L'enriquiment de l’oli d'oliva amb els seus propis fenols esdevé una estratègia interessant per augmentar i normalitzar la ingesta diària d’hidroxitirosol sense augmentar el consum calòric. No obstant això, olis amb alt contingut fenòlic proporcionen un gust amarg que podria provocar rebuig entre els consumidors. A més, altes dosis d'hidroxitirosol podria tenir una acció pro-oxidant. En aquesta tesi es va plantejar l'estratègia d'enriquiment d’un oli d'oliva no només amb els seus propis fenols, sinó amb fenols complementaris d'herbes aromàtiques, concretament de farigola, amb la hipòtesi de que apart de proporcionar millores en l'estabilitat de l'oli i l'acceptació dels consumidors, també podria aportar beneficis addicionals per a la salut. Un cop desenvolupat l'oli d'oliva enriquit en fenols, es va avaluar la biodisponibilitat dels fenols mitjançant mètodes in vitro i in vivo, avaluant possibles interaccions o sinergies entre ambdues fonts fenòliques. / El enriquecimiento de aceite de oliva con sus propios fenoles se convierte en una estrategia interesante para aumentar y normalizar la ingesta diaria de hidroxitirosol sin aumentar el consumo calórico. Sin embargo, aceites con alto contenido fenólico tienen un sabor amargo que podría provocar rechazo entre los consumidores, y además sus altas dosis de hidroxitirosol podría tener una acción pro-oxidante. En esta tesis se planteó la estrategia de enriquecimiento de aceite de oliva no sólo con sus propios fenoles, sino con fenoles complementarios de hierbas aromáticas, concretamente tomillo, con la hipótesis de que no sólo podría proporcionar mejoras en la estabilidad del aceite y la aceptación de los consumidores, sino que podría aportar beneficios adicionales para la salud. Una vez desarrollado el aceite de oliva enriquecido se evaluó la biodisponibilidad de los fenoles mediante métodos in vitro e in vivo, evaluando posibles interacciones o sinergias entre ambas fuentes fenólicas. / The enrichment of olive oil with its own phenolic compounds becomes an interesting strategy to increase and standardize the daily intake of hydroxytyrosol without increasing the caloric intake. Concerning olive oils with high phenolic content, however, they have a bitter taste, which could promote a refusal among consumers, and contain high doses of hydroxytyrosol that could have a pro-oxidant action. In this context, the strategy of enriching olive oil not only with its own phenolics but also with complementary phenols from aromatic herbs was outlined in this thesis with the hypothesis that it could not only improve olive oil stability and consumers’ acceptation but also provide additional health benefits. In this thesis a phenol-enriched olive oil was developed using the aromatic herb of thyme, and the bioavailability of the phenolic compounds was assessed, evaluating possible interactions or synergies between both sources through in vitro and in vivo approaches.

Tesis por compendio de publicaciones / A la hora de evaluar la calidad del vino se tienen en cuenta tres aspectos principalmente: el color, el sabor y el aroma. El color y el sabor se deben a la presencia de compuestos fenólicos, mientras que el aroma a la presencia de compuestos volátiles procedentes de las uvas, de la fermentación o del envejecimiento del vino. Los compuestos fenólicos y volátiles son metabolitos secundarios producidos por las plantas a través de diversas rutas metabólicas. Su producción puede ser respuesta a un estímulo externo estresante de tipo abiótico o biótico, ya que algunos de ellos pueden actuar como defensas químicas contra patógenos o herbívoros y su síntesis se ve aumentada tras un ataque. Sin embargo, la síntesis de estos compuestos de interés puede ser activada incluso cuando el estímulo no está presente con el uso de elicitores. Éstos son sustancias que cuando se aplican exógenamente desencadenan las rutas de biosíntesis de compuestos de defensa. Varios estudios han demostrado que el mecanismo involucrado en la respuesta de la planta tras el uso de elicitores implica un aumento en la concentración de compuestos polifenólicos y volátiles. Por ello, el principal objetivo de esta tesis doctoral es, determinar el efecto de la aplicación de elicitores en el momento del envero en uvas de la variedad Monastrell sobre los niveles de ciertos compuestos de interés enológico como son los compuestos fenólicos y aromáticos en uvas y si este incremento, si existe, permite mejorar la calidad de los vinos obtenidos. Basándonos en estas premisas, se ha diseñado una experiencia de tres años para determinar el efecto de los elicitores benzotiadiazol (BTH) y metil jasmonato (MeJ), tanto en su aplicación por separado como conjunta, y la hormona vegetal ácido abscísico (ABA) en la concentración de compuestos fenólicos y volátiles en uva y sus vinos correspondientes. Los tratamientos se aplicaron en las siguientes dosis: 0,3 mM de BTH, 10 mM de MeJ y 1,5 mM de ABA en forma de espray en el momento del envero, tres y seis días después. Tras la vendimia, la uva fue analizada en sus parámetros fisicoquímicos y su contenido en polifenoles y compuestos volátiles. Igualmente se elaboraron vinos con las uvas tratadas y sin tratar como control, para comprobar si el efecto observado en las uvas se veía reflejado también en su vino correspondiente. Los resultados mostraron que el tratamiento pre-cosecha de uvas con BTH conllevó mejores resultados con respecto a la composición fenólica de uvas y vino que con MeJ, mientras que MeJ aumentó los niveles de estilbenos y compuestos volátiles de uva y vino. Estas diferencias pueden estar relacionadas con la respuesta defensiva que cada elicitor desencadena. Un nivel aumentado de compuestos fenólicos puede ser tóxico para microorganismos que se estén alimentando de la planta y limitar su acción, mientras que un alto nivel de estilbenos y terpenos puede limitar a los herbívoros y patógenos invasivos. Los terpenos también pueden servir como señales que se transportan por el aire para disuadir herbívoros, ataque por predadores y participan en la señalización entre plantas. Sin embargo, algunos estudios han mostrado que la respuesta de las plantas a elicitores no depende solo de la variedad sino también del clon. A fin de determinar si hay un efecto clon en respuesta de las vides al tratamiento con elicitores con respecto al contenido fenólico, aplicamos BTH y MeJ a un viñedo con una colección de seis de los clones más importantes de la variedad Monastrell. Este análisis mostró que, en general, los dos elicitores aumentaban los niveles de compuestos fenólicos en las