Thesis (MSc Food Sc)--Stellenbosch University, 2011. / ENGLISH ABSTRACT: Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that has been isolated from a variety of food sources. It is the cause of the food-borne disease, listeriosis that shows symptoms such as meningitis, encephalitis and abortion. Different strains of L. monocytogenes exist and not all are thought to be pathogenic to humans. The aim of this study was to evaluate and compare conventional methods, culturing on selective (Oxford agar) and chromogenic (RAPID’L.mono agar) media, as well as speciesspecific and multiplex polymerase chain reaction (PCR) methods for the detection and identification of 94 L. monocytogenes isolates from various areas in an avocado processing facility, as well as the final product. To achieve a better understanding of the genetic diversity of the confirmed L. monocytogenes strains isolated from the avocado facility, two subtyping techniques, PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), were employed. All of the isolates were identified as Listeria species on both Oxford and RAPID’L.mono agar. On the RAPID’L.mono agar, 76 of the 94 isolates produced colonies typical of L. monocytogenes, with the remaining 18 showing colonies typical of L. innocua (n=13) and L. ivanovii (n=5). The species-specific PCR successfully amplified a 730 base pairs region of the hly gene of 80 of the 94 isolates. For the same 80 isolates the multiplex PCR successfully amplified 800, 517 and 238 base pair (bp) fragments of the inlA, inlC and inlJ genes, respectively. The remaining 14 isolates included the 13 isolates identified as L. innocua, as well as an isolate identified as L. monocytogenes on RAPID’L.mono. The results obtained on the Oxford agar showed a 100 % positive correlation when compared to the PCR results in identifying Listeria species, while the RAPID’L.mono had a 4 % false negative result in identifying L. monocytogenes compared to the PCR results. Sixty-four of the confirmed L. monocytogenes isolates were subtyped using PCRRFLP and PFGE. For the PCR-RFLP analysis, a 733 bp fragment of the inlA gene was successfully amplified for all of the isolates, followed by digestion with the restriction enzymes, AluI and Tsp509I. AluI produced three different banding patterns and Tsp509I produced two different banding patterns. Subtyping of the isolates using PFGE was carried out by macrorestriction of the genomic DNA with ApaI and AscI. The restriction fragments were resolved by PFGE and the fingerprints were classified into four clusters. In the combined analyses, cluster I contained forty-eight isolates (n=48), cluster II 1 isolate (n=1), cluster III fifteen isolates (n=15) and cluster IV 1 isolate (n=1). The PCR-RFLP results had a 98 % correlation with the PFGE results. The results of this study indicated inconsistencies between the results obtained by conventional and molecular detection methods for the identification of L. monocytogenes. Species-specific and multiplex PCR, however, proved useful to accurately detect and identify L. monocytogenes in a shorter period of time and could replace the use of conventional agar during identification. Both PCR-RFLP and PFGE proved useful in the subtyping of L. monocytogenes isolates with the PCR-RFLP being less expensive and results obtainable in a shorter period of time. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Listeria monocytogenes is ‘n patogeen afkomstig van voedsel wat uit ‘n verskeidenheid voedselbronne geisoleer kan word. Dit is die oorsaak van die voedsel afkomstigde siekte, listeriosis met simptome soos harsingvliesontsteking, ensefalitis en aborsie. ‘n Verskeidenheid L. monocytogenes stamme bestaan, maar nie almal word as patogenies beskou nie. Die doel van hierdie studie was om konvensionele metodes, naamlik mikrobiologiese kweking op selektiewe (Oxford agar) en chromatografiese (RAPID’L.mono agar) media, sowel as spesies-spesifieke en multipleks polimerase ketting reaksie (PKR) metodes te evalueer en vergelyk vir die deteksie en identifikasie van 94 L. monocytogenes isolate geisoleer vanuit verskeie areas in ‘n avokado prosesseringsfasiliteit sowel as die finale produk. Om ‘n beter begrip van die genetiese diversiteit van die isolate wat as L. monocytogenes bevestig is te verkry, is twee subtiperingstegnieke, PKR-restriksiefragmentlengte polimorfisme (PKR-RFLP) en pulsveld jel-elektroforese (PVJE) toegepas. Beide Oxford en RAPID’L.mono agar het al die isolate as Listeria spesies geidentifiseer. Op die RAPID’L.mono agar het 76 van die 94 isolate kolonies tipies van L. monocytogenes gevorm, 13 kolonies was tipies van L. innocua (n=13) en vyf kolonies tipies van L. ivanovii (n=5). Die spesies-spesifieke PKR het ‘n 730 basis paar (bp) streek van die hly geen suksesvol geamplifiseer vir 80 van die 94 isolate. Die multipleks PKR het 800, 517 en 238 bp fragmente van die inlA, inlC and inlJ gene onderskeidelik, vir dieselfde 80 isolate suksesvol geamplifiseer. Die oorblywende 14 isolate het die 13 isolate wat as L. innocua geïdentifiseer is en die een isolaat wat as L. monocytogenes op RAPID’L.mono geïdentifiseer is ingesluit. Resultate verkry met die Oxford agar het 100 % ooreengestem met die PKR resultate vir die identifikasie van Listeria spesies. Die RAPID’L.mono het ‘n 4 % vals negatiewe resultaat gelewer