Tesis por compendio de publicaciones / OBJETIVOS 1. Evaluar el uso de la alfa amilasa salivar como marcador de estrés usando técnicas tradicionales (ensayos enzimáticos) en humana, usando como modelo experimental a estudiantes de veterinaria que tenían que realizar una presentación oral de un trabajo en lengua extranjera. 2. Evaluar el uso de la alfa amilasa salivar como marcador de estrés usando técnicas tradicionales (ensayos enzimáticos) en cerdos. 3. Implementar nuevos enfoques para la medición de la alfa-amilasa en muestras de saliva de varias especies (incluidos los seres humanos) mediante la cuantificación directa de la cantidad de la alfa-amilasa salival en lugar de mediante la medición de su actividad 4. Detectar e identificar nuevos biomarcadores de estrés en la saliva mediante técnicas de proteómica. Una técnica avanzada que permite la separación e identificación de múltiples proteínas. METODOLOGÍA Esta tesis doctoral es un compendio de los siguientes artículos publicados: 1) Assessment of Stress Associated with an Oral Public Speech in Veterinary Students by Salivary Biomarkers. Tecles F, Fuentes-Rubio M, Tvarijonaviciute A, Martínez-Subiela S, Fatjó J, Cerón JJ. (2014) J Vet Med Educ. Jan 21:1-7. [Epub ahead of print]. 2) Validation of an automated method for salivary alpha-amylase measurements in pigs (Sus scrofa domesticus) and its application as a stress biomarker. Fuentes M, Tecles F, Gutiérrez A, Otal J, Martínez-Subiela S, Cerón JJ. (2011) J Vet Diagn Invest. Mar;23(2):282-7. 3) Porcine salivary analysis by two-dimensional gel electrophoresis in three acute stress models: a pilot study. Fuentes-Rubio M, Cerón J, de Torre C, Escribano D, Gutiérrez AM, Tecles F. (2014) Can J Vet Res. Apr;78(2):127-32. En el primer artículo, se midió el cortisol salival y la actividad alfa-amilasa para evaluar el estrés asociado con una presentación oral pública de los estudiantes de Patología Clínica Veterinaria. Se recogieron muestras de saliva antes y directamente después de la presentación oral de 5 minutos y a los 20 y 35 minutos después del comienzo de la misma. El cortisol alcanzó su punto máximo 20 minutos después del comienzo de la presentación, mientras que la alfa-amilasa salival alcanzó su máximo justo al final del discurso. No existió relación entre estos cambios y el nivel de estrés que se indica por el estudiante en un cuestionario, ni con el sexo del estudiante, o la calidad de la presentación. El objetivo del segundo estudio fue validar un método espectrofotométrico automatizado para la medición de alfa-amilasa salival en cerdos y evaluar su posible aplicación como biomarcador de estrés no invasivo . La validación analítica incluyó la precisión intra- e inter- ensayo, linealidad bajo dilución, y límite de detección. Además, para estudiar el posible uso de alfa- amilasa salival como marcador de estrés, 12 cerdos en crecimiento de 3-4 meses de edad fueron sometidos a estrés por inmovilización durante al menos 1 min, obteniéndose muestras de saliva en diferentes puntos de tiempo. Los resultados de la validación analítica indicaron que el método era preciso y capaz de medir la alfa-amilasa de una manera lineal. Los resultados obtenidos en la prueba de esfuerzo mostraron un aumento significativo en la actividad salival alfa amilasa. El propósito del artículo 3 fue estudiar los cambios en el proteoma salival de cerdos sanos en situaciones de estrés para identificar cualquier posible nuevo biomarcador salival de estrés. Tres grupos de animales fueron sometidos a 3 modelos de estrés: restricción seguido de muestreo simulado de sangre de la vena cava; transporte breve por carretera; restricción de movimiento en una jaula digestibilidad. La saliva se obtuvo de cada animal antes, 15 y 30 min después de la inducción de estrés. Las muestras de los animales que mostraron el mayor incremento en la concentración de cortisol salivar se agruparon y se realizó una electroforesis en geles bidimensionales. Se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue R-250 para la detección de spots y seleccionarlos para su identificación mediante espectrometría de masas. Los análisis estadísticos demostraron que 2 proteínas tenían diferencias significativas en la expresión antes y después de la inducción de estrés y fueron identificadas como fragmentos de albúmina y proteína de unión odorizante. CONCLUSIONES 1. La actividad enzimática de la alfa amilasa salivar puede ser usada como biomarcador de estrés en estudiantes de Veterinaria tras someter a los individuos a una presentación pública oral. 2. La actividad enzimática de la alfa amilasa salivar puede ser usada como biomarcador de estrés en cerdos tras someter a los individuos a un protocolo de restricción de movimientos. 3. La concentración de alfa amilasa en saliva de humanos, cerdos, caballos y ovejas puede ser cuantificada mediante un ensayo de inmunofluorometría a tiempo resuelto. Este ensayo tiene una variación inter-individual baja y es más sensible que los ensayos enzimáticos para detectar estrés. 4. El proteoma salivar de los cerdos ha revelado diferencias entre animales en condiciones basales y bajo condiciones de estrés. Esto se reveló como una herramienta útil para buscar posibles nuevos biomarcadores de estrés in estos animales tales como la proteína de unión odorizante. / OBJECTIVES 1. To evaluate the use of salivary alpha-amylase as a marker of stress using traditional techniques (enzymatic assays) in human using a model in which veterinary students had to make an oral presentation in a foreing language. 2. To evaluate the use of salivary alpha-amylase as a marker of stress using traditional techniques (enzymatic assays) in pigs. 3. To implement new approaches for measuring alpha-amylase in saliva samples of several species (including human beings) by direct quantification of the amount of the salivary alpha-amylase instead of by measuring its activity (Article 3, Article 4, Article 5, Article 6). 4. To detect and identify new biomarkers of stress in saliva by proteomics. An advanced technique that allows separation and identification of multiple proteins. METHODOLOGY This PhD thesis is a compilation of the following published papers: 1) Assessment of Stress Associated with an Oral Public Speech in Veterinary Students by Salivary Biomarkers. Tecles F, Fuentes-Rubio M, Tvarijonaviciute A, Martínez-Subiela S, Fatjó J, Cerón JJ. (2014) J Vet Med Educ. Jan 21:1-7. [Epub ahead of print]. 2) Validation of an automated method for salivary alpha-amylase measurements in pigs (Sus scrofa domesticus) and its application as a stress biomarker. Fuentes M, Tecles F, Gutiérrez A, Otal J, Martínez-Subiela S, Cerón JJ. (2011) J Vet Diagn Invest. Mar;23(2):282-7. 3) Porcine salivary analysis by two-dimensional gel electrophoresis in three acute stress models: a pilot study. Fuentes-Rubio M, Cerón J, de Torre C, Escribano D, Gutiérrez AM, Tecles F. (2014) Can J Vet Res. Apr;78(2):127-32. In the first article, salivary cortisol and alpha-amylase activity were measured to assess stress associated with a public oral presentation in Veterinary Clinical Pathology students. Stimulated saliva samples were collected before and directly after a 5-minute oral presentation and at 20 and 35 minutes after the beginning of the presentation. Cortisol peaked 20 minutes after the beginning of the presentation, whereas salivary alpha-amylase (sAA) peaked at 5 minutes, just at the end of the speech. These changes were not related to the level of stress that was indicated by the student in a questionnaire, the student’s sex, or the quality of the presentation. The aim of the second study was to validate an automated spectrophotometric method for salivary alpha-amylase measurement in pigs and evaluate its possible application as a noninvasive stress biomarker. The analytical validation included intra- and interassay precision, linearity under dilution, and limit of detection. In addition, to study the possible use of salivary alpha-amylase as a possible stress marker, 12 crossbred growing pigs of 3-4 months of age were subjected to restraint stress by a nasal snare for at least 1 min, and saliva samples were obtained at different time points. The results of analytical validation indicated that the method was precise and able to measure alpha-amylase in a linear manner. The results obtained in the stress test showed a significant increase in salivary alpha-amylase activity. The purpose of the research of article 3 was to study changes in the salivary proteome of healthy pigs in stressful situations to identify any potential new salivary biomarker of stress. Three groups of animals were subjected to 3 stress models: snaring restraint followed by simulated sampling of vena cava blood; brief transport by road; and restriction of movement in a digestibility cage. Saliva was obtained from each animal before and 15 and 30 min after the induction of stress. The samples from the animals that showed the greatest increase in salivary cortisol concentration were pooled and run on 2-dimensional gels. Coomassie Brilliant Blue R-250 was used for spot detection and mass spectrometry for spot identification. Statistical analyses showed that 2 proteins had significant differences in expression before and after the induction of stress. These proteins were identified as odorant-binding protein and fragments of albumin. CONCLUSIONS 1. The enzymatic activity of salivary alpha-amylase can be used as biomarker of stress in Veterinary students after subjecting the individuals to a public oral presentation. 