Thesis (Ph.D.) -- University of Adelaide, Dept. of Agronomy, 1974.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective of this study was to conduct analysis of data from six experiments with forage systems with Elephant Grass (EG) + Italian Ryegrass (IR) + Spontaneous Growing Species (SGS); EG + IR + SGS + Forage Peanut; and EG + IR + SGS + White or Red Clover, conducted in the Laboratório de Bovinocultura de Leite da Universidade Federal de Santa Maria, with rotational grazing using dairy cattle. The experiments analyzed were conducted between the years 2005 to 2013 and grouped by the month they grazing cycles were performed. Holstein dairy cows were used for evaluation, with an average body weight and milk production of 543 kg and 19 kg/day, respectively. The total forage production values and the average stocking rate and crude protein levels were 13.8, 16.5 and 16.8 t/ha; 2.90; 2.91 and 2.92 AU/ha/day and 17.5, 18.6 and 18.2%, for the respective forage systems. The forage systems consisting by forage legumes presented the best results in relation to pasture productivity and nutritive value of forage. The mixed with forage peanut controlled the spontaneous growing species and participated in the herbage mass throughout the year. In mixed pasture with clovers the nitrogen contribution to the system resulted in better conditions for the development of grasses forage (Italian ryegrass or elephant grass). / O objetivo desse estudo foi comparar sistemas forrageiros sem leguminosa e em consórcio, por meio de uma análise conjunta de dados provenientes de seis experimentos conduzidos no Laboratório de Bovinocultura de Leite da Universidade Federal de Santa Maria. Os sistemas forrageiros constituíram-se por capim elefante (CE) + azevém (AZ) + espécies de crescimento espontâneo (ECE), sem leguminosa; CE + AZ + ECE + amendoim forrageiro; e CE + AZ + ECE + trevo branco ou vermelho. Os experimentos foram realizados entre os anos de 2005 a 2013 e agrupados pelo mês em que foram efetuados os ciclos de pastejo. Para avaliação foram usadas vacas em lactação da raça Holandesa, com peso corporal e produção de leite média de 543 kg e 19 kg/dia, respectivamente. Os valores de produção de forragem e as médias de taxa de lotação e dos teores de proteína bruta foram de 13,8; 16,5 e 16,8 t/ha; 2,90; 2,91 e 2,92 UA/ha/dia e 17,5; 18,6 e 18,2%, para os respectivos sistemas forrageiros. Os sistemas forrageiros constituídos por leguminosas apresentaram os melhores resultados em relação à produtividade do pasto e ao valor nutritivo da forragem. O consórcio com amendoim forrageiro controlou as espécies de crescimento espontâneo e participou da massa de forragem durante todo o ano. No consórcio com trevos a contribuição de nitrogênio ao sistema implicou em melhores condições para o desenvolvimento das gramíneas acompanhantes (azevém ou capim elefante).

Research on efficient management systems to optimise Trifolium repens-Rhizobium symbiosis, is lacking in South Africa. The amount of nitrogen (N) fixed by symbiotic rhizobia in root nodules of T. repens is ultimately determined by health of the soil environment. Soil organic matter (SOM) is the main attribute that will sustain soil health as it affects the chemical, physical and biological aspects of soil. The aim of this study was to determine the potential of T. repens and T. ambiguum to sustain low N input pastures. The hypotheses of this study is that SOM can play an important role in ensuring good soil health, which supports the optimum growth and production of Trifolium spp. in low N input pastures. Four Trifolium repens cultivars were evaluated in field conditions to determine the effect of Rhizobium bacteria on the potential of the cultivars to nodulate. The cultivars Grasslands Huia, Haifa, Ladino and Regal were selected for assessment. The thousand-seed-mass (TSM) of each cultivar was measured to determine the quality and viability of the seed; and to determine the interaction between seed mass and nodulation. Mean TSM values of T. repens cultivars differed significantly, with Huia having the highest TSM followed by Haifa, Ladino and Regal. Biomass production was also measured as an indicator of efficiency of nitrogen