A administração intraperitoneal de 5-fluorouracil (5-FU) no pós-operatório imediato reduz a recorrência local e prolonga a sobrevida dos pacientes com câncer colônico. Contudo, esse tratamento também pode prejudicar a cicatrização das anastomoses intestinais. O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos da quimioterapia (QT) intraperitoneal (IP) pós-operatória (PO) precoce com o 5-FU e da selagem anastomótica com o TachoSil sobre o processo de cicatrização de anastomoses colônicas. Quarenta ratos foram divididos em quatro grupos (I - IV, com dez ratos em cada) e submetidos à secção do cólon esquerdo seguida por anastomose. As anastomoses dos ratos dos grupos II e IV foram cobertas com o TachoSil. Solução salina (2 ml/dia grupos I e II) ou 5-FU (20 mg/kg/dia grupos III e IV) foi administrado por via IP uma vez ao dia, desde do procedimento cirúrgico até a morte programada dos animais no quarto dia pós-operatório. Foram realizadas medidas da pressão de ruptura e análise histopatológica das anastomoses. A perda relativa de peso foi significativamente maior nos animais do grupo III comparado a todos os demais grupos (p=0,0004). Não houve diferença significativa entre os grupos no que se refere à presença de fístulas, coleções perianastomóticas, sinais de dilatação intestinal pré-anastomótica ou aderências pós-operatórias. A pressão de ruptura foi significativamente menor no grupo III comparada a todos os demais grupos (p=0,001). A neoangiogênese foi significativamente menor no grupo III comparada aos grupos I e II (p=0,05). A infiltração fibroblástica foi significativamente maior no grupo I e em comparação ao grupo III (p=0,035). Não ocorreu diferença significativa entre os grupos no que concerne à presença de infiltração de células inflamatórias e deposição de colágeno. Os dados obtidos permitem concluir que a QT IP precoce com 5-FU afetou negativamente a fase inicial da cicatrização de anastomoses colônicas. Contudo, a selagem com o TachoSil foi capaz de reverter alguns dos efeitos adversos decorrentes da QT. / The administration of 5-fluorouracil (5-FU) during the early postoperative period can decrease local cancer recurrence but may also cause impairment of the anastomotic healing. This study examined the effects of the use of this therapy and of the anastomotic sealing with a fibrin-collagen patch (TachoSil) on the healing of colon anastomoses. Forty male rats were divided into four groups (I to IV, 10 rats each) that underwent transection and anastomosis of the left colon. The anastomoses were covered with TachoSil in groups II and IV. Saline solution (2 ml/day groups I and II) or 5-FU (20 mg/kg/day; groups III and IV) was administered intraperitoneally (IP) once daily for three days. Bursting pressure (BP) was recorded and the anastomoses were examined macroscopically and graded histologically. The relative weight loss was significantly higher in group III than in the other groups (p=0.0004). Anastomotic dehiscense, postoperative adhesion formation, perianastomotic collections, and preanastomotic dilatation did not differ significantly among groups. BP was significantly lower in group III compared to all other groups (p=0.001). Neoangiogenesis was significantly lower in group III compared to groups I and II (p=0.05). Fibroblastic activity was significantly higher in group I compared to group III (p=0.035). Inflammatory cell infiltration and collagen deposition did not differ significantly among groups. Our results shown that the early postoperative IP chemotherapy with 5-FU impaired the healing of colon anastomoses. However, anastomotic sealing with TachoSil reversed some of the negative effects of this therapy.

