inhibitor 1) pode contribuir para o entendimento do processo de crescimento das flores. Este gene produz uma proteína, localizada no nucléolo, que está relacionada à inibição da proliferação celular no estigma e no estilete de Nicotiana tabacum, modulando o tamanho destes órgãos florais. Experimentos feitos para a identificação de parceiros de interação de SCI1 identificaram as proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum como candidatas à interação. A família 14-3-3 é composta de proteínas altamente conservadas, que formam dímeros em sua conformação nativa e são responsáveis pela modulação da atividade das mais variadas proteínas em resposta a sinais intracelulares. Por isso, estas proteínas estão associadas à regulação de uma série de processos, incluindo o metabolismo, transcrição, ciclo celular, entre outros. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo estudar as proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum e o seu papel durante o desenvolvimento floral. Os resultados aqui obtidos revelaram que a 14-3-3A possui localização citoplasmática e nuclear, enquanto a 14-3-3D se distribui apenas no citoplasma. Também foi evidenciado que estas proteínas são capazes de formar homodímeros e heterodímeros entre si. Os homodímeros de 14-3-3A estão distribuídos no citoplasma e no núcleo, enquanto os homodímeros de 14-3-3D e heterodímeros se encontram apenas no citoplasma. Adicionalmente, a interação in vivo entre a 14-3-3A e SCI1 foi confirmada por BiFC, apresentando localização nuclear, fora do nucléolo. Análises in silico da sequência de aminoácidos de SCI1 identificaram duas regiões putativas de reconhecimento por proteínas 14-3-3s. Estas regiões estão sendo analisadas funcionalmente por meio de ensaios de BiFC com sequências mutadas de SCI1. A análise deste conjunto de resultados, juntamente com outros resultados obtidos em nosso laboratório, sugere que apenas homodímeros de 14-3-3D e heterodímeros formados entre 14-3-3A e 14-3-3D sejam capazes de interagir com SCI1. Adicionalmente, a localização nuclear dessa interação difere daquelas observadas para SCI1 e para as 14-3-3s individualmente, sugerindo que as 14-3-3s migrem para o núcleo para interagir com SCI1. Nossa hipótese é de que as proteínas 14-3-3s possam modular a localização subnuclear de SCI1. Com o objetivo de levantar dados a respeito das possíveis funções desempenhadas pelas proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum, foram identificados os grupos de possíveis ortólogos dessas proteínas em A. thaliana, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum e N. benthamiana. Esta análise mostrou que os ortólogos às 14-3-3A e D em Arabidopsis estão associados ao ciclo celular, o que sugere que as proteínas de tabaco possam ter conservado essa função. Além disso, também foram produzidas plantas transgênicas silenciadas para cada uma dessas 14-3-3s de maneira independente. A análise dos fenótipos das plantas transgênicas não levou à elaboração de uma hipótese definitiva sobre a função dessas 14-3-3s no desenvolvimento floral. No entanto, algumas plantas transgênicas apresentaram estruturas menores, especialmente as pétalas, sugerindo que estas proteínas podem estar envolvidas no controle do tamanho de órgãos vegetais. / The modulation of size and shape in plant organs depends on temporal and spatial control of cell division and expansion. However, the molecular mechanisms that regulate this process during floral development are poorly understood. The study of SCI1 (Stigma/style Cell Cycle Inhibitor 1) signaling pathway can contribute to the understanding of the flower growing process. This gene produces a protein which is located in the nucleolus and is related to the inhibition of cell proliferation in the Nicotiana tabacum stigma and style, modulating the size of these organs. Experiments performed to identify SCI1 interaction partners have identified the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins as interaction candidates. The 14-3-3 family is composed of highly conserved proteins, which form dimers in their native conformation and are responsible to modulate the activity of a large variety of proteins in response to intracellular signals. Therefore, these proteins are associated to the regulation of several processes, including metabolism, transcription, and cell cycle, among others. In this context, the present work aimed to study the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins and their role during