Els senyals de quorum sensing (QS) del tipus N-acil-L-homoserina lactonas (AHLs) són les molècules predominants detectades entre els proteobacteris. En el sistema de QS regulat per les AHLs intervenen dues proteïnes que pertanyen a la família del tipus LuxI i LuxR. Les proteïnes LuxI sintetitzen AHLs que interactuen amb un domini específic de les proteïnes LuxR. Aquest complex s’uneix a seqüències promotores específiques i permeten a la població bacteriana coordinar l’expressió gènica. En molts bacteris gram negatius, aquest sistema regula factors de virulència. L’objectiu principal d’aquest treball ha estat la identificació i caracterització de les molècules senyal del tipus AHLs i determinar diferents fenotips associats al QS mitjançant l’estudi del regulador del sistema (luxR) en Stenotrophomonas maltophilia, un patogen humà oportunista intrahospitalari emergent. Així, l’estudi s’ha centrat en primer terme en la detecció d'AHLs en diferents aïllats clínics d’aquest patogen, en concret de les soques E77, M30 i K279a. La detecció d'AHLs s’ha dut a terme emprant la soca biosensora d’Agrobacterium tumefaciens KYC55 i, posteriorment, les AHLs s’han caracteritzat per espectrometria de masses. S’ha fet també un estudi del promotor del gen luxR, que ha permès identificar que l’expressió d’aquest gen és depenent de la fase de creixement. A més a més, s’ha demostrat que el domini d’unió a AHLs del regulador LuxR és capaç d’unir-se a aquestes molècules senyal. A nivell fenotípic s’ha investigat la implicació de LuxR en la formació de biofilms i en la motilitat del tipus swarming. Els resultats han demostrat la influència de LuxR en els dos fenotips tal i com s’ha descrit per altres LuxR homòlegs. Tanmateix, s’ha apreciat la inhibició d’ambdós processos quan s’ha usat com a inhibidor de QS (IQS) l’enzim AiiA, procedent de Bacillus subtilis, el qual hidrolitza les AHLs. Per últim, s’ha posat de manifest l’efecte estimulant que exerceix el sobrenedant de P. aeruginosa MPAO1 sobre el swarming de S. maltophilia. El fet d’haver estat capaços d’identificar i caracteritzar les AHLs i el regulador d’aquest sistema (LuxR), ens ha dut a cercar la sintasa (LuxI) entre els diferents genomes publicats. Tot i així, l’aproximació utilitzada en aquest treball no ens ha permès determinar la proteïna LuxI i, per tant, continua sent un objectiu obert que caldrà resoldre. Fins a dia d’avui, només el sistema de QS regulat per la molècula senyal anomenada Diffusible signal factor (DSF), ha estat ben estudiat en aquesta espècie. Els resultats obtinguts evidencien que en S. maltophilia podrien coexistir diferents sistemes de comunicació, un mediat pel DSF i un segon per les AHLs. / The N-acil-L-homoserine lactones (AHLs) signals are the predominant quorum sensing (QS) molecules detected among proteobacteria. A typical QS system is commonly mediated by two proteins belonging to LuxI and LuxR protein family. LuxI-type proteins synthesize AHLs which interact with a specific domain of LuxR-type proteins. This complex binds specific promoter sequences and allows bacterial populations to coordinate gene expression. In many gram-negative bacteria, this system regulates virulence factors. The main objectives of this work are the identification and characterization of signaling molecules (AHLs) and the determination of different QS phenotypes associated with the regulator of this system (luxR), in the emergent nosocomial opportunistic human pathogen Stenotrophomonas maltophilia. The study is firstly focused on the detection of AHLs in different clinical isolates of this pathogen, in particular in E77, M30 and K279a strains. The detection of AHLs was carried out using Agrobacterium tumefaciens KYC55 biosensor strain and posterior characterization of these molecules by mass spectrometry analysis. On the other hand, the study of luxR promoter allowed determining a growth-phase regulation of luxR gene expression. It has also been shown that the AHL binding domain of LuxR can bind these AHLs molecules. At phenotype level, the role of LuxR as a regulator has been analyzed through biofilm formation and swarming motility. The results demonstrate the influence of LuxR in both phenotypes, as described for other LuxR homologues. Furthermore, inhibition of QS by B. subtilis, AiiA enzyme, which hydrolyzes AHLs, caused the inhibition of biofilm formation and swarming motility. Finally, the stimulant effect produced by the supernatant of P. aeruginosa on swarming motility of S. maltophilia has been described. The fact of being able to identify and characterize the signal molecules (AHLs) and the regulator of the system (LuxR), lead us to look for the synthase (LuxI) among the annotated genomes. However, our first tentative did not allow us to determine LuxI, and because of that, this goal still remains to be clarified. Up to date, the QS system regulated by the signal molecule called Diffusible signal factor (DSF), is the only one that has been well studied in this species. The results obtained show that in S. maltophilia could coexist two different chemical language: one mediated by DSF and a second one by AHLs

Els estudis d’helmints paràsits de rosegadors (ordre Rodentia) són abundants a la península Ibèrica i, han sigut realitzats en gran part per l’equip d’helmintologia del Departament de Microbiologia i Parasitologia Sanitàries (Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona). Segons l’Atlas de los Mamíferos terrestres de España (1) hi ha 19 espècies de rosegadors excloent les espècies al·lòctones. La recopilació de Feliu et al. (1997) recull dades d’helmints de 16 espècies de rosegadors (2). Si hi afegim els estudis de Sciurus vulgaris (3) i de Glis glis (4) concloem que a excepció de Apodemus flavicollis s’han estudiat totes les espècies de rosegadors a nivell d’helmintofauna. Atès que l’estudi en aquesta àrea geogràfica rondaria la saturació i que es pot donar la catalogació de les espècies d’helmints com a etapa finalitzada, s’ha mirat d’enfocar l’estudi helmintològic cap a altres àrees biogeogràfiques, com és el Sud-est asiàtic (SEA). Encara que aquesta regió està sotmesa a grans canvis ambientals deguts a la globalització i la pressió del desenvolupament econòmic, el SEA la subfamília Murinae està formada per quasi 300 espècies (5) mostra de l’elevada biodiversitat. El nombre d’estudis realitzats per tal de conèixer la fauna helmintiana (quines espècies d’helmints paràsits hi ha i quins rosegadors actuen com a hostes d’aquests) referenciats a la base de dades del Natural History Museum of London (Host-Parasite Database) (6) és baix, i tant sols existeixen estudis de 26 (13%) de les espècies de Murinae associades al SEA. La combinació entre la gran diversitat d’hostes i el baix nombre d’estudis realitzats ens permet plantejar la hipòtesi de que existeix una elevada probabilitat de trobar espècies