A administração intraperitoneal de 5-fluorouracil (5-FU) no pós-operatório imediato reduz a recorrência local e prolonga a sobrevida dos pacientes com câncer colônico. Contudo, esse tratamento também pode prejudicar a cicatrização das anastomoses intestinais. O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos da quimioterapia (QT) intraperitoneal (IP) pós-operatória (PO) precoce com o 5-FU e da selagem anastomótica com o TachoSil sobre o processo de cicatrização de anastomoses colônicas. Quarenta ratos foram divididos em quatro grupos (I - IV, com dez ratos em cada) e submetidos à secção do cólon esquerdo seguida por anastomose. As anastomoses dos ratos dos grupos II e IV foram cobertas com o TachoSil. Solução salina (2 ml/dia grupos I e II) ou 5-FU (20 mg/kg/dia grupos III e IV) foi administrado por via IP uma vez ao dia, desde do procedimento cirúrgico até a morte programada dos animais no quarto dia pós-operatório. Foram realizadas medidas da pressão de ruptura e análise histopatológica das anastomoses. A perda relativa de peso foi significativamente maior nos animais do grupo III comparado a todos os demais grupos (p=0,0004). Não houve diferença significativa entre os grupos no que se refere à presença de fístulas, coleções perianastomóticas, sinais de dilatação intestinal pré-anastomótica ou aderências pós-operatórias. A pressão de ruptura foi significativamente menor no grupo III comparada a todos os demais grupos (p=0,001). A neoangiogênese foi significativamente menor no grupo III comparada aos grupos I e II (p=0,05). A infiltração fibroblástica foi significativamente maior no grupo I e em comparação ao grupo III (p=0,035). Não ocorreu diferença significativa entre os grupos no que concerne à presença de infiltração de células inflamatórias e deposição de colágeno. Os dados obtidos permitem concluir que a QT IP precoce com 5-FU afetou negativamente a fase inicial da cicatrização de anastomoses colônicas. Contudo, a selagem com o TachoSil foi capaz de reverter alguns dos efeitos adversos decorrentes da QT. / The administration of 5-fluorouracil (5-FU) during the early postoperative period can decrease local cancer recurrence but may also cause impairment of the anastomotic healing. This study examined the effects of the use of this therapy and of the anastomotic sealing with a fibrin-collagen patch (TachoSil) on the healing of colon anastomoses. Forty male rats were divided into four groups (I to IV, 10 rats each) that underwent transection and anastomosis of the left colon. The anastomoses were covered with TachoSil in groups II and IV. Saline solution (2 ml/day groups I and II) or 5-FU (20 mg/kg/day; groups III and IV) was administered intraperitoneally (IP) once daily for three days. Bursting pressure (BP) was recorded and the anastomoses were examined macroscopically and graded histologically. The relative weight loss was significantly higher in group III than in the other groups (p=0.0004). Anastomotic dehiscense, postoperative adhesion formation, perianastomotic collections, and preanastomotic dilatation did not differ significantly among groups. BP was significantly lower in group III compared to all other groups (p=0.001). Neoangiogenesis was significantly lower in group III compared to groups I and II (p=0.05). Fibroblastic activity was significantly higher in group I compared to group III (p=0.035). Inflammatory cell infiltration and collagen deposition did not differ significantly among groups. Our results shown that the early postoperative IP chemotherapy with 5-FU impaired the healing of colon anastomoses. However, anastomotic sealing with TachoSil reversed some of the negative effects of this therapy.

Vários métodos de análise para o ensaio do quimioterápico 5-Fluorouracil (5-FU) em fluidos biológicos de humanos e animais, foram previamente relatados. Considerando que a administração do 5-FU altera de alguma maneira a morfologia e função das glândulas salivares, e que a presença do quimioterápico na mucosa oral pode levar a algumas complicações orais, este trabalho teve como objetivo de determinar a presença de 5-FU na saliva de hamsters que receberam o quimioterápico pela técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), uma vez que este modelo animal é usado nos estudos com mucosite oral e hipofunção glandular, induzidas por 5-FU. Doze animais foram divididos em 4 grupos: CP e CPI, onde os animais receberam intraperitonealmente pilocarpina (CP) ou pilocarpina + isoproterenol (CPI) e o veículo do quimioterápico, e os grupos QP e QPI, onde os animais receberam, respectivamente, os mesmos secretagogos listados acima e o quimioterápico 5-FU. Após a administração do secretagogo, foi coletada a saliva de todos os animais, por um período de 60 min. Em seguida, a saliva foi congelada a -80 ?C para posterior determinação do quimioterápico por CLAE. Após análise dos cromatogramas, e com base nos resultados obtidos, foi possível identificar a presença do 5-FU nas amostras de saliva de hamsters que receberam o quimioterápico via intraperitoneal pela técnica da CLAE. / Various analytical methods for testing the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU) in biological fluids of humans and animals have been reported previously. Whereas the administration of 5-FU alter in any way the morphology and function of the salivary glands, and that the presence of chemotherapy in the oral mucosa can lead to some oral complications, this study aimed to determine the presence of 5-FU in chemotherapy treated hamsters saliva by Liquid Chromatography High Performance (HPLC), since this animal model is used in studies of oral mucositis and gland hypofunction induced by 5-FU. Twelve animals were divided into 4 groups: intraperitoneally pilocarpine (CP), pilocarpine + isoproterenol (CPI) and the chemotherapy of the vehicle, and the QP and QPI groups where the animals were, respectively, the same secretagogues listed above and 5-FU chemotherapy. After administration secretagogue, the saliva from all animals was collected for a period of 60 min. Then the saliva was frozen at -80 ºC for subsequent determination of chemotherapy by HPLC. After analysis of chromatograms, and based on the results obtained, it was possible to identify the presence of 5-FU in Hamsters saliva samples that received intraperitoneal chemotherapy via the technique of HPLC.