flower development. The results here obtained revealed that 14-3-3A is located in the nucleus and the cytosol, while 14-3-3D protein is distributed only in the cytosol. It was also shown that these proteins can form homodimers and heterodimers with each other. Homodimers of 14-3-3A are distributed in nucleus and cytosol, while 14-3-3D homodimers and heterodimers are located only in the cytosol. Furthermore, the in vivo interaction between SCI1 and 14-3-3A was confirmed by BiFC, showing nuclear localization, outside the nucleolus. In silico analyzes of SCI1 amino acid sequence identified two putative regions of recognition by 14-3-3 proteins. These regions are being evaluated by BiFC assays with SCI1 mutated sequences. The analyses of this set of results, together with other results obtained in our laboratory, suggests that only 14-3-3D homodimers and heterodimers between 14-3-3A and 14-3-3D are capable to interact with SCI1. Moreover, the nuclear localization of this interaction differs from the ones observed for SCI1 and for the 14-3-3s individually, which suggests that the 14-3-3s migrate to the nucleus to interact with SCI1. Our hypothesis is that the 14-3-3 proteins can modulate the subnuclear localization of SCI1. To obtain data concerning the possible roles of the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins, groups of possible orthologous of these proteins in A. thaliana, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum and N. benthamiana were identified. This analysis has shown that the orthologs of 14-3-3A and D in Arabidopsis are associated to the cell cycle, suggesting that the tobacco proteins might have conserved this function. Furthermore, transgenic plants silenced for each of the 14-3-3s independently were also produced. Phenotype analyzes of transgenic plants did not lead to a definitive hypothesis about the function of these 14-3-3s during floral development. However, some transgenic plants exhibited smaller structures, specially petals, which suggests that these proteins may be involved in the size control of plant organs.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:27:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1002_1.pdf: 528686 bytes, checksum: 535bcf01de6958ff7151de8b39e5c67f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Universidade Federal Rural de Pernambuco / Nesta dissertação provaremos uma conjectura proposta por Leo : uma matróoide M minimalmente 3-conexa suficientemente grande tem pelo menos 5|E(M)|+30 9 dos seus elementos pertencentes a alguma tráade. Também é fornecida uma cota para o número de elementos pertencentes a tríades em matróides 3-conexas com poucos elementos removíveis. Ambas as cotas são atingidas e são construidas famílias infnitas de matróides que atingem tais cotas. É feita ainda uma nova demonstraçao de resultados obtidos por Lemos e Leo sobre tríades que intersectam circuitos com no máximo um elemento removível em matróides 3-conexas

Les Facteurs de transcription du groupe PEA3 (Pea3, Erm et Er81) font partie de la famille d’oncogènes ETS. Leur expression est souvent observée lors de la mise en place des organes par morphogenèse de branchement tels que les poumons ou encore la glande mammaire. De plus une expression aberrante de ces facteurs de transcription est corrélée au caractère cancéreux de nombreux tissus tels que le côlon, les poumons ou encore le sein. Ainsi, l’expression d’Erm dans les tumeurs du sein est associée à un mauvais pronostic pour les patientes et celle de Pea3 constitue un marqueur de l’agressivité tumorale. Enfin, en qualité de facteur de transcription Pea3 module l’expression de gènes spécifiques alors appelés gènes cibles. Même si certains de ces gènes sont déjà bien caractérisés beaucoup de choses restent à faire pour comprendre les mécanismes moléculaires régulés par Pea3. Dans ce contexte lors de ma thèse je me suis intéressé à l’étude du rôle du facteur de transcription Pea3 dans les processus de morphogenèse et de tumorigenèse mammaires selon deux approches complémentaires : 1- l’étude des propriétés morphogénétiques modulées par Pea3 lors des étapes de morphogenèse et de tumorigenèse mammaires, 2- la recherche et la caractérisation de gènes régulés par Pea3 dans ce même contexte, par une analyse transcriptomique à grande échelle en utilisant des puces à ADN. Ces deux points sont développés grâce à l’utilisation de modèles cellulaires dans lesquelles nous modulons l’expression de Pea3. Les cellules épithéliales