2. The enzymatic activity of salivary alpha-amylase can be used as biomarker of stress in pigs after subjecting the individuals to restraint of movement protocol. 3. Alpha-amylase concentration in saliva of humans, pigs, horses and sheep can be quantified by TR-IFMA This assay has a lower inter-individual variation and is more sensitive than enzymatic assays to detect stress. 4. Salivary proteome of pigs has revealed differences between animals in basal status and under stress conditions. It was shown as a useful tool to search possible new salivary biomarkers of stress in these animals such as odorant-binding protein.

La especie porcina es considerada el modelo animal idóneo para el estudio y desarrollo de terapias contra enfermedades humanas debido a sus similitudes genéticas, anatómicas y fisiológicas con el hombre. Sin embargo, la eficiencia de la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos para utilizarlos con este fin sigue siendo muy baja, pues aun persisten los problemas de la fecundación polispérmica y las condiciones de cultivo subóptimas. Por estos motivos, se pretende profundizar en el conocimiento de los diferentes factores relacionados con el oviducto porcino que pudieran ser utilizados para modular el proceso de la fecundación in vitro (FIV) y contribuir a la mejora de los sistemas de PIV de embriones. La presente tesis aborda tres posibles vías de mejora diferentes en cuanto a complejidad e implicaciones fisiológicas consistentes en la adición al medio de cultivo de tres tipos de compuestos: fluido oviductal (FO), α-L-fucosidasa y óxido nítrico (NO). El objetivo del primer estudio fue determinar las condiciones óptimas de inclusión del FO en los protocolos de FIV. Para ello, se preincubaron ovocitos madurados in vitro con FO pre o postovulatorio y se realizó FIV. Se midieron las concentraciones de E2 y P4 en el FO. Finalmente se comparó la eficiencia de la FIV al utilizar semen fresco o congelado con ovocitos preincubados en FO preovulatorio. La eficiencia de la FIV porcina mejoró con la preincubación en FO preovulatorio. Cuando se utilizó semen congelado su capacidad de penetración aumentó comparando con semen fresco. La concentración de E2 en el FO preovulatorio fue mayor que la determinada en sangre para la misma fase del ciclo estral y la adición de E2 al medio de FIV a la concentración detectada en el oviducto produjo un efecto similar al de la adición de FO. Concluimos que la preincubación de los ovocitos en FO preovulatorio o la adición de E2 pueden considerarse protocolos adecuados para aumentar la eficiencia de la FIV porcina con semen fresco. En el segundo estudio se investigó el papel de la α-L-fucosidasa durante la FIV porcina. Para ello se añadió la enzima al medio de FIV y se observó un incremento en la penetración y en la unión de espermatozoides a la zona pelúcida (ZP). Se realizó inmunofluorescencia indirecta para detectar la α-L-fucosidasa espermática y finalmente se realizaron estudios de capacitación espermática, demostrándose que la α-L-fucosidasa aumenta los niveles de [Ca2+] intracelular y la fosforilación de tirosina. Por lo que concluímos que la α-L-fucosidasa estimula eventos relacionados con la capacitación en espermatozoides porcinos, dando lugar a una mayor capacidad de unión a la ZP y de penetración al ovocito. En el tercer estudio se investigó el papel del NO durante la maduración in vitro (MIV) porcina. Para ello se suplementó el medio de MIV con tres inhibidores distintos de la óxido nítrico sintasa (NOS) y con un donante de NO. Se estudió la expansión de las células del cúmulus y la reanudación de la meiosis, la resistencia de la ZP a la digestión enzimática y parámetros relacionados con la FIV. Los resultados mostraron que los tres inhibidores ejercían un efecto sobre la expansión de las células del cúmulus y que la reanudación de la meiosis solamente se vio detenida al añadir el inhibidor aminoguanidina. Posteriormente, se planteó la posibilidad de que la inhibición de las NOS afectara a la S-nitrosilación de proteínas del ovocito. Para ello se realizó nitrosilación in situ cuantificándose la intensidad de fluorescencia. De este modo, se demostró que la S-nitrosilación de proteínas es una de las vías por la que el NO ejerce su efecto en el ovocito, revelando la importancia del NO en la MIV. / The porcine species, owing to their genetic, anatomic, and physiologic similarities with humans, is considered as the ideal animal model for studying and developing novel therapies against human diseases. However, the efficiency of porcine embryo in vitro production (IVP) is nowadays still unacceptably low, because the problem of polyspermic fertilization has still not been adequately worked out and the embryo in vitro culture conditions are still considered to be suboptimal. For these reasons, the present doctoral thesis aims to deepen the understanding of the different factors related to the physiology of the pig oviduct that could be used to modulate the in vitro fertilization (IVF) process and contribute to improve pig embryo IVP systems. Therefore, we investigate three different ways of improvement, in terms of complexity and physiological implications, such as: 1) the oviductal fluid (OF), 2) α-l-fucosidase, 3) nitric oxide (NO). The aim of the first study was to determine the optimal conditions for the OF inclusion in the IVF protocols. For this purpose, in vitro matured oocytes were pre-incubated in OF collected before or after ovulation and subsequently used for IVF. Steroids concentrations in OF were measured and used in IVF experiments. Finally the IVF efficiency was compared between fresh or frozen semen with oocytes preincubated in preovulatory OF. Results showed that pig IVF efficiency improved with preincubation in preovulatory OF. When frozen-thawed semen was used with preovulatory OF incubated oocytes, penetration ability and polyspermy increased. The estradiol (E2) concentration in preovulatory OF was greater than that determined in blood serum at the same phase of the estrous cycle. We conclude that preincubation of oocytes in preovulatory OF or the addition of E2 can be considered suitable tools to increase the efficiency of IVF, only with fresh semen, in the pig. In the second study the role of α-L-fucosidase in pig IVF was investigated. Therefore, the enzyme was added to the IVF medium and a significant increase in sperm binding to the zona pellucida (ZP) and penetration was observed. Thereafter, the sperm-associated α-L-fucosidase was detected by indirect immunofluorescence. In this case, neither the intensity of fluorescence nor the patterns of sperm-associated α-L-fucosidase distribution were affected. Finally, experiments focused on the study of the capacitation events were conducted. The results showed that the addition of exogenous α-L-fucosidase increased the sperm intracellular [Ca 2+] and P-tyrosine phosphorylation, suggesting a role in promoting capacitation and at the same time protecting the sperm cells from premature acrosome reaction. This sequence of events would, in turn, explain the increased ability of this population of treated spermatozoa to bind ZP and penetrate the oocyte. The third study arose to determine the effect of NO during pig oocyte maturation. In vitro maturation (IVM) medium was supplemented with three NOS inhibitors, and a NO donor. The effects on cumulus cells expansion, meiotic resumption, ZP resistance to enzymatic digestion and various parameters related to IVF were studied. The results showed that after IVM, the three NOS inhibitors exerted an inhibitory effect on cumulus cells expansion, while meiotic resumption was suppressed only when the inhibitor aminoguanidine was added. Subsequently, to determine whether the NOS inhibition affect the S-nitrosylation of oocyte proteins, we performed in situ S-nitrosylation and the fluorescence intensity was quantified. Thus, it was shown for the first time that the S-nitrosylation of proteins is one of the ways by which NO exerts its effect on porcine maturation, revealing the importance of NO in both IVM and subsequent fertilization.

