Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von Formulierungsparametern auf die nasale In-vitro-Verfügbarkeit der Arzneistoffe Oxymetazolinhydrochlorid (OXY), Xylometazolinhydrochlorid (XYLO) und Natriumcromoglicat (DSCG) und untersucht das Permeationsverhalten von ausgewählten Fertigpräparaten und Eigenrezepturen an exzidierter Rindernasenmukosa sowie deren Wechselwirkungen mit einer Mucinmodelldispersion. Der Vergleich der strukturanalogen Sympathomimetika XYLO und OXY gegeneinander und mit dem Antiallergikum DSCG sollte hinsichtlich der Einfluss nehmenden Parameter den Bezug zur molekularen Struktur und den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Arzneistoffe ermöglichen. Eine mit DSCG durchgeführte In-vivo-Studie (Kaninchen) sollte klären, inwieweit die In-vitro-Daten und -Einflussparameter mit dem In-vivo-Verhalten korrelieren. Während im Resümee dieser Arbeit für XYLO und OXY Zusammenhänge zwischen ihren physikochemischen Eigenschaften, ihrer In-vitro-Permeabilität und den getesteten Formulierungsparametern aufgezeigt werden konnten, war dies für DSCG nicht möglich und ein Querbezug nicht gegeben. DSCG zeigt aufgrund seiner nachgewiesenen konzentrationsabhängigen Selbstassoziationstendenz substanzspezifisches Verhalten und reagiert sensibel auf eine Variation der Formulierungsparameter. Sowohl an der isolierten Mukosa als auch mit der Mucinmodelldispersion resultierten ausgeprägte Wechselwirkungen. Eine Kombination von DSCG mit dem Polymer Natriumhyaluronat erwies sich dabei als vorteilhaft, da sich die Mukoadhäsivität in vivo bestätigte. Eine entsprechende Formulierung scheint geeignet die Dosierungshäufigkeit von Natriumcromoglicat zu reduzieren und damit die Patientencompliance zu verbessern. Da die nasale Verfügbarkeit eines Pharmakons das Resultat eines komplexen Wechselspiels zwischen dem Wirkstoff, den vielfältigen Faktoren der applizierten Arzneiformulierung und den physiologischen Gegebenheiten ist, sind Verallgemeinerungen der Zusammenhänge schwierig und isolierte Effekte kaum zu erfassen. Die vorliegenden Resultate verdeutlichen jedoch, wie eminent wichtig die separate Betrachtung jedes Wirkstoffpräparates ist. / This thesis presents the formulation parameter's influence on the nasal in vitro availability of the model drugs xylometazoline hydrochlorid (XYLO), oxymetazoline hydrochlorid (OXY) and disodium cromoglycate (DSCG). The nasal availability has been studied using excised nasal bovine mucosa to capture the drug's in vitro permeation behaviour and a mucin model dispersion to determine the drug's interactions with the nasal mucus glycoproteins. The aim of this thesis was to determine the influence of different additionals on the nasal availability using commercial and test preparations of the model drugs. Comparing the results of the sympathomimetic XYLO, its hydroxy derivative OXY and the mast cell stabilizer DSCG with regard to the exerting formulation parameters should facilitate a relation between the drugs' molecular structure and physical-chemical properties. In the case of DSCG a concluding in vivo study on rabbits should clarify if influences established in vitro result in a altered availability in vivo too. Whereas for XYLO and its hydroxy derivative OXY connections between their physicalchemical properties, the in vitro permeation behaviour and the investigated formulation parameters excist but not for DSCG is a link between the three drugs not possible. DSCG possesses a strong substance specific component due to its concentartion dependent selfassoziation which reacts sensitively to altered formulation parameters. DSCG interacts with the isolated absorptive mucosa as well as with mucin modell dispersion in a marked extent. The combination of DSCG with the polymer sodium hyaluronate possesses in vivo an in vitro clear mucoadhesive properties which seem to be suitable to reduce DSCG's application frequency and improve thereby the patients' compliance. A drug's nasal availability results on a complex interplay of its physical-chemical properties, diverse formulation parameters and physiological conditions. Generalizations between the determined connections are difficult and isolated effects are hardly ascertainable. Additionally to the numerous formulation parameters with an impact on a drug's nasal availability it is nessecary to look at every drug formulation separatly.