mammaires TAC 2.1 modèle de morphogenèse mammaire dans lesquelles nous surexprimons Pea3 et les cellules mammaires transformées MMT, modèle de tumorigenèse mammaire dans lesquelles nous inhibons l’expression du facteur de transcription Pea3. Au cours de ma thèse nous avons ainsi pu montrer l’importance du facteur de transcription Pea3 dans le contrôle des propriétés de migration, d’invasion et de prolifération des cellules cancéreuses TAC et MMT. En accord avec ces données, la recherche des gènes dont l’expression est régulée par Pea3 dans nos deux modèles cellulaires suite à la modulation de Pea3, a permis d’identifier de nombreux gènes capables de réguler la prolifération, la migration et l’invasion des cellules. Parmi ces gènes nous nous sommes intéressés au gène cycline d2 bien connu pour son implication dans le contrôle de la progression du cycle cellulaire. Nous avons pu montrer que le gène cycline d2 est un gène cible direct du facteur de transcription Pea3 qui module l’expression dans le modèle cellulaire TAC des deux transcrits (cycline d2 et cycline d2 trc) issus de ce gène et décrits à ce jour. L’étude de la fonction des protéines Cycline D2 et Cycline D2 Trc dans les cellules TAC a été entreprise. Tout d’abord la surexpression de l’une ou l’autre de ces isoformes dans les cellules TAC 2.1 modifie de façon opposée leur capacité à s’organiser dans un gel de collagène mimant l’environnement d’une glande mammaire, la Cycline D2 réprimant cette capacité et la Cycline D2 Trc l’augmentant. L’utilisation de petits ARN interférents permettant de réprimer l’expression de ces deux protéines a permis de montrer une relation fonctionnelle, toujours opposée, des deux isoformes avec le facteur de transcription Pea3 pour le contrôle de la progression du cycle cellulaire mais aussi pour l’induction d’une transition épithélio-mésenchymateuse étroitement reliée au pouvoir de migration des cellules épithéliales lors du développement des organes comme la glande mammaire mais aussi lors de la progression tumorale. Notre étude a ainsi permis de mieux définir l’implication du facteur de transcription Pea3 lors des événements de morphogenèse et de tumorigenèse de la glande mammaire. De plus elle ouvre la réflexion sur le rôle du gène cycline d2 lors de ces événements. / "Proteins of the PEA3 group (Pea3, Erm and Er81) belong to the ETS family of transcription factors. They are expressed in organs that undergo an epithelial branching morphogenesis process such as the lungs and the mammary gland. Moreover, in these organs, they are aberrantly expressed during cancer progression. Indeed, during breast cancer high Pea3 or Erm expression is respectively associated with cancer metastatic potential and a lower patient survival rate. Finally, as transcription factors they control the expression of specific genes called target genes. Even though some of these genes are known, more work is needed to understand the molecular mechanism governed by the PEA3 transcription factors. The main topic of my PhD is the study of the role of the Pea3 transcription factor during mammary morphogenesis and tumorigenesis using two complementary approaches: 1- characterize the morphogenetic properties that are controlled by Pea3 during the mammary morphogenesis and tumorigenesis events 2- find and characterize the genes that are regulated by Pea3 using a large scale transcriptomic analysis based on a microarray technology. The strategy is based on the utilization of two main cell lines in which we modulate Pea3 expression: an epithelial cell line, model of mammary morphogenesis (TAC 2.1) in which we overexpress Pea3 and a cancer cell line, model of mammary tumorigenesis (MMT) in which Pea3 expression is knocked down by means of small interfering RNA sequences. During my PhD we showed that Pea3 controls the proliferation, invasion and migration properties of TAC 2.1 and MMT cells. In agreement with these data, the transcriptomic analysis after Pea3 expression modulation in these cells (overexpression or knockdown) demonstrate that a large proportion of the Pea3 regulated genes are already known players in the regulation of the proliferation, invasion and migration processes. Amongst these genes, we focused on the cyclin d2 gene which is a well characterized actor in cell cycle progression and cell proliferation. We showed that cyclin d2 is direct Pea3 target gene. The cyclin d2 gene gives rise to two different isoforms generated by a splicing event (Cyclin D2 and Cyclin D2 Trc) that