plantas tratadas, aunque el grado de respuesta difería entre los clones de la misma variedad. Considerando el tratamiento conjunto de BTH y MeJ, nuestros resultados indican que su uso aumenta positivamente las características cromáticas de los vinos resultantes, de forma similar que cuando se aplicó BTH por separado. Por otro lado, el aroma de los vinos elaborados con las uvas tratadas con BTH+MeJ fue aumentado de forma similar que cuando se aplicó MeJ por separado. Al contrario de lo esperado, y a pesar de que no se observó un efecto negativo, nuestros resultados parecen indicar que la aplicación conjunta de BTH y MeJ no sirve para optimizar las dos líneas de acción. Los resultados observados pueden ser importantes para la planta, ya que una de las consecuencias más destacadas del uso de elicitores exógenos es la reducción de la incidencia y severidad de la infección por mohos, como se ha demostrado en varios estudios. Considerando que el MeJ es un metabolito de origen natural en la planta y que el BTH es translocado y degradado en el tejido vegetal y, por tanto, no se esperan problemas de persistencia y residuos, los dos productos se pueden considerar una estrategia interesante para proteger la viña, como una alternativa o complemento a los tratamientos con fungicidas, aumentando al mismo tiempo, el contenido fenólico. Sin embargo, es importante indicar que estos primeros resultados deben ser completados con estudios respecto a la dosis utilizada, los momentos de aplicación y las posibles interacciones entre la uva y las condiciones climatológicas que pueden suponer diferentes resultados. / When evaluating the quality of wine, three main aspects have to be considered: color, taste and aroma. Color and also taste, although to a lesser extent, are due to the presence of phenolic compounds, whereas the aroma of wines is due to the presence of volatile compounds, which origin may be the grapes themselves, the fermentative process or the aging processes. Phenolic and volatile compounds are secondary metabolites of grapes. Plants produce a wide variety of this type of metabolites through diverse biosynthesis pathways and their production is sometimes a response to external stimuli, either environmental or biotic stresses. Some of them may act as chemical defences against pathogens or herbivores and their synthesis is increased when the attack exists. However, it is remarkable that the synthesis of these interesting compounds can be activated even when the stimulus is not present, with the use of elicitors. These are substances that mimic or are the naturally occurring substances that when applied exogenously trigger the biosynthetic pathways conducting to the synthesis of these defence compounds. Several studies demonstrated that the mechanism involved in the response of the plant after the use of elicitors implied an increased concentration of polyphenol and volatile compounds. For these reasons, the main objective of this PhD thesis is to determine the effect of the application of elicitors at veraison in Monastrell grapes on the level of oenological compounds such as fenolic and volatile compounds in grapes and wine. Based on these premises, we designed a three years experience to determine the effect of benzothiadiazole (BTH) and methyl jasmonate (MeJ) applications both separately and jointly, and the plant hormone abscisic acid (ABA) on the concentration of phenolic and volatile compounds in grapes and their corresponding wines. The treatments were done in the following concentrations: 0,3 mM de BTH, 10 mM de MeJ y 1,5 mM de ABA as spray at veraison, three and six days later. After harvest, the grape was analyzed for physicochemical parameters and its content in polyphenols and volatile compounds. Wines were elaborated from such grapes for determine if the effect, if any, was also reflect in the corresponding wine. The results showed that BTH treatment of preharvest grapes generally led to better results as regard the phenolic composition of grapes and wines than MeJ treatment whereas MeJ largely increased the levels of stilbenes and grape and wine volatile compounds. These differences may be related with the defence responses that each elicitor triggered. An increased level of phenolic compounds may be toxic for the feeding microorganisms and limit their action, while an increase in stilbenes and terpenes may limit herbivore and pathogen invasion because of their toxicity. Terpenes may also serve as airborne signals that deter herbivores, attract predators and act in plant-to-plant signaling. However, some studies had shown that the plant response to elicitors depends not only on the grape variety but also on the clone. To determine a possible effect of the clone in response to elicitors’ treatments on phenolic content, BTH and MeJ have been applied to a selection of six of the commercially most important Monastrell clones. Such analysis showed that, in general, the two elicitors increased the phenolic content in treated plants, but the degree of response was different from one clone to another from the same variety. Considering the combined treatment of BTH and MeJ, on one hand, our results indicate that the use of such combination positively increases the chromatic characteristics of the resulting wines, in a similar way to when BTH was applied separately. On the other hand, the aroma of the wines elaborated with BTH+MeJ treated grapes were increased in a similar way to when MeJ was applied separately. Contrary to expectations, and although a negative effect was not observed, our results seem to indicate that the combined application of BTH and MeJ did not serve to increase both lines of action. The results observed may be important for the plant since a reduced incidence and severity of gray mold infection is one of the most outstanding consequences of the use of exogenous elicitors, as demonstrated in several studies. Taking into account that MeJ is a naturally occurring plant metabolite and BTH was detected to be completely translocated and degraded in plant tissues, and therefore, no persistence or residue problems are expected, both products could be considered an interesting strategy to protect the vine, as an alternative or complement to fungicide treatments, increasing, at the same time, the phenolic content of the grapes. However, it is important to indicate that these first results should be completed. Further investigations must be done specially regarding doses, moments of application and grape-environment interactions that may exist and may make a difference on the results.