Zwei Glykosylhydrolasen des acidothermophilen Bakteriums Alicyclobacillus acidocaldarius konnten charakterisiert werden. Die jeweiligen Gene wurden kloniert und sequenziert. Das intrazelluläre Enzym CelA und das extrazelluläre Enzym CelB könnten zusammen eine tragende Rolle im Abbau von beta-1,4-verknüpften Polysacchariden spielen. Ein Gen, welches für eine beta-1,4-Endoglucanase (CelA) kodiert, wurde kloniert und überexpremiert. Das Enzym wurde gereinigt. Das Protein besitzt eine Immunoglobulin-ähnliche Domäne, jedoch keine Cellulosebindedomäne. Zusammen mit den Sequenzähnlichkeiten der katalytischen Domäne zeigen diese Merkmale, daß das Protein zur Familie 9, Untergruppe E1 der Glykosylhydrolasen gehört. CelA zeigte höchste Aktivität gegenüber beta-1,4-Glucanen, besaß jedoch auch Aktivität gegen Haferspelzenxylan. Das Enzym hatte ein pH optimum von 5.5 und ein Temperaturoptimum von 70 °C. Im Protein waren zwei Zink- und zwei Calcium-Ionen gebunden, die wahrscheinlich wichtig für die Temperaturstabilität sind. Gegenüber p-Nitrophenylglykosiden ergab sich ein überraschendes Hydrolysemuster: Höchste Aktivität wurde auf dem Cellobiosidderivat gefunden, eine niedrigere Aktivität fand sich auf dem Cellotetraosederivat, wohingegen keine Aktivität auf den Glucose- und Cellotriosederivaten gemessen wurden. Das Hydrolysemuster führte zu dem Schluß, daß in CelA die Bindung von beta-1,4-Glucanen entweder auf der nicht reduzierenden Seite der -2 Substratunterbindestelle sterisch verhindert wird, oder alternativ zwei starke Substratunterbindestellen -1 und -2 vorhanden sind. Es wurde kein Signalpeptid zur Markierung des Proteins für die Translokation über die Membran gefunden. Zusammen mit der hohen Aktivität gegenüber Oligosacchariden, dem fast neutralen pH Optimum und der Inaktivierung bei niedrigem pH, deutet dies auf eine Rolle des Proteins als cytoplasmatisches Enzym zum Abbau importierter Oligosaccharide hin. Ein zweites Enzym mit Xylanase- und Cellulaseaktivität wurde zunächst aus A. acidocaldarius Kulturen gereinigt. CelB besaß eine molekulare Masse von 100 kDa und konnte nur mit Hilfe von Detergenz von den Zellen abgelöst werden. Klonierung und Sequenzanalyse des entsprechenden Gens ergaben einen offenen Leserahmen, welches für ein Präprotein kodierte, das ein typisches Sec-abhängiges Signalpeptid besaß. Gereinigtes, rekombinantes CelB und eine verkürzte Variante, der die letzten 203 Aminosäuren fehlten, zeigten Enzymaktivitäten, die dem Wildtypprotein ähnlich waren. Ein niedriges pH-Optimum von 4 wurde bestimmt. Auch die Stabilität war bei niedrigem pH hoch, wobei das Enzym nach Inkubation über nacht bei pH 1.5 bis 7 eine Restaktivität von 80 % aufwies. Das Temperaturoptimum betrug 80 °C. Bei dieser Temperatur war das Enzym auch stabil und zeigte nach 1 h 60 % Restaktivität. CelB hatte die Spezifität eines Endoenzyms, jedoch wurden nach längeren Inkubationszeiten Cellobiose und Xylobiose aus Cellulose bzw. Xylan freigesetzt. Das Enzym gehörte zur Familie 51 der Glykosylhydrolasen, aber es war erst der zweite Eintrag dieser Familie mit typischer Endoglucanaseaktivität. CelB hatte höchste Sequenzähnlichkeit mit der zweiten Endoglucanase, EGF aus Fibrobacter succinogenes, wobei diese beiden Proteine eine markante Gruppe im phylogenetischen Baum dieser Familie bildeten. Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung der katalytischen Domänen ergab, daß CelB in Übereinstimmung mit der Anpassung an einen niedrigen pH-Wert, weniger geladene Aminosäuren als die neutrophilen Enzyme der gleichen Familie besitzt. Wildtyp-CelB und unverkürztes, rekombinantes CelB waren nur in Anwesenheit von Detergenz löslich. Dagegen war das verkürzte CelB Protein vollständig in Wasser löslich. Daher wird eine Rolle der C-terminalen Region bei der Zellassoziation nahegelegt. Dieser hydrophobe Bereich zeigte lokale Übereinstimmungen der Aminosäuresequenz mit einer hydrophoben Region einer Amylase aus dem gleichen Organismus. / Two glycoside hydrolases from the thermoacidophilic bacterium Alicyclobacillus acidocaldarius were characterized and the corresponding genes cloned and sequenced. Together the intracellular enzyme CelA and the extracellular enzyme CelB may play a major role in the degradation of beta-1,4-linked polysaccharides. A gene encoding a beta-1,4-endoglucanase (CelA) was cloned and the enzyme overexpressed and purified. The protein contained an immunoglobulin-like domain but lacked a cellulose-binding domain. In conjunction with sequence similarities of the catalytic domain these features demonsrated the protein to be a member of glycoside hydrolase family 9, subgroup E1. CelA was most active against substrates containing beta-1,4-linked glucans, but also exhibited activity against oat spelt xylan. It displayed a pH optimum of 5.5 and a temperature optimum of 70 °C. The protein was found to contain one zinc and two calcium ions, likely to be important for temperature stability. It showed a striking pattern of hydrolysis on p-nitrophenyl glycosides, with highest activity on the cellobioside derivative, some on the cellotetraoside derivative and none on the glucoside and trioside derivatives. The hydrolysis patterns led to the conclusion that CelA contained a steric block for beta-1,4-linked glucans on the non reducing side of subsite -2 or, alternatively, two strong binding sites -1 and -2. No signal peptide for transport of CelA across the membrane was detected. This, together with high activity on oligosaccharides, a near neutral pH optimum, and inactivation at low pH, suggests a role for the protein as a cytoplasmic enzyme for the degradation of imported oligosaccharides. A second enzyme with xylanase and cellulase activity was purified from A. acidocaldarius cultures. CelB displayed a molecular mass of 100 kDa and could only be removed from cells with the help of detergent. Cloning and sequence analysis of the corresponding gene revealed an ORF encoding a preprotein with a typical sec-dependent signal peptide. Purified recombinant CelB and a truncated varient lacking the C-terminal 203 amino acid residues displayed enzymatic properties similar to the wild-type protein. A low pH optimum of 4 was found. Stability was also high at low pH, the enzyme retaining 80 % of activity after incubation over night from pH 1.5 to 7. The temperature optimum was 80 °C, a temperature at which the enzyme was also stable, showing 60 % residual activity after 1 h. CelB displayed an endo mode of action, but release of cellobiose and xylobiose from cellulose and xylan, respectively, was observed after prelonged periods of incubation. CelB belonged to glycoside hydrolase family 51, but it was only the second entry in this family with activity typical of an endoglucanase. Highest sequence similarity was found towards the other endoglucanase, EGF from Fibrobacter succinogenes, the two forming a distinct group in the phylogenetic tree of this family. Analysis of the amino acid composition of the catalytic domains demonstrated that CelB contains fewer charged amino acids than its neutrophilic counterparts, which is in line with adaptation to low pH. Wild-type and full-length recombinant CelB were soluble only in detergent. In contrast, truncated CelB was completely water soluble, suggesting a role of the C-terminal region in cell association. This C-terminal hydrophobic region displayed local sequence similarities to a hydrophobic region of an amylase from the same organism.