are both regulated by Pea3 at the mRNA and protein levels. We then evaluated the function of these two isoforms in the mammary epithelial cell line TAC 2.1. Overexpression of these proteins in the TAC2.1 cells leads to a modification, in an opposite fashion, of their ability to grow and organize in 3D structures within a collagen envirronement. The Cyclin D2 and the Cyclin D2 Trc respectively repressing and enhancing these abilities. The use of small interfering RNA sequences targeting specifically one or the other isoform allowed us to show a functional link between both isoforms and the Pea3 transcription factor , again in an opposite way, especially during cell cycle progression and during epithelial to mesenchymal conversion, a hallmark of development and cancer progression. Thus, this study gives new clues to understand the involvement of the Pea3 transcription factor during mammary morphogenesis and tumorigenesis, events in which the cyclin d2 gene seems to be a major player. The characterization of the molecular events governed by Pea3 should help in defining new therapeutic strategies against breast cancer progression. "

Les aérosols atmosphériques constituent l’une des plus grandes incertitudes dans l’étude des processus de changement climatique. La diversité des leurs sources et mécanismes de formation rendent la distribution spatiale des aérosols très inhomogène ce qui nécessite la mise en place d’une instrumentation et de méthodes d’observation sophistiquées. Un nouveau photomètre solaire aéroporté PLASMA permet d’effectuer des mesures d’épaisseur optique des aérosols sur une large gamme spectrale (0.34−2.25 μm) et à différentes altitudes. La détermination de la distribution verticale des propriétés optiques des aérosols peut ainsi être utilisée pour valider les algorithmes d’inversion des mesures lidar. Il est possible de remonter à la distribution de taille des particules d’aérosol à différents niveaux. En outre, l’instrument peut être installé sur un véhicule afin de mesurer les profils horizontaux du contenu des aérosols. Cette étude est consacrée à la caractérisation et à l’étalonnage de l’instrument et à l’analyse de plusieurs jeux de données. De nombreuses mesures au sol, aéroportées et depuis un véhicule ont réalisées et sont comparées aux mesures d’autres instruments. L’étude de la sensibilité de l’algorithme d’inversion de Oleg Dubovik a montré qu’il est possible d’obtenir la distribution en tailles des particules à partir de mesures d’épaisseur optique quand l’indice de réfraction est connu avec une certaine précision. Les mesures aéroportées ont ainsi été inversées et les distributions de tailles obtenues pour différentes altitudes. Cette information permettra de mieux comprendre les processus de formation et la répartition spatiale des aérosols dans l’atmosphère. / Atmospheric aerosols still represents one of the greatest uncertainty in the study of the processes of climate change. The diversity of aerosol sources and their formation mechanisms make the spatial distribution of aerosols very inhomogenous and requires numerous instruments and different approaches for their analysis. A new multi-wavelength airborne sun photometer PLASMA (Photomètre Léger Aéroporté pour la Surveillance des Masses d’Air) developed in the Laboratory of Atmospheric Optics allows providing on-board measurements of aerosol optical depth over a wide (0.34 − 2.25 μm) spectral range and at different altitudes. The information of vertical distribution of aerosol optical properties can be then used to validate the lidar processing algorithms. It is possible to retrieve from PLASMA measurements the size distribution of the aerosol particles at different levels. Also, the instrument can be installed on an automobile in order to measure the horizontal profiles of AOT. This study is dedicated to characterization and calibration of PLASMA and to the analysis of several data sets. Numerous ground-based, airborne and automobile measurements were held and compared with other instruments. Sensitivity study of the Dubovik’s inversion algorithm showed that it is possible to get the particle’s size distribution from only AOD measurements assuming a value of the refractive index within a limited domain. Airborne PLASMA measurements were inverted and size distributions of the aerosol particles were obtained at different altitudes. This new information is helpful to better understand the formation and spatial distribution of aerosols in the atmosphere.