Le 5-Fluorouracile (5-FU) est un anti-métabolite intensément utilisé dans les traitements chimio-thérapeutiques de nombreux cancers. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'action de cet agent anti-cancer, son impact sur la biologie cellulaire et les processus de résistance restent encore largement à déterminer. Nous avons proposé que le 5-FU, en s'intégrant dans l'ARN induit une altération de la traduction. Dans cette étude, nous avons déterminé pour la lignée de cellules de cancer colorectal HCT116 la dose et le temps de traitement qui induit une modification du comportement cellulaire sans conduire à une mort cellulaire massive. Nous avons ensuite analysé le translatome de ces cellules traitées et celui de cellules non traitées. Pour cela, les fractions cytoplasmiques ont été purifiées et séparées sur gradients de saccharose pour séparer les ARNm qui sont associés aux polysomes de ceux associés aux monosomes et des ARN libres. L'analyse des modifications du translatome induites par le 5-FU montre que cette drogue est capable de stimuler la traduction d'un grand nombre d'ARNm qui codent pour des protéines possédant diverses fonctions. Cette activation traductionnelle est probablement médiée, au moins en partie, par une action du 5-FU sur les microARN. C'est ainsi que nous avons démontré que la stimulation de la traduction de l'ARNm du gène HIVEP2 est un mécanisme dépendant du microARN miR-155 / 5-Fluorouracil (5-FU) is an anti-metabolite intensely used in chemotherapeutic treatments in various cancers. The cellular and molecular mechanisms of action of this anti-cancer agent still remain to be determined. Because 5-FU is incorporated within all classes of RNA, knowledge of the different levels of gene expression regulation affected by 5-FU will help to decipher its mode of action. We hypothesized that the translational control is altered by 5-FU treatment as a consequence of disrupted RNA metabolism. In this study, the colorectal cancer cell line HCT116 has been treated or not by different doses of 5-FU for different periods of time to determine the time and dose window that induces modifications of cell behavior without leading to an extensive cell death. Translational reprogramming was then analyzed during this time and dose window. For this, cytoplasmic fractions were purified and separated through sucrose gradients to distinguish the actively translated mRNAs that are associated with polysomes from the inactive mRNAs associated with monosomes or free mRNAs. A microarray analysis was then performed to identify the mRNAs presented in monosome and polysome fractions with and without treatment. This polysome profiling approach reveals that 5-FU treatment did not turn-off the global translation efficiency, but rather modulates translation efficiency of specific mRNAs. Secondly, more than 640 mRNAs were found to be up-translated following 5-FU treatment. Finally, we have demonstrated that 5-FU induced up-regulation of HIVEP2 by a molecular mechanism involving an action of 5-FU on miR-155

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dhesmon Lima.pdf: 3726533 bytes, checksum: d3be37b6257d9747cd2404bc48091086 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / In this work, glassy carbon paste electrodes (GCPE) were modified with porphyran- capped gold nanoparticles (GCPE/AuNps-PFR) and applied for the determination of an anticancer drug, 5-fluorouracil (5-FU), by using differential pulse voltammetry (DPV). The PFR polysaccharide was isolated from commercial Nori seaweed, and its characterization was carried out by FTIR and 13C-NMR as well as by determining its total sugar and sulfate contents, which resulted in 82.8% and 11.9%, respectively. These experiments confirmed the chemical identity and purity of the extracted polysaccharide, which was used as reducing and capping agent to the synthesis of gold nanoparticles (AuNps-PFR). The temperature and the concentrations of AuCl4- and PFR for the AuNps-PFR synthesis were optimized by a 23 full factorial design including a central point assayed in triplicate. The smallest particles were produced with 128.7 nm by employing a temperature of 70 °C and concentrations of 2.5 mmol L-1 for AuCl4- and 0.25 mg mL-1 for PFR. The characterization of the AuNps-PFR nanocomposite was performed by UV-VIS, FTIR and DLS spectroscopies, FESEM, zeta potential and XRD. The UV-VIS spectrum showed an absorption at 524 nm (plasmon band), with no significant changes in its shape and absorption frequency for 90 days. This observation suggests that the AuNps-PFR are stable in suspension, which is in good agreement with the zeta potential of -30.5 mV obtained for the sample. The FTIR spectrum revealed that interactions between the AuNps and the PFR may exist, as a consequence of displacements in the frequency of the bands in the AuNps-PFR spectrum compared to that obtained for the PFR individually. The electrochemical characterization of the porphyran modified GCPE (GCPE/PFR) was carried out by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy in the presence of the Fe(CN)63-/4- probe, revealing that the polysaccharide had a positive effect on the electrode response, since higher current values and a lower charge transfer resistance for the electrochemical probe redox process were achieved compared to the unmodified GCPE. Even better responses were obtained after the