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In einer Bauxitmine bei Porto Trombetas im brasilianischen Bundesstaat Pará wurde auf rückgebauten Flächen die Entwicklung der Vegetation untersucht. Seit 1981 wird im Anschluß an den Bauxitabbau mit einheimischen Baumarten aufgeforstet. Zwischen 1993 und 1996 wurden in dem restrukturierten Gebiet acht verschiedene Flächen ausgewählt und das Wachstum der gepflanzten Bäume und der Spontanvegetation bestimmt. Der positive Einfluß des Auftragens von Oberboden aus dem Primärwald, was von der Minengesellschaft routinemäßig durchgeführt wird, wurde deutlich. Gepflanzte Bäume zeigten in den ersten Jahren über 100 % mehr Höhenwachstum im Vergleich zu Flächen ohne Oberboden. Nach elf Jahren entsprechen die Werte der Bodenfruchtbarkeit annähernd denen des Primärwaldes. Ohne Bepflanzung führt das Auftragen von Oberboden aus dem Primärwald zur spontanen Entwicklung eines Sekundärwaldes, der hauptsächlich aus Pionierarten besteht. Aus den Untersuchungen ergeben sich folgende Schlußfolgerungen: Die Pflanzung einheimischer Primärwaldbaumarten läßt in Kombination mit der natürlichen Sukzession einen Sekundärwald entstehen, der in der Artenzusammensetzung dem ursprünglichen Primärwald ähnlicher ist, als ein ausschließlich durch natürliche Sukzession entstandener Sekundärwald. Die untersuchten Aufforstungen zeigen, daß bereits kurz nach den durchgeführten Maßnahmen eine erosionsverhindernde Bodenbedeckung möglich ist und daß durch Rehabilitationsmaßnahmen relativ artenreiche Wälder entstehen können.Insgesamt, verglichen mit Literaturangaben und persönlichen Beobachtungen ähnlicher Flächen, sind die von der MRN aufgeforsteten Wälder in ihrer Sukzessionsentwicklung beschleunigt im Gegensatz zu degradierten Flächen, die nicht behandelt wurden. Aufgrund des steigenden Nutzungsdrucks auf die Primärwälder sollten bei Aufforstungsmaßnahmen auch andersartig degradierter Flächen zukünftig intensive Forschungen bezüglich land- und forstwirtschaftlicher Nutzung dieser Flächen angestrebt werden.

Kaliumkanäle ermöglichen es, den geladenen Kaliumionen selektiv die hydrophobe Lipidphase von Zellmembranen zu passieren. Sie operieren in ihren Funktionen als Antagonisten von Natrium- und Kalziumkanälen, um die elektrische Erregbarkeit von Zellen zu kontrollieren. Im ZNS der Vertebraten existiert eine Vielzahl verschiedener Kaliumkanäle, welche die zeitliche Struktur von Aktionspotentialen festlegen. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden bisher unbekannte Kanäle aus den Familien der spannungsgesteuerten Kv1-/Kv3- und der kalziumsensitiven SK-/BK-Kaliumkanäle aus dem ZNS der Regenbogenforelle kloniert. Diese wurden durch heterologe Expression in Insekten- und Säugerzellen einer biophysikalischen und pharmakologischen Charakterisierung zugeführt. Gegen fünf der bekannten Kanäle wurden spezifische Antikörper hergestellt. Mit Hilfe immunhistochemischen und PCR-Techniken konnte die gewebetypische und entwicklungsspezifische Expression der Kaliumkanäle untersucht werden. Mit den in dieser Arbeit präsentierten Daten konnte die Grundlage für eine differentielle Betrachtung der funktionellen Bedeutung und des Expressionsmusters der entsprechenden Kaliumkanäle im nativen Kontext gelegt werden.