d’helmints no descrites anteriorment o poc conegudes. Durant l’estada de Kittipong Chaisiri del Departament de Zoologia de la Facultat de Veterinària de la Universitat de Kasetsart (Bangkok, Tailàndia) al Laboratori de Parasitologia de la Facultat de Farmàcia de la UB l’any 2009, es va redactar un article que incloïa l’anàlisi de 68 rosegadors capturats en diferents hàbitats a les províncies de Buriram, Loei i Nan (Tailàndia), on es van identificar 11 espècies d’helmints: 2 cestodes, 8 nematodes i 1 acantocèfal (7). Aquests resultats van ser com un sondeig de la zona i, en veure que algunes d’aquestes espècies eren desconegudes per la ciència, no vam voler perdre geogràfica. Així, es va iniciar una etapa de col·laboracions amb els projectes finançats pel l’oportunitat d’aprofundir en l’estudi de l’helmintofauna d’aquesta zona govern francès: BiodivHealthSEA (Local impacts and perceptions of global changes: Biodiversity, health and zoonoses in Southeast Asia) i CERoPath (Community Ecology of Rodents and their Pathogens in a changing environment) que es van desenvolupar al SEA. Entre el 2011 i el 2015 hem identificat i descrit espècies noves de nematodes paràsits, hem trobat espècies que no s’havien tornat a trobar (o identificar) després de la seva descripció i hem pogut estudiar l’espectre helmintofaunístic d’una espècie de micromamífer insectívor. Les hipòtesis fonamentades en la situació global i particular d’aquests helmints i hostes, ens porten a un marc d’estudi en el que els objectius són els següents: 1. Augmentar el coneixement de la biodiversitat helmintiana de rosegadors del Sud-est asiàtic mitjançant la descripció d’espècies noves per a la ciència. 2. Incrementar el coneixement d’espècies d’helmints de micromamífers del Sud-est asiàtic prèviament descrites però poc conegudes aportant noves dades biogeogràfiques, mètriques, moleculars i morfològiques i sobre l’associació amb els seus hostes. 3. Ampliar el coneixement de l’espectre helmíntic d’una espècie de micromamífer insectívor (Suncus murinus) donant les primeres dades faunístiques a Cambodja. A mode esquemàtic presentem la metodologia global del conjunt de publicacions que conformen la tesi (detallada extensivament a cada publicació). En una primera etapa es realitza la captura dels hostes per trampeig i la seva identificació (segons morfometria i/o segons genètica), i posteriorment es procedeix a realitzar-ne l’eutanàsia i dissecció per obtenir els helmints. La segona etapa recull els procediments seguits des de l’obtenció dels helmints fins la seva identificació: preparació de les mostres per observació en microscòpia òptica o microscòpia electrònica, caracterització morfològica dels helmints amb mesures, il·lustracions i fotografies de microscòpia òptica o electrònica, classificació filogenètica d’helmints amb tècniques moleculars, i dipòsit d’espècimens a la col·lecció del Museu de Ciències Naturals de Barcelona. Aquests passos es realitzen en funció del nombre i de la qualitat dels helmints disponibles. En relació a la recerca bibliogràfica, la metodologia es basa en cercar paraules clau relacionades amb els paràsits, les localitats i els hostes en bases de dades de referència com Host-Parasite, Medline, ScienceDirect i WoK així com cercadors com Google academic i Google.

Este proyecto de investigación estudia la extracción, optimización de la extracción y uso de los polifenoles naturales procedentes de los residuos de limón (Lemon Waste, LW) y de té blanco (White Tea, WT), el té más antioxidante del mundo. Persigue un objetivo doble, encontrar y testar nuevas fuentes de productos y compuestos naturales bioactivos que puedan sustituir o disminuir el uso de compuestos sintéticos, y reutilizar y revalorizar residuos agroalimentarios. En la primera etapa de la investigación, se optimizó la extracción de polifenoles procedentes del WT mediante superficie respuesta (RSM), se caracterizó su composición y se evaluó su eficacia antiradicalaria. En la segunda etapa se optimizó la extracción de polifenoles del LW usando campos eléctricos pulsados (PEF), una técnica de extracción segura para el medio. Se caracterizó la composición de los extractos y se evaluó su capacidad antioxidante, antimicrobiana y de protección al estrés oxidativo inducido en células y en DNA. Finalmente se aplicaron los extractos a carne cruda (carne de vacuno cruda picada) y a envases activo de PE y PLA. Los resultados obtenidos muestran que los extractos de LW obtenidos poseen capacidad antioxidante, pueden proteger al DNA y a las células del estrés oxidativo inducido. Sin embargo muestra leves efectos como antioxidante en envases activos y en carne. Por otro lado, los extractos de WT demuestran ser un muy buen agente antioxidante muy efectivo en carnes crudas y en envases activos tanto los elaborados por recubrimiento de un film de PE como en los films desarrollados en PLA. Con lo que se concluye que es posible reutilizar residuos agroalimentarios para la obtención de antioxidantes naturales. Además se puede concluir que el WT es un muy buen agente protector de la oxidación con posibles aplicaciones en la industria cárnica y en la del embalaje. / This research project studied the antioxidant activity of lemon waste and white tea extracts, focusing on the optimization of the extraction process as well as their application onto food matrices and active packaging. The investigation was divided in three parts: in the first study, the extraction process was optimized by using Response Surface Methodology (RSM) based on the quantification of the antioxidant capacity and determination of the antiradical capacity of each extract. In the second study, environmentally- friendly extractions (i.e. without using organic solvents) were performed by using Pulsed Electric Fields. Furthermore, antimicrobial activity of the extracts and their capacity to protect cellular and DNA damage induced by external oxidative stress were evaluated. In the final part, the extracts were applied onto model emulsions, food (minced raw beef meat) and onto two different active packaging solutions based on polyethylene and polylactic acid. Results obtained demonstrate that lemon waste extracts show antioxidant capacity, can protect cells and DNA from externally induced oxidative damage and can be used as antioxidants in model emulsions, however show a reduced antioxidant effect in meat and in active packaging applied to meat. On the other hand, white tea extracts can be used as effective antioxidant agents in meat and in active packaging. From the results of these studies it is possible to conclude that lemon residual material can be used as a source of antioxidants. In addition, white tea is a good protector agent against oxidative processes and can be considered a good candidate for use as food additive or/and as a compound for active packaging formulations.

