En este trabajo se ha determinado la capacidad bioreparadora de metales de Micrococcus luteus DE2008, un microorganismo heterótrofo aislado directamente de los tapetes microbianos del delta del Ebro, y de Chroococcus sp. PCC 9106, una cianobacteria procedente de la Colección de Cultivos Pasteur. Para ello se han utilizado técnicas microscópicas de alta resolución (óptica y electrónica) y métodos de análisis bioquímicos y químicos con el fin de seleccionar microorganismos con capacidad para bioreparar ambientes naturales contaminados. En este trabajo, los metales ensayados para la selección de microorganismos con potencial bioreparador, han sido: el plomo (Pb (II)), el cobre (Cu (II)) y el cromo trivalente (Cr (III)), ya que los tres se han detectado en el río Ebro. Con el objetivo de determinar el efecto in vivo del cromo sobre los pigmentos fotosintéticos de Chroococcus sp. PCC 9106, se ha utilizado la microscopía láser confocal acoplada a un detector espectrofluorométrico (CLSM-λScan). Los resultados indican que Chroococcus sp. PCC 9106 es tolerante-resistente hasta una dosis de 0.26 mM de Cr (III). Para determinar los cambios en la biomasa total y en la viabilidad de Micrococcus luteus DE2008 y de Chroococcus sp. PCC 9106, en primer lugar se ha optimizado un método que combina el uso de fluorocromos, la microscopía láser confocal y un programa de análisis de imagen (FLU-CLSM-IA); y en segundo lugar se ha aplicado éste método para determinar el efecto de los metales sobre estos dos microorganismos y los resultados demuestran que M. luteus DE2008 presenta a nivel de biomasa total, una mayor resistencia al plomo (1.5 mM) que al cobre (0.1 mM) y que su viabilidad se ve afectada a partir de una concentración de 0.5 mM de Pb (II) y de Cu (II). Por otro lado, la concentración mínima de Cr (III) que tiene un efecto significativo en la biomasa total y en la viabilidad de Chroococcus sp. PCC 9106 es de 1.0 y 0.1 mM, respectivamente. Con el fin de determinar la biocaptación externa e interna del metal, se ha utilizado la microscopía electrónica de barrido (SEM), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el microanálisis de energía dispersiva por rayos X (EDX) acoplada a estos dos microcoscopios. Los resultados indican que, M. luteus DE2008 es capaz de captar Pb (II) y Cu (II) extracelularmente, mientras que Chroococcus sp. PCC 9106 capta el Cr (III) extra e intracelularmente. Finalmente para determinar la eficiencia de captación de los microorganismos ensayados a los diferentes metales pesados se ha utilizado un espectrómetro de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES). El cálculo de la eficiencia de biocaptación se basa en el porcentaje de bioabsorción (%) y en la capacidad específica de biocaptación de metales (q). Los resultados demuestran que M. luteus DE2008 tiene una mayor afinidad por el Pb (II) que por el Cu (II), ya que el porcentaje de bioabsorción (%) y la q son mayores en ambos casos para el plomo. Por otra parte, en el caso de Chroococcus sp. PCC 9106, el tiempo requerido para que la biocaptación del Cr (III) llegue al equilibrio es de 72h, siendo la q en este período de tiempo de 54 mg/g con un porcentaje de bioabsorción del 62%. Considerando todos los resultados obtenidos, se puede concluir que M. luteus DE2008 y Chroococcus sp. PCC 9106 podrían ser considerados como buenos bioreparadores de ambientes contaminados por metales. Ello es debido a que cumplen las siguientes características: son microorganismos autóctonos; fáciles de cultivar en condiciones de laboratorio; capaces de captar los metales extra y/o intracelularmente y presentan una alta tolerancia y una alta afinidad en la biocaptación de los metales. / This study determines the metal bioreparation capacity of Micrococcus luteus DE2008, an heterotrophic microorganism isolated directly from the microbial mats of the Ebro delta, as well of that of Chroococcus sp. PCC 9106, a cyanobacterium from the Pasteur Culture Collection. To do this, high resolution microscopic techniques (optical and electron), as well as biochemical and chemical methods have been used in order to select microorganisms with the ability to biorepair contaminated natural environments. In this work, the metals determined for the selection of microorganisms with biorepair potential were: lead (Pb (II)), copper (Cu (II)), and trivalent chromium (Cr (III)), since the three of them have been detected in the Ebro river. . A confocal laser scanning microscope connected to a spectrofluorimetric detector (CLSM- λScan) was used to determine the in vivo effect of chromium on the photosynthetic pigments of Chroococcus sp. PCC 9106. The results showed that Chroococcus sp. PCC 9106 is tolerant-resistant up to metal dose of 0.26 mM of Cr (III). In order to determine the changes in the total biomass and in the viability of Micrococcus luteus DE2008 and Chroococcus sp. PCC 9106, firstly, a method was optimised that combined the use of fluorochromes, the confocal scanning microscope, and an image analysis program (FLU-CLSM-IA). This method was then applied to determine the effect of the metals on these two microorganisms. The results demonstrated that the total biomass of M. luteus DE2008 had a higher resistance to lead (1.5 mM) than to copper (0.1 mM), and the viability of this microorganism was seen to be affected from a concentration of 0.5 mM for Pb (II) as well as for Cu (II). On the other hand, the minimum concentration of Cr (III) that had a significant effect on the total biomass and on the viability of Chroococcus sp. PCC 9106 was 1.0 and 0.1 mM, respectively. In order to determine the external and internal sequestration of the metal, a scanning electron microscope (SEM), a transmission electron microscope (TEM), and an energy-dispersive X-ray (EDX) spectrometer coupled to these two microscopes were used. The results showed that M. luteus DE2008 is only able to capture Pb (II) and Cu (II) extracelullarly, whilst Chroococcus sp. PCC 9106 captured Cr (III) extra and intracellularly. Finally, inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES) was used to determine the uptake efficiency of the two microorganisms with the different heavy metals. The calculation of the uptake efficiency was based on the percentage of bioabsorption (%) and on the specific metal biouptake capacity (q). The results showed that M. luteus DE2008 had a higher affinity for Pb (II) than for Cu (II), since the percentage of bioabsorption (%) and the specific uptake capacity (q) were higher for lead in both cases. On the other hand, in the case of Chroococcus sp. PCC 9106, according to the kinetic study, the time required for the uptake of Cr (III) to reach equilibrium (time in which the uptake capacity is maximum) was 72 hours, the (q) being in this period of time 54 mg/g with a percentage of bioabsorption 62%. Taking into account all the results obtained, it can be concluded that M. luteus DE2008 and Chroococcus sp. PCC 9106 could be considered to bioremediate environments contaminated by metals. This due to the fulfilling of the following characteristiques: they are native microorganisms; easy to culture under laboratory conditions, capable of uptaking metals extra and/or intracellularly, and finally, have a high tolerance and a high affinity in the uptake of metals.

