The first project presented here was generated around 1 calcitriol (1,25D₃), and novel low-calcemic analogues (VDAs). The hypothesis of this study was that VDAs may be effective in Diffuse Large B cell Lymphoma. It has been demonstrated that 1,25D₃ and certain VDAs displayed moderate cytotoxic and pro-apoptotic actions upon DLBCL cells. Additionally, 1,25D₃ and VDAs used in a combination with antidepressant clomipramine displayed concentration anti-stimulatory actions upon activated normal B-cells. The second part of the study is focused around a novel immunomodulator CX1001, data from which is currently confidential. The third project has been built around GPR61. I have demonstrated that myc-tagged GPR61 is expressed in the cell membrane and is subject to N-glycosylation. The N12S mutant of GPR61, which is not subject to N-glycosylation, is also expressed on the cell surface. Treating the cells with tunicamycin reduces cell membrane expression of non-mutated and mutated proteins. Furthermore, GPR61 mRNA and protein are expressed in white blood cells with significantly increased level of expression of the protein in Th17 cells.

Background: There are approximately 12 million statin users in the United Kingdom. Reports of statin intolerance occurs between 7 and 29% of users, manifesting as muscle ache, fatigue or more seriously, muscle breakdown leading to myopathy. Creatine phosphokinase (CK) levels are used as a biomarker of statin-induced muscle damage. Non-adherence or discontinuation of therapy is a common result of intolerance and can result in negative cardiovascular disease-related outcomes. Aim: This thesis attempts to identify trends in record-linked medical data in a Scottish Caucasian cohort (GoDARTS) that best represent statin intolerance in order to study associated genetic factors. Methods: Prescribing trends such as switching or discontinuation of statin therapy were examined, and thresholds created to select true cases of intolerance. Information on CK levels was gathered from medical records and appropriate test results were utilized. Genotypic data was gathered for the variants and genetic regions of interest using a variety of methods including chip-based genotyping followed by imputation, TAQMAN genotyping, and exome sequencing. Subsequently hypothesis-based association analyses were conducted, including linear and logistic regressions, followed by meta-analyses, regional GWAS followed by a regional meta –analysis. Results: The phenotypes of statin intolerance were validated both internally and externally. Previously reported missense variants in LILRB5 (Asp247Gly) and CKM (Glu83Gly) were replicated and shown to be associated with CK levels irrespective of statin usage in the GoDARTS cohort and the clinical trial setting (JUPITER). Further, the CKM variant was also associated with inducibility of CK at times of tissue injury. The Asp247 genotype in LILRB5 was associated with increased risk of statin intolerance, and was replicated in associations with non-compliance to statin therapy and the development of myalgia in the JUPITER trial. The association with myalgia showed a stratified effect based on therapy (statin or placebo), with those on placebo showing the genotype effect. Further, the variant was also associated with increased risk of statin-induced myositis, cases of which had been clinically adjudicated and exome sequenced for the PREDICTION-ADR consortium. Further exploration of the LILR gene region showed an association with variants in LILRB2 (His20Arg and Val235Met) which were in strong LD with each other but were not in linkage with the variant in LILRB5. Stratified analysis revealed that the risk for carriers of the LILRB2 variants was increased depending on the genotype carried at the LILRB5 variant. Conclusions: This study characterises novel genetic factors associated with statin intolerance impacting adherence. The findings point to the immunomodulatory effects of statins. The results suggest that true statin-induced myalgia and non-specific myalgia are distinct, with a possible role for the immune system in their development. The findings encourage further investigation into the immune-physiology of statin-induced muscle damage and identifies genetically susceptible groups who are more likely to be statin intolerant.

Bibliography: leaves 87-117. / vii, 117, [64] leaves, [8] leaves of plates : ill. (some col.) ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Indicates that PGE's and CsA may have similar modes of action. Findings suggest that therapies that selectively subpopulations of leucocytes, and manipulate the inflammatory mediators they produce, may be effective in the treatment of chronic immuno-inflammatory diseases similar to rheumatioid arthritis. / Thesis (Ph.D.)--University of Adelaide, Dept. of Pathology, 1994?