modification of the GCPE with the synthetized AuNps-PFR, as a consequence of the high electrical conductivity and large surface area displayed by the nanocomposite. The 5-FU was oxidized on the GCPE/AuNps-PFR surface according to an irreversible, pH dependent and diffusion controlled mechanism, showing an anodic wave at +1,1 V in BR buffer solution 0.04 mol L-1. The highest current value for 5-FU determination was achieved in BR buffer with pH 8.0, by DPV; therefore, this value was chosen for the further analysis. A linear relationship was observed between the anodic peak potential and the pH of the medium with a slope of -69 mV pH-1, demonstrating that the same number of protons an electrons participate in the 5-FU oxidation mechanism. The GCPE/AuNps-PFR exhibited a linear relationship between the peak current and 5-FU concentration over the range of 29.9 to 234.0 μmol L-1, with low detection (0.66 μmol L-1) and quantification limits (2.22 μmol L-1). Besides the good sensitivity for detecting 5-FU, the modified electrode showed reproducibility, and its response was not influenced by interfering compounds such as glucose, urea, albumin, ascorbic acid, Na+ and K+, suggesting its potential application to determine 5-FU in biologic matrices. The practical utility of the developed sensor was demonstrated for the quantification of 5-FU in pharmaceutical injection sample. A good average recovery percentage of 104.0% was achieved, with an acceptable relative standard deviation of 2.25%. So, these results could confirm the promising analytical performance of the modified electrode for the electroanalysis of 5-FU in real samples. / Neste trabalho, eletrodos de pasta de carbono vítreo (EPCV) foram modificados com nanopartículas de ouro estabilizadas no polissacarídeo sulfatado porfirana (PFR) e aplicados para a determinação do agente antitumoral 5-fluorouracil (5-FU), utilizando voltametria de pulso diferencial (VPD). A PFR foi extraída a partir de alga Nori comercial, e sua caracterização foi realizada por FTIR, RMN-13C e pela determinação dos teores de carboidratos totais e de grupos SO42-, os quais resultaram em 82,8% e 11,9%, respectivamente. Tais experimentos confirmaram a pureza e a identidade química do polissacarídeo extraído, que foi empregado como agente redutor e estabilizante para a síntese de nanopartículas de ouro (AuNps-PFR). A temperatura, a concentração do precursor AuCl4- e a concentração de PFR empregadas para a síntese das AuNps-PFR foram otimizadas por meio de um planejamento fatorial 23 com triplicata no ponto central. Um menor tamanho de partícula (128,7 nm) foi alcançado ao se empregar uma temperatura de 70 °C e concentrações de AuCl4- e PFR iguais a 2,5 mmol L-1 e 0,25 mg mL-1, respectivamente. As AuNps-PFR obtidas foram caracterizadas pelas espectroscopias UV-VIS, FTIR e DLS, MEV-FEG, potencial zeta e DRX. O espectro de UV-VIS mostrou uma banda em 524 nm (banda plasmon), que não apresentou variações significativas na forma e frequência de absorção durante 90 dias. Tais observações sugeriram que as AuNps-PFR são estáveis em suspensão, o que corrobora com o potencial zeta de -30,5 mV obtido para a mesma. O espectro de FTIR evidenciou a existência de interações entre as AuNps e a PFR, devido a deslocamentos das bandas apresentadas no espectro das AuNps-PFR em relação ao obtido para a PFR. A caracterização eletroquímica do EPCV/PFR, realizada por voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância eletroquímica em meio da sonda Fe(CN)63-/4-, evidenciou que o polissacarídeo conferiu aos eletrodos maiores valores de corrente e menor resistência à transferência de carga para o processo redox da sonda eletroquímica em comparação aos eletrodos não modificados. Respostas de corrente ainda maiores foram obtidas ao se empregar o EPCV/AuNps-PFR, como uma consequência da elevada condutividade e alta área superficial apresentada pelas nanopartículas. Por VC, verificou-se que o 5-FU foi oxidado irreversivelmente na superfície do EPCV/AuNps-PFR segundo um mecanismo dependente do pH e controlado por difusão, apresentando um processo anódico em +1,1 V em tampão BR 0,04 mol L-1. O pH do tampão BR para a determinação de 5-FU foi otimizado por VPD, tendo-se observado um máximo de corrente em pH 8,0, valor empregado para a obtenção das curvas analíticas. A relação linear observada entre o potencial de pico e o pH do meio com inclinação de -69,0 mV pH-1 evidenciou que o mesmo número de prótons e elétrons estão envolvidos no processo de oxidação. O EPCV/AuNps-PFR apresentou linearidade de resposta na faixa de 29,9 a 234,0 μmol L-1 de 5-FU, com limites de detecção e de quantificação iguais a 0,66 e 2,22 μmol L-1, respectivamente. Além da boa sensibilidade ao 5-FU, o EPCV/AuNps-PFR apresentou reprodutibilidade de resposta, e não sofreu interferência significativa de compostos como glicose, ácido ascórbico, ureia, albumina e íons Na+ e K+, sugerindo sua potencial aplicação para a determinação de 5-FU em matrizes biológicas. O eletrodo modificado foi aplicado para a quantificação do 5-FU em formulação farmacêutica comercial injetável, tendo-se obtido uma porcentagem média de recuperação igual a 104,0, com desvio padrão relativo dentro dos limites aceitáveis (2,25%). Confirma-se, deste modo, o bom desempenho analítico do sensor e da metodologia voltamétrica desenvolvida para a eletroanálise do 5-FU em amostras reais.

