Os copolímeros de 3-hidroxibutirato e 3-hidroxihexanoato (P3HB-co-3HHx) são da família dos polihidroxialcanoatos (PHA), materiais termoplásticos e biodegradáveis acumulados por bactérias a partir de fontes de carbono renováveis. O P3HB-co-3HHx desperta interesse industrial para frações de 3HHx menores que 20 mol%, assemelhando-se ao polietileno de baixa densidade. Neste projeto, criou-se um sistema genético para controlar a composição do copolímero P3HB-co-3HHx pela indução de genes da biossíntese de precursores 3HB. Baseado no promotor lac foram construídas cinco versões do plasmídeo de controle de copolímero (pCC) utilizando o promotor Lac. Porém, mesmo com a versão mais aprimorada, não foi possível o controle de composição de P3HB-co-3HHx em Pseudomonas sp. LFM461. Através de experimentos de atividade enzimática e RT-qPCR do cDNA do gene phaA e phaB, foi possível indicar que o problema está na impossibilidade do promotor Lac de promover expressão dos genes de biossíntese de 3HB presentes nos pCC. / Polyhydroxyalkanoates (PHA) are polyesters material accumulated by bacteria which has thermoplastic and biodegradable proprieties and can be produced from renewable feedstocks. Copolymers of 3-hydroxybutirate and 3-hydroxyhexanoate (P3HB-co¬-3HHx) which contain less than 20mol% of 3HHx have being researched for its industrial proprieties. Recently, our laboratory has been researching a Pseudomonas sp. strain, LFM461, which can produce high 3HHx content when hosting PHA biosynthesis genes from Aeromonas. In this project, it was design a genetic system for control of P3HB-co-3HHX composition through induction of 3HB monomers biosynthesis. Thus, five versions of a copolymer control plasmid (pCC) was built based on Lac promoter. However, even through improvements on stability and expression profile of pCC it was not possible to stablish an assay of successful PHA composition control in Pseudomonas sp. LFM461. By enzymatic activity and RT-qPCR of cDNA experiments we have indications of problems of Lac promoter on driving the expression of 3HB genes in pCC.

O potencial de bactérias em produzir polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de óleo de soja foi avaliado com ênfase em Aeromonas spp. Dez isolados apresentando características de Aeromonas spp. (colônias amarelas em GSP agar e produção de P3HB-co-3HHx) e perfis ARDRA similares foram obtidos. Dois isolados produzindo PHAMCL foram também obtidos e experimentos de identificação adicionais serão necessários para confirmar se pertencem ao gênero Aeromonas. P3HB-co-3HHx contendo diferentes frações molares de 3HHx foram produzidos. Isolados produzindo P3HB-co-3HHx a partir de óleo de soja ou ácido láurico foram incapazes de produzir P3HB a partir de glicose sugerindo sua incapacidade de gerar monômeros 3HB a partir de acetil-CoA. Introdução de plasmídeo abrigando genes de biossíntese de P3HB de Ralstonia eutropha em isolados capazes de utilizar eficientemente óleo de soja como fonte de carbono permitiu a produção de P3HB, mas não PHA contendo monômeros de cadeia média, sugerindo uma transferência ineficiente de intermediários a partir da <font face=\"Symbol\">&#946-oxidação para PHA sintase. / The potential of polyhydroxyalknoates (PHA) production from plant oils was evaluated especially in Aeromonas spp. Ten isolates presenting features of Aeromonas spp. (yellow colonies in GSP agar and production of P3HB-co-3HHx) and similar ARDRA profiles were obtained. Two isolates producing PHAMCL were also obtained and further identification experiments will be needed to confirm their position in Aeromonas genus. P3HB-co-3HHx containing different molar fractions of 3HHx were produced. Isolates producing P3HB-co-3HHx from soybean oil or lauric acid were unable to produce P3HB from glucose suggesting their incapability to generate 3HB monomers from acetyl-CoA. Introduction of a plasmid harboring P3HB biosynthesis genes from Ralstonia eutropha into isolates able to use efficiently soybean oil as carbon source allowed the production of P3HB but not PHA containing HAMCL suggesting an inefficient transfer of intermediates from &#946-oxidation to PHA synthase.

O potencial de bactérias em produzir polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de óleo de soja foi avaliado com ênfase em Aeromonas spp. Dez isolados apresentando características de Aeromonas spp. (colônias amarelas em GSP agar e produção de P3HB-co-3HHx) e perfis ARDRA similares foram obtidos. Dois isolados produzindo PHAMCL foram também obtidos e experimentos de identificação adicionais serão necessários para confirmar se pertencem ao gênero Aeromonas. P3HB-co-3HHx contendo diferentes frações molares de 3HHx foram produzidos. Isolados produzindo P3HB-co-3HHx a partir de óleo de soja ou ácido láurico foram incapazes de produzir P3HB a partir de glicose sugerindo sua incapacidade de gerar monômeros 3HB a partir de acetil-CoA. Introdução de plasmídeo abrigando genes de biossíntese de P3HB de Ralstonia eutropha em isolados capazes de utilizar eficientemente óleo de soja como fonte de carbono permitiu a produção de P3HB, mas não PHA contendo monômeros de cadeia média, sugerindo uma transferência ineficiente de intermediários a partir da <font face=\"Symbol\">&#946-oxidação para PHA sintase. / The potential of polyhydroxyalknoates (PHA) production from plant oils was evaluated especially in Aeromonas spp. Ten isolates presenting features of Aeromonas spp. (yellow colonies in GSP agar and production of P3HB-co-3HHx) and similar ARDRA profiles were obtained. Two isolates producing PHAMCL were also obtained and further identification experiments will be needed to confirm their position in Aeromonas genus. P3HB-co-3HHx containing different molar fractions of 3HHx were produced. Isolates producing P3HB-co-3HHx from soybean oil or lauric acid were unable to produce P3HB from glucose suggesting their incapability to generate 3HB monomers from acetyl-CoA. Introduction of a plasmid harboring P3HB biosynthesis genes from Ralstonia eutropha into isolates able to use efficiently soybean oil as carbon source allowed the production of P3HB but not PHA containing HAMCL suggesting an inefficient transfer of intermediates from &#946-oxidation to PHA synthase.