in vergelyking met die PKR resultate. Vier-en-sestig van die bevestigde L. monocytogenes isolate is gesubtipeer deur PKR-RFLP en PVJE. Tydens die PKR-RFLP analise is ‘n 733 bp fragment van die inlA geen suksesvol geamplifiseer, gevolg deur vertering met die restriksie-ensieme, AluI and Tsp509I. AluI het drie verskillende bandpatrone opgelewer en Tsp509I twee verskillende bandpatrone. Subtipering deur PVJE is uitgevoer deur makro-restriksie van die genomiese DNA met ApaI en AscI. Die restriksie fragmente is geskei deur PVJE en die vingerafdrukke is in vier groepe geklassifiseer. Groep I het 48 isolate (n=48), groep II 1 isolaat (n=1), groep III 15 isolate (n=15) en groep IV 1 isolaat (n=1) gehad tydens die gekombineerde analise. Die PKR-RFLP resultate het 98 % ooreengestem met die van die PVJE. Die resultate van hierdie studie het teenstrydighede tussen die resultate van konvensionele en molekulêre deteksie metodes opgelewer vir die identifikasie van L. monocytogenes. Die spesies-spesifieke en multipleks PKR het egter beide goed te pas gekom vir die akkurate deteksie en identifikasie van L. monocytogenes en kan heel moontlik die gebruik van konvensionele agar tydens identifikasie vervang. Beide PKRRFLP en PVJE was nuttig vir die subtipering van L. monocytogenes isolate. PKR-RFLP is egter ‘n goedkoper tegniek en die resultate is in ‘n korter tydsperiode beskikbaar.

Submitted by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-01-23T14:01:54Z No. of bitstreams: 5 22.pdf: 6729647 bytes, checksum: f44366fe5c167abbf5a70d5f3a327722 (MD5) license_url: 52 bytes, checksum: 3d480ae6c91e310daba2020f8787d6f9 (MD5) license_text: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) license.txt: 2109 bytes, checksum: aa477231e840f304454a16eb85a9235f (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2015-02-10T12:46:43Z (GMT) No. of bitstreams: 5 22.pdf: 6729647 bytes, checksum: f44366fe5c167abbf5a70d5f3a327722 (MD5) license_url: 52 bytes, checksum: 3d480ae6c91e310daba2020f8787d6f9 (MD5) license_text: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) license.txt: 2109 bytes, checksum: aa477231e840f304454a16eb85a9235f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-10T12:46:43Z (GMT). No. of bitstreams: 5 22.pdf: 6729647 bytes, checksum: f44366fe5c167abbf5a70d5f3a327722 (MD5) license_url: 52 bytes, checksum: 3d480ae6c91e310daba2020f8787d6f9 (MD5) license_text: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) license.txt: 2109 bytes, checksum: aa477231e840f304454a16eb85a9235f (MD5) Previous issue date: 2013 / O crescimento da popula??o mundial ocasiona alta na demanda por alimentos. O processo produtivo gera importante montante de res?duos que funcionam como fontes poluidoras de ?gua, solo e ar. Anualmente s?o usados no mundo aproximadamente 2,5 milh?es de toneladas de agrot?xicos. Dentre estes se encontra o clomazone, do grupo das isoxazolidinonas, um inibidor da s?ntese de caroten?ides e altamente lixivi?vel. De acordo com a problem?tica apresentada objetivou-se com este trabalho verificar a toler?ncia, por meio de avalia??es de crescimento, intoxica??o, an?lises anat?micas e de diversidade microbiana do solo, assim como a capacidade remediadora de doze esp?cies florestais nativas. Para montagem do experimento foi utilizado o delineamento em blocos ao acaso com quatro repeti??es. Foram feitas 3 aplica??es do herbicida clomazone com intervalos de 20 dias (aos 60, 80 e 100 dias ap?s o plantio), cada aplica??o foi correspondente ? metade da dose comercial de 2 L ha-1. Para as avalia??es de crescimento foram mensuradas a altura da planta, o di?metro do caule, o n?mero de folhas, a ?rea foliar e o ac?mulo de biomassa seca. Para as verifica??es anat?micas foram coletadas 2 folhas de cada planta sempre aos 7 dias ap?s a aplica??o do herbicida, nas duas primeiras aplica??es. Por meio de avalia??es micromorfom?tricas foram medidas na sec??o transversal das folhas das esp?cies florestais, a espessura e a ?rea ocupada pelos tecidos: epiderme adaxial e abaxial, par?nquima pali??dico e par?nquima lacunoso. Para estimativa de intoxica??o pelas plantas testadas, avaliou-se o efeito do produto por meio de notas de toxicidade. Para verifica??o de capacidade fitorremediadora das esp?cies arb?reas procedeu-se a semeadura da esp?cie indicadora sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench.) para indicativo do res?duo do herbicida no solo. Posteriormente em amostras de solo provenientes do experimento procedeu-se a an?lise de T-RFLP com intuito de caracterizar a diversidade microbiana presente. As esp?cies florestais sobreviveram ? aplica??o de clomazone, sendo que I. marginata, C. ferrea e S. brasiliensis apresentaram maior toler?ncia ao herbicida em rela??o ?s an?lise de crescimento, seguidas de S. parahyba, H. serratifolius repetindo-se I. marginata para avalia??es da integridade anat?mica. No entanto, n?o foi verificado, nas condi??es do experimento, remedia??o do solo para a maioria das esp?cies testadas. Contudo plantas de sorgo tiveram crescimento normal quando cultivadas em solo onde antes havia I. marginata. Os resultados de T-RFLP confirmaram a diversidade microbiana diferenciada associada a rizosfera de I. marginata. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Ci?ncia Florestal, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2012.

Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2017-06-12T18:57:15Z No. of bitstreams: 2 tarcisio_tomas_cabral_sousa.pdf: 1757108 bytes, checksum: 835c7914569f767d1b2d01ecdb785268 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2017-06-14T19:16:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tarcisio_tomas_cabral_sousa.pdf: 1757108 bytes, checksum: 835c7914569f767d1b2d01ecdb785268 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T19:16:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tarcisio_tomas_cabral_sousa.pdf: 1757108 bytes, checksum: 835c7914569f767d1b2d01ecdb785268 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) / APERAM BioEnergia / VERACEL / GERDAU / A produ??o de eucalipto vem sofrendo grandes preju?zos com o ataque de uma nova praga, o Thaumastocoris peregrinus, seu nome popular ? percevejo bronzeado devido seu h?bito alimentar, succivoro. Essa alimenta??o causa danos diretos ?s ?rvores, deixando as folhas com aspecto bronzeado, diminuindo a fotoss?ntese, chegando a secar e cair, o que pode culminar com a morte da planta. Poucos s?o os estudos relacionados a essa praga, n?o existindo um controle eficaz. Com o intuito de conhecer sobre a morfologia do sistema digest?rio, bem como a intera??o deste com micro-organismos e visando fornecer informa??es ao controle dessa praga, foram realizadas a histologia do sistema digest?rio e sequenciamento de fragmentos de DNA obtidos de micro-organismos internos ao inseto. A histologia permitiu observar que o percevejo n?o tem os cecos g?stricos, parte do intestino m?dio que armazena micro-organismos que auxiliam na digest?o dos alimentos e que ? possuidor de um par de gl?ndulas salivares que s?o compostas de dois l?bulos cada. As an?lises moleculares possibilitaram verificar que, possivelmente, existem micro-organismos presentes no sistema digest?rio vivendo em associa??o com o mesmo. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Ci?ncia Florestal, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2016. / The Eucalyptus production has suffered great losses from the attack of a new pest, the Thaumastocoris peregrinus, popularly known as bronze bug to cause silvering on eucalyptus leaves. This symptom occurs because of your eating habits, because it sucks the sap of its host. This feeding causes direct damage to trees, because its leaves stay with tanned look, reducing photosynthesis, reaching dry and fall off, which can lead to the death of the plant. There are few studies relating to this pest, with no effective control. With intuited to know about the digestive morphology and the interaction of this with micro-organisms, targeting subsidies to the control of this pest were performed histology of the digestive system and sequencing of DNA fragments obtained from internal micro-organisms to the insect. The histology allowed to observe that the bronze bug does not have the gastric cecum of the midgut that stores micro-organism to assist in digestion of food, and their digestive system is divided into three parts, foregut, middle and posterior, which is possessor of a pair of salivary glands that are composed of two lobes each. Molecular analysis enabled us to verify that, possibly, there are micro-organisms present in the digestive system living in association with the same.