L’objectif de ce travail de thèse consiste à la modélisation du comportement mécanique des matériaux cimentaires, tel que la pâte de ciment et le béton qui sont soumis à la carbonatation et à la lixiviation. Ces réactions chimiques entre le matériau cimentaire et le milieu agressif environnant entraînent des changements dans la microstructure du matériau et par conséquent sur le comportement mécanique et peut ainsi avoir un impact important sur la durabilité des structures. Pour la caractérisation du comportement mécanique de ces matériaux chimiquement influencés, deux approches différentes sont proposées dans cette thèse: l'approche macroscopique et microscopique. Dans la première partie, une approche macroscopique est utilisée. L'intérêt est d'utiliser un modèle élastoplastique classique pour voir l'influence de la carbonatation et la lixiviation sur les paramètres élastiques et plastiques. Ce modèle est par la suite couplé avec un modèle d’interface pour décrire le comportement mécanique et le processus de rupture des matériaux cimentaires, prenant en compte la localisation des déformations sur une bande de cisaillement. Dans la deuxième partie, en prenant avantage des modèles micro-macro, il est possible de lier explicitement l'évolution de la microstructure durant la dégradation au comportement mécanique du matériau. Deux à trois étapes d’homogénéisations basé sur la méthode sécante modifie sont nécessaires pour aboutir au critère macroscopique. Les capacités prédictives des modèles micro-macro proposés ont été démontrés a travers une large validation expérimentale. / The objective of this thesis is to model the mechanical behavior of cement based materials, such as cement paste and concrete, which are subject to carbonation and leaching. These chemical reactions between the cementitious material and the surrounding aggressive environment lead to changes in the material microstructure and consequently on the mechanical behavior, and can have a significant impact on the durability of structures. To characterize the mechanical behavior of these chemically influenced materials, two different approaches are proposed in this thesis: the macroscopic and microscopic approach. In the first part, a macroscopic approach is used. The interest is to use a classical elastoplastic model to see the effect of carbonation and lixiviation on the elastic and plastic parameters. This model is then coupled with an interface model to describe the mechanical behavior and the failure process of cementitious materials, taking into account the localization of deformations on a shear band. In the second part, by taking advantage of micro-macro models, it is possible to explicitly link the microstructure evolution during the degradation to the mechanical behavior of the material. Two or three homogenization steps based on the modified secant method are needed to reach the macroscopic criterion. The predictive capabilities of micro-macro models proposed here have been demonstrated through a wide experimental validation.

Le véhicule hybride combine plusieurs sources d’énergie pour se déplacer réduisant ainsi sa consommation. La gestion d’énergie est l’organe intelligent du véhicule qui permet de décider comment et quand utiliser ces sources. Différentes gestions sont possibles pour un même véhicule. Plus elle prend de contraintes en considération, plus elle est efficace, mais plus elle est difficile à réaliser en temps réel. La gestion du chauffage habitacle (impactant sensiblement la consommation) est cependant considérée de manière indépendante de la gestion de la chaîne de traction. Les stratégies optimales permettent de déterminer la meilleure répartition de puissance pour obtenir la consommation minimale. Si cette stratégie peut être déterminée d’un point de vue théorique en simulation, elle ne peut pas être reproduite sur un véhicule réel. En revanche, il est possible de déduire une gestion d’énergie temps réel à partir des stratégies optimales. Néanmoins, cette réalisation est complexe et pour le moment non structurée. L’objectif de la thèse est de proposer une gestion d’énergie globale d’un véhicule hybride incluant à la fois le système de traction et de chauffage. Pour cela, les échanges thermiques sont modélisés et organisés suivant le formalisme REM (Représentation Energétique Macroscopique) permettant d’unifier tous les modèles. Des validations expérimentales permettent de s’assurer de la précision des modèles. Enfin, une démarche progressive est proposée afin de construire une gestion d’énergie utilisable en temps réel et dont les résultats sont proches de l’optimum. / Hybrid vehicle uses several energy sources to reduce its fuel consumption. Energy management strategy (EMS) is one key element that enables to decide when and how to use these sources. For a single vehicle, different EMSs are possible. More the EMS considers constraints, more it is efficient but more it is difficult to solve in real time. The cabin heating system management who has a significant impact on the consumption is considered in a different EMS than the traction system management. Optimal EMS enables to evaluate the ideal power splitting to reach the minimal consumption. If this EMS can be theoretically evaluated in simulation, it cannot be implemented in real time. Nevertheless, it is possible to deduce a real time EMS using the results of the optimal EMS. This deduction is complex and no methodology is available to structure this conception. The objective of this thesis is to propose an EMS of a hybrid vehicle who includes the management of the traction system and of the heating system. To do that, the thermal exchanges are modeled and described using EMR (Energetic Macroscopic Representation) to unify all models. Experimental validations enable to evaluate the models accuracy. To finish, a step by step methodology is proposed to organize the development of a real time EMS. The results obtained with this real time EMS are closed to the optimal theoretical result.