Existe una relación evidente entre el consumo de sal y el mayor riesgo de padecer hipertensión. La hipertensión es una enfermedad crónica que afecta a algo más del 40% de la población general adulta en España. El pan es uno de los alimentos básicos de la dieta humana siendo en España la principal fuente dietética de sodio en la población adulta. El uso de masa madre produce un pan con una notable mejora de las características nutricionales y sensoriales, incluyendo aroma, sabor, textura de la corteza y miga, así como un alargamiento de la vida útil del pan. En este contexto nace el proyecto de obtener una nueva formulación de pan de masa madre funcionalmente activo, contribuyendo a disponer de un alimento saludable con propiedades beneficiosas para la salud. Para ello, se ha estudiado la posibilidad de sustituir el sodio (Na) por potasio (K) en las formulaciones de pan y la inclusión de moléculas biológicamente activas con un efecto hipotensor científicamente demostrado. El Ácido γ-Amino Butírico (GABA), un amino ácido no proteico, con numerosas funciones fisiológicas entre los que se encuentra el sistema de regulación de la presión arterial. La ingesta de un alimento rico en GABA y una reducción de su contenido en sal pueden ayudar a reducir la tensión arterial. En el proyecto se reúnen por tanto, las dos condiciones básicas para la obtención de un pan, elaborado con una masa madre que realza el sabor del pan, enmascarando posibles defectos asociados a la inclusión de sal potásica y por otra parte, la posibilidad de que esta masa madre contenga además sustancias bioactivas como el GABA y los Inhibidores del Enzima Convertidor de la Angiotensina (IECA). En el primer estudio se aislaron bacterias ácido lácticas de quesos artesanales españoles con el fin de obtener cepas altamente productoras de GABA. Las cepas fueron sometidas a ensayos cualitativos y ensayos cuantitativos para evaluar la habilidad de sintetizar GABA. Tras la selección de la mejor cepa, Lactobacillus brevis CECT 8183, ésta se usó para la producción de una masa madre optimizada para la producción de GABA. Los ensayos se llevaron a cabo a escala laboratorio y a escala piloto. En el estudio II se analizó el contenido de aminoácidos libres de los quesos artesanales con especial interés en conocer el perfil de GABA y ornitina como posibles compuestos bioactivos en los quesos y encontrar relación entre la capacidad de producción de la cepa aislada y el contenido de GABA presente en el queso. En el tercer estudio se obtuvo un pan elaborado con la masa madre rica en GABA que fue comparado con otros panes del mercado en cuanto contenido de aminoácidos, aminas biógenas y acrilamida como principales compuestos derivados del nitrógeno. Finalmente, se hizo una revisión del GABA como molécula bioactiva con gran interés aplicativo en la industria alimentaria. Estos resultados pueden contribuir a mejorar los beneficios para la salud de los panes enriquecidos en GABA y a tener en cuenta la cepa Lactobacillus brevis CECT 8183 como estárter para la producción de alimentos ricos en GABA. / The use of dough containing naturally occurring lactobacilli and yeasts produces bread with a notable improvement in nutritional and sensorial characteristics, including the aroma, taste and texture of both the crust and the crumb, and also increases the useful life of the bread. From this stems the project to obtain a new bread formulation using such a dough that is functionally active and contributes to providing a healthy foodstuff with beneficial properties. To this end we studied the possibility of substituting the sodium (Na) by potassium (K) in bread formulations and the inclusion of biologically active molecules with a scientifically demonstrated hypotensive effect. γ-Aminobutyric acid (GABA) is a non-protein amino acid with numerous physiological functions including playing a role in the regulation of blood pressure. Intake of food rich in GABA and a reduction in its salt content may help reduce blood pressure. Therefore, this project brings together two basic conditions for the production of a bread made using dough containing naturally occurring lactobacilli and yeasts which heightens the taste of the bread and furthermore offers the possibility that this dough also contains bioactive substances such as GABA and angiotensin-converting-enzyme (ACE) inhibitors. In the first study lactic acid bacteria were isolated from Spanish artisanal cheeses in order to obtain strains that produce large amounts of GABA. The strains were subjected to qualitative and quantitative tests to evaluate their capacity to synthesise GABA. After selection of the best strain, Lactobacillus brevis CECT 8183, it was used to produce a dough optimised for the production of GABA. In another study a bread was produced with the experimental dough, rich in GABA, and it was compared with other commercially available breads in terms of amino acid, biogenic amine and acrylamide contents as the main nitrogen-derived compounds. These results could contribute to improving the health benefits of breads enriched in GABA and to raising awareness of the strain Lactobacillus brevis CECT 8183 as a starter ingredient for the production of foodstuffs rich in GABA.

Objetivo: El principal objetivo de esta tesis fue estudiar la relación de los ácidos grasos y de las vitaminas liposolubles antioxidantes y carotenoides plasmáticos con la obesidad en la etapa gestacional y la adolescencia. Además, se planteó desarrollar un método analítico para analizar vitaminas y carotenoides en muestras de plasma. Metodología: Por una parte, se incluyeron 165 mujeres embarazadas (normopeso, sobrepeso y obesas) de 18 a 44 años de edad, y 162 recién nacidos. Se determinaron los ácidos grasos de los fosfolípidos plasmáticos (por cromatografía de gases) de las gestantes a las 24 y 34 semanas de gestación y en el parto, así como de los hijos al nacer. Por otra parte, se reclutaron 127 adolescentes con sobrepeso u obesidad, de 12 a 17 años de edad, los cuales fueron sometidos a un tratamiento integral de adelgazamiento. En éstos se analizaron las vitaminas A y E, β-caroteno y licopeno (por cromatografía líquida rápida de alta eficacia, UHPLC) y los ácidos grasos totales (por cromatografía de gases), tanto en condiciones basales como a los 2 y 6 meses de tratamiento. Asimismo, se estimó la actividad de algunas enzimas involucradas en el metabolismo de los ácidos grasos, empleando los siguientes índices: elongasa-6 de ácidos grasos=C18:0/C16:0, estearoil-coenzima A desaturasa-16=16:1n-7/16:0, estearoil-coenzima A desaturasa-18=C18:1n-9/C18:0, delta-5-desaturasa=C20:4n-6/C20:3n-6 y delta-6-desaturasa=C18:3n-6/C18:2n-6. Resultados: Las embarazadas obesas presentaron una menor proporción de los ácidos grasos C18:1 n-9, C17:0 y C18:3 n-3 que las gestantes con un estado nutricional normal, en los tres períodos de estudio. Los hijos de embarazadas obesas tuvieron una menor cantidad de C20:5 n-3 que el grupo control. La proporción de C14:0, C16:0, C18:0, C20:3 n-9, C22:5 n-3, C18:2 n-6 en plasma materno y el contenido plasmático de C20:2 n-6 y C22:5 n-3 de los hijos se relacionaron con los indicadores antropométricos de crecimiento fetal. Los recién nacidos macrosómicos presentaron una menor cantidad de C18:0 que los niños de peso normal. En los adolescentes, el aumento de las concentraciones de α-tocoferol, retinol y β-caroteno, ocurrido durante el tratamiento, se relacionó con la reducción de los indicadores