A capacidade de B. sacchari acumular poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato (P3HB-co-3HHx) foi confirmada, com até 2 mol% de 3HHx no PHA total (<10% do 3HHx máximo teórico a partir do ácido), indicando flexibilidade da PHA sintase por substratos, porém alta eficiência nas vias catabólicas do hexanoato. Análise da estabilidade térmica do PHA indicou uma temperatura de degradação reduzida, compatível com a presença de unidades 3HHx. Mutantes incapazes de crescer em ácido hexanóico foram obtidos com UV e transposon mini-Tn5, que ainda acumulavam 3HHx a partir de hexanoato mas com redução na capacidade do acúmulo de 3HB e 3HHx. Foram construídos recombinantes abrigando o gene phaB (codificador de 3-cetoacil-CoA redutase) de Ralstonia eutropha ou phaJ1 e phaJ2 (codificadores de enoil-CoA hidratases R-específicas) de Pseudomonas aeruginosa. A expressão de phaB ou phaJ1 aumentou a canalização de 3HB para a PHA sintase, apesar de não aumentar as frações de 3HHx. Monômeros de 3HHx e 3HO foram detectados a partir de ácidos butírico e octanóico, respectivamente. / The ability of B. sacchari to accumulate poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate (P3HB-co-3HHx) from glucose and hexanoic acid was confirmed. 3HHx content was up to 2 mol% of PHA (<10% of the maximum theoretical 3HHx from the acid), indicating a substrate flexibility of B. sacchari PHA synthase, but high efficiency of hexanoate catabolic pathways. Thermal stability analysis of the copolymer indicated a reduced degradation temperature compatible with 3HHx units. Mutants unable to grow on hexanoic acid were obtained with UV and mini-Tn5 transposon. They still accumulated 3HHx from hexanoate, but the ability to accumulate 3HB and 3HHx was reduced. Recombinants harboring the Ralstonia eutropha phaB (encoding 3-ketoacyl-CoA reductase) and Pseudomonas aeruginosa phaJ1 and phaJ4 genes (encoding R-specific enoyl-CoA hydratases) were constructed. Expression of both phaB and phaJ1 increased the channeling of 3HB to the PHA synthase, despite no increase on 3HHx fraction was observed. 3HHx and 3HO monomers were detected from butyric and octanoic acids, respectively.

A capacidade de B. sacchari acumular poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato (P3HB-co-3HHx) foi confirmada, com até 2 mol% de 3HHx no PHA total (<10% do 3HHx máximo teórico a partir do ácido), indicando flexibilidade da PHA sintase por substratos, porém alta eficiência nas vias catabólicas do hexanoato. Análise da estabilidade térmica do PHA indicou uma temperatura de degradação reduzida, compatível com a presença de unidades 3HHx. Mutantes incapazes de crescer em ácido hexanóico foram obtidos com UV e transposon mini-Tn5, que ainda acumulavam 3HHx a partir de hexanoato mas com redução na capacidade do acúmulo de 3HB e 3HHx. Foram construídos recombinantes abrigando o gene phaB (codificador de 3-cetoacil-CoA redutase) de Ralstonia eutropha ou phaJ1 e phaJ2 (codificadores de enoil-CoA hidratases R-específicas) de Pseudomonas aeruginosa. A expressão de phaB ou phaJ1 aumentou a canalização de 3HB para a PHA sintase, apesar de não aumentar as frações de 3HHx. Monômeros de 3HHx e 3HO foram detectados a partir de ácidos butírico e octanóico, respectivamente. / The ability of B. sacchari to accumulate poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate (P3HB-co-3HHx) from glucose and hexanoic acid was confirmed. 3HHx content was up to 2 mol% of PHA (<10% of the maximum theoretical 3HHx from the acid), indicating a substrate flexibility of B. sacchari PHA synthase, but high efficiency of hexanoate catabolic pathways. Thermal stability analysis of the copolymer indicated a reduced degradation temperature compatible with 3HHx units. Mutants unable to grow on hexanoic acid were obtained with UV and mini-Tn5 transposon. They still accumulated 3HHx from hexanoate, but the ability to accumulate 3HB and 3HHx was reduced. Recombinants harboring the Ralstonia eutropha phaB (encoding 3-ketoacyl-CoA reductase) and Pseudomonas aeruginosa phaJ1 and phaJ4 genes (encoding R-specific enoyl-CoA hydratases) were constructed. Expression of both phaB and phaJ1 increased the channeling of 3HB to the PHA synthase, despite no increase on 3HHx fraction was observed. 3HHx and 3HO monomers were detected from butyric and octanoic acids, respectively.