Im Rahmen der Arbeit Molekularbiologische Charakterisierung des Glukose Phosphotransferase System Regulators MtfA aus Escherichia coli wurde das als Mlc titration factor A charakterisierte Protein MtfA auf genetischer, biochemischer und physiologischer Ebene näher charakterisiert. Mit Hilfe von gezielten Austauschen konservierter Aminosäuren konnte im aminoterminalen Bereich eine leuzinreiche Dimerisierungsdomäne und im carboxyterminalen Bereich eine Mlc Wechselwirkungsdomäne identifiziert werden. Letzteres konnte mit Hilfe von Di-Hybrid Studien unabhängig bestätigt werden. Die EIIBGlc Domäne des Glukosetransporters vermag Mlc zu binden. Durch die Membranassoziation des Transporters kann Mlc von seiner Operatorsequenz durch Titration entfernt werden. Lösliches EIIBGlc bindet ebenfalls an Mlc. Es löst aber keine Inaktivierung des Repressors aus. MtfA dagegen liegt cytoplasmatisch vor und inaktiviert Mlc vermutlich über die Inhibierung seiner Tetramerisierung. Eine parallele Expression von MtfA und EIIBGlc zeigte einen inhibitorischen Einfluss von EIIBGlc auf die Wechselwirkung von MtfA und Mlc. Physiologische Untersuchungen von MtfA weisen auf einen Einfluss des Proteins auf das Chemotaxisverhalten von E.coli hin. Darüber hinaus konnte ein relativ schwacher mtfA-Promotor nachgewiesen werden. Im Rahmen von Wachstumskompetitionsversuchen wurde ein Wachstumsvorteil des MtfA Wildtyps im Vergleich zur Mutante beim Wachstum auf Glukose und bei 42°C beobachtet. Außerdem stellte sich bei diesen Versuchen ein Unterschied in der Regulation von MtfA in den Stämmen K-12 und LJ110 heraus. Dieser konnte im Rahmen von RT-RT PCR Studien sowie mittels Western-Blot Analysen bestätigt werden. Die erfolgreiche Reinigung des Proteins ermöglichte den Nachweis der Dimerisierung in verschiedenen biochemischen Analysen, sowie die Herstellung spezifischer Antikörper.

Zur Klärung der Frage, welche Rolle die Annexinen-homologen alpha-Giardine 14 und 19 tatsächlich im Lebenszyklus des humanpathogenen Darmparasits Giardia lamblia einnehmen, wurden verschiedene molekularbiologische und biochemische Untersuchungen durchgeführt. Die Untersuchungen im Falle des alpha14-Giardins ergaben, dass das Protein nur in gewissen Regionen der membranumgebenen Bereiche der Flagellen als Perlenschnur-ähnliche Verdickungen vorlag. Zusätzlich konnte sowohl eine Assoziation mit den Mikrotubuli des Axonems als auch mit der Plasmamembran nachgewiesen werden. Bei der Fahndung nach direkten Interaktionspartnern des alpha14 belegten verschiedene Methoden eine Wechselwirkung zwischen der Ankyrin-Domäne einer Ser/Thr-Kinase und dem alpha14. Auch konnte eine Phosphorylierung des Giardins eindeutig bestätigt werden. Weitere Eigenschaften des alpha14 waren die Fähigkeit der Oligomerisierung als auch die Bindung an Glykosaminoglykane. Infolgedessen könnte das alpha14-Giardin eine durch Phosphorylierung regulierte MAP-Funktion übernehmen und somit eine wichtige Rolle für die Dynamik oder Mobilität der Flagellen spielen. Das Hauptziel der im Falle des alpha19-Giardin durchgeführten Untersuchungen war die erste biochemische Charakterisierung des Proteins. Nach Bestätigung der Expression des alpha19-Giardins konnte mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers das Protein ausschließlich in den ventralen Flagellen von G. lamblia nachgewiesen werden. Im Weiteren wurde für das alpha19 der typischen Annexin-Charakter sowie eine Phosphorylierung bestätigt. Das Vorkommen des alpha19-Giardins in der Membranfraktion des G. lamblia-Rohextraktes sowie die Solubilisierung des Proteins durch Zugabe eines Detergenz gaben erste Hinweise auf eine Fettsäuremodifikation des N-Terminus des Proteins, in dem ein Sequenzmotiv für eine Myristoylierung vorliegt. Folglich könnte das Protein an membrandynamischen Prozessen innerhalb der ventralen Flagellen beteiligt sein.