La ecografía se utiliza en el diagnóstico de patologías y alteraciones del aparato reproductor del perro. El Doppler pulsado es empleado para describir las características de la onda espectral de la arteria testicular y establecer los valores de referencia de sus parámetros cuantitativos (velocidad del pico sistólico, VPS; velocidad al final de la diástole, VFD) y semicuantitativos (índice de resistividad, IR; índice de pulsatilidad, IP). En humana, el valor del IR de las arterias testiculares puede ser un indicador de la espermatogénesis y en el perro un marcador de la calidad seminal. Existe poca información sobre las características y parámetros cuantitativos y semicuantitativos de las arterias testiculares en el perro y su aplicación como predictores de la calidad espermática. El objetivo del presente estudio fue describir la morfología de la onda espectral y los valores de referencia de la VPS, VFD, IR e IP de las arterias testiculares en el perro y determinar la correlación entre los valores del IR de dichas arterias con la concentración y motilidad espermática. Se utilizaron cinco perros de la raza Beagle con una edad media de 4 años y un peso medio de 19 kg. Para el examen ecográfico se empleó un ecógrafo con una sonda electrónica lineal de 11 MHz. Los animales no fueron sedados, para evitar alteraciones sobre el flujo sanguíneo testicular. La recogida seminal se realizó de forma individual, por el mismo personal y franja horaria. Valorándose únicamente su fracción espermática. El estudio se dividió en dos experiencias. En la primera experiencia se realizaron cinco ensayos, consistentes en un examen ecográfico Doppler color y pulsado de las arterias testiculares de ambos testículos. En la segunda experiencia, se hicieron 15 ensayos basados en un examen ecográfico y una extracción y contrastación seminal, valorándose los parámetros de concentración y motilidad espermática, utilizando un sistema de análisis computerizado (ISAS® CASMA). Para la interpretación de los datos obtenidos se utilizó un análisis estadístico SPSS versión 15.0. En la primera experiencia, las arterias testiculares se identificaron fácilmente con el Doppler color y pulsado, presentando un modelo de flujo espectral de baja resistencia. Se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre los valores de VPS, VFD, IR e IP entre las distintas arterias, encontrándose los valores más altos en la arteria supratesticular y los más bajos en las arterias intratesticulares. Este comportamiento se repitió en todos los ensayos. Los valores medios obtenidos en la arteria supratesticular fueron: VPS= 15.32 cm/s ± 5.28, VFD= 6.76 cm/s ± 1.88, IR= 0.53 ± 0.13 e IP= 0.88 ± 0.39; en la arteria marginal: VPS= 10.72 cm/s ± 3.86, VFD= 6.24 cm/s ± 2.19, IR= 0.41 ± 0.10 e IP= 0.63 ± 0.20; y en las arterias intratesticulares: VPS= 6.34 cm/s ± 1.51, VFD= 4.10 cm/s ± 0.86, IR= 0.35 ± 0.07 e IP= 0.49 ± 0.12. Estos resultados podrían utilizarse como valores de referencia de los parámetros cuantitativos y semicuantitavos que definen a las arterias testiculares en la especie canina. Los resultados de la segunda experiencia sugieren la existencia de una correlación positiva estadísticamente significativa débil entre el IR de las arterias testiculares y los parámetros de calidad y motilidad seminal. Esta correlación se evidenció tanto a Tiempo a como a Tiempo b. En las arterias intratesticulares se evidenció el mayor número de correlaciones positivas (con la motilidad progresiva, VSL, VAP, LIN, STR y BCF) y la única correlación negativa significativa, con la concentración espermática. Aunque serían necesarios futuros estudios, este resultado podría indicar que la medición del IR en las arterias intratesticulares podría ser un parámetro predictor de la calidad seminal a nivel cuantitativo en el perro. / La ecografía se utiliza en el diagnóstico de patologías y alteraciones del aparato reproductor del perro. El Doppler pulsado es empleado para describir las características de la onda espectral de la arteria testicular y establecer los valores de referencia de sus parámetros cuantitativos (velocidad del pico sistólico, VPS; velocidad al final de la diástole, VFD) y semicuantitativos (índice de resistividad, IR; índice de pulsatilidad, IP). En humana, el valor del IR de las arterias testiculares puede ser un indicador de la espermatogénesis y en el perro un marcador de la calidad seminal. Existe poca información sobre las características y parámetros cuantitativos y semicuantitativos de las arterias testiculares en el perro y su aplicación como predictores de la calidad espermática. El objetivo del presente estudio fue describir la morfología de la onda espectral y los valores de referencia de la VPS, VFD, IR e IP de las arterias testiculares en el perro y determinar la correlación entre los valores del IR de dichas arterias con la concentración y motilidad espermática. Se utilizaron cinco perros de la raza Beagle con una edad media de 4 años y un peso medio de 19 kg. Para el examen ecográfico se empleó un ecógrafo con una sonda electrónica lineal de 11 MHz. Los animales no fueron sedados, para evitar alteraciones sobre el flujo sanguíneo testicular. La recogida seminal se realizó de forma individual, por el mismo personal y franja horaria. Valorándose únicamente su fracción espermática. El estudio se dividió en dos experiencias. En la primera experiencia se realizaron cinco ensayos, consistentes en un examen ecográfico Doppler color y pulsado de las arterias testiculares de ambos testículos. En la segunda experiencia, se hicieron 15 ensayos basados en un examen ecográfico y una extracción y contrastación seminal, valorándose los parámetros de concentración y motilidad espermática, utilizando un sistema de análisis computerizado (ISAS® CASMA). Para la interpretación de los datos obtenidos se utilizó un análisis estadístico SPSS versión 15.0. En la primera experiencia, las arterias testiculares se identificaron fácilmente con el Doppler color y pulsado, presentando un modelo de flujo espectral de baja resistencia. Se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre los valores de VPS, VFD, IR e IP entre las distintas arterias, encontrándose los valores más altos en la arteria supratesticular y los más bajos en las arterias intratesticulares. Este comportamiento se repitió en todos los ensayos. Los valores medios obtenidos en la arteria supratesticular fueron: VPS= 15.32 cm/s ± 5.28, VFD= 6.76 cm/s ± 1.88, IR= 0.53 ± 0.13 e IP= 0.88 ± 0.39; en la arteria marginal: VPS= 10.72 cm/s ± 3.86, VFD= 6.24 cm/s ± 2.19, IR= 0.41 ± 0.10 e IP= 0.63 ± 0.20; y en las arterias intratesticulares: VPS= 6.34 cm/s ± 1.51, VFD= 4.10 cm/s ± 0.86, IR= 0.35 ± 0.07 e IP= 0.49 ± 0.12. Estos resultados podrían utilizarse como valores de referencia de los parámetros cuantitativos y semicuantitavos que definen a las arterias testiculares en la especie canina. Los resultados de la segunda experiencia sugieren la existencia de una correlación positiva estadísticamente significativa débil entre el IR de las arterias testiculares y los parámetros de calidad y motilidad seminal. Esta correlación se evidenció tanto a Tiempo a como a Tiempo b. En las arterias intratesticulares se evidenció el mayor número de correlaciones positivas (con la motilidad progresiva, VSL, VAP, LIN, STR y BCF) y la única correlación negativa significativa, con la concentración espermática. Aunque serían necesarios futuros estudios, este resultado podría indicar que la medición del IR en las arterias intratesticulares podría ser un parámetro predictor de la calidad seminal a nivel cuantitativo en el perro.