Les infeccions urinàries constitueixen una de les infeccions bacterianes més freqüents tant en la comunitat com en l'àmbit hospitalari, que afecten dones sanes i pacients amb factors predisponents. Escherichia coli és sens dubte l'agent causal més freqüent d'aquestes infeccions. El qual també, s'ha constatat com a causant d’altres infeccions extraintestinals com ara colecistitis, peritonitis, meningitis i sèpsia. Paradoxalment, E. coli és el principal component de la flora facultativa comensal de l'intestí humà i altres animals. Basant-se en tècniques moleculars s'ha demostrat que aquesta espècie pot dividir-se principalment en quatre grups filogenètics principals: A, B1, B2 i D. S’ha pogut comprovar que les infeccions extraintestinals estan causades majoritàriament per soques del filogrup B2 i en menor proporció del D. D'altra banda s'ha pogut demostrar en diversos estudis experimentals i de correlació estadística, que les soques d'aquests filogrups associades a infecció porten amb més freqüència un conjunt de factors de virulència als que s’atribueixen les funcions patogèniques; com són les adhesines, els quelants de ferro, les toxines, les càpsules i d’altres. No obstant això, hi ha observacions que posen en qüestió aquestes troballes, com és el fet que amb certa freqüència soques dels filogrups A i B1, portadores d'escassos factors de virulència, causin infeccions urinàries i sèpsia en persones sanes. Això, i estudis específics per a cadascun d’aquest factors han qüestionat el seu valor patogènic; considerats de forma aïllada o col·lectivament. La forta correlació entre el filogrup i l'acció patògena podria indicar la presència de factors de virulència desconeguts i la importància de la seva associació. En aquest context, l’única manera de conèixer si una soca és capaç de fer infeccions extraintestinals i en particular infeccions urinàries, és avaluar-les en models experimentals, amb aquesta finalitat s’han descrit dos models in vivo. El primer d’ells, valora la capacitat de causar infecció generalitzada una vegada s’han sobrepassat les barreres naturals de l’hoste, i de permetre la disseminació del patogen al sistema circulatori i causant bacterièmia o septicèmia. Mentre que el segon model, d’infecció urinària ascendent, avalua el potencial virulent i patogen en el sistema urinari. I la capacitat del bacteri per ascendir des de la bufeta fins als ronyons quan no s’apliquen pautes terapèutiques per a contenir la infecció urinària de les vies baixes. Per tant, els principals objectius d'aquesta tesi doctoral han estat: i) determinar el grup filogenètic, els factors de virulència i altres característiques biològiques d’un grup de soques d’E. coli d’origen urinari i intestinal; amb la finalitat de seleccionar les soques utilitzades per als estudis amb els models experimentals in vivo; ii) estandarditzar dos models murins d’experimentació animal per a l’avaluació d’infeccions extraintestinals causades per E. coli i iii) avaluar el potencial virulent i patogen en els dos models murins de les soques d’E. coli prèviament seleccionades. El treball realitzat han permès incorporar en el grup de Microbiologia de l’Institut de Recerca Vall d’Hebron, dins del Servei de Microbiologia del Hospital Universitari Vall d’Hebron; dos models experimentals murins per a l’avaluació de la virulència i patogenicitat de soques d’E. coli. Així mateix, també ha permès la caracterització in vitro d’un grup de soques heterogènies, aportant les primeres proves de conceptes dels models. Els dos models murins estandarditzats i les dades aportades per aquesta tesi obren futures vies de treball com són: i) estudis de virulència de microorganismes causants de sèpsies o infecció urinària, ii) monitorització d’infeccions extraintestinals per a la determinació de la implicació específica de determinants de virulència mitjançant tecnologies d’expressió in vivo o assajos de competició de mutants, iii) avaluació de la eficàcia, la farmacocinètica i la farmacodinàmica de nous antimicrobianes, entre altres. / Urinary tract infections are one of the most common bacterial infections in the community and in hospitals, affecting healthy women and patients with predisposing factors. Escherichia coli is certainly the most common casual agent of these infections, which also is the cause of other extraintestinal infections such as cholecystitis, peritonitis, meningitis and sepsis. Paradoxically, E. coli is the main component of facultative commensal flora of the human intestine and other animals. Using molecular techniques it has been proven that this specie can be divided into four main phylogenetic groups, named A, B1, B2 and D. The majority of the extraintestinal infections are caused by strains from phylogenetic group B2 and in a less extent by group D strains. Moreover, several experimental studies and statistical correlations have demonstrated that the strains associated to infections, present more often a set of virulence factors attributed to features such as pathogenic adhesins, iron chelates, toxins, and capsules, among others. However, some observations are calling into question these results; such as the fact that frequently strains from phylogenetic groups A and B1 (carriers of fewer virulence factors) cause urinary tract infections and sepsis in healthy people. Because of this result and other studies carried out for each of the virulence factors, the pathogenic value of the factors, singly and collectively, has been questioned. The strong correlation among the pathogenic action of phylogenetic groups may indicate the presence of unknown virulence factors and the importance of their relationship with extraintestinal infections. Taking into account the background, the only way to know if a strain is capable of producing extraintestinal infection and particularly urinary tract infection, is evaluating them using experimental models. For this purpose, two in vivo models were described. The first one recognizes the worth of the ability to cause widespread infection once the natural barriers of the host have been exceeded, allowing the spread of the pathogen into the circulatory system causing bacteremia or septicemia. Meanwhile, the ascending urinary infection model assesses the pathogenicity and the virulent potential of the strains in the urinary system, besides the capability of the bacteria to ascend from the bladder to the kidneys without any treatment to contain the lower urinary tract infection Therefore, the main objectives of this thesis were: i) to determine the phylogenetic group, virulence factors, and other biological characteristics of urinary and intestinal E. coli strains, in order to select the strains to be used for in vivo experimental studies ii) to standardize two murine models for the evaluation of extraintestinal infections caused by E. coli, and iii) to evaluate the pathogenicity and the virulent potential of previously selected E. coli strains in murins models. The work has allowed the incorporation of two experimental murine models for the evaluation of the virulence and the pathogenicity of Escherichia coli strains into the Microbiology group of Vall d’Hebron Institut de Recerca in the Microbiology department of Hospital Universitari Vall d’Hebron. Likewise, it has allowed the in vitro characterization of a heterogeneous group of strains, providing the first evidence of concepts of those models. The two standardized murine models and the data provided by this thesis open several lines for future work, such as: i) studying the virulence of microorganisms causing sepsis or urinary tract infection, ii) monitoring of extraintestinal infections to determine the specific involvement of certain virulence factors by means of in vivo expression technologies or mutants competition assays, and iii) evaluating the efficacy, pharmacokinetics and pharmacodynamics of new antimicrobials, among other studies.