fixation. The cultivar Huia, with the heaviest seed, showed the highest biomass production. After eight weeks of growth, the nodulation index was determined from the size, number and colour of the bacterially associated root nodules. All plants, regardless of cultivar, formed nodules within eight weeks. It was concluded that TSM had no notable effect on nodulation. Planting date with associated temperature effects and the intrinsic cultivar effect also had no influence on nodulation. It was therefore concluded that nodulation potential of the four cultivars tested was similar in the specific environmental conditions. The total number of symbiotic rhizobial cells per gram of soil as affected by soil C content and the host plant was also determined. Inoculated and un-inoculated seeds were planted on five soil treatments, each with a different level of soil C. The plant infection technique (most-probable-number/MPN technique) was used to quantify the rhizobial numbers in soil as affected by soil C content and the host plant. The mean MPN-value ranged from 8907 to 78 Rhizobium cells per gram of soil for T. repens treatments, and 0 to 436 for T. ambiguum treatment. Soil C had no effect on the number of Rhizobium bacteria present in the soil. Inoculation however, had a significant effect on the MPN value of T. ambiguum, but not for T. repens. Most symbiotic Rhizobium was detected between a soil C content of 2.03% to 3.80% in both inoculated and non-inoculated soils. The spread plate count was used to determine the total number of symbiotic and saprophytic rhizobia. This method was used to quantify both symbiotic and free-living rhizobia. The effect of different levels of soil C on the amount of atmospheric N fixed was assessed by the N difference technique. Arctotheca calendula (cape weed) served as the reference plant in this study, to determine what percentage of N is derived from the atmosphere (%Ndfa). Biomass production was determined and served as the parameter to establish the efficiency of the Rhizobium bacteria in the soil. Inoculating seed with host specific rhizobia had no effect on the amount of N fixed. The mean %Ndfa differed significantly between soil organic C treatments with the species T. repens but did not differ significantly between soil organic C treatments with T. ambiguum. It was concluded from this study that symbiotic rhizobia introduced by inoculant was much more efficient in higher C content soils than free-living rhizobia, which highlights the importance of inoculation in improving the sustainable production of T. repens pastures. Although the amount of N fixed increased as the level of soil organic matter decreased, the efficiency of N fixation decreased proportionally. This explains the bigger change in soil N content on soil with a high C content. This study has thus highlighted the importance of soil organic carbon in the host specific Rhizobium inoculation sucsess, of T. repens low N input pasture systems. / Dissertation (MSc(Agric))--University of Pretoria, 2010. / Plant Production and Soil Science / unrestricted

Tyrimo objektas ir metodai: dobilų genties augalų lapų, stiebų, žiedų žaliavų tyrimas. Izoflavonai nustatyti ESC metodu. Darbo tikslas: Atlikti izoflavonų genisteino, formononetino ir daidzeino analizę dobilų genties augaluose, taikant ESC metodą. Darbo uždaviniai: atlikti literatūros analizę, apibendrinant dobilų (Trifolium L) genties augalų biologines savybes, izoflavonų taikymą gydymo tikslais ir nustatymo metodus. Parinkti ekstrakcijos sąlygas, įvertinant pasirinkto ekstrakcijos tirpiklio, jo poliškumo ir ekstrakcijos laiko įtaką. Optimizuoti ESC metodą dobilų žaliavos tyrimui ir pagrįsti metodo tinkamumą izoflavonų kiekio nustatymui. Atlikti įvairių dobilų rūšių lapų, žiedų, stiebų ir šaknų mėginių analizę optimizuotu ESC metodu ir nustatyti izoflavonų kiekius juose. Įvertinti izoflavonų kiekio įvairavimą skirtingose dobilų rūšyse. Nustatyti izoflavonų kiekybinės sudėties pasiskirstymą augalų dalyse. Palyginti T. pratense izoflavonų kiekių skirtumus augalo dalyse. Palyginti izoflavonų kiekybinės sudėties skirtumus T. pratense kultivuojamų ir laukinės populiacijos augalų žaliavose. Išvados: atlikus mokslinės literatūros