Data de aprova??o ausente. / Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2017-06-08T22:19:37Z No. of bitstreams: 2 luana_martins_santos.pdf: 1170564 bytes, checksum: 215e11cc17c654f8760cc6085cca3464 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2017-06-22T15:18:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 luana_martins_santos.pdf: 1170564 bytes, checksum: 215e11cc17c654f8760cc6085cca3464 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-22T15:18:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luana_martins_santos.pdf: 1170564 bytes, checksum: 215e11cc17c654f8760cc6085cca3464 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / A produ??o de muda ? uma etapa primordial e decisiva para a implanta??o de uma floresta. No entanto, devido a diversos fatores de ordem t?cnica, as perdas no setor de produ??o s?o bastante relevantes. Dentre estes fatores est? o descarte do substrato, que quando feito de forma err?nea favorece a prolifera??o de micro-organismos fitopatog?nicos em viveiro. Isso pode desencadear em perdas significativas e ainda se tornar um passivo ambiental. Raramente o substrato ? reutilizado nos viveiros comerciais, uma vez que presume-se que as caracter?sticas f?sica, qu?mica e biol?gicas formam perdidas durante a produ??o das mudas. Contudo, h? poucos estudos sobre micro-organismos em substratos. A import?ncia deste estudo fundamenta-se na escassez de pesquisa sobre essa problem?tica que afeta o setor de produ??o de mudas, bem como buscar alternativas sustent?veis que pressup?e a demanda de uso desse insumo. A aplica??o de t?cnicas moleculares vem sendo empregadas para detectar e identificar os micro-organismos em diversos ambientes. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi detectar a diversidade microbiol?gica em amostras de substratos descartados pela t?cnica de PCR-RFLP. Foram coletados dez amostras de substratos em diferentes viveiros no estado de Minas Gerais em diferentes fases de produ??o e estado de tecnifica??o. O DNA gen?mico total foi extra?do e amplificado pela t?cnica de PCR com oligonucleot?deos espec?ficos para fungos, bact?ria e archaea. Os produtos amplificados foram submetidos ? clivagem com enzimas de restri??o HaeIII, BamHI, TaqI e HindIII, para detec??o de poss?veis polimorfismos entre as amostras por meio da t?cnica de PCR-RFLP. Foi poss?vel verificar diferen?as entre as amostras de substratos, tanto em rela??o ao tamanho da regi?o do DNA amplificada, bem como em rela??o ? presen?a de s?tios de restri??o. Com base no ?ndice de similaridade, detectou-se uma maior varia??o da diversidade dentro da amostra em diferentes fases do que nas amostras entre os diferentes viveiros. Portanto, estes resultados podem ser relevantes para o conhecimento da diversidade microbiol?gica em substrato. Por?m mais estudos se fazem necess?rios para maior compreens?o destes micro-organismos e sua fun??o no substrato. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Ci?ncia Florestal, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2016. / The production of changes is a crucial and decisive step for the implementation of a forest. However, due to several technical factors, losses in the production sector are quite relevant. Among these factors is the disposal of substrate, which when done wrongly favors the proliferation of phytopathogenic microorganisms in nursery. This can trigger significant losses and still become a environmental liabilities. Rarely the substrate is reused in commercial nurseries, since it is assumed that the physical, chemical and biological characteristics were lost during the production of seedlings. However, there are few studies on microorganisms on substrates. The importance of this study is based on the scarcity of research on this issue that affects the production of seedlings, as well as seek sustainable alternatives that assumes the use of this raw material demand. The application of molecular techniques have been employed to detect and identify microorganisms in various environments. In this context, the objective of this study was to detect microbiological diversity in substrate samples dropped by PCR-RFLP technique. Ten samples were collected of substrates in different nurseries in the State of Minas Gerais in different stages of production and State of modern farms. Total genomic DNA was extracted and amplified by the PCR technique with specific oligonucleotides to fungi, bacteria and archaea. The amplified products were submitted to cleavage with HaeIII restriction enzymes, BamHI, HindIII, and TaqI for detection of possible polymorphisms between the samples by PCR-RFLP technique. It was possible to check differences between samples of substrates, both in relation to the size of the amplified DNA region as well as in relation to the presence of restriction sites. Based on the index of similarity, if a greater variation of diversity within the sample at different stages than in samples between different nurseries. Therefore, these results may be relevant to the knowledge of microbiological diversity in substrate. However more studies are needed to better understanding of these microorganisms and their role in the substrate.

In my thesis I concentrated on an analysis of biological samples of 60 dogs, which manifested epilepsy. The aim was to find out the relation between genotype of the selected locus and the occurrence of epilepsy. Based on the results of the analysis, I assessed, whether there is a demonstrable relation between the occurrence of epilepsy and genotype in a particular locus. According to the results, no influence of genotype on the age of first epileptic seizure was proved.