antropométricos de adiposidad general, con una mayor pérdida de peso y con la mejora de los marcadores de riesgo cardiometabólico. El descenso plasmático de los ácidos C14:0 y C18:2 n-6, y el incremento del C18:1 n-9 y de la actividad enzimática estimada de estearoil-coenzima A desaturasa-18 también se asociaron con la reducción de los indicadores antropométricos de adiposidad general y con una mayor pérdida de peso. La disminución del C14:0 y de la actividad estimada de elongasa-6 de ácidos grasos y delta-6-desaturasa, y el aumento de delta-5-desaturasa se relacionaron con la mejora de los marcadores de riesgo cardiometabólico de los adolescentes. Conclusiones: se desarrolló y validó un método analítico rápido, preciso y sensible, con linealidad y exactitud óptimas, que permite, en sólo tres minutos, la determinación simultánea de α-tocoferol, retinol, β-caroteno y licopeno en plasma por cromatografía líquida rápida de alta eficacia. La obesidad materna se relacionó con la composición plasmática de ácidos grasos de las embarazadas y de sus hijos. Los ácidos grasos saturados y poliinsaturados de las madres, y los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga y el ácido esteárico de los hijos se relacionaron con el crecimiento fetal. Los cambios de la composición plasmática de ácidos grasos, de la actividad enzimática estimada y de las vitaminas liposolubles antioxidantes y carotenoides de los adolescentes se asociaron con el descenso de la adiposidad, con una mayor pérdida de peso y con la mejora del perfil cardiometabólico de los adolescentes. / Aim: The main objective of this thesis was to explore the relationships between fatty acids (FA) and antioxidant lipo-soluble vitamins and carotenoids plasma levels and the obesity during pregnancy and adolescence. Moreover, the improvement of the analytical methodology to analyze vitamins and carotenoids in plasma samples was addressed. Methods: Two different populations were studied. On the one hand, 165 pregnant women (obese, overweight and normal weight) and their newborns were included. FA of plasmatic phospholipids were determined in maternal plasma at 24 and 34 weeks of gestation and at delivery, as well as in cord blood by gas chromatography (GC). On the other hand, 127 adolescents (obese and overweight) involved in a weight-loss program were recruited. Samples of plasma were obtained during the intervention, at baseline, 2 and 6 months. Vitamins A and E, β-carotene and lycopene were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) and total plasmatic FA by GC. Moreover, the enzymatic activity of some enzymes involved in FA metabolism was estimated using the respective product:substrate ratio. Results: Obese pregnant women presented lower levels of C18:1 n-9, C17:0 and C18:3 n-3 than normal weight ones, and the newborns from obese women had lower levels of C20:5 n-3. Maternal plasmatic levels of C14:0, C16:0, C18:0, C20:3 n-9, C22:5 n-3, C18:2 n-6 and cord blood levels of C20:2 n-6 and C22:5 n-3 were related to anthropometric indicators of fetal growth. In adolescents, the observed increase of α-tocopherol, retinol and β-carotene during the treatment was related with the decrease in anthropometric indicators of adiposity, weight loss and with an improvement in the cardiometabolic risk markers. Additionally, plasmatic variations during treatment of C14:0, C18:2 n-6, C18:1 n-9 and some of the studied enzymatic activities were also related with anthropometric indicators of adiposity and cardiometabolic risk markers. Conclusions: A reliable, sensitive and low-time consuming method for the simultaneous determination of α-tocopherol, retinol, β-carotene and lycopene by UHPLC was developed. The maternal and umbilical cord plasma FA composition was associated with maternal obesity. Some maternal and cord blood FA were related to fetal growth. In obese adolescents, the changes in plasmatic FA and vitamins levels during the intervention were associated with weight loss and an improvement in adiposity and cardiometabolic profile.

El estudio de la relación entre la dieta o factores específicos de la dieta y el estado de salud requieren medidas exactas de la exposición dietética. Los análisis tradicionales de exposición alimentaria, como las encuestas dietéticas o los cuestionarios de frecuencia de consumo contienen una serie de errores sistemáticos, como la limitación en la lista de alimentos considerados o estimaciones erróneas en el tamaño y la frecuencia de la ingesta, que han provocado una cierta inconsistencia en el verdadero papel de la alimentación sobre la salud humana. Como resultado de este hecho, existe un intenso esfuerzo por parte de la comunidad científica hacia la identificación de biomarcadores nutricionales. El objetivo principal de esta tesis ha sido el estudio de los biomarcadores de consumo de vino tinto, incluyendo principalmente aquellos metabolitos originados por la acción de la microbiota intestinal, mediante la generación de la base de datos Phenol-Explorer y su aplicación en estudios clínicos con vino tinto. Para ello se ha desarrollado la primera base de datos que considera el metabolismo de los compuestos fenólicos, concretándose en la generación del módulo de metabolismo de la base de datos Phenol-Explorer y se ha aplicado al estudio del metabolismo del vino. El conocimiento generado de este trabajo se aplicó a un estudio clínico y a un subestudio de similares características, ambos aleatorizados, cruzados y controlados de intervención con vino tinto, vino tinto desalcoholizado y ginebra como control para la identificación de biomarcadores. Se describió el más amplio perfil metabólico de metabolitos urinarios fenólicos mayoritariamente aquellos originados por la microbiota intestinal (n=61) mediante UPLCMS/ MS tras el consumo de vino tinto desalcoholizado observando un aumento de metabolitos (n=49) respecto al momento basal, principalmente aquellos originados por el metabolismo microbiano de los antocianos y los flavan-3-oles. Cuando se comparó la ingesta de vino alcoholizado y desalcoholizado no se observaron diferencias de excreción de metabolitos entre los dos vinos, por lo que se evaluó la capacidad discriminatoria de dichos metabolitos como biomarcadores de su consumo. A través de una regresión logística se estableció un modelo que incluía derivados del ácido gálico y el etilgalato. Tras su evaluación, estos resultaron ser buenos predictores del consumo de vino tanto para plasma como para orina. Estos resultados demuestran que la combinación de diversos biomarcadores procedentes del consumo de vino mejora su capacidad discriminatoria y predictiva respecto a la consideración de biomarcadores individuales. La comparación entre ambas matrices estableció que la orina 24 horas proporciona un mayor poder discriminatorio entre consumidores o no consumidores de vino respecto a la de plasma, sin embargo, existe una correlación entre los grupos de metabolitos y el modelo generado. En el subestudio realizado con 10 participantes donde también se recogieron muestras de heces, el análisis de la flora fecal tras el consumo de vino permitió establecer el efecto prebiótico de los polifenoles del vino sobre la microbiota intestinal, aumentando significativamente Enterococcus, Bifidobacterium y Eggerthella lenta tras el consumo de polifenoles, independientemente de la presencia de alcohol. De manera adicional se observaron mejoras de parámetros bioquímicos como el colesterol o la proteína-C reactiva