El microorganisme bacterià més virulent del món és Mycobacterium tuberculosis ja que és el que mata més persones per si sol que cap altra infecció. Encara que la malaltia es tracta amb quimioteràpia i existeix una vacuna preventiva existeix un reservori de 1.800.000.000 persones infectades en el món en aquest moment; això representa gairebé un terç de la població mundial. L'home és un hostatger resistent a la infecció per M. tuberculosis i per això caldria trobar un model animal que es comporti de forma semblant. En aquest sentit, les soques resistents a la infecció tuberculosa podrien reproduir aquesta situació i ens permetrien estudiar el comportament del bacil en unes condicions semblants a les humanes.Un macròfag inactivat no pot destruir M. tuberculosis i permet el seu creixement i supervivència dins del fagosoma afavorit per mecanismes de depressió immunològica. En canvi, en ser activat el macròfag, es converteix paulatinament en una màquina efectiva de destrucció que comporta l'acidificació del fagosoma, condicions reductores, hidrolases i efectes potencials de ROIs i RNIs. Aquests mecanismes potencialment destructors no semblen ser definitivament efectius davant la infecció i així parlem ocasionalment de bacils latents. Aquests bacils han de romandre durant un temps perllongat en aquestes condicions passant desapercebuts als mecanismes immunològics i suposant un dels principals problemes de la tuberculosi, la latència.Segons les hipòtesis actuals de la dinàmica de poblacions als granulomes que fonamenten el tractament de la tuberculosi, existirien poblacions semi-latents a les ferides granulomatoses que romandrien extracel·lularment i a un pH àcid (pH<5,5). Aquesta població seria una de les causants del fracàs del tractament junt amb la població latent. És per això que l'estudi de la susceptibilitat a l'àcid en un model in vitro ens pot permetre conèixer una mica més el comportament del bacil davant aquest mecanisme d'estrès. Existeixen ja altres estudis semblants amb M. smegmatis i fins i tot amb M. tuberculosis, però tots han basat la seva metodologia en shocks àcids, és a dir, adaptació ràpida a aquesta condició o com a molt han mantingut el bacil durant vàries hores. Realment, no sembla que sigui aquesta l'estratègia real que adopta el macròfag davant la infecció tuberculosa, ja que tot el procés descrit anteriorment per la caracterització del fagosoma i la posterior maduració a fagolisosoma porta un temps relativament curt, però M. tuberculosis roman més temps i cal un estudi tenint en compte aquesta variació de temps. A més, la destrucció del bacil per mecanismes clàssics del fagolisosoma no és immediata i pot no portar a una degradació total. De la mateixa forma, l'estudi en el model murí per aerosol de l'adaptació metabòlica de M. tuberculosis ens ha de servir per a corroborar els resultats obtinguts in vitro.Aquest treball intenta donar més llum sobre el bacil latent a nivell genètic i immunològic basant-se en estudis de metabolisme i resposta a l'estrès en un model in vitro i en el model murí per aerosol. L'objectiu essencial serà doncs el de cercar marcadors moleculars que permetin determinar la presència de bacils latents en teixit. Concretament, aquest estudi ha permès conèixer com varia l'expressió de més de 60 gens de M. tuberculosis a la presència d'àcid en un model in vitro que podria reproduir les condicions presents al interior del macròfag. Posteriorment, s'ha estudiat l'expressió dels gens més rellevants en ratolins infectats per aerosol aconseguint informació sobre el comportament d'aquest bacil dins del seu hostatger durant tot el procés d'infecció mitjançant la caracterització immunològica d'un model crònic per l'estudi de 24 citocines. Prèviament, s'ha caracteritzar àmpliament la patogènia d'aquest model crònic comparant la susceptibilitat a la infecció de dues soques de ratolí. / The most striking virulent organism in the world is Mycobacterium tuberculosis because it kills 2 million people every year all alone. An effective treatment and vaccine are available, but 1.800.000.000 people are still infected in the world, just a third of the world population.Tuberculosis only develops in 10% of immunocompetent people, so a resistant phenotype is shown. So, we have to look for a resistant model to resemble these conditions. On the one hand, mice resistant strains to tuberculosis are a good model for this study.An inactivated macrophage is not able to kill M. tuberculosis and allows the exponential growing and surivival inside phagosome in absence of an effective immune response. On the other hand, correctly activated macrophage acts as an effective destroy machine by acidificaction of phagosome, reduction condition, hydrolases and hazard effects of ROIs and RNIs. These mechanisms of destructions do not seem to be totally effective and that's the reason why we have to talk about latent infection. These bacilli must remain in those conditions allowing immune response not to recognise them and rising as one of the most striking problems in tuberculosis, latency.According to actual hypothesis about dynamic population in granulomes that are the basis for the treatment of tuberculosis, some semi-latent population would be present in granulomatous injuries extracellularly at pH lower than 5,5. This population would be one of the main reason for the treatment fail in conjunction with latent bacilli. That's the reason why the study of acidification susceptibility in an in vitro model may allow us to deeply know the bacilli behaviour in front of stress mechanisms. M. smegmatis has been studied in order to determine its answer to those conditions, but not M. tuberculosis. All strategies performed are based on a acid shock, this is a fast adaptation, but this situation does not resemble real conditions. I mean that adaptation to acidic conditions is related to a process of several hours (about 6). Moreover, phagosome maduration and phagolysosome formation is a slow process that requires long time. So, this time modulation must be taken into account. In the same way, the killing of M. tuberculosis may not be a fast process, this is, bacilli are able to overcome acidification for some days and so on. Eventually, the performing of this idea in the murine model is related to a metabolic adaptation of M. tuberculosis and must be useful for the confirmation of in vitro results.This study is trying to add some more ideas about the latent bacilli at genetic and immunologic level based on metabolism studies and answer to stress in an in vitro and in vivo model. The essential objective is to look for moleculars markers that may allow to define the presence of latent bacilli in tissues. In detail, this study has monitored the evolution of more than 60 genes of M. tuberculosis related to the acidic response that may resemble conditions in phagosomes from macrophages. Later, this expression has been followed up in a murine mode according to the conditions studied before. On the other hand, the immune response has been studied according to the expression of 24 cytokines related to tuberculosis. Previously, we have compared the behaviour of M. tuberculosis in two different strains of mice providing evidence of a resistant model for C57BL/6 mice.

Objetivos: Los objetivos planteados en el presente estudio fueron: i) Análisis de la colonización ambiental por P. aeruginosa en la UCI del Hospital de Sabadell; ii) Análisis del origen de la colonización y la infección causada por P. aeruginosa en los enfermos sometidos a VM valorando por un lado el origen endógeno o exógeno de dicha colonización e infección, por otro lado la secuencia de la colonización; iii) Determinar la existencia de cultivos policlonales de P. aeruginosa analizando su implicación en los estudios epidemiológicos de la colonización y/o infección así como en la heterogeneidad de los fenotipos de sensibilidad a los antimicrobianos en los cultivos de P. aeruginosa. Material: 160 aislamientos ambientales de P. aeruginosa (analizando, siempre que era posible, 4 colonias por cultivo) procedentes de los 41 cultivos obtenidos de 5 cortes ambientales realizados; 348 aislamientos ambientales de P. aeruginosa procedentes de los 93 cultivos obtenidos de los grifos de los boxes donde permanecían ingresados los pacientes; 1.104 aislamientos P. aeruginosa obtenidos de las distintas localizaciones anatómicas estudiadas en los 39 pacientes colonizados. Marcadores: (I) Electroforesis en campo pulsante (PFGE); (II) estudio de sensibilidad a los antimicrobianos. Resultados y Discusión: Se evidenció una importante heterogeneidad genética en las cepas P. aeruginosa aisladas en la UCI al tipificarlas mediante PFGE. La existencia de variaciones subclonales en algunos de los pulsotipos (PTs) obtenidos se asoció a la persistencia de los PTs y a la frecuencia de su aislamiento. P. aeruginosa mostró especial predilección por los grifos de los boxes y las superficies adyacentes a los mismos, siendo un reservorio estable. Por el contrario, su aislamiento en las manos del personal sanitario fue infrecuente. La colonización de los pacientes fue, mayoritariamente, de origen exógeno o ambiental. En la mitad de los episodios de neumonía asociada a la VM, las cepas responsables eran propias de los pacientes por lo que no se verían influidas por las medidas encaminadas a eliminar el reservorio ambiental. Los grifos de los boxes se identificaron como el reservorio principal de P. aeruginosa durante el período de VM. Sin embargo, tan sólo 1 de las 8 cepas asociadas a neumonía procedía del grifo. El lugar inicial de colonización sólo pudo identificarse en una tercera parte de los pacientes con colonización del tracto respiratorio inferior adquirida durante el período de VM, en estos casos, tanto el estómago como el tracto respiratorio superior tuvieron una importancia equivalente. Por otra parte, en los episodios de NAV en los que pudo determinarse el lugar inicial de colonización, el estómago no fue el origen. El 13 % de los cultivos fueron policlonales. En el 23 % de dichos cultivos no pudieron identificarse los distintos PTs presentes en función de la morfología de las colonias. Los cultivos policlonales fueron un hecho frecuente en los cultivos de los grifos y, en consecuencia, en los procedentes del tracto gastrointestinal de los enfermos, especialmente el estómago. En cambio, es importante resaltar que los cultivos provenientes del tracto respiratorio y de las muestras diagnósticas de NAV, con independencia de la morfología de las colonias, han mostrado un único PT. En el 10,6 % de los 341 cultivos con una morfología colonial se detectó más de un antibiotipo. El estudio de sensibilidad a partir de varias colonias permitiría detectar poblaciones mixtas, siendo necesario un estudio posterior para identificar los distintos fenotipos de sensibilidad coexistentes. Se detectó una cierta falta de estabilidad en el antibiotipo ya que el 11,4% de los cultivos con 1 PT mostraba más de un antibiotipo. Por otra parte, también se evidenció la falta de poder discriminativo del antibiotipo ya que en el 69% de los cultivos con más de 1 PT sólo se observó un antibiotipo. Para determinar el origen de las cepas de P. aeruginosa y las vías de colonización de los enfermos sometidos a VM, es necesario realizar el seguimiento de las distintas localizaciones anatómicas y del ambiente junto con la aplicación de un método de tipificación como el PFGE. Asimismo, es necesario analizar varias colonias por cultivo. / Objectives: i) Analysis of the environmental colonisation of the ICU by P. aeruginosa; ii) Analysis of the origin of the colonisation and the infection caused by P. aeruginosa in the mechanically ventilated patients analysing on the one hand the endogenous or exogenous origin of this colonisation and infection, and on the other hand the sequence of the colonisation; iii) To determine the existence of polyclonal cultures of P. aeruginosa analysing their implication in the epidemic studies of the colonisation and/or infection as well as in the heterogeneity of the antimicrobial susceptibility patterns of P. aeruginosa. Material: 160 environmental isolates of P.aeruginosa (analysing, whenever it was possible, 4 colonies for each culture) coming from the 41 cultures obtained in the 5 environmental surveys. 348 environmental isolates of P. aeruginosa obtained from the 93 cultures of the taps of the rooms and 1.104 isolates of P. aeruginosa belonged to the different anatomical locations studied in the 39 colonised patients. Markers: (I) PFGE and (II) Study of the antimicrobial susceptibility. Results and Discussion: An important genetic heterogeneity was evidenced in the P. aeruginosa strains isolated in an ICU when were typing by PFGE. The existence of subclonal variations in some of the obtained pulsotypes (PTs) was associated to the persistence of the PTs and their frequency of isolation. P. aeruginosa showed special predilection for the moist sites of the ICU (the taps of the rooms and the adjacent surfaces to the same ones) that have been a stable reservoir of this micro-organism. On the contrary, its isolation from the hands of the health care personnel was uncommon. The colonisation of the patients was, for the most part, of exogenous or environmental origin. In half of the VAP episodes, the responsible strains were of the own patients for what they would not be influenced by the measures guided to eliminate the environmental reservoir. The taps of the rooms were identified as the main reservoir of P. aeruginosa during the ventilation period. However, only 1 of the 8 strains associated to pneumonia came from the tap. The initial site of colonisation could only be identified in a third part of the patients with colonisation of the lower respiratory tract acquired during the period of MV, in these cases, as much the stomach as the upper airway had an equivalent importance. On the other hand, in those episodes of VAP where the initial site of colonisation could be determined, the stomach was not the origin. The 13% of the total cultures were polyclonal. The 23 % of these cultures could not be differentiated according to the morphology of the colonies. The polyclonal cultures were a frequent event in the cultures obtained from the taps and, in consequence, in the belonged to the gastrointestinal tract, especially to the stomach. In the other hand, it is noteworthy that the cultures belonged to the respiratory tract and the diagnostic respiratory secretions of VAP, independently of the morphology of the colonies, had only one pulsotype. In the 10,6 % of the 341 cultures, with colonies of the same morphotype, was detected more than one antibiotype. The study of the antimicrobial susceptibility of several colonies would allow detecting mixed populations, being necessary a later analysis to identify the different coexistent susceptibility phenotypes. A certain lack of stability was detected due to that a 11.4 % of the cultures with one pulsotype showed more than one antibiotype. Moreover, it was also evidenced a lack of discriminatory power due to that a 69% of the cultures with more than one pulsotype showed only one antibiotype. To determine the origin of the P. aeruginosa strains and the source and transmission routes of colonisation of the ventilated patients, it is necessary the surveillance study of different body sites over the time and the environment together with the applying of a typing method like the PFGE. In the same way, it is necessary to analyse different colonies in each culture.