OLIVEIRA, Jefferson Soares de. Caracterização bioquímica e atividade citotóxica in vitro e antitumoral in vivo de proteínas do látex de Calotropis procera. 2011. 149 f. : Tese (Doutorado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-20T14:23:08Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_jsoliveira.pdf: 3281739 bytes, checksum: 7e9d2e21ed1c7ab719fb84e18c80c57c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:35:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_jsoliveira.pdf: 3281739 bytes, checksum: 7e9d2e21ed1c7ab719fb84e18c80c57c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:35:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_jsoliveira.pdf: 3281739 bytes, checksum: 7e9d2e21ed1c7ab719fb84e18c80c57c (MD5) Previous issue date: 2011 / Latex of Calotropis procera was described as a source of pharmacologically active proteins such as anti-inflammatory and analgesic activities. This study evaluated the cytotoxic activity in vitro of proteins (LP) recovered from the latex of the medicinal plant C. procera against human cancer cells and the in vivo growth inhibition of Sarcoma 180. LP exhibited significant cytotoxicity for cell lines with IC50 values ranging from 0.11 to 1.36 µg/ml for tested cell lines (HL-60, SF295, HCT-8 and MDA-MB-435). There were no visible effects on the viability or morphology of healthy mononuclear cells exposed to PL (10 µg / ml) for 72 h, showing that PL was selective for malignant cells. Fractionation of PL by ion exchange chromatography (pH 5.0) gave rise to three new protein fractions (PI, PII and PIII) and almost all cytotoxicity present in PL was retained in fraction PI. The cytotoxic effects of PL and PI were diminished when pre-treated with pronase or 2-mercaptoethanol, reinforcing the protein nature of active molecules. PI was absent on cysteine protease activity, indicating that this enzyme abundantly found in PL is not involved in cytotoxicity. Mechanistic studies of LP cytotoxicity using HL-60 cells revealed that PL induces apoptosis probably due to changes in DNA topology since PL interfered in the activity of topoisomerase I. The cytotoxic activity present in PI seems to be performed by the synergic action of different proteins. This hypothesis is suggested since PI subjected to gel filtration chromatography produced distinct protein peaks that shared cytotoxic activity, although with lower extent than PI. Studies on growth inhibition of Sarcoma 180 showed that animals treated with PL by oral (10 or 20 mg/kg) or intraperitoneal (2 or 5 mg/kg) rout reduced tumor growth significantly (up 51.83%, po) and increased life span of transplanted animals for up to four days. The inhibitory activity of tumor growth was lost when the LP was subjected to proteolysis, acidic treatment or collected in iodoacetamide. On the other hand, LP maintained its in vivo activity after heat treatment, suggesting that thermo stable proteins are involved in the suppression of tumor growth. Biochemical parameters such as the enzymatic activity of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and the content of urea in serum were not affected in animals treated with LP. Treatment of animals with LP induced increasing of leukocyte numbers and protected from leukopenia induced by 5-FU administration. In addition, no significant changes in the histopathology of liver of animals treated with oral LP were seen. In vivo antitumor activity was retained in the PII and this activity was observed even when animals received a single dose of PII. It seems that the in vivo action of latex proteins is related to an immunestimulant event and not to the cytotoxic action of protein on cells Sarcoma 180. PII-3, recovered after PII fractionation on ion exchange column at pH 6.0, retained the tumor growth inhibition activity found in PII. PII-3 was shown to possess cysteine proteinase and papain inhibitor activities; however is not completely clear weather this molecules are involved in the antitumor activity. This study confirms the pharmacological potential of latex proteins from C. procera to control the development of tumor cells. / O látex de Calotropis procera foi descrito como uma fonte de proteínas farmacologicamente ativas como atividade antiinflamatória e analgésica. O presente trabalho avaliou a atividade citotóxica in vitro das proteínas (PL) recuperadas do látex da planta medicinal C. procera contra células de câncer humano e a inibição do crescimento do Sarcoma 180 transplantado em camundongos. PL apresentou significante citotoxicidade para as linhagens celulares com valores de IC50 variando entre 0,11 a 1,36 µg/ml para as linhagens celulares testadas (HL-60, SF295, HCT-8 e MDA-MB-435). Não foram observados efeitos visíveis sobre a viabilidade ou a morfologia de células mononucleares saudáveis expostas a PL (10 µg / ml) por 72 h, mostrando que PL apresentou seletividade para células tumorais. O