La transmissió cèl·lula a cèl·lula del VIH-1 és un mecanisme altament eficient de disseminació viral, i la seva rellevància durant la difusió in vivo en els llocs actius de replicació, és a dir, en els teixits limfoides primaris i secundaris, sembla probable. La transmissió d'antígens del VIH de cèl·lules infectades a cèl·lules T CD4+ no infectades es produeix a través de contactes cèl·lula a cèl·lula que requereixen exclusivament de la interacció entre la proteïna de l'embolcall del VIH gp120 i el receptor CD4 per induir la captació endocítica de partícules virals en compartiments resistents a la tripsina en la cèl·lula diana. No obstant això, no ha estat completament estudiat el destí dels antígens del VIH prèviament transferits i si la internalització de partícules del VIH mitjançant endocitosi pot donar lloc a una infecció productiva. En aquest treball es mostra com IgGb12, un inhibidor de la unió del virus a CD4, va impedir la infecció de les cèl·lules diana carregades amb el VIH suggerint que les partícules virals endocitades van necessitar tornar a la superfície i arribar novament l'espai extracel·lular per interaccionar amb el receptor CD4 i iniciar una infecció productiva. Estudis previs realitzats amb microscòpia confocal van trobar que les proteïnes clatrina i dinamina colocalitzaven amb les partícules del VIH a la cèl·lula diana. Tot i això, dynasore, un inhibidor de la escissió endosomal no va impedir ni la captura de virus, ni la fusió del virus amb la cèl·lula ni la replicació del virus després de la transferència cèl·lula a cèl·lula de partícules del VIH suggerint que la maduració endosomal no és necessària per cap etapa del cicle d'infecció del VIH. D'altra banda, la quantificació de la producció de DNA total va indicar que tots els agents anti-VIH inhibien la transmissió de virus lliure o cèl·lula a cèl·lula amb una potència similar descartant que la transmissió cèl·lula a cèl·lula pogués contribuir a la persistència del virus durant la teràpia antiretroviral. Finalment, es va observar que la transferència cèl·lula a cèl·lula d'antígens del VIH-1 era depenent del grau de polimerització de la actina de les cèl·lules diana CD4+ T. D'aquesta manera, les diferències fenotípiques en l'actina cortical entre les cèl·lules CD4+ T naive i memòria van determinar la eficiència de la transferència d'antígens virals induint diferents susceptibilitats a la infecció per VIH-1. Els nostres resultats reforcen la idea de que, després dels contactes cèl·lula a cèl·lula, els virus endocitats poden representar un reservori de partícules virals itinerant capaç d'induir la trans-infecció de les cèl·lules adjacents, però no poden induir una replicació eficient a partir dels compartiments endosomals. / La transmisión de célula a célula del VIH-1 es un mecanismo altamente eficiente de diseminación viral, y su relevancia durante la difusión in vivo en los sitios activos de replicación, es decir, en los tejidos linfoides primarios y secundarios, parece probable. La transmisión de antígenos del VIH de células infectadas a células T CD4+ no infectadas se produce a través de contactos célula a célula que requieren exclusivamente de la interacción entre la proteína de la envuelta del VIH gp120 y el receptor CD4 para inducir la captación endocítica de partículas virales en compartimientos resistentes a la tripsina en la célula diana. Sin embargo, no ha sido completamente estudiado el destino de los antígenos del VIH previamente transferidos y si la internalización de partículas del VIH mediante endocitosis puede dar lugar a una infección productiva. En este trabajo se muestra como IgGb12, un inhibidor de la unión del virus a CD4, impidió la infección de las células diana cargadas con el VIH sugiriendo que las partículas virales endocitadas necesitaron volver a la superficie y alcanzar nuevamente el espacio extracelular para interaccionar con el receptor CD4 e iniciar una infección productiva. Estudios previos realizados con microscopia confocal encontraron que las proteínas clatrina y dinamina colocalizaban con las partículas del VIH en la célula diana. A pesar de esto, dynasore, un inhibidor de la escisión endosomal no impidió ni la captura de virus, ni la fusión del virus con la célula ni la replicación del virus después de la transferencia célula a célula de partículas del VIH sugiriendo que la maduración endosomal no es necesaria para ninguna etapa del ciclo de infección del VIH. Por otra parte, la cuantificación de la producción de DNA total indicó que todos los agentes anti-VIH inhibían la transmisión de virus libre o célula a célula con una potencia similar descartando que la transmisión célula a célula pudiera contribuir a la persistencia del virus durante la terapia antiretroviral. Finalmente, se observó que la transferencia célula a célula de antígenos del VIH-1 era dependiente del grado de polimerización de la actina de las células diana CD4+ T. De esta manera, las diferencias fenotípicas en la actina cortical entre las células CD4+ T naive y memoria determinaron la eficiencia de la transferencia de antígenos virales induciendo distintas susceptibilidades a la infección por VIH-1. Nuestros resultados refuerzan la idea de que, después de los contactos célula a célula, los virus endocitados pueden representar un reservorio de partículas virales itinerante capaz de inducir la trans-infección de las células colindantes, pero no pueden inducir una replicación eficiente a partir de los compartimientos endosomales.

La tuberculosis es considerada como una de las enfermedades infecciosas más importantes del mundo. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud un tercio de la población mundial ha estado expuesta al agente causal Mycobacterium tuberculosis, que causa cerca de dos millones de muertes al año. La complejidad y duración del tratamiento, así como la aparición de cepas resistentes, exigen mejorar el conocimiento de los mecanismos de resistencia así como desarrollar nuevos fármacos o inhibidores que sean más eficaces. La resistencia de M. tuberculosis a antimicrobianos es debida a varios mecanismos operan en muchos casos simultáneamente. Entre ellos están las mutaciones en genes diana, la producción de enzimas que modifican o inactivan fármacos, la baja permeabilidad de la pared celular y las bombas de eflujo. Muchos de estos mecanismos de detoxificación son inducidos por diferentes compuestos incluidos los fármacos utilizados para el tratamiento. Estudios previos mostraron que el triclosán, un biocida con alta actividad antimicrobiana, induce en M. tuberculosis dos posibles sistemas de detoxificación: una posible dioxigenasa codificada por Rv3161c y un posible transportador tipo ABC codificado por Rv1686c-Rv1687c, sugiriendo que estos sistemas podrían tener un papel en el bajo efecto del triclosán en M. tuberculosis. También, se ha observado que el transportador ABC Rv1686c-Rv1687c se induce en macrófagos activados, en respuesta al H2O2 y a la privación de nutrientes sugiriendo que podría tener un papel en la virulencia de la bacteria. En este contexto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el papel de estos sistemas en la resistencia al triclosán y otros compuestos así como en la virulencia de M. tuberculosis. Para ello se estudió el efecto del triclosán a nivel transcripcional en la cepa H37Rv en donde se detectaron altos niveles de expresión de los genes Rv1687c y Rv3161c, confirmando que estos sistemas se inducen en presencia del biocida tal y como había sido reportado en la literatura. Posteriormente, se obtuvieron mutantes deficientes y cepas sobreproductoras de ambos sistemas que se usaron para evaluar la CMI del triclosán y otros fármacos. Sin embargo, contrario a lo que se esperaba, no se observaron diferencias en las CMIs de estas cepas y las de los controles. Así mismo, se estudió el papel de estas proteínas en la virulencia, infectando macrófagos murinos con cepas deficientes y sobreproductoras de ambos sistemas. Los resultados no mostraron ningún efecto en la virulencia ni en la proliferación del bacilo en el interior de los macrófagos. A continuación se estudiaron otros factores que podrían estar implicados en la resistencia intrínseca de M. tuberculosis al triclosán. Así se comprobó que la impermeabilidad de la envuelta celular estaría en parte implicada en la resistencia al biocida. También se estudió el papel de las bombas de eflujo utilizando inhibidores de las mismas. Los resultados no mostraron evidencia de la participación de bombas de eflujo en la resistencia al biocida. Finalmente se analizó el efecto del triclosán a nivel proteómico detectándose un aumento en la abundancia de la proteína codificada por Rv3161c y una disminución de las proteínas ThiC y PepQ. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que aunque la dioxigenasa Rv3161c y el transportador ABC Rv1686c-Rv1687c se inducen en presencia del triclosán, no están implicados en la resistencia de M. tuberculosis a este biocida ni a otros fármacos ensayados en este trabajo. La inducción de estos sistemas podría estar relacionada con algún mecanismo de detoxificación de metabolitos generados en respuesta al daño celular provocado por el triclosán. / Tuberculosis remains one of the most widespread infectious diseases in the world. According to the World Health Organisation, a third of the world’s population has been exposed to Mycobacterium tuberculosis, the causative agent, which causes around two million deaths a year. The complexity and duration of the treatment, as well as the emergence of drug-resistant strains, require a better knowledge of the drug-resistance mechanisms and the development of new drugs or inhibitors that are more effective. The resistance of M. tuberculosis to antimicrobials is due to multiple mechanisms operating simultaneously in many cases. These include mutations in the target genes, production of enzymes that modify or inactivate drugs, low cell-wall permeability and efflux pumps. Many of these detoxification mechanisms are induced by different compounds, including the drugs used in treatment. Previous studies have shown that triclosan, a biocide with high antimicrobial activity, induces two possible detoxification systems in M. tuberculosis: a dioxygenase encoded by Rv3161c and an ABC transporter encoded by Rv1686c-Rv1687c, suggesting that these systems could play a role in the limited effect of triclosan on M. tuberculosis. It has also been observed that the ABC transporter Rv1686c-Rv1687c is induced in response to H2O2 and to the lack of nutrients, suggesting that this could play a role in the virulence of the bacteria. In this context, the objective of this work was to assess the role of these systems in the resistance to triclosan and other compounds as well as in the virulence of M. tuberculosis. To do this, the effect of triclosan on transcriptional activity was assessed in the strain H37Rv in which high levels of expression of the genes Rv1687c and Rv3161c were detected, confirming that these systems are induced in the presence of the biocide, as had been reported in the literature. Then, deficient mutants and overproducing strains of both systems were used to assess the MIC of triclosan and other drugs. However, contrary to what was expected, no differences were observed in the MICs between these strains and the control. The role of these proteins in the virulence was also studied by infecting murine macrophages with deficient and overproducing strains of both systems. The results did not show an effect on either the deficiency or overproduction in the virulence and proliferation of the bacillus inside the macrophages. In order to identify the mechanisms related to the intrinsic resistance of M. tuberculosis to triclosan, the role of the cell envelope was assessed, and it was confirmed that biocide resistance may be related to its impermeable nature. The role of other possible efflux pumps was studied using inhibitors, and there was no evidence of the participation of any pump mediating in the biocide resistance. The effect of triclosan on M. tuberculosis proteome was also assessed in which an increase in the protein encoded by Rv3161c and a reduction in the proteins ThiC and PepQ were detected. The results obtained in this work suggest that although the dioxygenase Rv3161c and the ABC transporter Rv1686c-Rv1687c are induced in the presence of triclosan, they are not involved in the resistance of M. tuberculosis to this biocide or to other drugs tested in this work. The induction of these systems could be related to a detoxification mechanism of metabolites generated in response to the cell damage caused by triclosan.