Els micobacteris, especialment les espècies del complex tuberculosi, són responsables de nombroses infeccions en humans. L'OMS ha declarat la tuberculosi (TB) com una emergència global, cada any moren aproximadament 3 milions de persones de TB i es desenvolupen al voltant de 9 milions de nous casos. Durant alguns anys es va creure que es podria eradicar la TB als països desenvolupats. No obstant això, la incidència de la TB en aquests països no ha seguit la línia descendent que s’havia projectat. Tot i que el 80% de la TB està concentrada en 22 països, la reemergència al primer món ha estat influènciada pel gran moviment migratori des de països amb alta incidència de TB (alhora amb greus problemes de multiresistencia); l’existència de borses de pobresa al món industrialitzati el desmantellament d’alguns programes de control de la TB. Per al control de la TB és necessari el diagnòstic precoç a fi d’interrompre la cadena de transmissió. Els mètodes tradicionals de diagnòstic microbiològic no són eficients donada la seva lentitud. En els últims 20 anys s’han desenvolupat nous mètodes d’aïllament, identificació, estudis de sensibilitat i tipificació tant per a M. tuberculosi com per a la resta de micobacteris. Encara que amb menor importància en l’àmbit de salut pública que M. tuberculosi, la freqüència d'aïllament de micobacterias no tuberculosas (MNT) va augmentant, i al mateix temps es van descrivint noves espècies susceptibles de produir patologia en humans. L'any 1975 el gènere Mycobacterium comprenia al voltant de 30 espècies, actualment se n'han descrit al voltant de 150. Per orientar el tractament dels diferents micobacteris és necessari arribar a la identificació al nivell d'espècie fins i tot dins del complex tuberculosi. Els estudis de sensibilitat en M. tuberculosi són particularment importants tant per al monitoratge de les taxes de resistència inicial en una comunitat, que influiran en els tractaments empírics dels casos d'aquesta comunitat, com per a la detecció de soques resistents en pacients amb factors de risc. Els estudis de sensibilitat en les MNT es limiten a poques espècies, M avium complex, M kansasii i micobacteris de creixement ràpid no pigmentats amb significació clínica. Per tot això, el laboratori de micobacteriologia clínica juga un paper important tant en atenció sanitària com en l’àmbit de la salut pública. S’han desenvolupat noves tècniques i per tal de donar resultats adequats i amb el mínim de temps possible. Tradicionalment s’han utilitzat tècniques fenotípiques per a la identificació i estudis de sensibilitat, actualment estan veient-se complementades per les tècniques basades en la biologia molecular, fins i tot aplicables directament en la mostra clínica. Els objectius principals d’aquesta tesi han estat l’avaluació dels mètodes de diagnòstic del laboratori de micobacteris ( examen directe, amplificació d’àcidsnucleïcs, aïllament per cultiu i identificació) i el seguiment de les resistències als antituberculosos en casos nous i pacients amb tractament previ. Com a objectius secundaris han estat l’avaluació de dos sistemes no radiomètrics (MB/BacT ALERT® i BACTEC MGIT 960®) per a l’estudi de la sensibilitat als antituberculosos de primera línia, la caracterització molecular dels mecanismes de resistència als fàrmacs de primera línia i la descripció dels diferents llinatges de les soques de M. tuberculosis resistents aïllades a l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Al llarg del període estudiat s’ha observat un augment de l’aïllament de MNT, coincidint amb la pandèmia de la SIDA, així com una disminució a partir de la introducció del tractament combinat d’alta eficàcia. També s’ha observat un descens global en els aïllaments de M. tuberculosi, a causa de la disminució en pacients autòctons, encara que s’observa un increment de pacients immigrants. La sensibilitat de la bacil·loscòpia en el diagnòstic de la tuberculosi respiratòria ha estat del 52.2%, sent l’esput la mostra més sensible (64,4%). En la tuberculosi extrarespiratòria la sensibilitat de la bacil·loscòpia ha estat del 23,7%, sent les mostres osteoarticulars les mésfreqüentment positives (35,7%). L’especificitat ha estat del 99,9% amb un VPP del 99,4%. Globalment s’ha observat una major capacitat d’aïllament dels mitjans de cultiu líquid. L’efecte inòcul és més significatiu en aquelles mostres amb la bacil.loscòpia negativa, el que corrobora la importància de la utilització dels dos tipus de medi de cultiu en l’aïllament. L’especificitat de l'AMTD per a la detecció d’àcidsnucleïcs M. tuberculosi complex ha estat bona (99.8%). La sensibilitat en mostres bacil·loscòpia positiva fou del 94.2%, disminuint considerablement en mostres bacil·loscòpia negativa (especialment en la tuberculosi extrarespiratoria). El percentatge de resistència global en casos nous ha estat del 7,9%, significativament més alta en pacients immigrants (16,7%) que en pacients autòctons (5,7%). La resistència global en pacients amb tractament previ fou del 15.1%, significativament més alta en pacients immigrants (46,2%) respecte als pacients autòctons (5%). La multiresistència només es va trobar en pacients immigrants. Els sistemes MB/BacT ALERT i BACTEC MIGIT 960 són una bona alternativa no radiométrica al sistema BACTEC 460 per a l’estudi de sensibilitat als fàrmacs de primera línia. Quant als fàrmacs de segona línia totes les soques amb resistència a l'ethionamida presentaven resistència creuada amb la isoniazida, sent aquesta en el 75% resistència de baix nivell. El 75% de les soques resistents a la RIF presentaven resistència creuada amb la rifabutina. No s'han trobat resistències a altres fàrmacs de segona línia. La resistència a la INH s'ha degut en el 39,3% dels casos a alteracions en el codó 315 del gen katG i en el 32,1% a la regió reguladora de l'operó mabA-inhA. Un 28,6 % de les soques no van presentar alteracions en aquests loci. Totes les soques resistents a la Rifampicina van presentar mutacions a la regió central del gen rpoB. La soca que presentava una mutació en el codó 516 era sensible a la rifabutina. El 30% de les soques resistents a la STR presentaven mutacions en el gen rpsL un altre 30% al gen rrs. La soca resistent a la PZA presentava una deleció de 9 nucleòtids al gen pncA. Les soques resistents dels pacients llatinoamericans i espanyols comparteixen el mateix llinatges d'espoligotip (LAM). / Las micobacterias, especialmente las especies del complejo tuberculosis, son responsables de numerosas infecciones en humanos. La OMS ha declarado la tuberculosis (TB) como una emergencia global, cada año mueren aproximadamente 3 millones de personas de TB y se desarrollan alrededor de 9 millones de nuevos casos. Durante algunos años se creyó que se podría erradicar la TB en los países desarrollados, sin embargo, la incidencia de la TB en estos países no ha seguido la línea descendente que se había proyectado. A pesar de que el 80% de la TB está concentrada en 22 países, la reemergencia en el primer mundo ha sido influenciada por el gran movimiento migratorio desde países con alta incidencia de TB (a la vez con graves problemas de multiresistencia); la existencia de bolsas de pobreza en el mundo industrializado y el desmantelamiento de algunos programas de control de la TB. Para el control de la TB es necesario el diagnóstico precoz con el objetivo de interrumpir la cadena de transmisión. Los métodos tradicionales de diagnóstico microbiológico no son eficientes dada su lentitud. En los últimos 20 años se han desarrollado nuevos métodos de aislamiento, identificación, estudios de sensibilidad y tipificación tanto para M. tuberculosis como para el resto de micobacterias. Aunque con menor importancia en el ámbito de salud pública que M. tuberculosis, la frecuencia de aislamientos de micobacterias no tuberculosas (MNT) va aumentando, y al mismo tiempo, se van describiendo nuevas especies susceptibles de producir patología en humanos. En el año 1975 el género Mycobacterium comprendía alrededor de 30 especies, actualmente se han descrito alrededor de 150. Para orientar el tratamiento de las diferentes micobacterias es necesario llegar a la identificación a nivel de especie, incluso dentro del complejo tuberculosis. Los estudios de sensibilidad en M. tuberculosis son particularmente importantes tanto para la monitorización de las tasas de resistencia inicial en una comunidad, que influirán en los tratamientos empíricos de los casos de esta comunidad, como para la detección de cepas resistentes en pacientes con factores de riesgo. Los estudios de sensibilidad en las MNT se limitan a pocas especies, M aviumcomplex, M kansasii y micobacterias de crecimiento rápido no pigmentadas con significación clínica. Por todo esto, el laboratorio de micobacteriologia clínica juega un papel importante tanto en atención sanitaria cómo en el ámbito de la salud pública. Con el desarrollo de nuevas tecnologías se ha conseguido dar resultados adecuados y con el mínimo de tiempo posible. Tradicionalmente se han utilizado técnicas fenotípicas para la identificación y estudios de sensibilidad, actualmente están viéndose complementadas por las técnicas basadas en la biología molecular, incluso aplicables directamente en la muestra clínica. Los objetivos principales de esta tesis han sido la evaluación de los métodos de diagnóstico del laboratorio de micobacteriología ( examen directo, amplificación de ácidos nucleicos, aislamiento por cultivo e identificación) y el seguimiento de las resistencias a los antituberculosos en casos nuevos y pacientes