fracionamento de PL por cromatografia de troca iônica (pH 5,0) deu origem a três novas frações (PI, PII e PIII) e quase toda citotoxicidade presente em PL ficou retida na fração PI. Os efeitos citotóxicos de PL e PI foram diminuídos quando previamente tratados com pronase, ou 2-mercaptoetanol, sugerindo uma natureza protéica de moléculas ativas. PI não apresentou atividade de proteinase cisteínica, indicando que esta enzima, encontrada em abundância em PL, não está envolvida na citotoxicidade. Estudos do mecanismo da ação citotóxica de PL utilizando células HL-60 revelou que PL induz apoptose celular provavelmente devido a alterações na topologia de DNA, já que PL interferiu na atividade de topoisomerase I. A atividade citotóxica presente em PI parece ser desempenhada pela ação combinada de diferentes proteínas uma vez que PI submetida à cromatografia de filtração em gel gerou picos protéicos distintos que compartilharam atividade citotóxica, embora com menor potência que PI. Estudo de inibição do crescimento do Sarcoma 180 revelou que animais tratados com PL por via oral (10 or 20 mg/kg) ou intraperitoneal (2 or 5 mg/kg) reduziram de modo significativo o crescimento do tumor (em até 51,83%; v.o.) e prolongou o tempo de sobrevivência dos animais transplantados por até quatro dias. A atividade inibitória do crescimento do tumor foi perdida quando a fração PL foi submetida à proteólise, tratamento ácido ou com iodoacetamida. No entanto, PL conservou a sua atividade in vivo após o tratamento térmico, sugerindo que proteínas termoestáveis estão envolvidas na supressão do crescimento tumoral. Os parâmetros bioquímicos, como a atividade enzimática da aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) e o teor de uréia no soro, não foram afetados nos animais tratados com PL. PL induziu aumento no número de leucócitos de animais tratados e ainda eliminou completamente a leucopenia induzida pela administração do 5-FU. Em adição, não foram observadas mudanças na histopatologia do fígado de animais tratados com PL por via oral. Atividade antitumoral in vivo ficou retida no PII e esta atividade foi observada mesmo quando animais transplantados receberam uma única dose de PII sugerindo que a ação in vivo de proteínas do látex está relacionada a um evento imunoestimunate de proteínas e não à ação citotóxica sobre as células do Sarcoma 180. PII-3, obtido após fracionamento de PII em coluna de troca iônica em pH 6,0 reteve a atividade de inibição do crescimento tumoral de PII. Esta fração possui atividade de proteinase cisteínica e atividade de inibidor de papaína, porém não é completamente claro o envolvimento dessas moléculas na atividade in vivo. Este estudo confirma o potencial farmacológico das proteínas do látex de C. procera para controlar o desenvolvimento de células tumorais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work explored the adsorption of organic molecules to achieve change on surfaces. In this context it was proposed, the adsorption of organic molecules of halogenated derivatives of uracil, 5 Fluorouracil and 5 Chlorouracil, in monocrystalline substrate of HOPG (highly oriented pyrolytic graphite), sizzling was the technique used for construction of self-assembled monolayers (SAM). The atomic resolution of the STM (Scanning Tunneling Microscope) images of HOPG substrate prove its hexagonal structure and that their interatomic distance is 0.246 nm. While in the molecular resolution images of 5 Fluorouracil and of 5 Chlorouracil adsorbed on the HOPG substrate, is presented evidence that after in the adsorption some changes occur in the intermolecular distances in the structures and the positioning of these molecular films formed on the substrate because the molecular films behaved in a horizontal position and were stabilized laterally by hydrogen bonds when they are protonated, but when we performed the same procedure of adsorption for these organic molecules, only varying the pH of the environment, the change caused the deprotonation of the molecules, thus allowing one to simulate electrochemical environment and being able to extract information about the pKa of adsorbates using UV-Vis spectroscopy, and was also observed that these deprotonated molecular films behaved in a vertical position on the substrate. / Neste trabalho foi explorada a adsorção de moléculas orgânicas para realizar modificação em superfícies. Neste contexto foi proposta a adsorção das moléculas orgânicas de derivados halogenados do uracil, o 5 Fluorouracil e o 5 Clorouracil no, substrato monocristalino do HOPG (Grafite Pirolítico Altamente Orientado do inglês, Highly Oriented Pyrolitic Graphite), sendo usada a técnica de sizzling para construção de monocamadas automontadas (SAM Self-Assembled Monolayers). As imagens de STM (Scanning Tunneling Microscopy) de resolução atômica do substrato de HOPG comprovam sua estrutura hexagonal e sua distância interatômica que