Se han realizado dos experiencias con un total de 104 hembras caprinas de raza Murciano-Granadina pertenecientes al EMEGA de Guadalupe (Murcia), con el fin de determinar los valores de actividad catalítica de diversas enzimas (ASAT, ALAT, γ-GT, LDH y F.Al.), según el "status" sexual de los animales. En un primer grupo se ha trabajado con 54 cabras con edades comprendidas entre 12 y 14 meses y que todavía no habían tenido ningún parto. En una segunda experiencia se han tomado dos lotes de 25 cabras multíparas con edades entre 3'5 y 4 años. Para la primera experiencia se realizaron las tomas de sangre tres meses antes del inicio de las cubriciones (fase 1) con intervalos de 15 días (6 muestras), 7 muestras durante la fase de gestación (fase 2) y una tercera fase de lactación con una duración de 150 días (6 muestras). Para las hembras multíparas se tomaron 4 muestras con periodicidad mensual para el lote de gestantes y 7 muestras para el lote de hembras en la fase de lactación. La determinación de la actividad enzimática se ha llevado a cabo por técnicas espectrofotométricas mediante métodos automatizados. En la elaboración de los resultados se han empleado métodos estadísticos paramétricos para ASAT, ALAT, γ-GT y LDH y métodos no paramétricos para F.Al. En la primera experiencia los niveles medios de actividad enzimática hallados para ASAT han sido de 44'71 ± 8'20, 49'75 ± 12'90 y 115'76 ± 26'32 UI/l para las fases anterior a la cubrición, gestación y lactación, respectivamente. El estudio comparativo por "t" de Student, revela la existencia de diferencias significativas entre las tres fases. En hembras multíparas los valores medios fueron de 47'37 ± 9'72 UI/l para la fase de gestación y de 56'25 ± 8'06 UI/l para hembras en lactación encontrándose diferencias significativas entre sí, aunque se mantiene el hecho de que tanto en hembras primíparas como multíparas los resultados más elevados corresponden a la fase de lactación. La comparación entre ambas experiencias revela, asimismo, diferencias entre fases coincidentes para ambos grupos de animales. Para ALAT, las medias conseguidas en la primera experiencia fueron (15'69 ± 3'94, 23'55 ± 5'70, 11'43 ± 3'91 UI/I para las tres fases, respectivamente, y de 10'69 ± 4'41 y 13'13 ± 3'0 UI/l en las fases de gestación y lactación en hembras multíparas, Se han encontrado diferencias significativas entre fases entre experiencias.Los niveles medios de actividad catalítica de γ-GT para la primera segunda experiencia y dentro de las fases estudiadas fueron de 25'92 ± 5'65, 19'32 ± 5'61 y 24'11 ± 6'71 y 35'22 ± 7'82 y 40'85 ±6'60 UI/I, respectivamente, obteniéndose que tanto en hembras primíparas como multíparas los valores más bajos se detectaron durante la gestación, aunque los resultados tanto entre fases como entre experiencias para fases coincidentes se mostraron significativamente diferentes.En el caso de LDH los valores medios de actividad en cabras primíparas fueron en las fases anterior a la cubrición, durante la gestación y lactación de 161'56 ± 34'0, 79'80 ± 21'63 y 164'18 ± 40'53 UI/l, respectivamente, no hallándose diferencias significativas entre las fases l y 3, En hembras multíparas lo resultados medios hallados fueron de 115'20 ± 25'24 y 150'27 ± 20'31 UI/l para la tercera gestación y tercera lactación, respectivamente. Los niveles durante la gestación fueron significativamente inferiores a los encontrados en lactación tanto en hembras primíparas como en hembras multíparas. La comparación entre ambas experiencias determinó diferencias significativas. El estudio no paramétrico de F.Al. determinó unos valores para la mediana de 162'2, 117'4 y 123'5 UI/I en la primera experiencia y según las fases y de 149'4 y 161'9 UI/I para hembras multíparas. No se encontraron diferencias significativas entre gestación y lactación. / Two experiments have been conducted on a total of 104 Murciano-Granadina female goats belonging to EMEGA in Guadalupe (Murcia). The aim was to determine the values of catalytic in various enzymes (ASAT, ALAT, γ-GT, LDH and F.Al.) according to the sexual status of the animals. In the first experiment 54 goats aged between 12 and 14 months were used. In the second experiment two groups of goats aged between 3'5 and 4 years were used. In the first trial blood samples were taken three months before mating (phase 1) at intervals of 15 days, 7 samples during gestation (phase 2) and 6 samples during lactation (phase 3) over period of 150 days. In goats been taken 4 samples every month for animals during gestation and 7 samples for goats during lactation. Enzyme activity was determined using automated spectrophotometric techniques. The results were calculated using parametric statistical methods for ASAT, ALAT, and -GT and LDH, and non parametric methods for F.Al. There are significative differences on the average levels of ASAT, ALAT and -GT serum activity depending on the «sexual status» of the goat. The -GT activity depends on the age, having the young females enzyme activity levels lower than those who are in third gestation and third lactation period.There is a decrease in LDH catalytic activity levels during gestation in comparison with lactation period in both multiparous and primiparous goats. LDH is the on1y enzyme with has not significative differences between the period prior to breeding and first lactation period.The values found for the alkaline phosphatase enzyme activity had great individual variations in both multiparous and primiparous goats.