La proteïna RecA és coneguda per ser la principal recombinasa bacteriana I també l’activador del sistema SOS. RecA no només s’associa amb processos de reparació del DNA sinó que també està relacionada amb altres funcions com ara el control d’integrons, la transferència de resistències antibiòtiques i d’elements de virulència o la inducció de pròfags. A més, en els últims anys s’ha associat a la proteïna RecA un nou paper com a modulador del moviment en eixam o swarming a E. Coli i a S. Typhimurium. A dia d’avui, es coneix que tant la deficiència com l’excés de RecA causen una disminució dràstica de la capacitat de desplaçar-se mitjançant swarming. També es coneix que, en una soca de S. Typhimurium que sobreexpressa recA i que per tant és incapaç de desplaçar-se per swarming, aquest moviment es pot recuperar a través de l’expressió concomitant del gen cheW, indicant que in vivo aquestes dues proteïnes poden estar relacionades. A més, hi ha evidències experimentals de la interacció entre les proteïnes RecA i CheW in vitro. El gen cheW és un dels gens que componen el nucli de l’aparell de quimiotaxi. El seu producte, la proteïna CheW, és la encarregada de l’acoblament entre la proteïna CheA (una histidina quinasa) i els trímers de dímers de quimioreceptors formant la unitat de senyalització bàsica per la quimiotaxi. Es coneix que diverses unitats de senyalització són capaces d’agregar als pols de la cèl·lula donant lloc a una estructura macromolecular coneguda com a clústers de quimioreceptors que, a part de tenir un paper en la transducció de la senyal quimiotàctica, són necessaris per el moviment en swarming. De fet, mutants de E. Coli que sobreexpressen o presenten deficiències en el gen cheW presenten també una estructuració aberrant dels clústers de quimioreceptors, fet que s’ha relacionat amb els defectes en la quimiotaxis i el swarming també observats en aquestes cèl·lules. El mecanisme molecular a través del qual els sistema SOS, i més concretament RecA, modula el moviment per swarming encara es desconeix. De tota manera, hi ha suficients evidències que apunten a una connexió entre el sistema SOS i el sistema de quimiotaxi a través de la interacció entre les proteïnes RecA i CheW. Per això, el principal objectiu d’aquest treball és aclarir el paper del sistema SOS, i de la proteïna RecA, en el moviment per swarming de S. Typhimurium. Els resultats presentats en aquest treball demostren que les proteïnes RecA i CheW de S. Typhimurium són capaces d’interaccionar tant in vivo com in vitro. A més, també es demostra la tenir una estequiometria concreta entre aquestes dues proteïnes constitueix un factor clau a la hora de desplaçar-se per swarming. El mecanisme molecular que permet al sistema SOS controlar la motilitat per swarming encara no ha pogut ser descobert però en aquest treball es demostra que soques de S. Typhimurium que sobreexpressen recA i mutants deficients en el mateix gen presenten severes deficiències en l’estructuració dels clústers polars de quimioreceptors. En conclusió, el present treball clarifica la relació existent entre el sistema SOS i els sistema de quimiotaxi a S. Typhimurium a través de la interacció entre les proteïnes RecA i CheW. Malgrat la demostració de que la variació de la concentració cel·lular de RecA a les cèl·lules ocasiona defectes en l’estructuració dels clústers de quimioreceptors, el mecanisme molecular que permet la regulació del swarming a través de RecA encara no s’ha establert. En aquest treball, s’hipotetitza que RecA afecta el procés de formació de clústers de quimoreceptors a S. Typhimurium i que l’impediment de formar aquests clústers correctament és el motiu principal per el qual els mutants recA presenten defectes en el moviment per swarming. / The RecA protein is known to be the main bacterial recombinase and the activator of the SOS system. RecA is associated not only with DNA repair but also with several other functions such as the control of integron dynamics, prophage induction and the transfer of antibiotic resistances and virulence factors. Furthermore, in the last years a novel role of the RecA protein as a modulator of the swarming motility in E. coli and S. Typhimurium has been revealed. Up to date, it is known that the lack or the excess of RecA causes a dramatic depletion of the swarming motility in the aforementioned bacterial species. Also, the ability to swarm of an S. Typhimurium strain that overexpresses the recA gene can be recovered by concomitantly overexpressing the cheW gene. Moreover, there are experimental evidences of the interaction between RecA and CheW proteins. The cheW gene is one of the chemotaxis system core genes. Its product, the CheW protein, is known to serve in the cell as the coupling protein between the CheA histidine kinase and the chemoreceptors trimers of dimers to form the basic chemotaxis signaling unit. Several chemotaxis signaling units are known to aggregate at the cell poles forming a macromolecular structure known as chemoreceptor signaling arrays that, apart from their role in signal transduction during chemotaxis, are known to be required for swarming motility. E. coli mutants that either overexpress or lacks the cheW gene are known to have severe impairments in the formation of this chemoreceptor clusters. This, have been linked with the depletion of the swarming and chemotactic abilities displayed by those mutants The molecular mechanism by which the SOS system modulates the swarming motility through RecA still remains unknown. There are sufficient evidences pointing towards a link between the chemotaxis and the SOS systems through a RecA-CheW interaction. Thus, the main aim of this work is to elucidate the role of the SOS system through the RecA protein in the swarming motility of S. Typhimurium. Results presented here demonstrate that RecA and CheW proteins of S. Typhimurium are able to interact both in vivo and in vitro thus establishing a link between the SOS system and the bacterial motility. Also, the importance of a concrete stoichiometric relationship between both proteins have been established as a key factor for swarming motility. The molecular mechanism that exactly allows the SOS system to control the swarming motility still remains poorly understood but in this work it has been demonstrated that strains that either overexpress or lack the recA gene present a severe impairment to successfully structuring the chemoreceptor clusters arrays at its cell poles. In conclusion, the present work clarifies the relationship between the SOS and chemotaxis systems of S. Typhimurium through the interaction between the RecA and CheW proteins. The molecular mechanism behind the RecA modulation of the swarming motility still needs to be further investigated but in this work the affectation of the ability to form chemoreceptor signaling arrays in cells with an excess or lack of RecA is reported. Thus, it is hypothesized that RecA affects the clustering process in S. Typhimurium and that the inability to successfully form this clusters is at the core of the swarming impairment shown by the recA mutants of this specie.