Submitted by Pós graduação Farmácia (ppgfar@ufba.br) on 2017-05-30T20:39:16Z No. of bitstreams: 1 Flavia-Thamires -farmacia-final.pdf: 2671133 bytes, checksum: d04fe328ab695f2547b14e8d937e5959 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barroso (pbarroso@ufba.br) on 2017-06-01T17:33:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Flavia-Thamires -farmacia-final.pdf: 2671133 bytes, checksum: d04fe328ab695f2547b14e8d937e5959 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T17:33:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flavia-Thamires -farmacia-final.pdf: 2671133 bytes, checksum: d04fe328ab695f2547b14e8d937e5959 (MD5) / FAPESB / O diagnóstico dos coccídeos Cryptosporidium e Isospora belli é realizado principalmente pela pesquisa de oocistos em esfregaços fecais corados. Entretanto, não existe uma padronização na rotina laboratorial para a identificação microscópica desses coccídeos. O diagnóstico da Cryptosporidium pode também ser realizado pela detecção de coproantígenos por ensaio imunoenzimático (ELISA) ou pela amplificação do DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR), dispensando a identificação morfológica dos oocistos. Além disso, a análise do polimorfismo genético de fragmentos de restrição (PCR-RFLP) pode ser utilizada na caracterização das espécies de Cryptosporidium, permitindo um melhor entendimento da dinâmica da transmissão deste parasito. Os objetivos deste trabalho foram: (1) comparar as técnicas de concentração de formol-acetato de etila (FE) e sedimentação por centrifugação (SC), bem como as técnicas de coloração de Ziehl-Neelsen modificado (ZN), auramina (AR) e safranina (SF) na detecção de oocistos de Cryptosporidium e Isospora belli em amostras fecais; (2) comparar a microscopia com a pesquisa de coproantígeno para o diagnóstico de Cryptosporidium e avaliar os resultados discordantes utilizando a PCR e (3) caracterizar as espécies de Cryptosporidium de amostras fecais humanas, através da PCR-RFLP. Para comparação entre os métodos de concentração de oocistos, FE e SC, e as técnicas de coloração, ZN, AR e SF, foram utilizadas amostras fecais positivas para Cryptosporidium (n=27) e I. belli (n=15), conservadas em formalina a 10%. Os métodos foram avaliados quanto ao número de oocistos detectados e a qualidade microscópica dos esfregaços. Para comparação entre o método de ZN e ELISA para o diagnóstico de Cryptosporidium foram examinadas amostras fecais de 626 crianças de diferentes grupos. Posteriormente, todas as amostras positivas para Cryptosporidium obtidas no estudo, juntamente com outros isolados disponíveis no laboratório, foram submetidos à extração de DNA e análise por Nested-PCR/RFLP dos genes COWP e 18S rRNA, para determinação das espécies de Crptosporidium. Os métodos SC e ZN identificaram mais oocistos de ambos parasitos do que os demais métodos avaliados (p<0,05). Houve perda de oocistos no anel de detritos gordurosos no FE em praticamente todas as amostras de Cryptosporidium e I. belli. Por outro lado, os métodos FE e AR apresentaram menos artefatos nos esfregaços comparados aos demais, sendo classificados com qualidade microscópica superior. A frequência de Cryptosporidium nas crianças foi de 2,6% (16/626), sendo maior no grupo com doença diarreica, enfatizando a importância deste coccídeo como agente etiológico da diarreia infantil. A sensibilidade e especificidade do ELISA foram de 85,7% e 99,7%, respectivamente. A eficiência da amplificação do DNA de Cryptosporidium foi de 92% (23/25), considerando os resultados dos dois genes analisados. As espécies do parasito identificadas foram C. hominis (78,3%), C. felis (8,7%), C. parvum (4,3%) e mistura C. felis + C. hominis (8,7%). Esses dados são os primeiros de genotipagem de Cryptosporidium de indivíduos de Salvador, demonstrando a predominância de C. hominis nas infecções, e a elevada frequência de C. felis, sugerindo um provável papel de gatos na transmissão do parasito aos humanos em nosso meio. / The diagnosis of coccidia Isospora belli and Cryptosporidium is usually accomplished by identification of oocysts in stained fecal smears. However, there is a lack of standardization in the routine laboratory for microscopic identification of these coccidia. The diagnosis of Cryptosporidium can also be done by detecting coproantigens using the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or by parasite DNA amplification by polymerase chain reaction (PCR), eliminating the need of morphological identification of oocysts. Furthermore, the analysis of restriction fragment length polymorphism of amplified DNA (RFLP-PCR) can be used to characterize the species of Cryptosporidium, allowing a better understanding of the transmission dynamics of the parasite. The objectives of this study were: (1) to compare the techniques of concentration of formalin-ethyl acetate (FE) and sedimentation by centrifugation (SC), as well as the techniques of modified Ziehl-Neelsen (ZN), auramin (AR) and safranin (SF) in the detection of Cryptosporidium and Isospora belli in stool samples, (2) to compare the microscopy with coproantigen detection for the diagnosis of Cryptosporidium and evaluate discordant results using PCR and (3) to characterize the species Cryptosporidium in human fecal samples by PCR-RFLP. To compare the methods for concentration, FE and SC, and staining of oocysts, ZN, AR and SF, there were used positive fecal samples for Cryptosporidium (n = 27) and I. belli (n = 15), preserved