Las fluoroquinolonas son fármacos antimicrobianos bactericidas con excelente actividad frente a un amplio espectro de bacterias aerobias y contra micoplasmas. Concretamente danofloxacino es una fluoroquinolona que fue desarrollada exclusivamente para uso veterinario. En su espectro antimicrobiano, ha mostrado ser efectivo frente a bacterias gram-negativas y algunas bacterias gram-positivas, micoplasmas, y patógenos intracelulares, tales como Brucella y especies de Chlamydia. Bacterias responsables de múltiples infecciones en el tracto intestinal, respiratorio o tejido mamario. Dadas sus buenas cualidades farmacocinéticas, como son su bajo porcentaje de unión a proteínas plasmáticas, volúmenes de distribución elevados y buena penetración en células y tejidos, son valiosos agentes para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias intracelulares. Po otra parte, la liberación controlada de fármacos administrados por vía parenteral ha adquirido una importancia creciente en el desarrollo de nuevas formulaciones farmacéuticas. Resulta interesante poder administrar el medicamento con amplios intervalos, lo que supone un menor coste y un menor estrés de manejo de los animales. OBJETIVOS Después de lo anteriormente mencionado, se plantearon los siguientes objetivos para el presente estudio: 1. Determinación de los parámetros farmacocinéticos de danofloxacino tras la administración intravenosa y subcutánea, en solución acuosa, en ovino. 2. Determinación de los parámetros farmacocinéticos de danofloxacino tras su administración subcutánea, en solución de P407 al 25% y en solución de P407 al 25% más carboximetilcelulosa al 2%, en ovino. 3. La determinación y cuantificación de la eliminación de dicha fluoroquinolona en la leche, dependiendo de la vía de administración y la formulación, como base para determinar su utilidad en el tratamiento de mamitis. 4. Determinación de las CMI de este antibiótico para Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus aureus como gérmenes representativos de procesos infecciosos respiratorios y mamarios en la especie a estudiar. 5. Obtención de la formulación, vía/s de administración y pauta/s posológica/s más adecuada/s en la oveja para el tratamiento de infecciones sistémicas, en base a las CMI obtenidas y al estudio PK/PD. METODOLOGÍA El estudio se ha realizado sobre 5 ovejas todas ellas sanas y adultas y con pesos que oscilaban entre 72 y 106 Kg. Con una edad entre 2,5 y 3,5 años y de raza Lacaune. A cada animal se le administró una dosis única única IV o SC de danofloxacino a la dosis de 6 mg/kg o de 18 mg/kg en solución del polímero P407 al 25% (SC1) y en solución del polímero P407 al 25% más carboximetilcelulosa al 2% (SC2). Las muestras de sangre fueron recogidas antes de inyectar el fármaco (tiempo 0 o pre-tratamiento), y a 0,083, 0,167, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 32, 48, 72 y 96 horas tras la administración. Las muestras de leche fueron ordeñadas inmediatamente antes y después de la administración del fármaco a 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 32, 48, 72 y 96 horas. Este estudio fue aprobado por el comité bioético de la universidad de Murcia. La determinación de danofloxacino en plasma y leche se realizó mediante HPLC con detección fluorimétrica y el ajuste a modelos farmacocinéticos compartimentales y no compartimentales se realizó mediante el programa farmacocinético WinNonlin Professional® (Versión 5.2.1). Además se determinó la concentración mínima inhibitoria de dicha fluoroquinolona frente a Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. RESULTADOS Y CONCLUSIONES La semivida plasmática en la fase terminal para danofloxacino en las distintas formas de administración IV, SC, SC1, y SC2 fueron: 3,87 ± 0,65, 5.18 ± 0.84, 10.27 ± 3.59 y 13.49 ± 2.90 h, respectivamente. En el análisis farmacocinético de la leche se determinan parámetros como Cmax reportando valores para las vías IV, SC, SC1 y SC2 de 28734.02 ± 11069.35, 20344.02 ± 4636.72, 44370.58 ± 20548.37 y 30829.29 ± 8400.38 µg/L respectivamente. Los valores de la ratio AUCleche/AUCplasma fueron de 12.81 ± 3.62, 13.53 ± 3.46, 25.42 ± 9.25 y 27,12 ± 8.02 respectivamente para las distintas vías y la ratio Cmáx-leche/Cmáx-plasma de 4.73 ± 1.81, 12.04 ± 4.89, 17.38 ± 6.55 y 18.11 ± 4,85 respectivamente. De las cepas estudiadas frente a danofloxacino, con un rango de concentraciones entre 0,250 mg/L – 0,0625 mg/L se obtuvo como CMI90, un valor de 0,125 mg/L para danofloxacino. Por lo tanto las ratios AUC/CMI obtenidos fueron: 83,7±13,34 para IV, 85,1±10,19 para SC, 57,67±12,21 para SC1 y 73,94±18,92 para SC2, y los valores de las ratios Cmáx/CMI fueron 36,88±4,56, 13,67±2,08, 6,76±1,08 y 8,23±1,3 respectivamente. De dicho estudio se puede concluir que: 1. La permanencia de danofloxacino es superior tras la administración subcutánea SC1 y SC2, por tanto, serían las mejores formas de administración a fin de obtener concentraciones plasmáticas durante un mayor tiempo. 2. Que los valores de los ratios Cmáxleche/Cmáx plasma y AUCleche/AUCplasma, son muy superiores a uno en todos los casos para las vías extravasculares, e indican que el fármaco tiene un alto grado de acceso y acumulación desde el plasma hacia la leche. 3. Con una dosis de 18 mg/kg de danofloxacino administrado mediantes las formulaciones SC1 y SC2, obtendríamos según los parámetros farmacocinéticos/farmacodinámicos, el éxito clínico y evitaríamos la aparición de resistencias. / Fluoroquinolones are bactericidal antimicrobial agents with excellent activity against a broad spectrum of aerobic bacteria and mycoplasma. Concretely danofloxacin is a fluoroquinolone that was developed exclusively for veterinary use. In its antimicrobial spectrum, it has been shown to be effective against gram negative bacteria and some gram-positive, mycoplasma, and intracelular pathogens, such as Brucella and Chlamydia. Bacteria responsible for multiple intestinal and respiratory infections or breast tissue infections. Given the good pharmacokinetic properties, such as their low percentage of protein binding, high volume of distribution and good penetration in cells and tissues, are valuable agents for treating infections with intracellular bacteria. In other hand, the controlled release of drugs administered parenterally has become increasingly important in the development of new pharmaceutical formulations. It is interesting to administer the drug with broad ranges, which means lower costs and less stress in the handling of the animals. OBJECTIVES After the above, the following objectives for this study were raised: 1. Determination of pharmacokinetic parameters of danofloxacino after intravenous and subcutaneous administration in aqueous solution in sheep. 2. Determination of pharmacokinetic parameters of danofloxacino after subcutaneous administration at a dose of 18 mg / kg with the p407 polymer solution of 25% (SC1) and P407 polymer solution of 25% plus carboxymethylcellulose 2% (SC2). 3. Determination and quantification of danofloxacin elimination in milk, depending on the route of administration and formulation as a base to determine their utility in mastitis treatment. 