Beaucoup de médicaments anticancéreux entrainent à plus ou moins long terme une cardiotoxicité, dont les mécanismes moléculaires restent encore très mal connus. Aujourd'hui, peu de moyens existent pour prédire, au stade du développement préclinique, le potentiel cardiotoxique de ces molécules. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail de thèse a consisté à utiliser le principe de transfert d'énergie bioluminescente par résonance (BRET) pour créer des biosenseurs de l'activité des phosphoinositide-3-kinases (PI3K) de classe IB. En effet, ces protéines kinases ubiquitaires sont des cibles pharmacologiques majeures de part leur implication dans les phénomènes cancéreux, et sont également importantes pour l'homéostasie cardiaque. Ainsi, elles pourraient constituer une cible cardiaque des agents anticancéreux participant au développement de la cardiotoxicité. Les PI3K-IB sont des hétérodimères formés d'une sous-unité catalytique (C) p110y associée à une sous-unité régulatrice (R) dont il existe deux isoformes, p87 et p101. Pour développer le senseur PI3Ky, un donneur (Rluc8) et un accepteur (GFP2) d'énergie BRET ont été fusionnés en position N- ou C-terminale de chacune des sous-unités C et R (senseur intermoléculaire). Après vérification de l'expression cellulaire de ces constructions dans les cellules HEK293T, les interactions entre les différentes paires de senseurs BRET (8 combinaisons au total) C et R ont été mesurées, en temps réel dans les cellules vivantes, à la recherche d'un couple capable de refléter l'activation de la PI3K. Nos résultats démontrent des interactions spécifiques basales entre les sous-unités C et R des couples p110y-p87 et p110y-p101. Par contre, aucune des conditions de stimulations testées (nature du récepteur, concentrations de ligand, temps de stimulation, stœchiométrie des senseurs) n'a permis de détecter des modulations du signal BRET. La présence de co-activateurs connus de la PI3Ky tels que les protéines Ras ou les protéines G hétérotrimériques n'a pas non plus aidé à la modulation du signal BRET. Nous avons ensuite tenté de créer un senseur indirect de l'activité de la PI3Ky en mesurant par BRET les interactions entre les sous-unités de PI3K et des protéines G (décrites dans la littérature) lors de l'activation de la PI3Ky. Étonnamment, les résultats révèlent une pré-association basale entre les sous-unités de la PI3Ky et celles des protéines G mais sans détection de modulation significative de signal BRET après stimulation. En conclusion, nous n'avons pu établir un biosenseur BRET de l'activité de la PI3Ky en mesurant les interactions entre les sous-unités régulatrices et catalytiques. Ainsi, l'absence de modulations détectables du signal BRET après stimulation entre les deux sous-unités pré-complexées pourrait rendre compte d'un mécanisme d'activation impliquant des changements conformationnels plutôt qu'une association-dissociation physique. Dans le futur, l'étiquetage intramoléculaire des sous-unités C ou R avec les deux sondes BRET pourrait peut-être mieux détecter ces conformations et l'activité de la PI3Ky. D'un point de vue fondamental, l'existence de pré-complexes PI3Ky-protéines G pourraient également rendre compte d'une régulation spatio-temporelle plus fine et spécifique de la kinase, en accord avec les récents concepts de modules de signalisation préformés. / Cardiotoxicity is a recognized long-term consequence of a lot of anticancer drugs, but its mechanisms are not well-known. To date, the cardiotoxic potential of anticancer drugs is difficult to predict during preclinical studies due to the lack of appropriate tools. In this context, the aim of this thesis project was to develop biosensors, based on the use of bioluminescent resonance energy transfer (BRET) principle, to measure class IB phosphoinositide-3-kinases (PI3K) activity. Indeed, these ubiquitous kinases are major pharmacological oncotargets due to their participation in cancer development, but they also have a preponderant role in cardiac homeostasis. Thus, they could represent cardiac targets for anticancer drugs participating in the development of cardiotoxicity.PI3K-IB are heterodimers of a catalytic subunit (C) p110y and a regulatory subunit (R) p87 or p101. To develop the PI3Ky sensor, BRET energy donor (Rluc8) and acceptor (GFP2) were fused at the N-terminal or C-terminal of each subunit (intermolecular sensor). After expression control of each probe in HEK293T cells, the interactions between C and R subunits for all BRET pairs (8 combinations) were studied, in living cells in real time, so to find one able to sense