é de 0,246 nm. Já nas imagens de resolução molecular do 5 Fluorouracil e do 5 Clorouracil adsorvido no substrato do HOPG, são apresentadas evidências de que após a adsorção ocorrem mudanças nas distâncias intermoleculares, nas estruturas e no posicionamento desses filmes moleculares formados no substrato, pois os filmes moleculares se comportaram em um posicionamento horizontal e são estabilizados lateralmente por ligações de hidrogênio quando estão protonadas, mas quando foi realizado o mesmo procedimento de adsorção para essas moléculas orgânicas, só que variando o pH do meio, esta variação provocou a deprotonação das moléculas, assim permitindo simular um ambiente eletroquímico e sendo possível extrair informação sobre o pKa dos adsorbatos usando a espectroscopia UV-Vis, e foi observado também que estes filmes moleculares deprotonados se comportaram em um posicionamento vertical no substrato.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A mucosite induzida por quimioterÃpicos à um efeito colateral importante e limitante da terapia do cÃncer, cuja fisiopatologia nÃo à completamente compreendida. O presente estudo visa investigar o papel do Ãxido nÃtrico (NO) na patogÃnese das mucosites oral e intestinal induzidas por 5-fluorouracil (5-FU) e metotrexato (MTX) e os efeitos da glutamina (GLU) e alanil-glutamina (AL-GLU) na mucosite oral induzida por 5-FU. A mucosite oral foi induzida por duas administraÃÃes intraperitoneais (i.p.) de 5-FU nos 1 e 2 dias (60 e 40 mg/kg respectivamente), em hamsters. Os animais foram tratados subcutaneamente (s.c.) com os inibidores da Ãxido nÃtrico sintase (NOS), N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidina (1400W; 1 mg/kg), aminoguanidina (AG; 5 or 10 mg/kg), Nφ-Nitro-L-Arginina Methyl Ester (L-NAME; 5, 10 or 20 mg/kg) ou salina (0,4 ml), uma hora antes do 5-FU e, diariamente, atà o sacrifÃcio, no 10 dia. Em outro ciclo de experimentos, os animais receberam salina, suspensÃo de GLU ou de AL-GLU (100 mM) uma hora antes do 5-FU e, diariamente, atà o sacrifÃcio, nos 10 e 14 dias. A mucosite intestinal foi induzida pela administraÃÃo de MTX (2,5 mg/kg; s.c.) nos primeiros trÃs dias de experimentos, em ratos Wistar. Os animais foram tratados com AG (10 mg/Kg; i.p.), ou L-NAME (20 mg/Kg; i.p.), uma hora antes do MTX e, diariamente, atà o sacrifÃcio, no 5 dia. Na investigaÃÃo do papel do NO na mucosite oral induzida por 5-FU, os seguintes parÃmetros foram avaliados: anÃlises micro e macroscÃpica, atividade de mieloperoxidade (MPO) e da NOS, nÃveis teciduais de nitrito, imunohistoquÃmica para NOSi e detecÃÃo de morte celular. O efeito do 5-FU na produÃÃo salivar tambÃm foi avaliado. No estudo dos efeitos da GLU e AL-GLU, anÃlises micro e macroscÃpicas, atividade de MPO, detecÃÃo de morte celular, estoques teciduais de glutationa e concentraÃÃo sÃrica de glutamina foram os parÃmetros avaliados. No estudo do papel do NO na mucosite intestinal, foram realizados anÃlise histopatolÃgica, medida da altura de vilos nos trÃs segmentos do intestino delgado, atividade de MPO, detecÃÃo de apoptose, assim como, western blot e imunohistoquÃmica para NOSi. 1400W e AG, contrariamente ao L-NAME, reduziram os parÃmetros macro e microscÃpicos da mucosite oral e a infiltraÃÃo de cÃlulas inflamatÃrias, detectada na histopatologia e na atividade de MPO. Foram observados ainda, no 10 dia, maior atividade da NOS e marcaÃÃo imunohistoquÃmica para NOSi. 1400W reverteu a diminuiÃÃo da secreÃÃo salivar induzida por 5-FU. A mucosite oral induzida por 5-FU resultou na diminuiÃÃo dos nÃveis sÃricos de glutamina, bem como dos estoques teciduais de glutationa, no 10 dia, efeitos que foram revertidos pela administraÃÃo de GLU e AL-GLU. Apesar de nÃo ter prevenido a mucosite oral no 10 dia, o tratamento com GLU ou AL-GLU reduziu os parÃmetros macro e microscÃpicos da mucosite oral, e a atividade de MPO, no 14 dia. Na mucosite intestinal, AG e L-NAME preveniram o encurtamento de vilos e reduziram a necrose de criptas, assim como o infiltrado inflamatÃrio, efeitos induzidos pelo MTX, sendo esse Ãltimo constatado pela anÃlise histopatolÃgica e atividade de MPO. Foi detectado maior marcaÃÃo imunohistoquÃmica para NOSi no jejuno de ratos submetidos à mucosite intestinal. Esses resultados sugerem o papel relevante do NO na fisiopatologia das mucosites oral e intestinal. O presente estudo demonstrou ainda que a GLU e AL-GLU aceleraram a recuperaÃÃo da mucosa dos animais submetidos a mucosite oral por 5-FU, aumentando os nÃveis teciduais de glutationa, reduzindo a inflamaÃÃo e promovendo reepitelizaÃÃo / Mucositis induced by antineoplastic drugs is an important, dose-limiting and costly side effect of cancer therapy, which pathophysiology is not completely understood. The aim of the present study was to investigate the role of nitric oxide (NO) on the pathogenesis of oral and intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil (5-FU) and methotrexate (MTX) and the effect of glutamine (GLU) and alanyl-glutamine (AL-GLU) on 5-FU-induced experimental mucositis. Oral mucosistis was induced by two intraperitoneal (i.p) administrations of 5-FU on the 1st and 2nd days (60 and 40 mg/kg, respectively) in hamsters. Animals were treated subcutaneously (s.c.) with the nitric oxide synthase (NOS) inhibitors N-(3-(Aminomethyl)benzyl)acetamidine (1400W; 1 mg/kg), aminoguanidine (AG; 5 or 10 mg/kg), Nφ-Nitro-L-Arginine Methyl Ester (L-NAME; 5, 10 or 20 mg/kg) or saline (0.4 ml), one hour before the injections of 5-FU and daily until sacrifice, on the 10th day. In another set of experiments, animals received saline, GLU or AL-GLU suspension (100 mM) one hour before the injections of 5-FU and daily until sacrifice, on the 10th or 14th day. Intestinal mucositis was induced by three administrations of MTX (2.5 mg/kg; s.c.) on the first three days of the experiment, in Wistar rats. Animals were treated i.p. with AG (10 mg/Kg), or L-NAME (20 mg/Kg), one hour before the injections of MTX and daily until sacrifice, on the 5th day. In the investigation of the role of NO on 5-FU induced oral mucositis, the following parameters were evaluated: microscopic and macroscopic analysis, myeloperoxidade (MPO) and NOS activities, nitrite level, immunohistochemistry for NOSi, salivary secretion, and cell death. In order to study the effect of GLU and AL-GLU, microscopic and macroscopic analysis, MPO activity, cell death, glutathione stores and the serum concentration of glutamine, were evaluated. In the MTX-induced intestinal mucositis, histopathological analysis was evaluated and the villus height in all three small intestine segments was measured. MPO activity, cell death, as well as, western blot and immunohistochemistry to evaluated the expression of the NOSi, were also conducted. 1400W or AG, but not L-NAME, reduced macroscopic and histological parameters of oral mucositis, and reduced the inflammatory cell infiltration as detected on histopathology and by MPO activity. Increased NOS activity and immunostaining for NOSi were detected. 5-FU induced a decrease in salivary secrection, observed on 4th day, and this effect was prevented by 1400W. The 5-FU-induced oral mucositis significantly decreased the serum GLU level as well as the cheek pouch glutathione stores, observed on day 10. GLU or AL-GLU reversed the 5-FU effects, restoring serum GLU levels and cheek pouch glutathione stores, observed on day 10, but did not prevent oral mucositis at this time. However, GLU and AL-GLU reduced macroscopic and histological parameters of oral mucositis, and reduced the MPO activity on day 14. In the MTX-induced mucositis, AG and L-NAME significantly prevented villous blunting, lamina propria cell death, and reduced crypt necrosis induced by MTX, decreasing neutrophil infiltration as detected by histopathology and by MPO activity. These data were associated with the detection of iNOS expression by Western blot and by immunohistochemistry in the jejunum tissue. These results suggest an important role of NO in the pathogenesis of oral and intestinal mucositis induced by 5-FU and MTX. The present study also demonstrated that GLU or AL-GLU hastens mucosal recovery increasing mucosal tissue glutathione stores, reducing inflammatory parameters and speeding reepithelization

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Despite therapeutic advances, colorectal cancer still has a 45% mortality rate, and one of the most crucial problems is the development of acquired resistance to treatment with anticancer drugs. Thus the aims of this project are to develop drug-resistant colon cancer cell lines in order to identify mechanisms of resistance for the most commonly drugs used in colorectal cancer: 5-fluorouracil, oxaliplatin, and irinotecan. Following evaluation of drug sensitivity to these agents in an initial panel of eight colorectal cancer cell lines, 3 lines (DLD-1, KM-12 and HT-29) were selected for the development of 5-FU (3 lines), oxaliplatin (2) and irinotecan (1) resistant sublines by continuous drug exposure, with resistance confirmed using the MTT assay. Consistently resistant sublines were subject to a „stable isotope labelling with amino acids in cell culture‟ (SILAC) approach and a MudPIT proteomics strategy, employing 2D LC and Orbitrap Fusion mass spectrometric analysis, to identify novel predictive biomarkers for resistance. An average of 3622 proteins was quantified for each resistant and parent cell line pair, with on average 60-70 proteins up-regulated and 60-70 down-regulated in the drug resistant sublines. The validity of this approach was further confirmed using immunodetection techniques. These studies have provided candidate proteins which can be assessed for their value as predictive biomarkers, or as therapeutic targets for the modulation of acquired drug resistance in colorectal cancer.