šaltinių analizę, apibendrintos dobilų genties augalų biologinės savybės, izoflavonų taikymas gydymo tikslais ir flavonoidų bei izoflavonoidų nustatymo metodai. Įvertintas tirpiklio poliškumas ir taikomos ekstrakcijos trukmės įtaka izoflavonų kiekiui. Optimizuotas ESC metodas kiekybinei izoflavonų analizei dobilų (Trifolium L.) genties augalų žaliavoms... [toliau žr. visą tekstą] / Object and methods: phytochemical analysis of different parts (leaves, blossoms, roots) of clover genus plants. Aim: to perform analysis of isoflavons genistein, formononetin and daidzein in clover genus plants by HPLC method. Objective: to perform analysis of scientific literature and evaluate characteristics of clover genus (Trifolium L.) plants and their usage for medical purpose, and analysis methods of active components. Select the conditions of extraction considering influence of solvent, its polarity and time of extraction. Optimize HPLC method for raw material analysis of clover genus and justify its suitability for quantitative analysis of isoflavons. Perform analysis of isoflavons in different parts of various clover genus plants by optimized HPLC method. Evaluate quantity difference between isoflavons in various genus of clover. Evaluate quantity difference between isoflavons in different parts of plants. Compare quantities of isoflavons in different parts of T. pratense pants. Compare quantity difference between isoflavons in raw materials of cultivated and naturally grown T. pretense plants. Results: performed scientific literature analysis justified characteristics and therapeutic effects of clover genus (Trifolium L.) plants, evaluated analysis methods of flavonoids and isoflavonoids. Also was evaluated influence of polarity of solvent and time of extraction to quantity of isoflavons. Quantitative HPLC analysis method for isoflavons in raw materials of clover... [to full text]

Objetivo: avaliar os efeitos do tratamento com o Trifolium pratense nos sintomas menopausais em mulheres climatéricas utilizando o Índice Menopausal de Kupperman (IMK) e pelo Inventário de Satisfação Sexual Golombok e Rust versão feminina (GRISS) l. Metodologia: Este estudo foi prospectivo, randomizado, duplo cego e controlado com placebo, e realizado no setor de Ginecologia Endócrina e Climatério da Disciplina de Ginecologia do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia do Hospital das Clínicas, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Foram selecionadas 100 mulheres na faixa etária de 45 a 65 anos com sintomas menopausais, com amenorréia superior há 1 ano e sem tratamento nos últimos 6 meses. Após a seleção, as mulheres foram divididas em dois grupos: Grupo I (n = 50) receberam Trifolium pratense na dose de 40 mg, 1 capsula/dia, por via oral; Grupo II (n = 50) receberam placebo (controle), contendo lactose, 1 cápsula/dia por via oral. A duração do tratamento foi de 12 meses e as mulheres foram avaliadas antes do tratamento com quatro, oito e 12 meses de tratamento, por exames clínico e laboratorial. Aplicaram-se o teste de t Student e o ANOVA para avaliar as diferenças entre os grupos. Resultados: Houve melhora significante dos sintomas após quatro meses de tratamento no IMK, principalmente, as ondas de calores, em relação aos dados antes do tratamento nos dois grupos. Não observamos melhora na avaliação da sexualidade (GRISS). Conclusão: Nossos dados sugerem que o efeito da ministração de 40mg ao dia de Trifolium pratense pode não ser superior ao do placebo, na redução dos sintomas da pós-menopausa durante um ano de estudo / Objective: to evaluate the effects of Trifolium pratense treatment on the climacteric symptoms and sexualiy in postmenopausal women through Kuppermann Menopausal Index (KMI) and the Golombok Rust Inventory of Sexual Satisfaction (GRISS), respectively. Methods: This study was prospective, randomized, double-blind and placebo-controlled study. Hundred women were selected, aged between 45 and 65 years with climacteric symptoms, with menstruation absence (amenorrhea) that was more then one year and without any treatment for last six months. After selection, women were divided into two groups: GI (n = 50) received 40 mg Trifolium pratense (one capsule per