Els sistemes de comunicació bacteriana -coneguts com quorum sensing (QS)- a través de molècules senyalitzadores del tipus àcid gras han despertat molt d’interès en els darrers anys ja que s’ha vist que molts bacteris patògens els utilitzen per regular funcions relacionades amb la virulència. Es coneix que Stenotrophomonas maltophilia presenta el sistema de QS DSF (Diffusible Signal Factor) el qual és controlat pels gens que conformen el clúster rpf (Regulation of Pathogenecity Factors). No obstant, no està clar els mecanismes pels quals S. maltophilia sintetitza i sensa les molècules senyal així com quines funcions estan regulades per aquest sistema. En aquest treball hem demostrat que existeixen dues poblacions de S. maltophilia les quals es diferencien en base al clúster rpf (rpf-1 o rpf-2) que presenten. Cada variant difereix bàsicament en els gens que codifiquen per la sintasa RpfF i el sensor RpfC. A més, hem observat que existeix una associació entre ambdós components, generant-se la parella RpfF-1/RpfC-1 per les soques rpf-1 i RpfF-2/RpfC-2 per les soques rpf-2. Addicionalment, hem demostrat que només aquelles soques que presenten la variant rpf-1 produeixen nivells detectables de DSF i aquest regula motilitat bacteriana, formació de biofilm i virulència. Per altra banda, les soques de la variant rpf-2 necessiten més còpies de la sintasa RpfF-2 o l’absència del repressor RpfC-2 per produir DSF. En aquest cas, el sistema de QS DSF sembla només regular pocs fenotips relacionats amb virulència en situacions molt específiques. També hem mostrat que existeix un feedback positiu en la síntesi de DSF i que ambdós grups de soques actuen de manera sinèrgica en la producció de DSF i la virulència de tota la població. Addicionalment, hem observat que, mentre la variant RpfC-1 és un sensor promiscu el qual permet l’alliberació de la sintasa RpfF-1 tant punt detecta no només DSF sinó també àcids grassos de cadena mitja, el sensor RpfC-2 és molt més específic, alliberant RpfF-2 només quan detecta DSF. A més a més, aquí també mostrem com el sistema de QS cis-DA (cis-decenoic) descrit recentment a Pseudomonas aeruginosa és també present a S. maltophilia i regula un alt nombre de factors de virulència. En aquesta línia, hem sigut capaços de caracteritzar preliminarment dos components importants en la biosíntesi de l’àcid gras cis-DA: les enoil coA hidratases (ECH) Smlt0266 i Smlt0267. Hem observat que, mentre la mutació de la hipotètica sintasa Smlt0266 només condueix a l’increment de la formació de biofilm, la mutació en el gen que codifica per la ECH alternativa Smlt0267 implica una reducció dràstica en la formació de biofilm, la motilitat bacteriana, la producció d’exopolisacàrids, la resistència a antibiòtics i la virulència. Resultats similars s’han obtingut per els mutants dels gens ortòlegs a P. aeruginosa, la qual cosa recolza la importància d’aquestes dues ECHs, a més a més del sistema DSF, en la regulació de la virulència i aporta noves dianes interessants pel desenvolupament de teràpies antimicrobianes contra aquest potencial patogen humà / Fatty-acid mediated Quorum Sensing (QS) systems have aroused considerably interest in the last years since it has been reported that many important bacterial pathogens use these communication systems to regulate virulence-related functions. It is known that Stenotrophomonas maltophilia presents the DSF (Diffusible Signal Factor) QS system, which is controlled by components that are encoded in the rpf cluster (Regulation of Pathogenicity Factors). However, the mechanisms by which S. maltophilia synthesize and sense as well as the biological functions that are under control of DSF-QS remain unclear. Here, we have first demonstrated that two populations of S. maltophilia can be distinguished depending on the rpf cluster (rpf-1 or rpf-2) they harbour. Each variant cluster differs basically in the genes that encode for the synthase RpfF and the sensor RpfC. Moreover, we have observed that there exist a full association between both components, existing the pair RpfF-1/RpfC-1 for the rpf-1 variant and RpfF-2/RpfC-2 for the rpf-2 variant. In addition, we have demonstrated that only strains harbouring the rpf-1 variant produce detectable levels of DSF and it seems to regulate bacterial motility, biofilm development and virulence. On the other hand, strains harbouring the rpf-2 variant need extra copies of rpfF-2 or the absence of rpfC-2 to achieve detectable levels of DSF. In this case, DSF-QS seems to control only some virulence-related phenotypes in very specific environments (e.g., zebrafish infection). We also have shown that DSF is produced in a positive feedback-manner in S. maltophilia, and also, that both rpf-variant groups act synergistically in the DSF production and virulence ability of the whole population. In addition, we have observed that while RpfC-1 is a promiscuous sensor that liberates free active-RpfF-1 -with the subsequent DSF synthesis- upon detection not only DSF, but also saturated medium-length fatty acids, the sensor RpfC-2 only allows activation of RpfF-2 upon detection of DSF-itself, indicating that this sensor component is much more specific. Here, we further report that the cis-DA (cis-decenoic acid) QS system recently described in Pseudomonas aeruginosa is also present in S. maltophilia, and it regulates various virulence factors. In this line, we have preliminary characterized two important components in the biosynthesis of cis-DA, the enoyl-CoA hydratases (ECH) Smlt0266 and Smlt0267. We have observed that while the mutation in the putative synthase smlt0266 lead to alteration basically in biofilm formation, the mutation of the alternative ECH smlt0267 results in a drastic effect in many virulence-related behaviours such as biofilm formation, bacterial motility, exopolysaccharide production, antibiotic resistance and virulence. Similar results have been obtained for the mutants in the orthologous P. aeruginosa genes ∆dspI and ∆dspII. These results further support the significance of these two ECH, in addition to DSF-QS system, in virulence regulation of S. maltophilia and provide new interesting targets for developing new antimicrobial therapies against this potential human pathogen.