Vigabatrin, a GABA (γ-aminobutyric acid) agonist is a drug widely prescribed in Europe and Asia between 1989 and 1997 for drug resistant, partial epilepsy and has been associated with visual field defects. Uncertainity in the effect of Vigabatrin on vision resulted in decreased prescriptions. However, there has been poor reproducibility in previous studies due to many factors, especially poor sensitivity and specificity of tests for Vigabatrin associated visual dysfunction. The wide field multifocal electroretinogram (WF-mfERG) can objectively measure discrete areas of retinal function up to 90 degrees. The results of 204 patients with epilepsy divided into four groups are presented. A subgroup of 89 patients had repeat investigations. The patients were divided into four groups. Group 1.The Vigabatrin group comprised patients who had been taking Vigabatrin for at least 1 year (56 patients). Group 2. Forty nine patients who had previously taken Vigabatrin for at least 1 year but had stopped taking this treatment for at least 2 years comprised the ex-Vigabatrin group. Group 3.The GABA group had 46 patients who used other anti-epileptic drugs (AED) with GABA action other than Vigabatrin. Group 4. Fifty three patients who had never used an AED with GABA action including Vigabatrin made up the non-GABA group. Surprisingly, the percentage of patients with visual field defects were high in all groups investigated (Vigabatrin group 59%, ex-Vigabatrin group 46%, GABA group 30.2% and non-GABA group 21.2%). However, abnormal bilateral WF-mfERG responses were only found in the Vigabatrin group (48%) and the ex-Vigabatrin group (22%). The study suggests that there are probably different causes of visual field abnormalities in patients with epilepsy not related to Vigabatrin. We propose that the most sensitive and specific tests that can be used to detect visual dysfunction associated with Vigabatrin is the WF-mfERG

Η υπηρεσία γενετικής και φαρμακογονιδιωματικής ανάλυσης έχει τη δυνατότητα να εξασφαλίσει τη βέλτιστη θεραπεία και την καλύτερη χρήση φαρμακευτικής αγωγής σε έναν αυξανόμενο αριθμό ασθενειών, ενώ η εξατομικευμένη και η γονιδιωματική ιατρική θα γίνουν όλο και πιο χρήσιμες με αποτέλεσμα τη σταδιακή αύξηση των διαθέσιμων γενετικών εξετάσεων κατά τα επόμενα έτη. Επί του παρόντος, το επίπεδο της ευαισθητοποίησης του κοινού για τη γενετική ανάλυση και τις επιπτώσεις της είναι πιθανώς χαμηλό, το ίδιο ισχύει και για τους επαγγελματίες υγείας, οι οποίοι είναι σε πρώτη θέση να παρέχουν τις γενετικές υπηρεσίες στο ευρύ κοινό. Η έλλειψη της ευαισθητοποίησης των επαγγελματιών υγείας για την υπηρεσία της γενετικής και φαρμακογονιδιωματικής ανάλυσης αποτελεί ένα σημαντικό εμπόδιο για την προώθηση της εφαρμογής της γονιδιωματικής ιατρικής.Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποκαλύπτει τις απόψεις των επαγγελματιών υγείας σε σχέση με τη γενετική και φαρμακογονιδιωματική ιατρική. Στόχος της διατριβής αποτελεί η διερεύνηση και η συγκριτική μελέτη του επίπεδου κατανόησης και εμπειρίας των επαγγελματιών υγείας, ειδικά των γιατρών και των φαρμακοποιών, σε σχέση με τη γενετική και φαρμακογονιδιωματική ανάλυση στην Ελλάδα. Ειδικότερα, θα εξακριβωθούν οι απόψεις τους στα διάφορα θέματα που αφορούν τον τομέα της γενετικής ανάλυσης και της εξατομικευμένης ιατρικής και των επιπτώσεών τους στην ελληνική κοινωνία. Η έρευνα παρέχει νέες ιδέες και για άλλες ευρωπαϊκές χώρες όπου έχουν στόχο να εμπλακούν πιο ενεργά οι πάροχοι υγειονομικής περίθαλψης έχουν στόχο να εμπλακούν πιο ενεργά σε όλες τις πτυχές της γενετικής ιατρικής και να ενσωματώσουν την εξατομικευμένη ιατρική στην καθημερινή κλινική πρακτική τους. / Genetic and pharmacogenomic testing has the potential to ensure better therapy and medication use in a growing number of diseases, while personalized medicine and