correlacionados con cambios en los géneros Bifidobacterium y Bacteroides. Finalmente, los cambios bacterianos se asociaron con los cambios en la excreción de metabolitos fenólicos observándose que los aumentos de las bifidobacterias se correlacionaban con aumentos de metabolitos microbianos como el siríngico y 4-hidroxibenzoico derivados de los antocianos del vino, y la existencia de una correlación inversa para el Enterococcus y la Eggerthella lenta, con el 3(4-hidroxi)fenilacético y los ácidos hidroxicinámicos respectivamente. / The study on the relationship between diet and health status require accurate measurements of dietary exposure. Traditional analysis of dietary exposure might lead to bias in the estimation of the role of food on human health. Therefore, there is an intense effort by the scientific community on the identification of biomarkers. The principal objective of the Thesis has been to contribute to the identification and evaluation of biomarkers of red wine consumption, focusing on the intestinal microbiota metabolites. To this purpose the Phenol-Explorer database metabolism module was developed and applied to study wine metabolism. The knowledge generated in this work was applied to a clinical study and a substudy of similar characteristics, both randomized, crossed and controlled intervention with red wine, dealcoholized red wine and gin as a control for biomarkers identification. Therefore, it has been described the broadest phenolic metabolic profile, mainly representing metabolites originated by microbiota (n=61), by UPLC-MS/MS in urine after consumption of dealcoholized red wine. Most of increased metabolites from baseline (n=49) were of anthocyanins and flavanols microbial metabolism origin. When comparing the intake of red wine and dealcoholized red wine no differences in metabolite excretion were observed, so both wines were used to evaluate the discriminatory power of these metabolites as biomarkers of wine intake. Through a logistic regression, a model including derivatives of gallic acid and ethylgallate was established. This model was found to be better predictor of wine consumption in plasma and urine than individual metabolites. These results demonstrated that the combination of different biomarkers could improve the discriminatory and predictive ability regarding the consideration of individual biomarkers. In the substudy conducted with 10 participants, fecal samples were also collected. Their analysis on microbiota content allowed establishing the prebiotic effect of polyphenols, where significant increases of Enterococcus, Bifidobacterium and Eggerthella lenta after both wines were detected and correlated to improvements in biochemical parameters such as cholesterol or C-reactive protein. Finally, bacterial changes were associated with changes in the excretion of phenolic metabolites, as bifidobacterias, which increase was correlated with anthocyanins derived microbial metabolites.

Actualment, s’estan invertint molts esforços en la detecció de components bioactius, com ara els polifenols, en fruites i hortalisses pel seu possible paper en la prevenció i el tractament de malalties cròniques. La quantitat de polifenols ingerits en la dieta és d’aproximadament 1 g/dia, quantitat més gran que la que prové de qualsevol altre antioxidant de la dieta. De fet, és aproximadament 10 vegades superior a la de vitamina C i 100 vegades superior a la de vitamina E i a la ingesta de carotens. D’altra banda, algunes dades epidemiològiques han mostrat una associació inversa entre el risc de mortalitat total o malalties cardiovasculars i el consum d’aliments rics en polifenols, com ara les fruites i hortalisses, el te, l’oli d’oliva verge i el vi. El tomàquet és l’hortalissa més consumida a Espanya (14.5 kg/any per persona) amb una important repercussió econòmica. En els últims 5 anys, el consum del tomàquet ha crescut un 2.8% anual. En l’àmbit de la fruita/hortalissa transformada, el tomàquet també ocupa el primer lloc en consum amb una ingesta de tomàquet fregit envasat de 4.1 kg/any per persona i de tomàquet natural envasat de 3 kg/any per persona. Els tomàquets espanyols destaquen pel seu elevat contingut en flavonoides, encara que no hi ha gaires estudis que s’hagin centrat en com afecta el processat i l’elaboració industrial de les salses als polifenols, així com tampoc l’evolució d’aquests compostos durant la vida útil d’aquests productes. El tomàquet i els seus derivats contenen altres fitoquímics valuosos com ara els carotens. El trans-licopè és el carotè més important dels tomàquets i el millor amortidor d’oxigen atòmic (captador de radicals lliures). A més del trans-licopè, els tomàquets també contenen altres carotens com els cis-isòmers del licopè i també α-, beta-carotè i luteïna. La importància dels isòmers cis recau en la seva elevada biodisponibilitat en l’organisme humà, per la qual cosa són necessaris mètodes per a la identificació d’aquests carotens. Alguns estudis han investigat l’efecte del tractament tèrmic en els carotens de salses de tomàquet, i s’hi ha observat un increment d’isòmers cis durant el processat. No obstant això, no hi ha estudis que valorin la influència de l’origen, el processat i l’emmagatzematge de tomàquets, salses, quètxups, gaspatxos i sucs de tomàquet quant als polifenols. / Currently many efforts are being invested in the detection of bioactive components of nutrients in fruits and vegetables, such as polyphenols, and their possible role in the prevention and treatment of chronic diseases. Total dietary polyphenol levels are approximately 1 g/day, a much larger amount than any other antioxidant that comes from the diet. In fact, it is about 10 times the dietary vitamin C and 100 times higher than vitamin E and carotene intake. Moreover, some epidemiological data have shown an inverse association between the risk of mortality or cardiovascular disease and consumption of foods rich in polyphenols, such as fruits and vegetables, tea, olive oil and wine. The tomato is the most consumed vegetable in Spain (14.5 kg/year per person) and makes a significant economic impact. In the last 5 years, the consumption of tomatoes has grown by 2.8% annually. In the field of fruit/vegetables, tomatoes also rank first with the consumption of fried tomatoes at an intake of 4.1 kg/year and that of raw tomatoes at 3 kg/year per person. Spanish tomatoes are known for their high content of flavonoids, although there is a lack of studies focused on how the industrial processing of sauces affects the content of polyphenols, and also the evolution of these compounds during their shelf life. The tomato and its derivatives contain other valuable phytochemicals such as carotenoids. trans-Lycopene is the most important carotene of tomato and it is an excellent free-radical scavenger; its capacity is more than twice that of beta-carotene. In addition to trans-lycopene, tomatoes also contain other carotenoids such as cis-isomers of lycopene and α- and beta-carotene and lutein. The importance of cis-isomers lies in their high bioavailability in the human body. Therefore, methods are needed to identify these carotenoids. Some studies have studied the effect of heat treatment on carotenoids in tomato sauces, and an increase has been observed during processing. However, no studies have been focused on evaluating the influence of the origin, processing and storage of tomatoes, sauces, ketchups, tomato juices and gazpachos on the level of polyphenols.