con tratamiento previo. Otros tres objetivos secundarios han sido la evaluación de dos sistemas no radiomètricos (MB/BacT ALERT® y BACTEC MGIT 960®) para el estudio de la sensibilidad a los antituberculosos de primera línea, la caracterización molecular de los mecanismos de resistencia a los fármacos de primera línea y la descripción de los diferentes linajes de las cepas de M. tuberculosis resistentes aisladas en el Hospital de la Santa Creui Sant Pau. A lo largo del periodo estudiado se ha observado un aumento del aislamiento de MNT, coincidiendo con la pandemia del SIDA, así como una disminución a partir de la introducción del tratamiento combinado de alta eficacia. También se ha observado un descenso global en los aislamientos de M. tuberculosis, debido a la disminución en pacientes autóctonos, aunque se observa un incremento de pacientes inmigrantes. La sensibilidad de la baciloscopia en el diagnóstico de la tuberculosis respiratoria ha sido del 52.2%, siendo el esputo la muestra más sensible (64,4%). En la tuberculosis extrarespiratória la sensibilidad de la baciloscopia ha sido del 23,7%, siendo las muestras osteoarticulares las más frecuentemente positivas (35,7%). La especificidad ha sido del 99,9% con un VPP del 99,4%. Globalmente se ha observado una mayor capacidad de aislamiento de los medios de cultivo líquido. El efecto inóculo es más significativo en aquellas muestras con bacilocopia negativa, lo que corrobora la importancia de la utilización de los dos tipos de medio de cultivo en el aislamiento. La especificidad de la AMTD para la detección de ácidos nucleicosdel complejo M. tuberculosis ha sido buena (99.8%). La sensibilidad en muestras con bacilocopia positiva fue del 94.2%, disminuyendo considerablemente muestras baciloscopia negativa (especialmente en la tuberculosis extrarespiratoria). El porcentaje de resistencia global en nuevos casos ha sido del 7,9%, significativamente más alta en pacientes inmigrantes (16,7%) que en pacientes autóctonos (5,7%). La resistencia global en pacientes con tratamiento previo fue del 15.1%, significativamente más alta en pacientes inmigrantes (46,2%) respecto a los pacientes autóctonos (5%). Sólo se detectómultiresistència en pacientes inmigrantes. Los sistemas MB/BacT ALERT y BACTEC MGIT 960 son una buena alternativa no radiométrica al sistema BACTEC 460 para el estudio de sensibilidad a los fármacos de primera línea. En cuanto a los fármacos de segunda línea, todas las cepas con resistencia a la ethionamida presentaban resistencia cruzada con la isoniazida, siendo esta en el 75% de bajo nivel. El 75% de las cepas resistentes a la RIF presentaban resistencia cruzada con la rifabutina. No se han encontrado resistencias en otros fármacos de segunda línea. La resistencia a la INH se ha debido en el 39,3% de los casos a alteraciones en el codón 315 del gen katG y en el 32,1% a la región reguladora del operón mabA-inhA. Un 28,6% de las cepas no presentaron alteraciones en estos loci. Todas lascepas resistentes a la Rifampicina presentaron mutaciones en la región central del gen rpoB. La cepas que presentaba una mutación en el codón 516 era sensible a la rifabutina. El 30% de las cepas resistentes a la STR presentaban mutaciones en el gen rpsL otro 30% al gen rrs. La cepas resistente a la PZA presentaba una deleción de 9 nucleótidos en el gen pncA. Las cepas resistentes de pacientes latinoamericanos y españoles comparten el mismo linaje de espoligotipo (LAM). / WHO has declared tuberculosis (TB) as a global emergency, every year die about 3 million people and 9 million new cases develop. For some years it was believed that TB could be eradicated in developed countries. However the incidence of TB in these countries hasn’t followed the diminishing line that had been projected. Although the 80% of Tb has been concentrated in 22 countries, the large migratory movement to developed countries from countries with high TB incidence has played an important role in this emergence. Multiresistence, the existence of poverty bags in the industrialized world and the abolishment of TB control programmes, have also contributed. Early diagnosis is required for TB control in order to break the transmission chain. The traditional methods for microbiological diagnosis take time and therefore are not efficient enough. During the last 20 years, new methods have been developed for isolation, identification, susceptibility tests and typing of both M.tuberculosis and the other mycobacteria. While in 1975 the genera Mycobacterium included about 30 species, over 150 species have been described so far. Species identification is required to guide the treatment for different mycobacteria, even within the M. tuberculosis-complex. M. tuberculosis susceptibility test are particularly important not only for resistance monitoring, which is going to influence empirical treatments, but also for detectation of those resistant strains in patients with risk factors, therefore allowing aproppiate treatment. MNT susceptibility test are constrained in a few species, M. avium complex, M. kansasii and non-pigmented rapid-growing mycobacteria with clinical importance. For this reason, the clinical mycobacteriology lab has an important role both in public health and healthcare, New techniques were developed along these years in order to improve the response time from the lab, including several liquid media systems (both radiometric and non-radiometric) for isolation and susceptibility tests. Although traditionally phenotypic tests were used for identification, nowadays molecular techniques are used more a more, and they have been applied even on clinical specimens. The main aims of this thesis were the evaluation of several methods of diagnosis in the mycobacteriology lab (direct microscopically examination, nucleic acid amplification, isolation and identification) and the surveillance of antituberculosis chemotherapy resistance in new cases and new patients. As secondary objectives this thesis included the evaluation of two non-radiometric systems (MB/BacT ALERT® and BACTEC MGIT 960®) for the susceptibility studies of first-line antituberculosis drugs, the molecular characterization of the resistance mechanisms of these drugs and the description of several of several lineages resistant M. tuberculosis strains isolated at the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Along this period of time, there was initially an increase of MNT isolations coinciding with the AIDS pandemics, followed by a decrease after TARGA introduction. There has also been a global decrease of MTB isolations due to decrease of autochthonous patients despite the increase of immigrant patients. Sensitivity of microscopy examination in the pulmonary TBC was 52.2%, and sputum was the sample with higher sensitivity.(64,4%). In extrapulmonary TBC, the general sensitivity was 23.7% and osteoarticular samples showed the highest positive values (35,7%). Specificity was 99,9% and PPV was 99,4%. Globally the isolation performance was better in liquid media. The inoculum effect is more significant in those samples with negative microscopy examination, which highlights the importance of using both a liquid and solid medium. AMTD specificity for MTB complex was good (99,8%). AMTD sensitivity in positive microscopy examinations was 94,2%, although this value decreased considerably in negative examinations (especially in extrapulmonary TBC). The global resistance in new cases was 7.9%, corresponding to 16.7% in immigrant patients and 5.7% in autochthonous patients. Whereas the global resistance in patients with previous treatment was 15.1%,,it was significantly higher in immigrant patients (46.2%) than in autochthonous patients (5%). Multiresistance was only found in immigrants. MB/BacT ALERT and BACTEC MIGIT 960 systems are a good non-radiometric alternative to the BACTEC 460 for the first-line drug susceptibility studies. Regarding second-line drugs, all ethionamide-resistance strains showed cross-resistance to Isoniazide (75% of the cases displaying a low resistance). 75% of RIF-resistant strains showed cross-resistance to rifabutine. No other resistance to second-line drugs was found. IHN-resistance was mainly due to mutations in the 315 codon of the gene katG (in 39,3% of the cases) and in the mabA-inhA regulating region (32,1%). The rest of the isolated strains (28,6 %) didn’t show mutations in these loci. All rifampicin-resistant strains showed mutations in the central region of gene rpoB. Out of all STR-resistant strains, 30% showed mutations in the gene rpsL and 30% in the gene rrs. The only isolated strain with resistance to PZA, showed a 9-nucleotide deletion in the gene pncA. Isolation of LAM strains was equally distributed in Spanish and Latino American patients, quite in agreement with other reports. In these cases, it was difficult to determine whether they were imported strains due to their common phylogenetic origin. The lineage Haarlem was the most prevalent in Europe and wasn’t isolated in immigrants. Out of the 45 strains included in the study, two cases belonged to Asiatic patients, one of them corresponded to EIA-Manilla (belonging to a Philippine patient) and the other was non-classifiable. In this case the phylogenetic difference between autochthonous and endemic strains in our area makes the strain importation phenomenon more evident. A Beijing strain displaying streptomycin resistance was isolated from an autochthonous patient belonging to a mixed-grouping in which the index case was an immigrant patient.