4. MIC determination of this antibiotic for Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus like representative germs for respiratory and mammary infections in this species studied. 5. Obtention of formulation, route of administration and regimen dosage more appropriate for the treatment of systemic infections in sheep, based on the MIC obtained and PK/ PD study. METHODOLOGY The study has been carried on five healthy adult sheep of Lacaune breed with weights ranging from 72 to 106 kg and aged between 2.5 and 3.5 years. Administration routes and doses have been intravenous (IV) and subcutaneous (SC) doses of 6 mg/kg and subcutaneous administration at a dose of 18 mg / kg with the P407 polymer solution of 25% (SC1) and P407 polymer solution of 25% plus carboxymethylcellulose 2% (SC2). The samples were obtained immediately before dosing (blank) and 0.083, 0.167, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2. 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48 and 72 h after dosing. This study was approved by the bioethical committee of the University of Murcia. Danofloxacin determination in plasma and in milk was done with HPLC with fluorimetric detection and the compartmental and non compartmental pharmacokinetic adjustment modeling was done using WinNonlin® Professional (Version 5.2.1). In addition, the minimum inhibitory concentration of the fluoroquinolone was determined against Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. RESULTS AND CONCLUSIONS Plasma half-life for danofloxacin in the terminal phase for the different forms of administration IV, SC, SC1, and SC2 were: 3,87 ± 0,65, 5.18 ± 0.84, 10.27 ± 3.59 y 13.49 ± 2.90 h, respectively. Pharmacokinetics analysis of milk parameters like Cmax were determined and reporting values for the IV, SC, SC1 and SC2: 28734.02 ± 11069.35, 20344.02 ± 4636.72, 44370.58 ± 20548.37 y 30829.29 ± 8400.38 µg/L respectively. AUCleche/AUCplasma ratio values were de 12.81 ± 3.62, 13.53 ± 3.46, 25.42 ± 9.25 y 27,12 ± 8.02 respectively f or different routes and the ratio Cmáx-leche/Cmáx-plasma values were 4.73 ± 1.81, 12.04 ± 4.89, 17.38 ± 6.55 y 18.11 ± 4,85 respectively. The strains were studied against danofloxacin, with a concentration range of 0.250 mg /L - 0.0625 mg/L reported MIC90, value of 0.125 mg / L. The ratios AUC / MIC were: 83.7 ± 13.34 for IV, 85.1 ± 10.19 for SC 57.67 ± 12.21 for SC1 and 73.94 ± 18.92 for SC2, and values of Cmax / MIC ratios were 36.88 ± 4.56, 13.67 ± 2.08, 6.76 ± 1.08 and 8.23 ± 1.3 respectively. From this study it can be concluded that: 1. Permanence of danofloxacin is higher after SC1 and SC2, therefore, SC1 and SC2 will get plasma concentrations for a longer time. 2. Cmáx leche/Cmáx plasma and AUC leche/AUC plasma ratio values for extravascular routes are elevated in all cases, which indicate that the drug reaches high penetration and accumulation in milk. 3. With 18 mg/kg de danofloxacino administered through SC1 and SC2 formulation, we would obtain clinical success and the prevention of bacterial resistance development according to pharmacokinetic / pharmacodynamic parameters.

Los objetivos de esta tesis eran realizar la caracterización antigénica de Sphaerospora dicentrarchi, un mixosporidio de las lubinas; analizar la presencia de carbohidratos en éste y otros mixosporidios; estudiar la modulación in vitro de la actividad de los leucocitos de la lubina por el parásito; y estudiar el efecto de la inmunización de lubinas con esporas de S. dicentrarchi. Los resultados demostraron la existencia de bandas en los extractos antigénicos de S. dicentrarchi con pesos moleculares de entre 21 y 130 kDa y de proteasas. La mayoría de los mixosporidios ensayados contenían manosa y/o glucosa en sus cápsulas polares y N-acetil-glucosamina en sus valvas. Se demostró la relación entre el grado de parasitación por S. dicentrarchi y la actividad de los leucocitos, y que la hormona del crecimiento estimula el estallido respiratorio en mayor medida cuando las lubinas están parasitadas. La inmunización con esporas produjo cambios en la respuesta inmunitaria. / The objectives of this work were study a) the antigenic composition of Sphaerospora dicentrarchi, myxosporean parasite of sea bass; b) the presence of carbohydrates which could be shared by Myxosporea from different hosts; c) the modulation of the in vitro activity of leucocytes by S. dicentrachi; d) the immunoregulatory role of GH in sea bass; and e) the immune response of sea bass after immunization with S. dicentrarchi. The results showed the existence of parasitic bands with molecular weights between 21 and 130 kDa, as well as proteases. The presence of mannose and/or glucose, and N-acetyl-D galactosamine respectively, in polar capsules and valves of most of the myxosporea assayed was demonstrated. An active role of head kidney phagocytes against S. dicentrarchi in in vitro assays was observed, this activity could be increased with GH. The immunization of sea bass with S. dicentrarchi resulted in the activation of the immune response.

Esta investigación aporta evidencias sobre el uso potencial de la luz láser de diodo de 655 nm de emisión continua para modificar la motilidad espermática canina. El modelo experimental usado ha sido el de muestras frescas de semen de perros adultos (5.9  2.1 años) y sanos de raza beagle que han sido sometidas a diferentes dosis y potencias de irradiación láser. Se han analizado los diferentes parámetros de motilidad y las subpoblaciones espermáticas. Los resultados indican claramente que la energía láser modular la motilidad espermática y que este efecto es dosis dependiente y potencias dependiente, mediante un mecanismo de acción no relacionado con los mecanismos de la tirosina ni por las especies reactivas de oxígeno mitocondrial (mROS). / Aquesta recerca aporta evidències sobre l’ús potencial de la llum làser de díode de 655 nm d’emissió contínua per modificar la motilitat espermàtica canina. El model experimental emprat ha estat el de mostres fresques de semen de gossos adults (5.9  2.1 anys) i sans de raça beagel, que han estat sotmeses a diferents dosis i potències d’irradiació làser. S’han analitzat els diferents paràmetres de motilitat i les subpoblacions espermàtiques. Els resultats indiquen clarament que l’energia làser modula la motilitat espermàtica i que aquest efecte és dosi dependent i potència dependent, mitjançant un mecanisme d’acció no relacionat amb els mecanismes de la tirosina ni per les espècies reactives d’oxigen mitocondrial (mROS). / This research provides evidences on the potencial use of the 655 nm continuous wave diode laser irradiation to modify the canine sperm motility. The experimental model used has been fresh samples from adult (5.9  2.1 years old) and healthy beagle dog sperm that have been exposed to different doses an output powers of laser irradiation. The different motility parameters have been analysed as well as the spermatic subpopulations. The results clearly indicate that the laser energy modulates the sperm motility and that this effect is depends on the dose and on the output power. This effect is done by a mechanism of action that is not related to tirosine mechanism nor to mitochondrial reactive oxygen species (mROS).