genomics will become more useful resulting in gradual increase of available genetic tests in the coming years. Currently, the level of awareness of genetic tests and the impacts is rather low and the same is true for the healthcare professionals who have been entrusted to be in the front-line of delivering these services to the general public. The lack of awareness among health professionals of genetic and pharmacogenomic testing constitutes a major barrier to expediting the implementation of genomic medicine, with its potential to adjust conventional treatment modalities according to a patient’s genomic profile. The purpose of this thesis is to determine the level of awareness of healthcare professionals with respect to genetics and pharmacogenomics and their potential benefits to society, together with the challenges and pitfalls that need to be overcome. Especially to ascertain healthcare professionals’ views and opinions, specifically physicians and pharmacists, on various issues pertaining to genomics, personalized medicine and their impact on society. This study provides novel insights, which we hope will be useful to other European countries that are aiming to more actively engage healthcare providers in all aspects of genomic medicine. This will in turn expedite the incorporation of personalized medicine into daily clinical practice.The results of this thesis provide new insights that should facilitate integration of genetics and pharmacogenomics into patient care in Greece.

Οι διαφορετικοί τρόποι ανταπόκρισης στα φάρμακα που παρατηρούνται από άτομο σε άτομο, οι οποίοι βασίζονται στις γενετικές διαφορές μεταξύ διαφόρων πληθυσμών παρουσιάζουν ένα σημαντικό κλινικό πρόβλημα όχι μόνο στην Ελλάδα αλλά και σε άλλες χώρες. Επάνω στο θέμα αυτό έχει αναπτυχθεί ένας καινούργιος κλάδος επιστήμης και υπηρεσιών στην ελληνική αγορά, οι υπηρεσίες γενετικής και φαρμακογενετικής ανάλυσης, οι οποίες μελετούν τις γενετικές διαφορές στα ένζυμα που επηρεάζουν το μεταβολισμό και τη δράση των φαρμάκων στους ασθενείς. Στόχος της εργασίας ήταν η κατανόηση του ρόλου των υπηρεσιών γενετικής και φαρμακογενετικής ανάλυσης στην ελληνική αγορά πραγματοποιώντας μία έρευνα απόψεων ασθενών και του κοινού για την υπηρεσίες γενετικής και φαρμακογενετικής ανάλυσης σε δύο μεγάλες πόλεις (Αθήνα, Πάτρα) και σε μία κωμόπολη (Αίγιο). Για τις ανάγκες της παρούσας εργασίας, ρωτήθηκαν συνολικά 688 άτομα τα οποία χωρίστηκαν σε 3 ηλικιακές ομάδες (<35 ετών, 35-60 ετών και >60 ετών). Το ερωτηματολόγιο αποτελείτο από 9 συνολικά ερωτήσεις με σκοπό να διερευνηθεί (α) το κατά πόσο το ευρύ κοινό είναι ενημερωμένο για το σκοπό των γενετικών και φαρμακογενετικών αναλύσεων, (β) το κατά πόσο το ευρύ κοινό είναι διατεθειμένο να υποβληθεί σε γενετικές/φαρμακογενετικές αναλύσεις, (γ) αν η επιλογή των ατόμων επηρεάζεται από την κάλυψη της ασφάλειας τους, (δ) αν πιστεύουν ότι οι αναλύσεις πρέπει να διενεργούνται κατευθείαν από τους ενδιαφερόμενους ή κατόπιν υπόδειξης από ειδικό. Τα ευρήματα έδειξαν ότι οι περισσότεροι ερωτηθέντες ήταν ενημερωμένοι για τις γενετικές αναλύσεις γνωρίζοντας ότι οι γενετικές αναλύσεις γίνονται με πολύ απλούς τρόπους. Παρατηρήθηκε ότι το μεγαλύτερο ποσοστό των ατόμων ήταν διατεθειμένοι να προβούν σε μια γενετική εξέταση όταν γνώριζαν ότι οι γενετικές αναλύσεις μπορούν να παρέχουν πληροφορίες για την πιθανότητα εμφάνισης μιας κληρονομικής νόσου. Επιπλέον, οι άνθρωποι που ήταν διατεθειμένοι να προβούν στις γενετικές αναλύσεις ήταν περισσότεροι από αυτούς που ήταν διατεθειμένοι να προβούν στις φαρμακογενετικές αναλύσεις. Ωστόσο, οι περισσότεροι πίστευαν ότι οι γενετικές/φαρμακογενετικές αναλύσεις πρέπει να γίνονται από τους ενδιαφερόμενους κατόπιν υπόδειξης από κάποιον ειδικό. Πιο συγκεκριμένα, η μεγάλη πλειοψηφία των ερωτηθέντων πίστευαν ότι οι γενετικές/φαρμακογενετικές αναλύσεις πρέπει