La necesidad de energía renovable y la constante amenaza del calentamiento global han motivado el desarrollo de nuevas tecnologías más sostenibles que las actuales, como los sistemas bioelectroquímicos, también conocidos con el nombre de celdas electroquímicas microbianas (Microbial Electrochemical Cells, MXCs), que combinan la electroquímica con el metabolismo de un grupo particular de microorganismos llamados exoelectrógenos o ARB (Anode Respiring Bacteria). Entender la actividad metabólica de los ARB y sus condiciones óptimas de crecimiento es de gran importancia para garantizar el máximo rendimiento de las MXCs. Por este motivo, la presente tesis estudia los sistemas bioelectroquímicos y tiene como objetivo desarrollar, estudiar y mejorar la comunidad microbiana de las MXCs para aumentar su rendimiento. Se han aplicado técnicas moleculares avanzadas cuales el estudio metagenómico del gen 16S ribosomal y la PCR en tiempo real (qPCR). Se han diseñado diferentes montajes experimentales para estudiar las condiciones de operación que favorecen a los ARB frente a otros microorganismos que disminuyen la eficiencia de las MXCs, como son los metanógenos o las bacterias homoacetógenas. El enriquecimiento de ARB bajo diferentes resistencias externas en celdas de combustible microbianas (Microbial Fuel Cells, MFC) ha demostrado que el ánodo inoculado en una MFC bajo una resistencia externa baja (12 Ω) tiene un mejor rendimiento cuando es trasladado a una celda de electrólisis microbiana (Microbial Electrolysis Cell, MEC); es decir, proporciona mayor intensidad y mayor tasa de producción de H2 que otras MFC inoculadas con resistencias externas superiores (220 y 1000 Ω). Los análisis de qPCR han confirmado que el uso de una resistencia externa baja en MFC comporta la formación de una biopelícula anódica con mayor contenido de Geobacter. Un estudio se ha llevado a cabo en dos etapas para conocer las limitaciones del uso a largo plazo del inhibidor de la metanogénesis 2-bromoetanosulfonato (BES). En MFCs alimentadas con acetato, se ha observado como el BES se demostraba ineficaz (hasta 200 mM) a largo plazo, ya que no puede evitar el crecimiento de Archaea (concretamente del género que usa hidrógeno como donador de electrones, Methanobrevibacter), lo que parece indicar el desarrollo de resistencia al BES. A concentración 200 mM de BES la actividad metanógenica disminuye, pero resulta en un incremento de la recirculación de hidrógeno por homoacetogénesis. Además, se ha demostrado la degradación de BES en MFC. Se ha obtenido una alta intensidad de corriente (hasta 10 A·m-2) en una MEC inoculada con un cultivo puro de Geoalkalibacter ferrihydriticus a pH básico (9.3). Estos resultados sugieren la posibilidad de que las condiciones alcalinas puedan mejorar el rendimiento de las MXCs mediante la creación de un entorno más selectivo para los ARB. También se ha seleccionado, a partir de lodos anaerobios, una comunidad capaz de trabajar en condiciones de pH básico utilizando medio alcalino y un control del pH en línea. Se han obtenido unos rendimientos muy elevados en MFC y MEC. El estudio de las poblaciones existentes muestra un elevado contenido en el género Alkalibacter en una MFC alcalina (37% de la comunidad bacteriana). El género Geoalkalibacter se ha confirmado a pH alto, particularmente en MEC (43%). Finalmente, se ha desarrollado una estrategia con el propósito de obtener un cultivo sintrófico entre fermentadores y ARB capaz de usar el suero de leche como donador de electrones. Este es fermentado principalmente a acetato por bacterias del ácido láctico (Enterococcus sp. comprendía el 22% de la comunidad bacteriana). La actividad exoelectrogénica se ha demostrado con la presencia de Geobacter sp. (37%), que consume el acetato como donador de electrones. Esta comunidad microbiana ha sido capaz de degradar el suero para producir directamente energía o H2 (0.6 LH2·L-1REACTOR·d-1). / The need of renewable energy and the constant threat of global warming have motivated the development of emerging sustainable technologies. Among them, bioelectrochemical systems envisage a future where energy and other added value products, such as hydrogen, can be obtained from organic waste streams. Thus, bioelectrochemical systems, also known with the name of microbial electrochemical systems (MXCs), fit perfectly in the new paradigm with respect to wastes, which should be valorized rather than treated. MXCs combine the electrochemistry with the metabolism of a particular group of microorganisms called exoelectrogens or anode respiring bacteria (ARB). The need of understanding the metabolic activity of ARB and their optimal growth conditions are of high importance to ensure the maximal performance of MXCs. In this frame, this thesis aimed to develop, to study and to upgrade the microbial community of MXCs in view of increasing their performance. For this purpose, ribosomal 16S gene targeted metagenomics study and quantitative real-time PCR (qPCR) techniques were implemented in this thesis. qPCR curves were built to study the evolution of ARB and methanogen microbial communities. Further, 454 pyrosequencing analysis were conducted in order to deepen the composition of microbial electrodes communities. Different experimental setups were designed to study operational conditions under which ARB could outcompete other microorganisms that can undermine MXCs performance, such as methanogens and homoacetogenic bacteria. The first step was the ARB enrichment at different external resistances in Microbial Fuel Cells (MFCs). This study showed that the anode inoculated under low external resistance (12 Ω) in MFC mode showed better performance in the posterior Microbial Electrolysis Cell (MEC) mode (i.e. gave higher current intensity and showed higher H2 production rate) than other MFCs inoculated under higher resistances (220 and 1000 Ω). Moreover, qPCR confirmed that the use of a low external resistance provides an MFC anodic biofilm with the highest content of Geobacter (the most usual ARB). A long term study of the most common methanogens chemical inhibitor: 2-bromoethanesulfonate (BES) was performed in two steps to underline its limitations. A long term acetate-fed MXCs showed BES ineffectiveness caused by Archaea (hydrogen-oxidizing genus Methanobrevibacter) resistance to high BES concentration (up to 200 mM) in MEC. In addition, BES degradation was demonstrated in MFC. Moreover, at higher BES concentration (200 mM), methanogenesis activity decreased but resulted in an increase of H2 recycling by homoacetogenesis. A MEC inoculated with Geoalkalibacter ferrihydriticus pure culture at high pH revealed high current intensity production (up to 10 A·m-2). These results suggested the possibility to use alkaline conditions with the objective to improve MXCs performance by creating a more selective environment. Then, a high pH community was selected from anaerobic sludge using alkaline medium and an online pH control. High performances were obtained in both MFC and MEC (around 50 mA·m-2 of current density and 2.6 LH2·L-1REACTOR·d -1). Alkalibacter genus was highly detected in an alkaline MFC (37% of the bacterial community) and it was identified as a potential ARB. The presence of Geoalkalibacter genus was confirmed at high pH (9.3) conditions and especially in MEC (43 %). Finally, a successful strategy was developed with the purpose of obtaining a cheese-whey fermentative-ARB syntrophic community. Cheese-whey was fermented to acetate mainly by lactic acid bacteria (Enterococcus genus was 22% of the total bacterial community) and other fermenting bacteria as Sphaerochaeta and Dysgonomonas genera. Exoelectrogenic activity was performed by Geobacter sp. (37%), that used the acetate as electron donor. This microbial community was able to degrade cheese whey to produce directly energy or H2 (0.6 LH2·L-1REACTOR·d-1). Moreover, cheese whey MXCs demonstrated the intrinsic ability to inhibit methanogenic activity without using other external inhibition strategies.