Esta tesis presenta un estudio del comportamiento de los lechones adoptados y las estrategias que se podrían aplicar para disminuir las emociones negativas derivadas de la práctica de la adopción. En este sentido, se realizó en una primera experiencia un análisis detallado del efecto de la edad en el comportamiento de los lechones adoptados de uno, cuatro y siete días de edad durante tres períodos de observación de dos horas de duración. En general, se observó que los lechones adoptados de mayores edades tienen dificultades para adaptarse a la camada y a la cerda adoptiva. Sobre todo los lechones de siete días de edad presentan agresiones en la ubre aun durante el tercer periodo con mayores lesiones en la zona de la cabeza. Además, las conductas observadas en los adoptados como el caminar, las vocalizaciones y el intento de escape fueron buenos indicadores del estado emocional de los lechones y el juego del estado de bienestar. Los resultados de este estudio sugieren que las primeras horas de adopción son las más criticas para el lechón, afectado tanto emocional como físicamente, siendo los lechones de siete días de edad los que presentan peor capacidad de adaptación. Este estudio posteriormente fue utilizado como control en las siguientes experiencias. En la segunda experiencia se analizó el efecto del enriquecimiento ambiental con objetos y el enriquecimiento sensorial acústico en los lechones de uno y cuatro días de edad en un solo período de observación de dos horas de duración inmediatamente después de la adopción. En general, se observó que los lechones de cuatro días de edad permanecieron aislados menos tiempo y los agresores disminuyeron considerable con pocas agresiones de menor duración, mientras que estas agresiones no existieron en los lechones de 1 día. En ambas edades el intento de mamar entre amamantamientos ocurrió menos veces y el juego fue frecuente y duradero. Por tanto, el uso del enriquecimiento ambiental beneficiaría el comportamiento de los lechones en adopción acelerando el proceso de adaptación. En la tercera experiencia se estudió el efecto del momento del día en que se efectúan las adopciones en los lechones de uno y cuatro días de edad en un periodo de observación de dos horas de duración. Las adopciones fueron realizadas en horas de la tarde y posteriormente comparadas con las adopciones de la primera experiencia realizadas en horas de la mañana. En términos generales, los lechones de cuatro días de edad presentaron un comportamiento de aislamiento disminuido, un descanso prolongado con la camada receptora, y menor frecuencia y tiempo de mamar entre periodos de amamantamiento. Además, las agresiones en ambas edades duraron poco tiempo y las agresiones entre adoptados y residentes decrecieron, asimismo, en los lechones de cuatro días de edad el porcentaje de lechones agresores disminuyó. Mientras que el juego fue muy frecuente y prolongado en los lechones de un día de edad. Por lo cual, pensamos que realizar las adopciones en horas de la tarde puede ayudar a disminuir el estado de frustración de los lechones adoptados. En la cuarta experiencia se consideró el efecto de la situación espacial de la madre biológica en el comportamiento de los lechones adoptados. Los lechones adoptados manifestaron un comportamiento de aislamiento disminuido, tardaron en mamar entre amamantamientos, el intento de escape y las vocalizaciones disminuyeron. Las agresiones en los lechones de un día no existieron y duraron poco tiempo en los de cuatro días de edad. En base a estos resultados sugerimos que realizar las adopciones en un ambiente aislado de los estímulos familiares podría ayudar a disminuir las emociones negativas en los lechones. / This thesis presents a study on the behavior of adopted piglets and the strategies that could be applied to reduce the negative emotions caused by the practice of adoption. In the first study a detailed analysis on the behavior of adopted pigs from the ages of one, four and seven days, during three distinct stages of observation which was two hours in duration distributed over a twenty-four period. In general, it was observed that adopted pigs of older ages had difficulties adapting to their litter and to their adoptive sow, especially pigs of seven days of age, which resulted repeated attempts to escape and a marked “wandering-squealing syndrome during the first period and aggression during sucking towards other members of the litter this resulted in major injuries to the zone of the head and continue into the third period. The results of this study suggests that the first hours of adoption were the most critical for adopted piglets which were affected both emotionally and physically. we observed that piglets of seven days of age had the worst difficulty in adapting. This study was later used in a controlled experiment in later studies. In the second study we analyzed the effect of environmental enrichment on two distinct age groups one and four days, in only one period of observation of two hours immediately after adoption. In general, we observed that the piglets of four days of age kept themselves isolated lesser time and that the aggressive piglets behaviour diminished considerably, with fewer aggressions and for shorter durations. However this type of aggression did not exist in the piglets of one day. In both ages, the sucking attempt between nursing happened for a lesser number of times and play was frequent and longer. Therefore, the use of environmental enrichment could benefit the behavior of piglets in adoption, accelerating the process of adjustment. In the third study we aimed to establish whether the time of the day adoptions took place affected the piglets of one and four days of age, in period of observation of just two hours. The adoptions that took place in the evening and were subsequently compared to adoptions that were carried out in the first study in the morning. Overall piglets of four days of age presented behavior of reduced self isolation, prolonged rest with their litter receptora and less frequent sucking times and for shorter times between periods of nursing. On the other hand, aggression in both ages lasted for a short time and aggression directed towards the receptor litter decreased. , the percentage of piglet aggressors from the four days group decreased, whereas the play behaviour of the one day piglets was very frequent and prolonged. The investigation demostrated adoptions conducted in the evening helped reduce frustration in adopted piglets. In the last study we considered the effect of the spatial location of the biological mother in the behavior of the adopted piglets. We observed decreased self isolation, latency sucking between nursings, simultaneously attempts to escape and vocalizations declined. The aggression in the piglets of one day did not exist, whereas in those of four days lasted a short time. On the basis of these results we suggest that adoptions should be carried out in isolation from the birth family stimuli which helps in decreasing negative emotions in the piglets.

Se realizaron cuatro experiencias con el fin desarrollar métodos simples y sensibles para la determinación de las proteínas de fase aguda en muestras de saliva y jugo cárnico de cerdo, y contribuir a un mayor conocimiento sus posibles usos y aplicaciones. En la primera experiencia se desarrolló y optimizó un inmunoensayo para la determinación de la haptoglobina porcina en muestras de saliva y jugo cárnico basado en la fluorometría a tiempo resuelto. En la segunda experiencia se adaptó un inmunoensayo, previamente desarrollado para la determinación de la proteína C reactiva en muestras de sangre entera porcina, para la cuantificación de los niveles de dicha proteína en muestras de saliva y jugo cárnico. La tercera experiencia se centró en estudiar la utilidad práctica de los fluoroinmunoensayos desarrollados para evaluar la respuesta de fase aguda en enfermedades producidas en condiciones de campo. Además se valoró si la saliva y el jugo cárnico podrían utilizarse como muestras alternativas al suero sanguíneo para la determinación de Hp y CRP porcina. Finalmente, la cuarta experiencia consistió en un estudio proteómico en muestras de saliva porcina. Se utilizaron técnicas electroforéticas de alta resolución para realizar la separación de las proteínas salivares en una y dos dimensiones y permitir la identificación de dichas proteínas mediante inmunoblot y espectrofotometría de masas. / The objectives of the present study were:1. To develop and validate a time resolved immunofluorometric assay (TR-IFMA) for Hp quantification in saliva and meat juice of pigs, including the study of the stability of Hp in those body fluids. A monoclonal antibody against porcine Hp was produced for this purpose allowing the development of a fast one-step assay that give results of a 95 wells plate in only 20 minutes.2. To develop and validate a TR-IFMA for CRP quantification in saliva and meat juice of pigs, including the study of the stability of CRP in those body fluids.3. To perform a clinical evaluation of the two TR-IFMAs developed in field conditions. For this purpose Hp and CRP were quantified in serum, saliva and meat juice of animals with PRRS at different ages and the results were compared in order to assess the usefulness of APP determinations in saliva and meat juice as an alternative to serum.4. To perform a preliminary evaluation of whole saliva by proteomics for possible identifications of new biomarkers of disease in pigs.