day); GII (n = 50) received placebo (control, one capsule of lactose per day). The length of treatment was 12 months and women were evaluated before and after four, eight and twelve months of treatment through clinical and laboratorial exams. The t Student test and ANOVA were applied for analyzing the differences between groups. Results: There was significant ameliorate in the symptoms after four months of treatment through the KMI, mainly in hot flashes, compared to baseline data of both groups. The sexuality evaluation did not found any difference before and after treatment in both groups. Conclusion: Our data suggested that the 40 mg Trifolium pratense effect may be not superior than placebo in relation to decrease the postmenopausal symptoms during one year of study

A formononetina e a biochanina A são as isoflavonas majoritárias nas partes aéreas de Trifolium pratense L. (trevo-vermelho) relacionadas com as principais atividades farmacológicas da planta. São chamadas de fitoestrógenos, pois possuem estrutura similar ao do 17-β-estradiol, e são capazes de se ligar aos receptores estrogênicos (ERβ e ERα). As isoflavonas agliconas são moléculas de baixa hidrossolubilidade, o que pode limitar sua aplicação em produtos para pele e a expressão de sua atividade biológica. O presente trabalho tem como objetivo obter uma fração enriquecida em isoflavonas de T. pratense e avaliar a permeação cutânea das agliconas formononetina e biochanina A individualmente e associadas. Adicionalmente, o efeito de promoção da permeação cutânea em pele de orelha suina também foi objeto do estudo. A fração foi preparada por maceração e após precipitação das isoflavonas agliconas por evaporação do etanol, o precipitado foi separado por filtração e purificado por cromatografia em coluna de poliamida. O produto foi seco e apresentou concentração de isoflavonas de 2,8 mg/g de formononetina e 2,7 mg/g de biochanina A. No entanto, essa concentração ainda não foi suficiente para posterior incorporação em uma formulação visando testes de permeação cutanea. Neste contexto, os estudos de permeação em pele de orelha de suíno (Franz cells) foram realizados com as isoflavonas majoritárias de referência incorporadas à hidrogéis de hidroxipropilmetilcellulose (HPMC). Para avaliar o teor de isoflavonas nas formulações e nas diferentes camadas da pele foi desenvolvido método bioanalítico utilizando cromatografia líquida de alta eficiência, o qual mostrou-se linear, específico, exato, preciso e robusto. Os hidrogéis foram desenvolvidos utilizando como polímero HPMC (3,5%, m/v) e as isoflavonas (0,1%) foram incorporadas à essa base, individualmente ou associadas, em presença ou ausência de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD) ou metil-β-ciclodextrina (MβCD). Os resultados obtidos na avaliação da permeação cutânea revelaram que as isoflavonas permearam mais quando incorporadas individualmente na base especialmente a formononetina. A biochanina A apresentou maior capacidade de permeação do que a formononetina, alcançando concentrações na epiderme de 0,5 ug/cm2 e na derme de 1,5 μg/cm2, representando cerca de 2,7 vezes mais comparando com a concentração de formononetina (respectivamente, 0,2 μg/cm2 e 0,4 μg/cm2). uso de ciclodextrinas aumentou significativamente a permeação da formononetina, tanto na epiderme quanto na derme. Para a biochanina A, apenas a retenção na epiderme foi aumentada com a presença de ciclodextrinas. A HPβCD foi a ciclodextrina que apresentou os melhores resultados de promoção da permeação da formononetina na derme e epiderme, proporcionando um aumento de 113%. Para a biochanina A, as duas ciclodextrinas aumentaram a sua concentração na epiderme na mesma proporção (37%). Quando as duas isoflavonas foram incorporadas em misturas 1:1 no hidrogel, a formononetina apresentou menor retenção, tanto na epiderme (0,1 μg/cm2) quanto na derme (0,4 μg/cm2). Contrariamente, a biochanina A apresentou retenção semelhante àquela apresentada quando foi incorporada isoladamente no hidrogel, caracterizando-se como uma molécula mais permeável e não sofrendo interferência da formononetina na sua permeação e retenção. Não foi observado efeito significativo da presença das ciclodextrinas