in 10% formalin. The methods were evaluated according the numbers of oocysts detected and the microscopic quality of smears. For comparison between ELISA and ZN for the diagnosis of Cryptosporidium in faecal samples, there were examined 626 stool samples from children of different groups. Subsequently, all positive samples for Cryptosporidium obtained in the study, along with other isolates available in the laboratory, were subjected to DNA extraction and analysis by Nested-PCR/RFLP of the COWP and 18S rRNA genes to determine the species of Crptosporidium. The SC and ZN methods identified more oocysts of both parasites than other methods tested (p <0.05). The loss of oocysts in the fatty debris layer of FE method was observed in all Cryptosporidium and I. belli samples. Moreover, the methods of FE and AR had fewer artifacts in smears compared to the others, being ranked with higher microscopic quality. The frequency of Cryptosporidium in children was 2.6% (16/626), being higher in patients with diarrheic disease, emphasizing the importance of this protozoan as etiologic agent of childhood diarrhea. The sensitivity and specificity of ELISA were 85.7% and 99.7%, respectively. The efficiency of amplification of Cryptosporidium DNA was 92% (23/25), considering the results of the two genes. The species of the parasite identified were C. hominis (78.3%), C. felis (8.7%), C. parvum (4.3%) and a mixture of C. felis + C. hominis (8.7%). To our knowledgment, these data represent the first genotyping study of Cryptosporidium from individuals of Salvador, demonstrating the dominance of C. hominis infection and the high frequency of C. felis, suggesting a potential role of cats in the transmission of the parasite to humans in our area.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T13:25:42Z No. of bitstreams: 1 Grazielle Cardoso da Graça.pdf: 2006498 bytes, checksum: 53326885a5878760b37f852744da05fd (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T13:25:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grazielle Cardoso da Graça.pdf: 2006498 bytes, checksum: 53326885a5878760b37f852744da05fd (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose é um complexo de doenças caracterizada não só pelo considerável pleomorfismo clínico, mas também pela variação epidemiológica, devido à notável diversidade de espécies de Leishmania e de vetores envolvidos no ciclo de transmissão e, quando aplicável, os seus grupos de reservatórios. O diagnóstico da infecção por Leishmania associado à identificação da espécie causal é importante para o prognóstico, definição de esquemas terapêuticos adequados e para vigilância epidemiológica da doença. Neste contexto, os métodos baseados na PCR tem sido os mais investigados e por isso muitos métodos tem sido descritos. O principal objetivo deste estudo foi estabelecer uma metodologia que apresentasse uma boa sensibilidade para ser utilizada no diagnóstico da leishmaniose cutânea e que fosse capaz de identificar o agente etiológico causal da infecção ao nível específico. Para isto, neste trabalho utilizamos diferentes metodologias baseadas na PCR que já foram empregadas em vários estudos enfocando o diagnóstico molecular das leishmanioses: PCR kDNA, PCR ITS1 e PCR g6p. O limite de detecção, sensibilidade frente a amostras clínicas obtidas de pacientes com LC e a capacidade destas metodologias em discriminar entre as espécies relacionadas com a LC humana no Brasil foram avaliados. Além disso, considerando resultados anteriores do nosso grupo que indicaram que regiões do gene hsp70 poderiam ser utilizadas para o alcance deste objetivo, desenvolvemos metodologias de PCR direcionadas para a amplificação de fragmentos que correspondiam a distintas regiões do gene hsp70, com tamanho variando entre 230pb a 390pb. Considerando as quatro regiões que foram analisadas, escolhemos uma (aqui denominada de PCR hsp70C) por ter apresentado o melhor limite de detecção de DNA de Leishmania e que, através da PCR RFLP hsp70C, foi capaz de discriminar todas as espécies de Leishmania, patógenos humanos, que circulam no Brasil, quando cepas de referência foram analisadas. A sensibilidade da PCR hsp70C empregando DNA extraído de tecido coletado de pacientes diagnosticados com leishmaniose foi avaliada, comparando com as demais metodologias mencionadas anteriormente; além disso, a capacidade da PCR-RFLP em identificar espécies de Leishmania foi validada empregando um painel de 70 cepas de Leishmania, representando as diferentes espécies e a distribuição geográfica destas, e também foi aplicada ao material clínico analisado. Foi possível concluir que a PCR kDNA é um método bastante sensível e por isso indicado para o diagnóstico molecular das leishmanioses, mas não permite a identificação de espécies. A PCR ITS1 apresenta boa sensibilidade para o diagnóstico das leishmanioses, mas a capacidade de identificação de algumas espécies de Leishmania que circulam nas Américas, através da PCR-RFLP, depende de metodologias mais complexas, dificultando seu uso em áreas de circulação de espécies como L. braziliensis e L. guyanensis, por exemplo. Finalmente, A PCR-RFLP hsp70C, direcionada para a amplificação de uma região do gene hsp70 de Leishmania, combina boa sensibilidade para detectar Leishmania diretamente em material clínico e a habilidade em identificar todas as espécies que circulam no Brasil, sendo útil principalmente em áreas onde existe a ocorrência de espécies de Leishmania em