Penicillium digitatum i Penicillium expansum son els patògens més devastadors de fruits cítrics i de llavor, respectivament, i són els responsables d’importants pèrdues econòmiques durant el maneig en postcollita. Una millor comprensió de les interaccions hoste-patogen, incloent els mecanismes de defensa de l'hoste i els factors de virulència del patogen, poden jugar un paper important en el disseny d’estratègies de control noves i més segures. Per assolir aquests objectius generals, es va utilitzar una aproximació multidisciplinar, incloent estudis patològics, bioquímics i moleculars. El primer objectiu d'aquesta tesi va ser estudiar les capacitats d'infecció d'ambdós patògens en taronges i en pomes a diferents estats de maduresa dels fruits, concentracions d'inòcul del patogen i temperatures d'emmagatzematge, per definir les interaccions compatibles i incompatibles. Com que tots dos patògens estudiats requereixen una ferida per iniciar el procés d'infecció, es va estudiar l'efecte de la resposta a la ferida en taronges i en pomes, com un mecanisme de defensa contra els patògens compatibles i els no-hostes. La lignina va ser identificada com un component important implicat en la resposta de defensa a la ferida de taronges i de pomes respecte a patògens compatibles i no-hostes, utilitzant aproximacions histoquímiques i bioquímiques. Es van dur a terme anàlisis transcriptòmiques en resposta als patògens compatibles i als no-hostes per identificar gens implicats en la ruta dels fenilpropanoids. Es va analitzar l'expressió de diversos gens implicats en aquesta ruta utilitzant diferents aproximacions. A més a més, es va avaluar la capacitat de P. digitatum i P. expansum per millorar la seva virulència acidificant de manera local el pH de les taronges i de les pomes. La barreja dels àcids màlic i cítric podria contribuir en l'acidificació de la podridura de les taronges per P. digitatum mentre que la disminució del pH en pomes podrides per P. expansum es va relacionar amb l'acumulació dels àcids glucònic i fumàric. Els resultats globals obtinguts en aquesta tesi ens poden ajudar a comprendre millor els mecanismes de defensa de les fruites i els factors de virulència dels patògens per controlar les malalties de manera més eficaç. / Penicillium digitatum y Penicillium expansum son los patógenos más devastadores de frutos cítricos y de pepita, respectivamente, y son los responsables de importantes pérdidas económicas durante el manejo poscosecha. Una mejor compresión de las interacciones huésped-patógeno, incluyendo los mecanismos de defensa del huésped y los factores de virulencia del patógeno, puede jugar un papel importante en el diseño de estrategias de control nuevas y más seguras. Para alcanzar estos objetivos generales, se utilizó una aproximación multidisciplinar, incluyendo estudios patológicos, bioquímicos y moleculares. El primer objetivo de esta tesis fue estudiar las capacidades de infección de ambos patógenos en naranjas y en manzanas a diferentes estados de madurez de los frutos, concentraciones de inóculo del patógeno y temperaturas de almacenaje para definir las interacciones compatibles e incompatibles. Debido a que ambos patógenos estudiados requieren una herida para iniciar el proceso de infección, se estudió el efecto de la respuesta a la herida en naranjas y manzanas, como un mecanismo de defensa contra los patógenos compatibles y los no-huéspedes. La lignina fue identificada como un componente importante implicado en la respuesta de defensa a la herida de naranjas y manzanas respecto a patógenos compatibles y no-huéspedes, utilizando aproximaciones histoquímicas y bioquímicas. Se llevaron a cabo análisis transcriptómicos en respuesta a los patógenos compatibles y los no-huéspedes para identificar los genes implicados en la ruta de los fenilpropanoides. Se analizó la expresión de varios genes implicados en esta ruta utilizando diferentes aproximaciones. Además, se evaluó la capacidad de P. digitatum y P. expansum para mejorar su virulencia acidificando de manera local el pH de las naranjas y las manzanas. La mezcla de los ácidos málico y cítrico podría contribuir en la acidificación de la podredumbre de las naranjas por P. digitatum mientras que la disminución del pH en manzanas podridas por P. expansum se relacionó con la acumulación de los ácidos glucónico y fumárico. Los resultados globales obtenidos en esta tesis nos pueden ayudar a comprender mejor los mecanismos de defensa de las frutas y los factores de virulencia de los patógenos para controlar las enfermedades de manera más eficaz. / Penicillium digitatum and Penicillium expansum are the most devastating pathogens of citrus and pome fruits, respectively, and are responsible for important economical losses during postharvest handling. A better understanding of host-pathogen interactions, including host defence mechanisms and pathogen virulence factors, can play an important role to design new and safer control strategies. To achieve these general objectives, a multidisciplinary approach including pathological, biochemical and molecular studies was used. The first objective of this thesis was to study the infection capacities of both pathogens in oranges and apples at different maturity stages of fruit, pathogen inoculum concentrations and storage temperatures to define compatible and incompatible interactions. Due to both studied pathogens require a wound to initiate the infection process, the effect of wound response in oranges and apples was studied as a defence mechanism against compatible and non-host pathogens. Lignin was identified as an important compound involved in the orange and apple wound response to compatible and non-host pathogens using histochemical and biochemical approaches. Transcriptomic analysis in response to the compatible and non-host pathogens were conducted to identify apple genes involved in phenylpropanoid pathway. The expression of several genes involved in this pathway was analysed in oranges and in apples using different approaches. In addition, the ability of P. digitatum and P. expansum to enhance their virulence by locally acidifying the pH of oranges and apples was evaluated. The mixture of malic and citric acids could at least contribute to the acidification of P. digitatum-decayed oranges while the pH decrease in P. expansum-decayed apples was related to the accumulation of gluconic and fumaric acids. Overall results obtained in this thesis can help us to better understand fruit defence mechanisms and pathogen virulence factors to control diseases more effectively.

El diagnóstico de la tuberculosis (TB) se basa en gran medida en métodos microbiológicos convencionales: a) un cribado mediante microscopía de bacilos ácido-alcohol resistentes que permite de forma rápida, sencilla y económica una primera orientación hacia el diagnóstico de TB en caso de que la baciloscopia sea positiva; y b) el cultivo de las muestras clínicas en medios específicos para micobacterias. El cultivo micobacteriano es el método considerado gold standard en el diagnóstico microbiológico de la TB, y además, permite obtener el aislamiento clínico con el que posteriormente se puede estudiar la sensibilidad a los fármacos antituberculosos o realizar análisis epidemiológicos. Sin embargo, estos métodos fenotípicos convencionales son insuficientes para un control eficaz de la tuberculosis, debido sobre todo a la baja sensibilidad de la microscopía y a la lentitud del cultivo micobacteriano. En este sentido se han desarrollado técnicas basadas en la amplificación genómica por PCR (polymerase chain reaction) y posterior estudio post-amplificación, fundamentalmente mediante hibridación en fase líquida o sólida, con sondas complementarias a los genes de interés, tanto para la detección del microorganismo como de su resistencia a los fármacos. En esta tesis se trata de evaluar, en un primer bloque, dos de los sistemas comerciales más recientes para el diagnóstico rápido de la TB. Uno de ellos es el sistema integrado de PCR a tiempo real, Xpert MTB/RIF (Cepheid, EEUU). Así se propuso determinar la eficacia de este sistema en casos de alta sospecha de tuberculosis y baciloscopia negativa, en nuestra área. En términos de sensibilidad se detectó un 78,2% de los casos de tuberculosis pulmonar y un 58,3% en los casos de tuberculosis extrapulmonar. Además, se determinó, en un estudio de rentabilidad potencial del uso en rutina de esta técnica, que el uso del Xpert MTB/RIF puede adelantar en una media de una semana el inicio del tratamiento antituberculoso, además de ahorrar recursos económicos en el diagnóstico (hasta 2000 euros). Por otro lado, la evaluación el sistema GenoQuick MTB (Hain LIfescience, Alemania) de PCR convencional y posterior hibridación rápida en fase sólida (lateral-flow dipstick), mostró a esta técnica como una alternativa a la previamente descrita al comprobarse que la sensibilidad obtenida en muestras con baciloscopia negativa fue de 78,1%, con una discreta mayor complejidad técnica pero también con un menor coste económico. Estos sistemas de PCR e hibridación se revelan como métodos muy útiles para la detección directa en muestra clínica de M. tuberculosis complex. Otro aspecto muy relevante, sobre el que también se ha investigado en los últimos años, es el de la detección de mutaciones genéticas implicadas en la resistencia a los principales fármacos antituberculosos. De esta forma se planteó, en un segundo bloque de la tesis, el diseño y desarrollo de un sistema propio de microarrays (sistemas miniaturizados de amplificación e hibridación con oligonucleótidos fijados en una matriz orgánica) para la detección rápida de la resistencia de algunos de los fármacos antituberculosos más importantes. Tras caracterizar las mutaciones presentes en los aislamientos resistentes de nuestra área y basándose también en las mutaciones más frecuentemente descritas en la literatura, se diseñaron dos microarrays de baja densidad y bajo coste, 1) para la detección de mutaciones relacionadas con la resistencia a la estreptomicina y las fluoroquinolonas (obteniéndose una sensibilidad del 92,5% y el 87,5%, respectivamente; y 2) al etambutol (con una sensibilidad y especificidad del 100%). Este sistema de microarrays se plantea como una buena alternativa a los sistemas comercialmente disponibles, al tener un coste económico menor y ofrecer la flexibilidad de añadir más o diferentes dianas de resistencia, en función del perfil de mutaciones de cada área geográfica. / Tuberculosis remains one of the biggest health threats, causing around 8.5 million of new cases and 1.5 million deaths worldwide, each year. The two cornerstones for the tuberculosis control are rapid diagnosis and rapid detection of drug resistance, allowing prompt initiation of the adequate pharmacological treatment and avoiding the spread of the disease to other individuals. Conventional microbiological methodologies for tuberculosis diagnosis are the smear microscopy and the mycobacterial culture. Nevertheless, the microscopy has low sensitivity especially in cases of extrapulmonary tuberculosis, and Mycobacterium tuberculosis complex culture is very slow. In the past two decades, molecular methodologies have emerged as valuable tools for rapid diagnosis in the field of tuberculosis. In the first block of the thesis, we determined the effectiveness of two techniques for direct detection of M. tuberculosis complex. The sensitivity of the Xpert MTB/RIF (Cepheid) was 78.2% in pulmonary samples and 58.3% in extrapulmonary specimens, all smear-negative. The sensitivity of the GenoQuick MTB (Hain Lifescience) was 78.1% among smear-negative specimens. Given the high economical cost of the Xpert MTB/RIF test, but once proven its advantages for rapid diagnosis, we tried to determine the potential cost-effectiveness of using this technique in daily routine, in an area of low-medium incidence of tuberculosis. In terms of economical costs, the performance of the Xpert MTB/RIF could save a median of 2,000 € among smearnegative patients. In the second part of the thesis, we developed and evaluated a low-cost low-density microarray (LD-SQ) designed for the detection of the main mutations most frequently described to be related to streptomycin, second-line anti-tuberculous injectable drugs (rrs and rpsL genes) and fluoroquinolones (gyrA gene). The microarray detected 92.5% of the mutations related to streptomycin and 87.5% to fluoroquinolones. We also characterized the most prevalent embB mutations related to resistance to ethambutol in our area, and developed a low-cost low-density microarray (LD-EMB) for the rapid detection of these mutations, obtaining a 100% of sensitivity and specificity. The microarray platforms developed for rapid detection of streptomycin, fluoroquinolones and ethambutol showed up as an alternative for rapid diagnosis of drug resistance, with the advantage, compared to other commercially available techniques, of being lower cost and including more targets and codon substitutions, as well as the flexibility to exchange them, depending on the needs of each setting.