PI3Ky activation. Our results indicated specific basal interaction between C and R subunits from p110y-p87 and p110y-p101 pairs. However, none of the stimulation conditions tested (receptor nature, ligand concentration, stimulation kinetics and biosensor stoichiometry) allowed the detection of BRET signal modulation. Further addition of p110y co-activators such as Ras proteins or heterotrimeric G proteins, did not improve BRET modulation. We then tried to create an indirect BRET sensor of PI3Ky activity by measuring the interaction between PI3K and G proteins subunits, known to occur during PI3Ky activation. Surprisingly, results highlighted a basal pre-association of PI3Ky and G protein subunits without BRET modulations upon PI3Ky stimulation.In conclusion, we failed to create a BRET biosensor of the PI3Ky activity based on the measure of the interaction between the catalytic and regulatory subunits. However, the pre-association of PI3K subunits without BRET modulation could reflect a mechanism of PI3Ky activation based on conformationals changes of the complex between C and R subunits rather than physical association-dissociation. In the future, intramolecular labeling of the C or R subunit with the two BRET probes could better detect conformational changes and therefore PI3Ky activity. From a fundamental standpoint, the existence of PI3Ky-G proteins pre-complexes could reflect a specific spatio-temporal fine-tuning of the PI3K activity, in agreement with recent concept of preformed cell signaling platforms.

Le présent projet propose de mettre au point des marqueurs biologiques de génotoxicité environnementale permettant une approche intégrée de la complexité des contaminations. Les préoccupations relatives aux pollutions des sols et des sédiments sont récentes. La contamination métallique des sols par exemple, due aux activités anthropiques est cependant préoccupante. Ce, en termes de risques pour la santé humaine et environnementale, du fait de la persistance, de l’accumulation, et du transfert possible de ces métaux vers les nappes souterraines et vers les chaînes trophiques. Le projet de recherche porte sur la validation au laboratoire de marqueurs de génotoxicité, mis en œuvre sur plusieurs espèces représentatives en écotoxicologie terrestre, Eisenia fetida et Trifolium repens. Des travaux préliminaires, dans le cadre d’un programme « Ecotoxicité des sols contaminés par les éléments traces métalliques » soutenu par l’ANR et les FEDER, ont permis de mettre en évidence la pertinence du test des comètes avec Trifolium vis-à-vis des sols contaminées en éléments traces métalliques ou à des hydrocarbures en mélanges (lixiviats de déchet industriels). Le test des comètes (Single Cell Gel Electrophoresis Assay) permet la détection et la quantification des dommages à l’ADN (cassures double et simple brin, sites alcali-labiles) au sein d’une population cellulaire, induits par certains agents environnementaux. Il permet d’évaluer l’atteinte au génome d’organismes modèles exposés. Cette atteinte de l’ADN est une composante essentielle à estimer car elle contribue à l’origine des phénomènes de cancérogenèse. / This project proposes to develop biomarkers of environmental genotoxicity for an integrated approach to the complexity of the contamination. Concerns about pollution of soils and sediments are recent. Metal contamination of soils, for example, due to human activities, however, is worrying. This, in terms of risks to human health and environmental, because of the persistence, accumulation, and the possible transfer of these metals into groundwater and into food chains. The research project presented consists in the validation of laboratory markers of genotoxicity, implemented on several representative species in terrestrial ecotoxicology, Eisenia fetida and Trifolium repens. Preliminary work, as part of a program "Ecotoxicity of soils contaminated with trace elements" supported by the ANR and the ERDF, helped to highlight the relevance of the comet assay with Trifolium vis-à-vis Soil contaminated by trace metals or mixtures of hydrocarbons (industrial waste leachate). The comet assay (Single Cell Gel Electrophoresis Assay) allows detection and quantification of DNA damage (DNA double and single-stranded, alkali-labile sites) in a cell population, induced by certain environmental agents. It assesses the impairment of the genome of model organisms exposed. This DNA damage is an essential component to estimate because it contributes to the origin of the phenomena of carcinogenesis.

D.Sc. (Chemistry) / Please refer to full text to view abstract