na promoção da permeação cutânea das isoflavonas nas misturas, exceto para a formononetina, na epiderme. O conjunto dos resultados demonstrou que a formononetina e biochanina A são capazes de permear a pele sendo majoritariamente retidas na epiderme e na derme, revelando o seu potencial uso em preparações cosméticas destinadas à prevenção do envelhecimento cutâneo. As ciclodextrinas apresentaram acentuado efeito promotor da permeação cutânea apenas para a formononetina, que apresenta menor permeabilidade. / The main isoflavones present Trifolium pratense L. (red clover) aereal parts are the isoflavones formononetin and biochanin A, related to its pharmacological activities. These compounds are known as phytoestrogens due to its similarity to the structure of 17-β-estradiol, being able to bind to the estrogen receptor (ERβ and ERα). Aglicones of isoflavones display low water solubility limiting its incorporation in products for the skin and expression of its biological activity. The present work aims to develop a isoflavones-enriched fraction of T. pratense and to evaluate the skin permeation of the aglicones formononetin and biochanin A individually, and in association. Moreover the promoter effect of cyclodextrins on their skin permeation will also be evaluated. The enriched-fraction was prepared by maceration in ethanol 40% (v/v). The ethanol was evaporated and the dispersion was filtered. The supernatant was purified using a column chromatography packet with polyamide. The final product was dried and presented a concentration of 2.8 mg/g of formononetin and 2.7 mg/g of biochanin A. However, these amounts of isoflavones were not enough for subsequent incorporation into a formulation to proceed the cutaneous permeation tests. In this context, the permeation studies were performed using the chemical reference formononetin and biochanin A, incorporated into the hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) hydrogels for the permeation studies on porcine ear skin (Franz cells). To evaluate the isoflavone concentration in the formulations and in the different skin layers, a bioanalytical method was validated using high performance liquid chromatography (HPLC), which showed linearity, specificity, accuracy, precision and robusteness. Hydrogels were developed using HPMC (Methocel® K4M) polymer (3.5%, m/v) and the isoflavones were incorporated into this base individually or in combination, in the presence or absence of hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) or methyl-β-cyclodextrin (MβCD). The results obtained in the cutaneous permeation tests showed higher permeation values when the isoflavones were individually incorporated into the formulations especially for formononetin. Biochanin A showed higher permeation capacity when compared to formononetin, reaching 0.5 μg/cm2 in the epidermis and 1.5 μg/cm2 in the dermis, representing about 2.7 times the concentration of formononetin (0.2 μg/cm2 and 0.4 μg/cm2). The use of cyclodextrins increased significantly the permeation values of formononetin, both in the epidermis and in the dermis. For biochanin A only the retention in the epidermis was increased. HPβCD was the cyclodextrin that showed the best results for formononetin as permeation promoter, providing an increasing in the epidermis and dermis of 113%. Both cyclodextrins improved the biochanin A permeation in the same proportion in the epidermis (37%). When the isoflavones were incorporated into hydrogels together (1:1 ratio), formononetin showed less retention in both skin layers (0.1 μg/cm2 in the epidermis and 0.4 μg/cm2 in the dermis) and biochanin A remained with similar performance when added alone. In the presence of cyclodextrins, no significant effect was observed in the promotion of skin permeation of isoflavones in mixtures, except for formononetin, in the epidermis. Taken together, the results indicated that formononetin and biochanin A present skin permeation being mostly retained in the epidermis and dermis, revealing its potential use in cosmetic products preparations for preventing skin aging. Cyclodextrins presented a marked skin permeation promoting effect only on formononetin, which molecule presents lower permeability.