L'objectiu principal d'aquest treball experimental ha estat l'estudi dels biofilms fototròfics d'ambients hipogeus, el que ens ha permès d'aprofundir sobre les tècniques d'observació, els organismes i el monitoratge de les comunitats fotosintètiques que s'hi desenvolupen. S'han posat a punt i/o s'han millorat tècniques per examinar l'estructura tridimensional dels biofilms i per identificar els microorganismes i llurs pigments fotosintètics. Amb la informació obtinguda, s'han assajat mètodes per al control i la prevenció del seu desenvolupament.La microscòpia confocal ens ha permès l'observació dels nuclis o nucleoides i els plans de divisió cel·lular en l'espai; la forma, l'organització i el gruix de les beines mucilaginoses que envolten els microorganismes fotosintètics, així com les substàncies polimèriques extracel·lulars presents al biofilm. Gràcies a l'autofluorescència dels pigments fotosintètics s'ha pogut reconèixer diferents caràcters com plans de divisió, distribució dels til·lacoids i/o de cloroplasts, localització de cèl·lules especialitzades o tipus de ramificació, per a la identificació i la caracterització dels cianobacteris i altres microorganismes fotosintètics. El processament de les seccions per obtenir els diferents tipus d'imatges tridimensionals va permetre caracteritzar l'estructura dels biofilms, mostrant la distribució espacial dels microorganismes, els EPS i el substrat, així com la disposició i la morfologia dels microorganismes en profunditat i la porositat d'aquestes comunitats.També es va elaborar un programa informàtic on es van implementar les diferents funcions de quantificació útils per a l'estudi d'aquestes comunitats: biovolum, distribució de biomassa, gruix mitjà, distribució del gruix, rugositat, porositat i distribució de la porositat, i cobertura de la superfície. Pel que fa a l'anàlisi dels pigments fotosintètics presents en cadascun dels microorganismes fototròfics, s'ha posat a punt un mètode per obtenir els espectres de fluorescència d'una àrea seleccionada de la mostra mitjançant el microscopi confocal espectral. Espècies pertanyents a diferents grups filogenètics, com Cyanobacteria, Bacillariophyta o Chlorophyta, van presentar unes característiques i unes propietats de fluorescència dels seus pigments característiques que en permetien la discriminació respecte d'altres grups filogenètics. Així mateix, amb aquesta tècnica es va poder determinar quines eren les espècies de cianobacteris amb ficoeritrina i sense.Posteriorment, s'han determinat els microorganismes fotosintètics més representatius de diferents tipus de cavitats naturals i catacumbes, així com la seva distribució i els factors ambientals a què estan sotmesos, en la natura i en cultiu. En els ambients hipogeus prospectats, la temperatura i la humitat eren relativament elevades i constants, mentre que la llum, tant la solar que entrava en coves i avencs, com l'artificial, per il·luminar coves turístiques o catacumbes, semblava el factor determinant de la presencia i la distribució dels microorganismes i dels biofilms que formaven. En les tres cavitats naturals estudiades al massís càrstic del Garraf (Barcelona, NE Espanya), la temperatura, la humitat relativa i la llum, presentaven clars gradients, des de l'entrada fins a una certa profunditat, on les condicions romanien constants. Els biofilms formats per cianobacteris cocals mucilaginosos i de color fosc es van tornar més prims amb la disminució de la llum i gradualment van ser substituïts per biofilms formats per cianobacteris filamentosos amb beines transparents calcificades, com Geitleria calcarea i Loriella osteophila, que produïen taques blanques a les parets. En general, a l'entrada de les cavitats es va observar la majoria d'espècies trobades pertanyents als grups Chlorophyta i Bacillariophyta. Els líquens crustacis de l'entrada de les cavitats van ser substituïts per altres de tal·lus leprós, com Botryolepraria lesdainii i Macentina stigonemoides. L'autofluorescència i el marcatge selectiu dels EPS han permès seguir la formació de les substàncies mucilaginoses que intervenen en els primers passos dels processos d'adhesió dels hormogonis. En alguns taxons de cianobacteris filamentosos, com Leptolyngbya spp. i Scytonema spp., els extrems polisacarídics dels hormogonis semblen actuar com a mecanismes d'adhesió, com una mena de goma d'enganxar al començament de l'adhesió al substrat. A les Catacumbes Romanes, els principals organismes formadors de biofilms van ser les molses i els cianobacteris filamentosos amb beina. L'estructura dels biofilms era heterogènia, especialment en gruix, densitat i composició d'organismes. De manera semblant al cas de les coves i els avencs, es va observar una diversitat decreixent en els biofilms fototròfics en disminuir la irradiància. Atès que la llum fou el factor més important que influïa en aquests biofilms i que el rang de longituds d'ona menys absorbit corresponia a la zona del verd (500-560 nm), es va avaluar el potencial de la llum verda per prevenir el creixement del biofilms fototròfics. Es va examinar el seu efecte en biofilms formats pel cianobacteri Gloeothece membranacea (Cyanobacteria) i l'alga verda Chlorella sorokiniana (Chlorophyta). La resposta dels biofilms a la llum verda va comprendre diferències en la fluorescència dels pigments, el gruix dels biofilms, així com la simplificació de la seva estructura tridimensional, si es compara amb els biofilms sota llum blanca. També es va estudiar l'efecte que produeix la llum verda en la morfologia i la ultraestructura de l'espècie aerofítica Gloeocapsopsis magma, aïllada de la cova turística de Collbató (Barcelona, NE Espanya). Les beines de les cèl·lules sota llum verda no eren estratificades i les cèl·lules van ser significativament més llargues que les cèl·lules sota llum blanca de la mateixa edat. Respecte de la ultraestructura, les cèl·lules en llum verda contenien només alguns tilacoides distribuïts a l'atzar, grànuls de cianoficina i polifosfats dispersos en el citoplasma. Per altra banda, es va estudiar in situ l'efecte que produïa la suma de factors: la presència de llum verda i l'aplicació dels biocides convencionals - dues formulacions de clorur de benzoalconi - utilitzats en les neteges de les obres d'art. Es va seleccionar com a zona d'estudi model la cova de Collbató (Barcelona, NE Espanya). Els resultats d'aquest estudi van demostrar que els biocides redueixen la biomasa, registrada d'acord amb els nivells de fluorescència comparats amb els dels controls. A més, sota llum verda i biocides, l'abundància de Scytonema julianum i altres espècies predominants va disminuir, excepte en els casos de Nostoc punctiforme i Gloeocapsopsis magma, ambdues cobertes amb beines de polisacaràrids molt gruixudes i amb un ampli ventall de pigments accessoris. Atès que la llum verda contribueix a alentir el creixement dels microorganismes fotosintètics i fa que penetrin menys a l'interior dels substrats; pot esdevenir una estratègia eficient per evitar el biodeteriorament de monuments hipogeus il·luminats artificialment, fins i tot en els dominats per cianobacteris rics en pigments accessoris, com la ficoeritrina. / Caves with dim natural light, and lighted hypogean environments, have been found to host phototrophic microorganisms from various taxonomic groups. These microorganisms group themselves into assemblies known as communities or biofilms, which are associated with rock surfaces. In this work, the phototrophic biofilms that colonise speleothems, walls and floors in three tourist caves (Spain) and Roman hypogean monuments (the St. Callistus and St. Domitilla catacombs, Rome, Italy) were studied. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) and scanning (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) were used to study these organisms and acquire three-dimensional data on their biofilm structure. CLSM was used in a multi-channel mode whereby the different channels map individual biofilm components. Photosynthetic organisms were visualized by their in vivo pigment fluorescence, whereas extracellular polymeric substances (EPS) and the DNA structures of photo- and heterotrophic microorganisms were determined by staining with Concanavalin-A (Con-A) conjugated to the fluorophore label Alexa Fluor 488 and with the fluorophore label Hoechst 33258, respectively. The reflection mode revealed calcified sheaths and inorganic substrata. The distribution of microorganisms and EPS in the biofilms, and the relationship between the biofilms and their substrata, were studied by image analysis. Cyanobacteria, green microalgae, diatoms, mosses and lichens were found to be grouped as biofilms that differed according to the sampling sites. A confocal technique for the analysis of fluorescent pigments from a single cell, based on spectrofluorometric methods is also reported. Analysis of fluorescent pigments allows the establishment of a simultaneous relationship among in vivo pigment identification, organism morphology and 3D localization of cells that have particular fluorescence signatures within the biofilms. Finally, an evaluation of the use of monochromatic green light (GL) illumination as a method for preventing biofilm growth was performed. The CSLM permitted a comparison of the effects of illuminating photosynthetic biofilms with GL and with white light (WL). The results show retarded biofilm growth in the case of the former, suggesting the utility of GL for the illumination of cultural patrimony sites that are threatened by photosynthetic biofilms.