Algunos tratamientos de elaboración y conservación de los alimentos lesionan las bacterias, de manera que pierden la capacidad para multiplicarse y no son detectadas por métodos de cultivo convencionales. La citometría de flujo es una técnica de análisis independiente del cultivo de los microorganismos, usada ampliamente para evaluar de manera rápida el estado fisiológico de células bacterianas individuales, siendo la integridad de membrana unos de los indicadores más habituales debido a su importancia en la supervivencia de éstas. Sin embargo, los resultados obtenidos mediante citometría de flujo se ven afectados por la presencia de partículas de las muestras alimentarias. En esta tesis, se evaluaron estrategias para desarrollar un ensayo por citometría de flujo basado en el uso del yoduro de propidio (YP), fluorocromo que no atraviesa las membranas intactas, combinado con un fluorocromo que penetra las membranas intactas, para detectar y cuantificar con precisión bacterias patógenas lesionadas. En el primer experimento, se ajustaron las concentraciones y las ratios de combinaciones de YP con SYTO 9, SYTO 24 y SYTO BC para mejorar la resolución de poblaciones de células sanas y muertas de Escherichia coli O157:H7, Salmonella Enteritidis y Listeria monocytogenes en suspensiones control. Esto permitió detectar células lesionadas en suspensiones expuestas a estreses relacionados con los alimentos. En el segundo experimento, se aplicaron las tinciones optimizadas a muestras de ensalada de pasta inoculadas con E. coli O157:H7. Asimismo, se compararon ocho pre-tratamientos basados en la filtración gruesa de las muestras homogeneizadas y en un paso de dilución/lavado, para evaluar la reducción de partículas interferentes y la recuperación de E. coli O157:H7 de la ensalada. El pre-tratamiento más favorable fue la combinación de la bolsa de homogenización con filtro de 63 µm y la filtración centrífuga a través de un filtro de 5 µm, ya que redujo la concentración de partículas interferentes tanto como diluir la muestra. Considerando que el objetivo principal de esta tesis fue detectar específicamente bacterias patógenas lesionadas, en el tercer experimento, la optimización se llevó a cabo para suspensiones control de E. coli O157:H7 en soluciones tampón comúnmente usadas en inmunoensayos, y teñidas con SYBR Green I, un fluorocromo con alta afinidad por los ácidos nucleicos, YP y un anticuerpo marcado con R-ficoeritrina (Ac-RFE). La adición de Ac-RFE no afectó notablemente la resolución de las poblaciones en comparación con la resolución conseguida con la tinción con SYBR Green I y YP, y permitió reconocer claramente las células de E. coli O157:H7. En el cuarto experimento, se evaluaron estrategias de filtración de señal analítica para reducir la adquisición de datos procedentes de partículas interferentes. Posteriormente, se aplicó el pre-tratamiento de muestra optimizado, la tinción para evaluar la integridad de membrana y la inmunodetección, y la filtración de señal analítica, para monitorizar los cambios de la integridad de membrana de E. coli O157:H7 inoculada en ensalada de pasta durante 14 días de almacenamiento en refrigeración (pH 4,5; 4°C). Con este protocolo optimizado, el límite de detección disminuyó a 5 log UFC/g. Además, se observó que la mayoría de células de E. coli O157:H7 estaban lesionadas al principio del almacenamiento, pero mostraban una membrana intacta al final, lo que sugiere que las células lesionadas repararon su membrana durante la exposición a ácido y refrigeración y, por lo tanto, sobrevivieron en la ensalada de pasta. En conclusión, el ensayo por citometría de flujo para la evaluación de la integridad de membrana y la inmunodetección desarrollado en esta tesis es una buena herramienta para monitorizar el efecto de tratamientos relacionados con los alimentos sobre el estado de la membrana de E. coli O157:H7, parámetro fisiológico relacionado con la presencia de células lesionadas. / Nowadays, one of the key factors driving consumer food choice is convenience. This has led to an increase in the ready-to-eat (RTE) meal market, with a consequent emergence of new food safety hazards, since food processing and preservation technologies that may be applied to these food products have a milder effect on microorganisms than traditional food processing strategies (e.g. pasteurization, sterilization). As a result, some of those technologies render injured bacteria, which may lose their ability to multiply and are therefore not detected by conventional plating. However, their presence in food must not be overlooked, due to their potential capacity to recover and pose a hazard to health in the case of pathogens. Flow cytometry is a culture-independent technique which has been widely used in bacterial research to rapidly assess the physiological state of individual cells, with membrane integrity being one of the most popular parameters due to its essential role in survival. However, flow cytometry results are largely affected by the interference of food particles. In this thesis, several strategies were evaluated to develop a flow cytometry assay, based on the use of the membrane-impermeant dye propidium iodide (PI) combined with a membrane-permeant dye, to accurately detect and enumerate injured pathogenic bacteria. In the first experiment, concentrations and ratios of combinations of PI with SYTO 9, SYTO 24, and SYTO BC were adjusted to improve resolution of healthy and dead Escherichia coli O157:H7, Salmonella Enteritidis and Listeria monocytogenes populations in control suspensions. This allowed detection of injured cells in suspensions exposed to food-related stresses. In the second experiment, optimized stainings were applied to RTE pasta salad samples inoculated with E. coli O157:H7. Moreover, eight different salad sample pre-treatments based on coarse filtration of homogenates and a dilution/wash step were compared in terms of background particle reduction and E. coli O157:H7 recovery. The most advantageous pre-treatment was the combination of a 63-µm filter blender bag and centrifugal filtration through a 5-µm filter, since it was equivalent to sample dilution in reducing background particle concentration. Considering that the ultimate goal of this thesis was to detect specific injured pathogen cells in RTE pasta salad, in the third experiment, optimization was carried out for E. coli O157:H7 control suspensions in buffers commonly used in immunoassays and stained with the high-affinity nucleic acid dye SYBR Green I, PI, and an R-phycoerythrin-labeled antibody (Ab-RPE). Addition of Ab-RPE did not remarkably affect population resolution compared with staining only with SYBR Green I and PI, and allowed clear recognition of E. coli O157:H7. Finally, in the fourth experiment, a range of signal filtering strategies were evaluated for reduced acquisition of flow cytometry data arising from interfering food particles. Then, optimized salad sample pre-treatment, combined membrane integrity and immunodetection staining, and signal filtering were applied to monitor the changes in membrane integrity of E. coli O157:H7 inoculated in pasta salad throughout 14-day refrigerated storage (pH 4.5, 4°C). With this optimized flow cytometry protocol, the limit of detection of the assay was reduced to 5 log CFU/g. Additionally, it was observed that most E. coli O157:H7 cells were injured at the beginning of refrigeration, but showed an intact membrane at the end, which suggests that injured cells repaired their membrane during exposure to refrigeration and acid stresses, and therefore survived in RTE pasta salad. In conclusion, the immunodetection and membrane integrity flow cytometry assay in food samples developed in this thesis is a good tool to monitor the effect of a number of food-related treatments on E. coli O157:H7 cell membrane state, a physiological parameter that can be related to the presence of injured cells.