Objetivo: avaliar os efeitos do tratamento com o Trifolium pratense nos sintomas menopausais em mulheres climatéricas utilizando o Índice Menopausal de Kupperman (IMK) e pelo Inventário de Satisfação Sexual Golombok e Rust versão feminina (GRISS) l. Metodologia: Este estudo foi prospectivo, randomizado, duplo cego e controlado com placebo, e realizado no setor de Ginecologia Endócrina e Climatério da Disciplina de Ginecologia do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia do Hospital das Clínicas, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Foram selecionadas 100 mulheres na faixa etária de 45 a 65 anos com sintomas menopausais, com amenorréia superior há 1 ano e sem tratamento nos últimos 6 meses. Após a seleção, as mulheres foram divididas em dois grupos: Grupo I (n = 50) receberam Trifolium pratense na dose de 40 mg, 1 capsula/dia, por via oral; Grupo II (n = 50) receberam placebo (controle), contendo lactose, 1 cápsula/dia por via oral. A duração do tratamento foi de 12 meses e as mulheres foram avaliadas antes do tratamento com quatro, oito e 12 meses de tratamento, por exames clínico e laboratorial. Aplicaram-se o teste de t Student e o ANOVA para avaliar as diferenças entre os grupos. Resultados: Houve melhora significante dos sintomas após quatro meses de tratamento no IMK, principalmente, as ondas de calores, em relação aos dados antes do tratamento nos dois grupos. Não observamos melhora na avaliação da sexualidade (GRISS). Conclusão: Nossos dados sugerem que o efeito da ministração de 40mg ao dia de Trifolium pratense pode não ser superior ao do placebo, na redução dos sintomas da pós-menopausa durante um ano de estudo / Objective: to evaluate the effects of Trifolium pratense treatment on the climacteric symptoms and sexualiy in postmenopausal women through Kuppermann Menopausal Index (KMI) and the Golombok Rust Inventory of Sexual Satisfaction (GRISS), respectively. Methods: This study was prospective, randomized, double-blind and placebo-controlled study. Hundred women were selected, aged between 45 and 65 years with climacteric symptoms, with menstruation absence (amenorrhea) that was more then one year and without any treatment for last six months. After selection, women were divided into two groups: GI (n = 50) received 40 mg Trifolium pratense (one capsule per day); GII (n = 50) received placebo (control, one capsule of lactose per day). The length of treatment was 12 months and women were evaluated before and after four, eight and twelve months of treatment through clinical and laboratorial exams. The t Student test and ANOVA were applied for analyzing the differences between groups. Results: There was significant ameliorate in the symptoms after four months of treatment through the KMI, mainly in hot flashes, compared to baseline data of both groups. The sexuality evaluation did not found any difference before and after treatment in both groups. Conclusion: Our data suggested that the 40 mg Trifolium pratense effect may be not superior than placebo in relation to decrease the postmenopausal symptoms during one year of study

A formononetina e a biochanina A são as isoflavonas majoritárias nas partes aéreas de Trifolium pratense L. (trevo-vermelho) relacionadas com as principais atividades farmacológicas da planta. São chamadas de fitoestrógenos, pois possuem estrutura similar ao do 17-β-estradiol, e são capazes de se ligar aos receptores estrogênicos (ERβ e ERα). As isoflavonas agliconas são moléculas de baixa hidrossolubilidade, o que pode limitar sua aplicação em produtos para pele e a expressão de sua atividade biológica. O presente trabalho tem como objetivo obter uma fração enriquecida em isoflavonas de T. pratense e avaliar a permeação cutânea das agliconas formononetina e biochanina A individualmente e associadas. Adicionalmente, o efeito de promoção da permeação cutânea em pele de orelha suina também foi objeto do estudo. A fração foi preparada por maceração e após precipitação das isoflavonas agliconas por evaporação do etanol, o precipitado foi separado por filtração e purificado por cromatografia em coluna de poliamida. O produto foi seco e apresentou concentração de isoflavonas de 2,8 mg/g de formononetina e 2,7 mg/g de biochanina A. No entanto, essa concentração ainda não foi suficiente para posterior incorporação em uma formulação visando testes de permeação cutanea. Neste contexto, os estudos de permeação em pele de orelha de suíno (Franz cells) foram realizados com as isoflavonas majoritárias de referência incorporadas à hidrogéis de hidroxipropilmetilcellulose (HPMC). Para avaliar o teor de isoflavonas nas formulações e nas diferentes camadas da pele foi desenvolvido método bioanalítico utilizando cromatografia líquida de alta eficiência, o qual mostrou-se linear, específico, exato, preciso e