να γίνονται κατόπιν υπόδειξης από κάποιον γιατρό και σημαντικά λιγότεροι κατόπιν υπόδειξης από κάποιον φαρμακοποιό. Στις μικρές πόλεις οι πληροφορίες που αφορούν τις γενετικές/φαρμακογενετικές αναλύσεις δεν είναι τόσο διαδεδομένες συγκριτικά με τις μεγάλες πόλεις. Οι περισσότεροι ασθενείς δεν είχαν την ευκαιρία να υποβληθούν σε κάποια γενετική/φαρμακογενετική εξέταση, εφόσον κανείς ποτέ δεν τους παρότρυνε σχετικά. Όμως, αν οι ειδικοί (ειδικά οι γιατροί) μπορούν να παροτρύνουν περισσότερο τους ασθενείς ώστε να υποβληθούν σε τέτοιες εξετάσεις, οι γιατροί θα μπορέσουν να χρησιμοποιούν τα αποτελέσματα των εξετάσεων προκειμένου να καθορίσουν την καλύτερη θεραπευτική επιλογή για τους ασθενείς. Επιπλέον, οι επιλογές των ασθενών επηρεάζονται πολύ από το αν οι αναλύσεις μπορεί να καλύπτονται από ασφαλιστικούς φορείς. Όταν οι δαπάνες των υπηρεσιών καλύπτονται από το δημόσιο ταμείο υγείας ή κάποιους ασφαλιστικούς φορείς, οι ασθενείς θα είναι πιο διατεθειμένοι να υποβληθούν στις εξετάσεις. / Individual difference in drug response is common among patients and it appears to be due to the interactions of genetic factors. Therefore, knowledge about individual genetic variability in drug response is clinically and economically important. Genetic and pharmacogenetic testing which have been developed recently in Greece, study people’s genetic difference in order to predict their response to medicines. Objectives: The purpose of this thesis is to explore patients’ views about genetic and pharmacogenetic testing services and their future development in the Greek market. Methods: 688 questionnaires were distributed to people, originating from 2 major cities (Athens, Patras) and a smaller city (Egio), who were divided into three age groups (<35 years, 35-60 years and >60 years) in Greece. The questionnaires consisted of 9 questions which were designed to explore people’s opinion on (a) how well informed the general public is about the objectives of genetic and pharmacogenetic analysis (b) whether the general public is willing to undertake these tests (c) if their choices will be influenced by reimbursement of testing costs, and (d) if they believe that the tests should be carried out with or without specialists’ (doctor or pharmacist) advice. Results: The views of 688 individuals showed that most responders were aware of genetic tests. They also knew that genetic tests could be easily carried. In addition, the largest percentage of people was willing to order a genetic test when they knew that genetic analysis can inform them on the possibility to develop a hereditary disease. In addition, the number of people who were willing to take genetic tests was more than those who were willing to take pharmacogenetic tests. However, most people believed that genetic / pharmacogenetic tests should only be carried out following the advice of a specialist. In particular, most responders believed that genetic / pharmacogenetic tests should be carried out following the advice of a doctor rather than the advice of a pharmacist. In smaller towns, information about genetic/pharmacogenetic tests is not so much widespread compared to large cities. Conclusion: Most patients have not had the opportunity to take a genetic / pharmacogenetic test as no one has ever suggested them to do so. But if the experts (especially the doctors) could give specific advices to their patients on such tests, the test results could used to determine the best treatment for the patients. Therefore the consequences of side effects or lack of effectiveness of certain drugs could be avoided and drug therapy could be improved. Apart from that, the choices of patients are mostly influenced by their insurance. If the cost of the tests could be reimbursed by some health insurances, patients would be more willing to take the tests.