Die mit der in dieser Arbeit entwickelten Rekonstitutionsmethode gemessenen Protonentranslokationsraten erreichen physiologisch relevante Werte und liegen ca. eine Größenordnung über Messungen, die mit vergleichbaren Methoden erzielt wurden. - Die Stöchiometrie der Untereinheit c ist in vitro vom Verhältnis der Untereinheiten a, b und c abhängig. Das bedeutet, dass bei einer Rekonstitution mit verringerter Menge an Untereinheit c Fo-Komplexe mit einheitlich weniger c-Untereinheiten entstehen. Das deutet darauf hin, dass der Fo-Komplex möglicherweise mit verschiedenen c-Stöchiometrien Protonen translozieren kann und dass die Stöchiometrie der Untereinheit c einen Einfluss auf die Protonentranslokationsrate des Fo-Komplexes haben könnte. - Die Stöchiometrie der Untereinheit c im FoF1-Komplex ist in vivo von der Expressionsrate ihres Gens weitgehend unabhängig. - Das unterschiedliche Verhalten der c-Stöchiometrie bei Variation der relativen c-Menge in vitro und in vivo legen einen Regulationsmechanismus in der Zelle nahe, der die Stöchiometrie der Untereinheit c je nach physiologischer Notwendigkeit einstellt und der unabhängig von der Expressionsrate der Untereinheit c arbeitet.

The KdpFABC complex is a P-type ATPase. Several features make the inducible Kplus-transporting ATPase a unique member of this enzyme family. Aspects of structure and function of KdpB, the catalytic subunit of the complex, were examined here. Site-directed mutagenesis of the charged residues aspartate 583 and lysine 586 in the putative transmembrane helix 5 of KdpB revealed that these charges are involved in the coupling of ATP hydrolysis to ion translocation. The binding of FITC was shown to be specific and the binding site is within the nucleotide-binding domain of KdpB, most probably at lysine 395. Modification of KdpB with FITC was affected by adenosine nucleotides. A Mg2plus-dependent hydrolysis of p-nitrophenolphosphate was observed, which was inhibited by micromolar concentrations of ortho-vanadate and FITC. Low concentrations of ATP stimulated pNPP hydrolysis, while higher concentrations of ATP were inhibitory. ADP, AMP and Pi inhibited the pNPP hydrolysis. The catalytic modules of KdpB were separately synthesized, purified and biochemically characterized. It was found that KdpBN was highly soluble and could be concentrated up to 1 mM and higher. Therefore, the KdpBN domain was used for further structural analysis using nuclear magnetic resonance spectroscopy. The KdpBN domain could be purified from cells grown in minimal medium with 15N-ammonium sulfate and 13C1-6 glucose as sole nitrogen and carbon sources, respectively. The purified, labeled KdpBN protein was applied to NMR analysis. High quality multidimensional NMR spectra were obtained (M. Haupt and H. Kessler, TU Munich, personal communication) and structure calculations leading to backbone assignments were carried out. An ortholog of the H4H5 domain of KdpB from the thermopilic archaeon Methanococcus jannaschii, Mj0968, was cloned, expressed, purified, and characterized.

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