L'oleat d'estrona administrada oralment produeix una reducció del pes corporal deguda principalment a la pèrdua de massa grassa de l'organisme. En aquest treball ens hem centrat en estudiar els efectes del tractament a curt termini amb oleat d'estrona per tal de conèixer quins mecanismes d'acció estan implicats en els seus efectes reductors del pes corporal. Es van iniciar els estudis amb models in vitro, però la presència d'una espècie enzimàtica amb forta activitat sobre la molècula de treball impedeix continuar la línia de treball. Els models in vivo van permetre afirmar que l'oleat d'estrona duu a terme els seus efectes sobre el pes corporal i el metabolisme per vies diferents de les activades com a conseqüència d'una restricció energètica de la ingesta. D'altra banda es va determinar que l'efecte més primerenc del tractament a curt termini amb oleat d'estrona era la reducció dels nivells de colesterol plasmàtic a patir de les 6 hores de l'administració de la primera dosi oral. Aquesta davallada es deguda bàsicament a un increment del recanvi de colesterol esterificat, conseqüència d'un transport lipoproteic accelerat.El teixit adipós blanc experimenta una reducció del nombre cel·lular degut, en part, a un increment de la via apoptòtica en resposta al tractament, que varia la seva via d'activació en funció de la localització adiposa. Finalment es van realitzar estudis d'expressió gènica en teixit adipós mitjançant la tècnica del arrays de DNA. L'anàlisi de les dades obtingudes indicava diferències significatives pel que fa l'expressió de diversos factors implicats en l'extracció d'àcids grassos de les lipoproteïnes (reducció de l'expressió de LPL), en el transport d'àcids grassos (reducció de FABP4 i FATP1), en generar àcids grassos de nova síntesi (reducció de l'ACC i FAS) i en la mobilització de reserves lipídiques i oxidació dels àcids grassos (reducció expressió d'HSL i CPT1b), estant el procés global controlat per factors reguladors com TNFα. / Oral oleoyl estrone treatment induces body weight loss mainly due to fat pad waste. In this work, we focused on the study of short term effects of oleoyl estrone in order to elucidate the main mechanisms involving their weight reduction effects.Initially, in vitro models were used, but the presence of an enzymatic activity affecting our study molecule made it difficult to follow this particular path.In vivo models allowed us to determine that oleoyl estrone directly affects body weight by other ways rather than those used by food restriction.Moreover, it was observed that a decrease on plasmatic cholesterol levels was the first metabolic effect detected on treated animals, just from the very 6 hours after the initial oral dose. Decrease on cholesterol levels could be explained by an increased cholesteryl-ester turnover, essentially as a consequence of accelerated lipoprotein handling.Furthermore, adipose tissue reduces their cellular number on treated animals, in part, by the activation of apoptotic mechanisms through different pathways depending on the adipose pad location.Finally, we studied gene expression in adipose tissue by DNA arrays. The analysis of the results showed significant statistical differences on the expression rates of some genes related to the extraction of fatty acids from lipoproteins (reduced expression of LPL), fatty acid transport (reduction FATP1, FABP4), on generating new synthesized fatty acids (reduced FAS and ACC) and the mobilization of lipidic stores and fatty acid oxidation (reduced HSL and CPT1b), being all the process controlled by some regulatory factors (TNFα).

La consulta íntegra de la tesi, inclosos els articles no comunicats públicament per drets d'autor, es pot realitzar prèvia petició a l'Arxiu de la UPC / Vegetables and fruits are foods that have large number of compounds beneficial to health, as well as being essential in the diet. Its components include the phenolic substances. These compounds have a great antiradical activity and can be used to increase the stability of food, since they possess the ability to avoid the lipid peroxidation and can protect even against oxidation caused by metal cations. These cations favor the creation of reactive oxygen species, harmful to health and can participate directly or indirectly in the oxidation of lipids. The food industry produces large amounts of by-products and waste, which can be used for substances with high added value, such as natural antioxidants to replace the synthetic ones. In addition, this type of waste has a significant environmental impact due to high organic load and costs due to handling, transport and storage, among other processes. The present Doctoral thesis has obtained extracts rich in polyphenols, from three agro-industrial waste, natural: leaves of Borage, avocado seed and pericarp of pineapple. The conventional extraction by batch or continuous, has been applied to obtain polyphenols from these wastes. The conventional process has been optimized through the use of response surface methodology and equations of mass transfer: Fick law, theory of film, empirical, Peleg and speed law have been studied to establish a representative mathematical model. The diffusion coefficients were determined with the Fick law equation. Also have been applied new techniques, such as magnetic pulses and extraction assisted by ultrasound, to improve or accelerate the process of extraction, which has provided a 280% increase in the quantity of bioactive components obtained seed from avocado applying extraction assisted with ultrasound and a 520% of the leaves of Borage with extraction using magnetic pulses. In the kinetics of extraction, the studied equations had a adjustment, R2, between 0.99 and a 0.81. The extracts obtained have been evaluated in different models of food: emulsions, mincemeat and cupcakes, to determine if they increase the stability and prevent or retard the oxidation of fats and oils. There has been a decrease in the formation of oxidation products, both primary and secondary : from 80 to 90% (hydroperoxides) in emulsions, up to a 90% in products of secondary oxidation in the minced meat with extracts of Borage and avocado seed; and between 50 and 90% in the muffins with pineapple extract. Therefore it is shown that has been prolonged useful life time and increased stability against oxidation. Conclusion, in the study, was demonstrated that the use of by-products from agroindustry was useful to prepare natural extracts with antioxidants. These wastes represent a cost for industry and can be used to obtain compounds with high added value. Also, They slow down the oxidation of fats in different models of food. The by-products of the production industry of Borage (leaves), avocado (seeds) and pineapple (epicarp) contain large amounts of polyphenols and show a remarkable antioxidant capacity. In addition, these wastes may be material for the production of polyphenols such as acid rosmarinic and chlorogenic employing technologies appropriate for its refining. / Los vegetales y frutas son alimentos que poseen gran cantidad de compuestos beneficiosos para la salud, además de ser imprescindibles en la dieta. Entre sus componentes se encuentran las sustancias fenólicas. Estos compuestos poseen una gran actividad antiradicalaria y pueden ser utilizados para incrementar la estabilidad de los alimentos, ya que poseen la capacidad de evitar la peroxidación de los lípidos y pueden proteger incluso frente a la oxidación causada por cationes metálicos. Estos cationes favorecen la creación de especies reactivas de oxígeno, perjudiciales para la salud y pueden participar directa o indirectamente en la oxidación de los lípidos. La industria de los alimentos produce gran cantidad de subproductos y desperdicios, que se pueden utilizar para obtener sustancias de alto valor añadido, como antioxidantes naturales y sustitutos de los sintéticos. Además, este tipo de residuo posee un gran impacto ambiental debido a la gran carga orgánica y tiene un coste debido a