La producció de proteïnes homòlogues i heteròlogues a escala industrial requereix sistemes d’expressió variats i eficients. Els bacteris grampositius, com Streptomyces, poden ser una alternativa per a la producció de proteïnes recombinants ja que aquestes són produïdes i secretades al medi. La seqüenciació del genoma d’algunes espècies de Streptomyces i el seu anàlisi post-genòmic ha permès determinar i caracteritzar la seva maquinària de secreció. Així, se sap que els precursors de les proteïnes que s’han de secretar són exportats majoritàriament per una via principal de secreció (via Sec) o bé per una via secundària (via Tat). Aquests precursors contenen un pèptid senyal de tipus I que permet la seva correcta translocació a través de la membrana plasmàtica, la seqüència del qual determina per quina de les dues vies es dirigeix. Un cop translocades, les peptidases senyal de tipus I (SPases) processen la majoria d’aquestes proteïnes secretades i les alliberen al medi extracel·lular en la seva forma madura. Estudis previs en la maquinària de secreció han determinat que Streptomyces lividans té quatre peptidases senyal Sip (SipW, SipX, SipY i SipZ) de les quals, SipY és la que desenvolupa el paper majoritari. La soca deficient en aquesta proteïna SipY té la capacitat de secreció notablement afectada però, paradoxalment, és un bon hoste per a la sobreproducció de proteïnes secretades, ja que presenta una activitat proteàsica considerablement disminuïda. En aquest treball s’ha estudiat la producció d’agarasa i de lacasa en la soca SipY- (S. lividans ΔsipY) a escala de bioreactor per avaluar si aquesta soca pot ser considerada com a possible hoste per a la producció de proteïnes recombinants per la indústria. Aquestes dues proteïnes se secreten majoritàriament per la via Tat. En el cas de l’enzim agarasa, el gen expressat prové de S. coelicolor A3(2) i s’ha produït l’enzim en discontinu amb la soca salvatge (S. lividans TK21pAGAs5) i la soca mutada (S. lividans ΔsipYpAGAs5). La soca S. lividans ΔsipYpAGAs5 ha presentat una millor producció i s’ha seleccionat el medi més adequat per tal de produir aquesta proteïna estudiant el seu comportament operant en continu. També s’han estudiat diferents estratègies en discontinu alimentat, entre les quals la major producció s’ha obtingut amb una addició de mannitol i evitant que aquesta font de carboni s’esgoti en el medi. En el cas de la lacasa, s’han construït tres soques en les quals el gen de la pròpia lacasa de S. lividans és regulat per tres promotors diferents: el promotor propi de la lacasa, el promotor del gen de resistència a eritromicina i el promotor del gen agarasa de S. coelicolor. La soca en el qual el gen és regulat pel promotor del gen agarasa (S. lividans ΔsipYpFD-DagA-laccase) ha estat seleccionada i s’ha estudiat la producció de l’enzim utilitzant mannitol o glucosa com a font de carboni en discontinu i discontinu alimentat. En l’operació en discontinu alimentat van ser necessàries dues addicions de glucosa per assolir els mateixos nivells de producció que amb una addició de mannitol. / Recombinant protein production on industrial scale requires varied and efficient expression systems. Gram-positive bacteria such as Streptomyces, may be an alternative since proteins are secreted through the medium. The sequence of the genome of several Streptomyces species and their post-genomic analysis has allowed to determine and characterize the secretion machinery. Two secretion pathways are mainly use in Streptomyces: Sec pathway and Tat pathway. Protein precursors contain type I signal peptide that allows a proper translocation though membrane and whose sequence determines which pathway must be used in order to export each protein. During its translocation, type I signal peptidases (SPases) cleave the signal peptide leading the secretion of the mature protein through the medium. Previous studies on the secretory machinery have described four signal peptidases in Streptomyces lividans (SipW, SipX, SipY and Sip Z) and they have postulate SipY as the one which develops the main role in protein secretion. SipY deficient strain has a secretion ability significantly affected but, paradoxically, it is a good host for the protein overproduction since it has a considerably reduced protease activity. In this work, we have studied the production of agarase and laccase in SipY- strain (S. lividans ΔsipY) in a bioreactor scale to assess whether this strain can be considered as a host for the production of recombinant proteins in the industry. These two proteins are mainly secreted by Tat pathway. Firstly, agarase from S. coelicolor A3(2) was cloned in a multicopy plasmid in S. lividans wild type strain and SipY- mutant strain (S. lividans TK21pAGAs5 and S. lividans ΔsipYpAGAs5). Batch cultures have been carried out and S. lividans ΔsipYpAGAs5 of which has presented better agarase production and it has been selected. Appropriated medium has been also selected operating in continuous. Secondly, focusing on laccase production, three strains have been constructed in which the homologous gene of S. lividans is regulated by three different promoters: its own promoter, the promoter of erythromycin resistance gene and the S. coelicolor agarase promoter. The strain in which the laccase gene is regulated by agarase promoter (S. lividans ΔsipYpFD-DagAplaccase) has been selected and studied in batch and fed-batch mode using mannitol or glucoses as carbon source. In fed-batch cultures, two glucose addition have been necessary to achieve the same production as unic mannitol addition.

La utilización de bacterias iniciadoras de fermentación maloláctica es de fundamental importancia para los elaboradores de vino comprometidos con la producción de vinos de alta calidad y sin riesgos para la salud, ya que estas bacterias han sido seleccionadas como poco productoras de aminas biógenas. Sin embargo, en ciertas condiciones se obtienen vinos con altos niveles de aminas biógenas, aun cuando estos vinos han sido inoculados con bacterias seleccionadas. En el presente trabajo, con la tipificación de bacterias aisladas de la fermentación maloláctica usando un método basado en RAPD-PCR, se demostró que el estárter maloláctico puede tener diferentes niveles de implantación y que a su vez, esto se correlaciona con la producción de aminas biógenas durante la fermentación maloláctica, lo cual explicaría los altos niveles de aminas obtenidos en vinos inoculados con estárteres malolácticos. Para entender como las diferentes prácticas enológicas afectan la implantación del estárter maloláctico, lisozima, nutrientes, co-inoculación con levaduras, o siembra del estárter por diferentes métodos (inoculación directa o pie de cuba) fueron estudiados respecto al nivel de implantación y producción de aminas biógenas. Luego de la fermentación maloláctica, las aminas biógenas pueden aumentar, degradarse o estar constantes durante el almacenamiento del vino una vez que este ha sido embotellado. Esto puede crear incertidumbre respecto al nivel que las aminas biógenas tendrán en el momento de su comercialización. En la segunda parte de esta tesis, se puso en evidencia la presencia de microorganismos y enzimas libres en el vino embotellado capaces de producir histamina durante su almacenamiento; también se sospecha la presencia de enzimas capaces de degradar histamina. Se estudió la relación entre esto, y el contenido de aminas al final de un año de almacenamiento; diferentes perfiles de vinos se identificaron: histaminogénicos, histaminoliticos e histamin-estables. Indicadores para estimar el riesgo de producción de histamina fueron propuestos. Siguiendo con el interés de investigar tecnologías que ayuden a producir vinos sin peligro para la salud del consumidor, el uso de técnicas biológicas para reducir los niveles de ocratoxina A (OTA) en vinos fue investigado. En la tercera parte de esta tesis, estárteres malolácticos fueron evaluados respecto a su capacidad para reducir OTA durante la fermentación maloláctica. Algunos estárteres, fueron capaces de reducir OTA en vinos conteniendo 13% de etanol. La reducción de OTA parece relacionarse con el pH del vino. La interacción entre la formación de aglomerados de protein-polifenoles en función del etanol y pH, y la interacción que esto podría tener en la capacidad de adopción fue discutido. La modificación de la pared celular debido al proceso de liofilización de los estárteres como causa posible de la capacidad reductora de los estárteres fue también abordado. Los resultados son prometedores, sin embargo, sería necesario profundizar en la investigación para entender los mecanismos ligados a la reducción de OTA producido por los estárteres malolácticos en vinos. / Malolactic bacterial starters are used in the production of high quality and safe wines because of their capabilities to produce low levels of biogenic amines and perform the malolactic fermentation under controlled conditions. However, in certain conditions, inoculated wines can have high biogenic amines content which is in contradiction with the expected performance of the bacterial starter. In the present work, it was demonstrated, by typification of bacterial strains using RAPD-PCR, that malolactic starters can present different levels of implantations and this is correlated with the biogenic amines produced during the malolactic fermentation, which can explain the unexpected results when malolactic starters are used. In order to understand how the implantation is affected by oenological practices, lysozyme, nutrients, co-inoculation with yeast, or application of different seeding methods (direct inoculation or pied de cuve) were studied regarding their impact on the level of implantation and biogenic amines production. On the other hand, biogenic amines in bottled wine evolve all along the storage period. Their content increase, decrease or stay constant, which creates incertitude regarding the levels of biogenic amines that the wine will have in the moment of its commercialization. In the second part of this thesis, we demonstrated the presence of microorganisms with decarboxylase capabilities and exocellular amine-decarboxylase enzymes in the bottled wine. The presence of amine-degrading enzymes is also suspected. The link between the latter and the biogenic amines found at the end of a year of storage were related and different histamine profiles were determined for the wines: histaminolitic, histaminogenic and histamine-stable. Some indicators to measure the risk of histamine development are proposed. In the search for technological means to help wine-makers to elaborate safe wines, the use of biological tools to reduce the levels of ochratoxin A (OTA) in wines was investigated. In the third part of this thesis, malolactic starters were screened by their property to reduce OTA during the malolactic fermentation. Some malolactic starters were able to obtain high OTA reductions in wines containing 13% ethanol. OTA reduction by starters seems to be related to the pH. The interaction between protein-polyphenols haze formation as function of ethanol and pH and the interaction that this might have on absorption phenomenon is discussed. Modification of cell wall by lyophylization process and its consequences on adsorption properties are also analyzed. The results are encouraging but more investigation is needed to understand OTA reduction mechanism carried-out by malolactic bacterial strains in wines.