Tesis por compendio de publicaciones / La preselección del sexo de la descendencia mediante el uso espermatozoides portadores del cromosoma X o del Y separados por citometría de flujo es hoy en día una realidad. Sin embargo, mientras el semen separado está disponible comercialmente en bovino, en otras especies domesticas, incluyendo la especie porcina, la técnica está todavía a nivel experimental. La finalidad principal de esta tesis fue desarrollar un protocolo para la aplicación eficiente de los espermatozoides de verraco separados mediante citometría de flujo. Para ello, se han desarrollado los siguientes estudios. En el primer estudio, se evaluó la capacidad de los espermatozoides procedentes de eyaculados de diferentes verracos para resistir el procedimiento de separación espermática. Para ello, eyaculados de verraco fueron fueron sometidos a diferentes tratamientos: conservación en estado líquido, congelación estándar, separación espermática mediante citometría de flujo y separación y congelación. Los parámetros evaludados fueron: motilidad, viabilidad, oxidación lipídica de la membrana plasmática y fragmentación del ADN. El segundo estudio tuvo como objetivo la optimización los protocolos para la criopreservación de los espermatozoides separados de verraco. Para ello fueron evaluados los efectos de la congelación estándar (3% glicerol) sobre las características in vitro de los espermatozoides separados y congelados a una baja concentración espermática. Así como los efectos de diferentes concentraciones de glicerol sobre la calidad espermática de los espermatozoides separados y congelados a bajas concentraciones. El objetivo del tercer estudio fue diseñar un protocolo adecuado para la manipulación de los espermatozoides de verraco durante y después del proceso de separación con el fin de obtener espermatozoides separados con una óptima capacidad fecundante. Para este proposito, diferentes aspectos de la separación espermática fueron evaluados. Se evaluó el efecto de la alta dilución, el medio de recolección usado y la composición del fluido recirculante sobre la calidad (motilidad y viabilidad) y la funcionalidad (capacidad fecundante in vitro) de espermatozoides separados. El objetivo del cuarto estudio fue desarrollar un procedimiento útil de inseminación laparoscópica utilizando un número muy bajo de espermatozoides separados por citomería de flujo que permita obtener óptimos resultados de fertilidad a nivel de granja. Se evaluó el efecto de una inseminación laparoscópica simple (oviductos) y doble (oviductos y cuernos uterinos) con espermatozoides separados, sobre los parámetros reproductivos de las cerdas inseminadas. Tras los resultados de estos estudios, podemos concluir que: Existe una variabilidad individual entre verracos respecto a su capacidad para resistir el proceso de separación espermática por citometría de flujo. Además la respuesta de los espermatozoides de un verraco a una determinada biotecnología espermática no predice la respuesta de los mismos a otros procedimientos. La congelación de espermatozoides a bajas concentraciones en combinación con el uso de concentraciones finales de glicerol de 0.5–1% podría ser un método apropiado para la criopreservación de espermatozoides de verraco separados por citometría de flujo. La adición de EDTA en el fluido envolvente y de yema de huevo en el medio de recogida mejora la capacidad fecundante in vitro de los espermatozoides de verraco separados y ambos agentes deberían ser incluidos como componentes esenciales en los medios utilizados en los procedimientos de separación espermática por citometría de flujo en porcino. El procedimiento de inseminación laparoscópica descrito en el presente estudio es un método efectivo y aplicable en condiciones de granja para la obtención de descendencia de sexo deseado en ganado porcino. El protocolo de doble inseminación laparoscópica, usando entre 3 y 6 millones de espermatozoides separados por cerda permite obtener unos adecuados parámetros reproductivos a nivel de granja, haciendo que la tecnología de separación espermática por citometría de flujo sea potencialmente aplicable en núcleos de selección genética en ganado porcino. / Sex pre-selection of the offspring by using X or Y chromosome bearing spermatozoa sorted by flow cytometry is nowadays a reality. However, while sexed spermatozoa are commercially available for bovine, in other domestic species including the pig the technique is still at experimental level. The main objective of this thesis was to develop a protocol to efficiently apply flow cytometric sex-sorting procedure on boar spermatozoa. To achieve this objective, the following studies were developed. In the first study, the ability of ejaculated spermatozoa from individual boars to withstand flow cytometric sex-sorting procedure was evaluated. Sperm-rich ejaculate samples were split into three aliquots. The aliquots were (1) diluted and stored, (2) frozen-thawed using standard protocols, or (3) sex-sorted with subsequent liquid storage or frozen-thawed. The sperm quality was evaluated based on total sperm motility, viability, lipid peroxidation and DNA fragmentation. The objective of the second study was to optimize protocols for cryopreservation of sex-sorted boar spermatozoa. We evaluated the effects of a standard boar sperm cryopreservation procedure on the in vitro characteristics of sex-sorted sperm frozen at low sperm concentrations and the effects of different final glycerol concentrations on post-thaw quality. The objective of the third experimental study was to design and adequate protocol for boar sperm handling during and after sperm sex sorting for obtaining sex sorted boar sperm with an optimal in vitro fertilizing ability. For this purpose, different aspects of the sorting procedure were examined. The effects of the high dilution rates, type of collection medium used, and sheath fluid composition on sorted boar sperm quality and function were evaluated. Sperm quality was assessed by motility and viability tests, whereas sperm function was evaluated by an in vitro fertilization assay which determined the penetration and polyspermy rates as well as the mean number of sperm penetrating each oocyte. The objective of the fourth study was to develop a useful procedure for laparoscopic inseminations with sex-sorted spermatozoa that allows obtaining optimal fertility results at a farm level. We evaluated the effects of single (oviducts) and double (oviducts and tips of the uterine horns) laparoscopic insemination with sex-sorted sperm on the reproductive performance of sows. The results achieved in these four studies have generated the following conclusions: There is an individual variability among boars to withstand the sorting procedure by flow cytometry. The response of spermatozoa to a specific semen-processing technique does not predict the response of spermatozoa from the same boar to other semen-processing techniques. Freezing at low sperm concentration in combination with the use of a final glycerol concentrations of 0.5–1% could be a suitable method for the cryopreservation of sex-sorted boar sperm. The addition of EDTA to sheath fluid and EY to collection medium improved the in vitro fertilizing ability of sex-sorted sperm, and both agents should be included as essential media components for flow cytometric sperm sex sorting in swine. The laparoscopic insemination procedure described in the present study is an effective method for obtaining offspring of the desired sex in swine at a farm level. The double laparoscopic insemination procedure, using between 3 and 6 millions of sex-sorted sperm per sow produces adequate results for reproductive parameters, making sperm-sexing technology potentially applicable in elite breeding units.