manipulación, transporte y almacenamiento, entre otros procesos. En la presente Tesis Doctoral se ha estudiado la obtención de extractos naturales, ricos en polifenoles, a partir de tres desperdicios agroindustriales: Hojas de borraja, semilla de aguacate y epicarpio de piña. Se ha aplicado la extracción convencional, por lotes y en continuo, para obtener polifenoles a partir de estos residuos. Se han optimizado los procesos convencionales mediante el uso de la metodología de superficie de respuesta y se han aplicado las ecuaciones de transferencia de masa: Ley de Fick, teoría del film, empírica, Peleg y ley de velocidad, para obtener un modelo matemático representativo. La ecuación de la ley de Fick se ha usado para conseguir los coeficientes de difusión en las extracciones. Además se han aplicado técnicas novedosas, tales como, pulsos electromagnéticos y extracción asistida por ultrasonidos, para así mejorar y/o acelerar el proceso de extracción, lo que ha proporcionado un incremento de un 280% en la cantidad de componentes bioactivos obtenidos de la semilla de aguacate aplicando extracción asistida con ultrasonidos y un 520% de las hojas de borraja con la extracción mediante el uso de pulsos electromagnéticos. Con respecto a la cinética de extracción, el ajuste R2 de las ecuaciones estudiadas está entre un 0.81 y 0.99. Se han evaluado los extractos obtenidos en diferentes modelos de alimentos: emulsiones, carne picada y magdalenas, para determinar si aumentan la estabilidad y evitan o retardan la oxidación de las grasas y aceites. Se ha observado una disminución en la formación de los productos de la oxidación, tanto primaria como secundaria: entre un 80 y un 90% (hidroperóxidos) en las emulsiones, en un 90% los productos de oxidación secundaria en la carne picada con extractos de borraja y aguacate; y entre un 50 y un 90% en las madalenas con extracto de piña. Por lo tanto queda demostrado que se ha prolongado el tiempo de vida útil y ha aumentado la estabilidad frente a la oxidación. Como conclusión global, se ha demostrado que el uso de subproductos de la agroindustria es muy útil para la elaboración de extractos naturales que incorporan antioxidantes y es una materia prima importante que pasa de ser un residuo por el que se ha de pagar a ser un producto que permite obtener compuestos de alto valor añadido. Ralentizan la oxidación de las grasas en diversos modelos de alimentos. Los subproductos de la industria de la producción de borraja (hojas), aguacate (semillas) y piña (epicarpio) contienen gran cantidad de polifenoles y muestran una remarcable capacidad antioxidante. Además, estos desperdicios pueden ser material para la producción de polifenoles tales como el ácido rosmarínico y clorogénico empleando las tecnologías adecuadas para su refinación.

Tesi realitzada a l'Institut Hospital del Mar d'Investigacions Mèdiques (IMIM) / Cardiovascular diseases (CVD) are the principal cause of mortality worldwide. Lifestyle plays a crucial role in preventing the development of CVD, and one of its key elements is diet, which directly affects cardiometabolic health and cardiovascular risk. Given the complexity of diet and also of cardiovascular disease etiology, a lot of recent research into the association between diet and disease have focused on dietary patterns, as this is currently the most holistic way to study dietary habits in the population. In this work, we examined dietary patterns and their components that are associated with cardiometabolic health. Data were obtained from two population-based cross-sectional surveys conducted in Girona (Spain) in 2000 and 2005. The first survey included 3,058 randomly selected free-living men and women aged 25 to 74 years. The second survey included 6,352 men and women aged 35 to 80 years. These cohorts were re-examined in 2010 and 2012, with a follow up rate of 80.6% and 78.0%, respectively. At baseline and follow-up, we collected data on diet, using a validated food frequency questionnaire (FFQ), and on cardiovascular risk. We performed validation studies of a priori and a posteriori dietary patterns. In the a priori analysis, we found that a Diet Quality Index derived from a short Diet Quality Screener had good ability to predict future cardiovascular health complications. The a posteriori analysis showed good reproducibility and modest validity of dietary patterns defined using cluster analysis of the FFQ data. In a further step, we analysed the impact of energy under-reporting on dietary patterns and secular trends in dietary patterns. We concluded that energy under-reporting is a serious problem in nutritional epidemiology, especially when developing dietary guidelines for the general population, and more solid research is urgently needed in this area. To explore the association between diet and cardiovascular risk factors and CVD, we focused on abdominal obesity, a risk factor that had received increasing interest in recent years. Adherence to the Mediterranean diet and substitution of soft drinks with other caloric beverages, such as milk and juice, was associated with decreased abdominal adiposity. Finally, we studied the association between dairy products and cardiovascular events, and concluded that consumption of dairy products does not have an adverse impact on CVD incidence, and that frequent intake of yogurt was negatively associated with CVD incidence, presumably due to its prebiotic properties. In conclusion, this PhD research shows a smaller increase in waist circumference among individuals with high adherence to the Mediterranean diet, and the opposite for soft drink consumption. Furthermore, the results support the hypothesis that yogurt consumption is cardioprotective. Finally, it underlines the need to control for energy misreporting in epidemiological studies, and to validate dietary patterns. / En este trabajo, hemos examinado qué patrones dietéticos y cuáles de sus componentes están asociados con la salud cardiometabólica. Los datos se han obtenido a partir de dos estudios transversales de base poblacional realizados en España en 2000 y 2005. El primer estudio incluyó 3.058 y el segundo - 6.352 hombres y mujeres de 25 a 80 años de edad. Estas dos cohortes fueron re-examinadas en el año 2010 y 2012. Al inicio y al final del estudio se recogieron los datos dietéticos y los datos sobre los factores de riesgo cardiovascular. En el análisis a priori, encontramos que el Índice de Calidad Alimentaria derivado de un Cuestionario corto de Calidad de la Dieta tenía buena capacidad para predecir acontecimientos relacionados con la salud cardiovascular. El análisis a posteriori mostró una buena reproducibilidad y una validez modesta de los patrones dietéticos definidos mediante análisis de clústers de los datos de un cuestionario de frecuencia de alimentos. En el análisis del impacto de la declaración inferior de los niveles reales de energía consumida sobre los patrones dietéticos y las tendencias seculares en los mismos, llegamos a la conclusión de que la energía declarada por debajo de valores reales es un problema grave en la epidemiología nutricional, sobre todo en el desarrollo de guías alimentarias para la población en general. El seguimiento de una dieta mediterránea y la substitución de las bebidas gaseosas por otras bebidas calóricas, se asoció con una disminución de la adiposidad abdominal, un factor de riesgo de enfermedades cardiovasculares (ECV). Por último, llegamos a la conclusión de que el consumo frecuente de yogur se asoció negativamente con la incidencia de ECV. En conclusión, esta investigación doctoral muestra un menor aumento de la circunferencia de la cintura entre los individuos que siguen una dieta mediterránea, y lo contrario para el consumo de bebidas gaseosas. Además, los resultados apoyan la hipótesis de que el consumo de yogur actúa como cardioprotector. Por último, subraya la necesidad de controlar la declaración errónea del consumo de energía en los estudios epidemiológicos, y de validar los patrones dietéticos.