OBJETIVO GENERAL:Desarrollo de técnicas de diagnóstico molecular de Pneumocystis jirovecii, y conocimiento de la prevalencia de la resistencia a sulfamidas. OBJETIVOS DETALLADOS: 1. Desarrollar técnicas de diagnóstico molecular de P. jirovecii y de tipado del gen de la Dihidropteroato Sintetasa (DHPS) de P. jirovecii, sitio activo de las sulfamidas.2. Determinar la prevalencia de P. jirovecii con mutaciones en el gen de la DHPS, en pacientes VIH-positivos con neumonía por Pneumocystis (PcP) en España, en el periodo de la terapia antirretroviral combinada (c-ART).2.1. Estudiar la asociación entre las mutaciones y la exposición previa a sulfamidas y sulfonas. 2.2. Estudiar los factores pronóstico de mortalidad en la PcP, y el impacto clínico de presencia de mutaciones en la DHPS.3. Determinar la prevalencia de P. jirovecii con mutaciones en el gen de la DHPS, en pacientes VIH- positivos con neumonía por Pneumocystis (PcP) en Hospital Clínic de Barcelona, en el periodo previo a la terapia antirretroviral combinada (pre c-ART), 1989-1995, y compararla con la del periodo c-ART, 2001-2004, en el mismo centro.4. Conocer la epidemiología de la PcP, y la prevalencia de las mutaciones en el gen de la DHPS de P. jirovecii, en África (Sudáfrica y Malawi) y Sudamérica (Brasil). CONCLUSIONES:1. Se desarrollaron dos técnicas de PCR, una nested-PCR y una PCR cuantitativa a tiempo real, para el diagnóstico de Pneumocystis jirovecii, mediante la detección del gen de la DHPS. Dichas técnicas presentaron una sensibilidad que osciló entre el 62.5% y el 100%, dependiendo del tipo de muestra clínica, y su método de conservación. 2. En un subgrupo de 71 muestras positivas para P. jirovecii, confirmadas microscópicamente, y 70 muestras negativas, los valores de sensibilidad y especificidad fueron de 94% y 81% para la nested-PCR, y de 94% y 96% para la rT-PCR.3. La rT-PCR cuantitativa, con un límite de detección de 1 copia de DHPS / µl de muestra, presentó una especificidad significativa- mente mejor, que la nested-PCR. Por lo tanto, podría considerarse la técnica recomendada para el diagnóstico de P. jirovecii. 4. La prevalencia de mutaciones en el gen de la DHPS de P.jirovecii en España, en la era c-ART, fue del 3.7%, siendo la prevalencia más baja descrita hasta el momento en EUA y Europa. 5. Aproximadamente el 50% de los pacientes de nuestra serie de la era c-ART presentó una PcP, como debut de la infección por VIH. Por lo tanto, no habían estado previamente expuestos a profilaxis con sulfamidas. Este hecho explicaría la baja prevalencia de mutaciones en el periodo c-ART en nuestro país.6. La mortalidad global de la serie de pacientes en la era c-ART fue de15%, elevándose a 80% en los pacientes que requirieron ventilación mecánica.7. Ninguno de los pacientes que presentó mutaciones en el gen de DHPS requirió ingreso en UCI, ni murió. Por lo tanto, podemos concluir que su presencia no se asocia a un peor pronóstico en la PcP. 8. Las mutaciones en el gen de DHPS sólo confieren un bajo nivel de resistencia a las dosis de sulfamidas administradas como profilaxis, pero a mayores dosis de sulfamidas, administradas con fines terapéuticos, el tratamiento con TMP-SMX fue efectivo en la mayoría de los casos.9. Presentar una Pao2 < 60 mmHg al ingreso se identificó como un factor de riesgo de ingreso en UCI, mientras que haber tomado c-ART previamente, se mostró como un factor protector.10. Presentar una Pao2 < 60 mmHg al ingreso, o la necesidad de ingreso en UCI durante la 1º semana de hospitalización, se asociaron a una mayor mortalidad. La severidad de la insuficiencia respiratoria al ingreso determinó el pronóstico de la PcP.11. Las mutaciones en el gen de la DHPS fueron más frecuentes en el periodo pre-cART (1989-1995), que en el periodo c-ART (2001-2004), siendo del 33% vs 5.5%, respectivamente. La exposición previa a las sulfamidas en los pacientes en el periodo pre-cART fue del 51% frente al 20% en el periodo c-ART, lo que explicaría la mayor prevalencia de mutaciones. Sin embargo, su presencia tampoco empeoró el pronóstico dela PcP.12. Las mutaciones en DHPS de P. jirovecii fueron infrecuentes en niños sudafricanos infectados por VIH (prevalencia de 13.3%), siendo probablemente debido a una transmisión madre-hijo de cepas mutantes, más que a una sobre-exposición a sulfamidas. Aunque la mortalidad por PcP fue elevada en Sudáfrica (66.7%), no se incrementó por la presencia de mutaciones.13. La incidencia de PcP en adultos infectados por VIH en Malawi fue de 1.0/100 personas/a, siendo menor que la incidencia de la tuberculosis pulmonar y de la neumonía bacteriana.14.No se detectaron mutaciones en la serie de 70 pacientes infectados con VIH y PcP en Brasil, por una menor exposición a sulfamidas. / MAIN OBJECTIVE:Development of diagnostic molecular techniques of Pneumocystis jirovecii, and determine the prevalence of resistance to sulfa-drugs in Spain, and study of the PcP epidemiology in South Africa, Malawi and Brazil.RESULTS AND CONCLUSIONS:1. Two PCR techniques were designed, a nested PCR and a quantitative real-time PCR (rT-PCR) to detect DHPS of P. jirovecii. Sensibility of both ranges between 62.5% and 100%, depend on type of sample.2. Nested-PCR and rT-PCR showed a sensibility of 94%, and specificity of 96% and 81%, respectively. rT-PCR could be considered as molecular standard diagnostic technique of P. jirovecii.3. Prevalence of sulfa-drugs resistance in Spain in the combined antiretroviral therapy (c-ART) era was 3.7%. The lowest described in US and Europe, maybe due to PcP was the debut of HIV infection in almost 50% of patients, so they were not exposed previously to sulfa-drugs.4. Global mortality of patients in the c-ART era was 15%, going to 80% in patients who required mechanical ventilation. Patients harbouring DHPS mutations did not require mechanical ventilation, neither ICU admissions. None of them died. Treatment with cotrimoxazole was effective in almost every patient.5. To show a Pao2 < 60 mmHg at admission was identified as a risk factor of ICU admission, and to have c-ART previously a protector factor.To show a Pao2 < 60 mmHg at admission and need ICU admission at first week were identified as a risk factor of mortality.6. Prevalence of DHPS mutations in pre c-ART period was 33%, when previous sulfa-exposure was higher, although, their presence did not worse the outcome.7. The prevalence of DHPS mutations in HIV South African children was 13.3%, probably due to a mother-to -child transmission of mutant strains; their presence did not increase the mortality.8. The incidence of PcP in HIV-infected adults in Malawi was 1.0/100 persons/year, lower than tuberculosis and bacterial pneumonia.9. DHPS mutations were not detected in the HIV-infected Brazilian patients with PcP, maybe due to a lowest sulfa-drug exposure.