Το γλουταμινικό οξύ αποτελεί τον κύριο διεγερτικό νευροδιαβιβαστή στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα των θηλαστικών, παίζοντας σημαντικό ρόλο σε διαδικασίες μάθησης και μνήμης, αλλά και σε διεργασίες διεγερσιμοτοξικότητας. Το γλουταμινικό οξύ ασκεί τις δράσεις του μέσω δύο ομάδων υποδοχέων, των ιοντοτρόπων και των μεταβοτροπικών υποδοχέων. Οι ιοντοτρόποι υποδοχείς είναι δίαυλοι ιόντων, των οποίων η ενεργοποίηση προκαλεί ταχεία διεγερτική νευροδιαβίβαση και διακρίνονται σε δύο μεγάλες υποομάδες ,τους NMDA και τους μη- NMDA υποδοχείς. Οι μεταβοτροπικοί υποδοχείς, συνδέονται με G-πρωτεΐνες και προκαλούν αργή συναπτική νευροδιαβίβαση μέσω ενεργοποίησης δεύτερων αγγελιοφόρων. Διακρίνονται σε τρεις μεγάλες ομάδες: το Group I που περιλαμβάνει τους mGluR1 και mGluR5, οι οποίοι ενεργοποιούν την Φωσφολιπάση C (PLC), το Group II που περιλαμβάνει τους mGluR 2 και 3 και το Group III που περιλαμβάνει τους mGluRs 4, 6, 7και 8, οι οποίοι ρυθμίζουν αρνητικά την αδενυλική κυκλάση. Οι μεταβοτροπικοί υποδοχείς διαδραματίζουν σημαντικό νευροτροποποιητικό ρόλο σε ολόκληρο τον εγκέφαλο και αποτελούν στόχο για θεραπευτική αγωγή διαφόρων ψυχιατρικών και νευρολογικών διαταραχών όπως το άγχος, η κατάθλιψη, το σύνδρομο του εύθραυστου Χ και η σχιζοφρένεια. Στον ιππόκαμπο, μια δομή όπου διενεργούνται διεργασίες μάθησης και μνήμης, οι mGluR5 υποδοχείς είναι οι πλέον άφθονοι από την οικογένεια των Group I Μεταβοτροπικών υποδοχέων και παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της συναπτικής πλαστικότητας και χωρικής μάθησης. Όπως έχει δειχθεί από ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες, μια από τις πιο αξιοσημείωτες επιδράσεις των mGluR5 υποδοχέων είναι η ενίσχυση των NMDA-εξαρτώμενων ρευμάτων. Η δράση τους αυτή φαίνεται να παίζει ρόλο στη δημιουργία του LTP ( μακροχρόνια συναπτική ενίσχυση), καθώς η χορήγηση του ειδικού ανταγωνιστή των mGluR5 υποδοχέων (ΜΡΕΡ) σε ιππόκαμπειους νευρώνες επίμυος, αναστέλλει την επαγωγή του LTP. Στο ραβδωτό σώμα, οι mGluR5 υποδοχείς βρίσκονται υπό τον έλεγχο των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης, με τους οποίους σχηματίζουν ετεροδιμερή συμπλέγματα Α2Α-mGluR5 υποδοχέων. Στον ιππόκαμπο, οι Α2Α υποδοχείς αδενοσίνης εκφράζονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα, ενώ είναι ελάχιστα τα βιβλιογραφικά δεδομένα για την πιθανή αλληλεπίδρασή τους με τους mGluR5 υποδοχείς. Προκειμένου να διερευνήσουμε το μοριακό μηχανισμό μέσω του οποίου οι mGluR5 υποδοχείς του γλουταμινικού οξέος ενισχύουν τα ρεύματα των NMDA υποδοχέων στον ιππόκαμπο επίμυος, εξετάσαμε την in vitro επίδραση της ενεργοποίησης των mGluR5, στο επίπεδο φωσφορυλίωσης της NR2B υπομονάδας του NMDA υποδοχέα, στα κατάλοιπα τυροσίνη-1472 και σερίνη-1303. Εν συνεχεία, διερευνήσαμε in vitro, την ενδεχόμενη αλληλεπίδραση των mGluR5 και Α2Α υποδοχέων στον ιππόκαμπο, μελετώντας την επίδραση της διέγερσης ή της αναστολής τους στην mGluR5-επαγόμενη φωσφορυλίωση των NMDA υποδοχέων. Τέλος, προκειμένου να ανιχνεύσουμε το ενδοκυττάριο μονοπάτι μεταγωγής σήματος των mGluR5 υποδοχέων στον ιππόκαμπο, εξετάσαμε την επίδραση της ενεργοποίησης των mGluR5 υποδοχέων στο επίπεδο φωσφορυλίωσης της ERK ½ κινάσης καθώς και την επίδραση της διέγερσης των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης στην ενεργοποίηση αυτή. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η διέγερση των mGluR5 υποδοχέων του γλουταμινικού οξέος με τον ειδικό αγωνιστή τους, CHPG, επάγει μια ισχυρή φωσφορυλίωση του καταλοίπου τυροσίνη- 1472 της NR2B υπομονάδας, η οποία είναι εξειδικευμένη στη θέση αυτή δεδομένου ότι δεν εμφανίζονται στο κατάλοιπο σερίνη-1303. Σύμφωνα με τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα, η φωσφορυλίωση του καταλοίπου τυροσίνη -1472 της NR2B υπομονάδας, παίζει ρόλο στη μετακίνηση του υποδοχέα στη μεμβράνη και στην ορθή τοποθέτηση του στη σύναψη (trafficking). Συγκεκριμένα, η φωσφορυλίωση στη θέση αυτή καταστέλλει την κλαθρίνη-εξαρτώμενη ενδοκυττάρωση των NMDA υποδοχέων, με αποτέλεσμα τη συσσώρευσή τους στη συναπτική μεμβράνη. Η συσσώρευση των NR2B-NMDA υποδοχέων και η σωστή τοποθέτηση τους στη συναπτική μεμβράνη προάγει τις NMDA εξαρτώμενες αποκρίσεις. Το γεγονός αυτό, συμφωνεί με τα ηλεκτροφυσιολογικά δεδομένα που δείχνουν ότι η διέγερση των mGluR5, ενισχύει τα ρεύματα των NMDA υποδοχέων και προάγει την επαγωγή του LTP στον ιππόκαμπο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, θεωρούμε ότι η φωσφορυλίωση στη τυροσίνη-1472, αποτελεί το μοριακό μηχανισμό ( ή μέρος αυτού), μέσω του οποίου η ενεργοποίηση των mGluR5 υποδοχέων προάγει τα ρεύματα των NMDA διαύλων. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι mGluR5 υποδοχείς του γλουταμινικού οξέος φαίνεται να βρίσκονται υπό τον έλεγχο των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης και στον ιππόκαμπο, όπως και στο ραβδωτό σώμα, καθώς τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι φαρμακευτική αναστολή των Α2Α υποδοχέων εξασθενεί σημαντικά την 10 ικανότητα των ιπποκάμπειων mGluR5 να ελέγχουν τις NMDA-επαγόμενες απαντήσεις. Άρα στον ιππόκαμπο φαίνεται ότι οι Α2Α υποδοχείς δρουν αδειοδοτικά για τη λειτουργία των mGluR5 υποδοχέων ως προς τη ρύθμιση των NMDA-επαγόμενων απαντήσεων. Τέλος, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι η ενεργοποίηση των mGluR5 υποδοχέων, με το ειδικό αγωνιστή τους CHPG, στον ιππόκαμπο, επάγει τη φωσφορυλίωση της ERK 1/2 κινάσης με τρόπο δοσοεξαρτώμενο. Η επαγωγή αυτή δεν υπόκειται στον έλεγχο των Α2Α υποδοχέων αδενοσίνης, καθώς η φαρμακευτική αναστολή τους δεν είχε επίδραση στα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ERK 1/2 κινάσης. Η λειτουργική σημασία της ενεργοποίησης αυτής δεν είναι ακόμα γνωστή και αποτελεί στόχο μελλοντικών πειραμάτων μας. / --

Chapter 1 provides a general introduction on the role of bioisosterism of fluorine aiming to improve the pharmacokinetics properties of lead compounds. GABAA receptors specifically, synaptic GABAA receptors, extrasynaptic GABAA receptors and GABAA rho receptors are then presented. Compounds that exhibit agonist and partial agonist effects at these receptors are also discussed. The applications of some compounds as GABAA receptor PET radiotracers are also described. Chapter 2 details the synthesis of two fluorinated analogues of muscimol, fluoromuscimol and trifluoromethylmuscimol. Fluoromuscimol was obtained from the lithiation of a Boc-protected isoxazole followed by in-situ fluorination using NFSI, whereas trilfuoromethylmuscimol was obtained from the coupling of a heteroaryl iodide with trifluoromethylcopper species, which was generated in-situ from MFSDA in the presence of CuI. Fluoromuscimol and trifluoromethylmuscimol were assessed on human synaptic, (α₁β₂γ₂), extrasynaptic, (α₄β₂δ) and ρ₁ subunits of the GABAA receptor. The biological results show that fluoromuscimol exhibits greater maximum response in comparison to GABA at the extrasynaptic GABAA receptors (α₄β₂δ), but lower overall potency, whereas trifluoromethylmuscimol was inactive at all the tested GABAA receptors. Chapter 3 discusses the synthesis and late stage fluorination of diaryliodonium salts as precursors to fluoromuscimol. Application of iodonium salts as precursors for nucleophilic fluorination in PET studies are also highlighted. The last part of this chapter focuses on the synthesis of iodomuscimol as a potential alternative SPECT radiotracer to fluoromuscimols in probing GABA binding sites on GABAA receptors.