simpatria. / Leishmaniasis is zoonosis caused by parasite protozoa belonging to the genus Leishmania, which comprises about 30 species, and of these about 20 are responsible for causing human diseases. Leishmaniasis is characterized by considerable clinical pleomorphism and epidemiological variability. Diagnosis of Leishmania infection associated with the identification of the causative species is important for prognosis, definition of appropriate treatment schemes and epidemiological surveillance of the disease. In this context, PCR-based methods have been the most investigated and therefore many methods have been described, although there are still limitations in terms of validation and ability to discriminate between different Leishmania species. In Brazil there are at least seven species associated with human cutaneous Leishmaniasis (CL) and one species associated with visceral Leishmaniasis. The main goal of this study was to establish a methodology presenting both good sensitivity and capacity to identify the causative etiologic agent of the infection at species level. To this end, this study employed different methodologies based on PCR already used in several studies focusing on the molecular diagnosis of Leishmaniasis: kDNA PCR, ITS1 PCR and g6p PCR. The limit of detection, sensitivity in the face of clinical samples obtained from patients diagnosed with CL and the ability of these methodologies to discriminate between species related to human CL in Brazil were evaluated. Furthermore, considering previous results from our group showing that regions of the hsp70 gene could be used to achieve this goal, we developed PCR-based methodologies targeting fragments that correspond to different hsp70 gene regions, with sizes ranging from the 230pb to 390pb. Considering the four regions that were analyzed, we chose one (here named as hsp70C PCR) for having presenting the best detection limit of Leishmania DNA and the capacity of discriminating human pathogens Leishmania species that circulate in Brazil, when reference strains were analyzed by PCR RFLP hsp70C. The sensitivity of hsp70C PCR using DNA extracted from tissue collected from patients diagnosed with CL compared with the other methods mentioned above. In addition, the ability of hsp70C PCR-RFLP to identify Leishmania species has been validated using a panel of 70 Leishmania strains, representing different species and geographic regions aditionaly clinical material was also analyzed. The results suggest that kDNA PCR is a very sensitive method and therefore suitable for the molecular diagnosis of Leishmaniasis, but does not allow the identification of the species envolved in the infection. The ITS1 PCR is quite sensitive for the diagnosis of Leishmaniasis, but the non ability to identify the sympatric species like L.guyanensis and L.braziliensis, by PCR-RFLP limits its use in some in the South America. Finally, PCR-RFLP hsp70C, combines good sensitivity to detect Leishmania DNA extracted from clinical material and the ability to identify all Leishmania species that circulate in Brazil, being particularly useful in areas where Leishmania species are simpatric.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-06T11:18:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 909512 bytes, checksum: 95d360795ba1a42ae10b3949c99caca0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-06T11:18:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 909512 bytes, checksum: 95d360795ba1a42ae10b3949c99caca0 (MD5) Previous issue date: 2005-12-14 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Os ovinos foram introduzidos no Brasil principalmente pelos portugueses e espanhóis durante o processo de colonização. Por motivos sócio-culturais, a criação desses animais foi considerada no Brasil uma atividade de categoria inferior, de modo que foram criados somente para subsistência. Esse descaso fez com que os produtos derivados de ovinos (lã, carne, pele) perdessem competitividade frente aos produtores de outros países. Para que ocorra uma mudança desse cenário, é necessária uma profunda modificação logística de todas as classes envolvidas na produção de ovinos, visto que os ovinos representam, principalmente nas regiões Sul e Nordeste, uma fonte de recursos importante do ponto de vista social, cultural e histórico. O objetivo desse trabalho foi realizar um conjunto de técnicas moleculares que permitam a caracterização genética das principais raças e/ou estoques de ovinos naturalizados do Brasil de modo a.oferecer subsídios para a elaboração de programas estratégicos de conservação e melhoramento desta espécie. Foram utilizadas quatro classes de marcadores moleculares (RAPD, microssatélites, sequenciamento do DNA mitocondrial e do cromossomo Y) em até 11 raças de ovinos naturalizadas e comerciais existentes no Brasil. Os resultados permitiram identificar padrões de estruturação genética existentes nessa espécie no Brasil, bem como demonstraram a viabilidade de aplicação de marcadores moleculares para: 1) monitoramento genético de rebanhos; 2) testes de exclusão de paternidade para controle de pedigrees; 3) origem geográfica de raças ou populações; 4) inferências filogenéticas intra- específicas. / In Brazil, sheep breeds were introduced during the colonization process by Spanish and Portuguese settlers. Social and cultural factors determined that sheep rearing was considered a low-status activity, and therefore, sheep were raised only to meet subsistence goals. The