Encara que els gens de resistència a antibiòtics són una eina important per a la selecció i manteniment de plàsmids recombinants, les autoritats reguladores consideren el seu ús inacceptable en diverses àrees dins la indústria biotecnològica, sobretot quan el producte serà utilitzat amb finalitat terapèutica. Un sistema d’expressió basat en el vector pQE (Quiagen) amb un marcador de selecció plasmídic alternatiu (basat en l’auxotròfia de glicina) va ser desenvolupat prèviament (Vidal et al., 2008). El sistema d’expressió pQE es basa en el promotor T5, induïble per IPTG. La no-­‐ estabilitat del promotor en absència d’inductor pot provocar una inestabilitat estructural del vector, que portarà a nivells baixos d’expressió deguts, per exemple, a fenòmens de recombinació a la regió del promotor T5. El repressor lac, codificat pel gen lacI, s’uneix molt fortament al promotor, interferint en la transcripció del gen d’interès. Així doncs, els nivells transcripcionals del gen lacI tenen un paper crític en els sistemes d’expressió basats en el promotor T5, influenciant els nivells basals de transcripció i la concentració d’inductor. Encara que la sobreexpressió de la proteïna d’interès és un factor important en quant a càrrega metabòlica, també cal tenir en compte la contribució deguda a l’expressió d’altres gens plasmídics. En aquest sentit, per tal de millorar la robustesa del sistema i minimitzar la càrrega metabòlica relacionada amb els gens codificats als plàsmids, s’han eliminat tots els gens de resistència a antibiòtics i s’han afinat els nivells d’expressió del marcador auxotròfic (glyA) i del repressor lac (lacI). En aquest treball s’han construït uns cassettes d’expressió on els gens lacI i glyA estan sota el control d’un seguit de promotors constituents sintètics, per tal d’obtenir suficient inhibidor lacI per evitar la “no-­‐estabilitat del promotor” i assegurar el nivell mínim de transcripció de glyA necessaris tant per al manteniment del plàsmid com per al correcte creixement del cultiu en medi definit. A més, el gen de resistència a antibiòtic en el vector d’expressió va ser reemplaçat per la construcció glyA-­‐lacI, obtenint un sistema totalment lliure de gens per a la resistència a antibiòtic. Finalment, s’ha estudiat la capacitat per a la sobreexpressió de FucA recombinant a diferents escales (flascons agitats i bioreactor) i en diversos modes d’operació (discontinu i discontinu alimentat) per tal d’obtenir alts nivells d’expressió. Per últim, per tal d’analitzar la població bacteriana a nivell de cèl·∙lules individuals, els canvis morfològics (FSC i SSC) i les característiques físiques i bioquímiques de les diferents cèl·∙lules dins la població bacteriana, s’han realitzat anàlisis de citometria de flux. / While antibiotic resistance marker genes are a powerful system for selection and maintenance of recombinant plasmids in hosts such as E. coli, its use has been considered unacceptable in many areas of biotechnology by regulatory authorities, particularly when the recombinant product will be used in the therapeutic field. Previously, we have developed an expression system based on the pQE vector series (Qiagen) with an alternative plasmid selection marker based on glycine auxotrophy complementation (Vidal et al., 2008). The pQE expression system is based on the IPTG-­‐induced T5 promoter. Promoter leakiness in inducer absence may lead to structural instability of the expression vector, resulting in reduced expression levels, e.g. due to recombination events in the T5 promoter region. The lac repressor, encoded by the lacI gene, binds very tightly to the promoter, interfering with the transcription of the gene of interest. Therefore, lacI transcriptional level plays a key role in T5 promoter-­‐based expression systems, influencing the basal transcriptional levels and the concentration of inducer. Furthermore, although the overexpression of the plasmid-­‐encoded protein of interest is a major factor in the metabolic burden, expression of other plasmid-­‐genes may also contribute. Thus, in order to improve the system robustness, all the antibiotic resistance genes have been removed and the expression levels of the auxotrophic marker (glyA) and the lac repressor (lacI) genes have been fine-­‐tuned, in order to minimize the metabolic burden related to plasmid-­‐encoded genes. In this study, an expression cassette has been constructed where the lacI and glyA genes have been placed under the control of selected synthetic constitutive promoters in order to obtain the sufficient lacI inhibitor ensuring lack of “promoter leakiness” and the minimal glyA transcriptional levels needed for plasmid maintenance and optimal cell growth in defined media. Moreover, in the expression vector the antibiotic resistance gene was replaced by the lacI-­‐glyA cassette, thus yielding a completely antibiotic resistance gene free system. Finally, in order to obtain high expression levels of the protein of interest, the capacity for recombinant FucA overexpression has been investigated at different scales (shake flasks and bioreactors) and operation modes, batch and fed-­‐batch. Lastly, flow cytometry analyses were performed in order to analyze the bacterial populations at the single-­‐cell level: changes in morphology (FSC and SSC) and physical and biochemical characteristics of individual cells within a bacterial population.