The most successful antimicrobial agents in clinical use are of microbial origin and of these the greatest variety has been found in the genus Streptomyces. However, the resistance of the pathogenic microbes to the commonly used antibiotics is increasing as a result of the wide-spread and long-term use of these antibiotics. Therefore, understanding the strategies that bacteria use to become resistant is of crucial need. Streptomycetes are Gram positive bacteria, commonly found in soil and are known antibiotic-producers. The focus of this thesis was to underpin the mechanism of resistance to penicillin G in isolated strains of streptomycetes that exhibit elevated resistance to penicillin G and to characterise these organisms. Moreover, to investigate the interaction between penicillin G and PBPs in Streptomyces strains and investigate the relationship between growth rate and penicillin G resistance in Streptomyces in vitro. Ninety six Streptomycetes were isolated and characterized. Morphological examination and the16s rRNA sequences of these strains indicated that strains belong to the species Streptomyces. The MICs and MBCs for penicillin G for the isolated Streptomyces strains were measured by plate culture. Some strains showed growth up to 400 μg/ml with penicillin G, which indicate that the strains were highly resistant against penicillin G. Some strains were unable to grow at penicillin concentrations above 200μg/ml. Also, The MICs of penicillin G for isolated Streptomyces strains were measured using a novel OxoPlates® system in 96-well culture format employing Mueller-Hinton broth culture. The MICs of all strains ranged from 1-100 μg /ml. Results indicate that the sensitivity of Streptomyces strains of penicillin G is not directly related to β-lactamase production in the panel of isolates examined. There was no correlation between the MICs of penicillin G and the growth rate in these isolates. Likewise, there was no association between the position of beta-lactamase producing and non-beta-lactamase producing strains on the phylogenetic tree and their beta-lactamase xii activity. Beta-lactamase producing and non-producing strains refers to the same ancestral origin clade. Additionally, the comparative analysis of 16S rRNA gene sequence and phylogenetic relationship of strain (W43) revealed that the isolate clustered with (W76) Streptomyces lividans strain YLA0. Bocillin (a penicillin binding protein stain) staining in β-lactamase producing strains showed staining throughout the mycelia whereas in non β-lactamase producing strains staining only occurred in certain parts of the mycelia. Bocillin also revealed that in spores PBPs were located on both poles of the spores. Streptomyces coelicolor has the ability to grow at high concentrations of penicillin G up to 640 μg/ml in continuous culture. It also has the capacity to grow at very low amounts of dissolved oxygen in continuous culture. Significantly, there was a correlation between the growth rate of S. coelicolor and the resistant to penicillin G. S. Coelicolor was more sensitive to penicillin G at a high dilution rate. Furthermore, our strategy of using the Bug-Lab for monitoring the progress of S. Coelicolor 1147 in continuous culture, even at low concentrations of cells in real time was successful.