outcome of this is that products derived from sheep such as wool, meat and hides are non competitive in the international market. A change of this scenario requires a profound logistic alteration involving all sheep production-related groups, particularly in the northern and southern regions in the country, where sheep are of high cultural, social and historical relevance. The objective of this work was to characterize the main naturalized Brazilian sheep breeds using molecular markers. Our results will be a baseline for the development of management and conservation programs. Four kinds of molecular markers were used (RAPD, microsatellites, and sequences of mtDNA and Y chromosome) and were applied on 11 breeds of naturalized and commercial breeds. Results identified the genetic structure of the species in the Country and demonstrated the efficiency of molecular markers for 1) herd genetic monitoring, 2) paternity (exclusion) analyses, 3) for determining the geographic origin of breeds and populations, and 4) for investigating within-species phylogenies.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2014-07-07T20:06:26Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ João Antônio Miranda Souza.pdf: 2240651 bytes, checksum: 74599c9ddde7f9d862894d9a27be25e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-07T20:06:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ João Antônio Miranda Souza.pdf: 2240651 bytes, checksum: 74599c9ddde7f9d862894d9a27be25e0 (MD5) / CAPES / Cryptococcus é uma levedura zoonótica, frequentemente associada a excretas de pombos e seu isolamento já é relatado em todo o mundo. Trata-se de uma levedura encapsulada, de forma globosa ou ovalada, que apresenta acentuado tropismo pelo sistema nervoso central. O principal problema é que o fungo permanece viável em excretas secas dessas aves por um longo período, tornando-se um reservatório de partículas infectantes passíveis de serem inaladas. O trabalho teve como objetivo caracterizar a variedade fenotípica e genética de Cryptococcus spp. ambientais da cidade de Salvador, Bahia. Para a execução desse estudo, 200 amostras de excre-mentos secos de pombos foram coletadas no solo entre novembro 2011 e fevereiro de 2012, em praças públicas, centro de distribuição de alimentos e no Porto da cida-de Salvador, Bahia. Foram adicionados 4mL de solução salina esterilizada, acresci-da de cloranfenicol, para cada 1g de excreta. A mistura foi submetida à agitação em vortex por 3 minutos, e mantida em repouso por 60 minutos e, em seguida, diluições foram feitas. Foram aspirados 0,1 mL do sobrenadante e semeados com alça de Drigalski, de cada diluição, em placas de ASD contendo cloranfenicol. As placas fo-ram incubadas em estufa de demanda de oxigênio a 28oC por até 21 dias. Colônias sugestivas foram repicadas em caldo uréia e analisadas com tinta da China para pesquisa de cápsula e micromorfológica com coloração de Gram. Após a identifica-ção do gênero, as leveduras foram identificadas bioquimicamente por auxanograma, zimograma, crescimento a 37ºC e repicadas em ágar Níger (Guizotia abyssinica), e CGB. Foram isoladas 37 leveduras, das quais 22 são da espécie C. neoformans, 4 de C. gattii, 5 de C. albidus, 3 de C. uniguttulatus e 3 da espécie C. laurentii. A de-terminação dos genótipos foi realizada utilizando a técnica de PCR-RFLP do gene URA5 e foram verificados os perfis moleculares VNI (53,8%), VNIII (11,5%), VNIV (19,2%), VGII (7,7%), VGIII (3,8%) e VGIV (3,8%). A positividade para Cryptococcus nas amostras encontradas nos locais de estudo, associado ao grande número de pombos, apontam para a existência de riscos ambiental que devem servir de alerta aos órgãos de vigilância sanitária em Salvador. A identificação de espécies como C. gattii, C. albidus, C. uniguttulatus e C. laurentii em excretas de pombos evidencia a importância de novos estudos epidemiológicos para traçar os perfis de espécies de Cryptococcus que podem ser detectados de fontes ambientais em nossa cidade.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-28Bitstream added on 2014-06-13T18:43:16Z : No. of bitstreams: 1 marchesin_src_dr_sjrp.pdf: 719824 bytes, checksum: 27f6c7b9b1235bdfcec78f2741f543a0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A proposta do presente trabalho foi analisar as relações de proximidade genética e evolutiva entre espécies de Chiroptera, a partir da utilização da técnica PCR-RFLP para a obtenção de dados moleculares para os genes mitocondrial 12/16S e nuclear RAG2. A variabilidade detectada no presente estudo para as diferentes espécies é extremamente importante e poderá orientar ou subsidiar estudos com diferentes finalidades. A complexidade dos táxons de Chiroptera observada em outras análises, como citogenética e morfológica também foi revelada pela análise de RFLP, reforçando a importância dessa metodologia nos estudos evolutivos do grupo. / The aim of this study was to assess the relationships of genetic and evolutive proximity among Chiroptera species, through the obtention of molecular data through mitochondrial (12/16S) and nuclear (RAG2) genes by PCR-RFLP technique. The variability detected by this study to the different species is extremely important and can direct or subsidize studies with different purposes. The complexity of Chiroptera taxa observed in cytogenetic and morphologic analyses was also revealed by the RFLP technique, reinforcing the importance of this methodology in evolutive studies of the group.