A molecular receptor for mephedrone, an amphetamine-like NPS, was developed using host-guest chemistry and pharmacophoric design. The in-field detection of new psychoactive substances (NPS) is an area that has garnered considerable attention in the last few years. With the continuously expanding number of NPS on the market, traditional detection mechanisms lack the selectivity needed. In this project a new methodology has been developed for the design of host molecules for use in in-field detection, based on biomimetic design. To understand what a sensory molecular needs to be selective against, GC-MS and HPLC analysis were employed to identify and quantify thirteen aminoindane internet samples. It was found that the composition of internet samples varies greatly in terms of concentration of active ingredient, with a range of 17-95 % w/w of active ingredient identified. It was also found that caffeine was the most common cutting agent with a range of 27.7-30.2 % w/w identified. This highlights the need for both selectivity and sensitivity in detection mechanisms. Using the principles of biomimetic design, a methodology for the treatment of protein-ligand interactions was developed. Protein-ligand binding data collected from the Protein Databank was analysed for mephedrone related structures and common cutting agents, identified through aminoindane internet sample analysis and literature sources. From this work a three-point pharmacophoric model was developed, upon which two host molecules were considered, macrocyclic calixarenes and acyclic anthraquinones. Both contained the three binding interactions deduced from the pharmacophore design; two p-stacking interactions and one hydrogen bond acceptor. The final host molecule taken forward for testing was 1,8-dibenzylthiourea anthracene (Probe 1). The binding affinity of Probe 1 to mephedrone was tested using 1H-NMR. An estimated association constant of 104 M-1 was calculated, with a 1:1 binding stoichiometry. Along with ESI-MS and DFT calculations, it was found that mephedrone binds to Probe 1 in a concerted fashion with a three-point binding geometry, with two hydrogen bonds and one p-stacking interaction. A modest optical response using fluorescence spectroscopy was also observed between mephedrone and Probe 1 at high molar concentrations. A more pronounced response was observed upon addition of high molar concentrations of flephedrone. 1H-NMR showed that Probe 1 selectively bound mephedrone over methamphetamine as well as the four most common cutting agents identified from literature: lidocaine, caffeine, paracetamol and benzocaine, which have been shown to cause false positives in previous studies. Probe 1 showed significant selectivity for the β-ketoamine arrangement. This is supported by the systematic analysis of mephedrone, methamphetamine, mephedrone precursor and flephedrone. This is the first time this has been achieved using host-guest chemistry. A protocol was developed to successfully detect mephedrone via Probe 1 using NMR spectroscopy in a simulated street sample containing two of the most common cutting agents, benzocaine and caffeine. To further aid future design of small host molecules a methodology for the in silico analysis of small molecule host-guest binding using metadynamics was explored. Solvent interactions with the host and guest molecules were observed, highlighting the importance of solvent choice in binding studies. Metadynamics shows potential to be used in further work for improving the approach in which host molecules are designed in future.