robusto. Os hidrogéis foram desenvolvidos utilizando como polímero HPMC (3,5%, m/v) e as isoflavonas (0,1%) foram incorporadas à essa base, individualmente ou associadas, em presença ou ausência de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD) ou metil-β-ciclodextrina (MβCD). Os resultados obtidos na avaliação da permeação cutânea revelaram que as isoflavonas permearam mais quando incorporadas individualmente na base especialmente a formononetina. A biochanina A apresentou maior capacidade de permeação do que a formononetina, alcançando concentrações na epiderme de 0,5 ug/cm2 e na derme de 1,5 μg/cm2, representando cerca de 2,7 vezes mais comparando com a concentração de formononetina (respectivamente, 0,2 μg/cm2 e 0,4 μg/cm2). uso de ciclodextrinas aumentou significativamente a permeação da formononetina, tanto na epiderme quanto na derme. Para a biochanina A, apenas a retenção na epiderme foi aumentada com a presença de ciclodextrinas. A HPβCD foi a ciclodextrina que apresentou os melhores resultados de promoção da permeação da formononetina na derme e epiderme, proporcionando um aumento de 113%. Para a biochanina A, as duas ciclodextrinas aumentaram a sua concentração na epiderme na mesma proporção (37%). Quando as duas isoflavonas foram incorporadas em misturas 1:1 no hidrogel, a formononetina apresentou menor retenção, tanto na epiderme (0,1 μg/cm2) quanto na derme (0,4 μg/cm2). Contrariamente, a biochanina A apresentou retenção semelhante àquela apresentada quando foi incorporada isoladamente no hidrogel, caracterizando-se como uma molécula mais permeável e não sofrendo interferência da formononetina na sua permeação e retenção. Não foi observado efeito significativo da presença das ciclodextrinas na promoção da permeação cutânea das isoflavonas nas misturas, exceto para a formononetina, na epiderme. O conjunto dos resultados demonstrou que a formononetina e biochanina A são capazes de permear a pele sendo majoritariamente retidas na epiderme e na derme, revelando o seu potencial uso em preparações cosméticas destinadas à prevenção do envelhecimento cutâneo. As ciclodextrinas apresentaram acentuado efeito promotor da permeação cutânea apenas para a formononetina, que apresenta menor permeabilidade. / The main isoflavones present Trifolium pratense L. (red clover) aereal parts are the isoflavones formononetin and biochanin A, related to its pharmacological activities. These compounds are known as phytoestrogens due to its similarity to the structure of 17-β-estradiol, being able to bind to the estrogen receptor (ERβ and ERα). Aglicones of isoflavones display low water solubility limiting its incorporation in products for the skin and expression of its biological activity. The present work aims to develop a isoflavones-enriched fraction of T. pratense and to evaluate the skin permeation of the aglicones formononetin and biochanin A individually, and in association. Moreover the promoter effect of cyclodextrins on their skin permeation will also be evaluated. The enriched-fraction was prepared by maceration in ethanol 40% (v/v). The ethanol was evaporated and the dispersion was filtered. The supernatant was purified using a column chromatography packet with polyamide. The final product was dried and presented a concentration of 2.8 mg/g of formononetin and 2.7 mg/g of biochanin A. However, these amounts of isoflavones were not enough for subsequent incorporation into a formulation to proceed the cutaneous permeation tests. In this context, the permeation studies were performed using the chemical reference formononetin and biochanin A, incorporated into the hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) hydrogels for the permeation studies on porcine ear skin (Franz cells). To evaluate the isoflavone concentration in the formulations and in the different skin layers, a bioanalytical method was validated using high performance liquid chromatography (HPLC), which showed linearity, specificity, accuracy, precision and robusteness. Hydrogels were developed using HPMC (Methocel® K4M) polymer (3.5%, m/v) and the isoflavones were incorporated into this base individually or in combination, in the presence or absence of hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) or methyl-β-cyclodextrin (MβCD). The results obtained in the cutaneous permeation tests showed higher permeation values when the isoflavones were individually incorporated into the formulations especially for formononetin. Biochanin A showed higher permeation capacity when compared to formononetin, reaching 0.5 μg/cm2 in the epidermis and 1.5 μg/cm2 in the dermis, representing about 2.7 times the concentration of formononetin (0.2 μg/cm2 and 0.4 μg/cm2). The use of cyclodextrins increased significantly the permeation values of formononetin, both in the epidermis and in the dermis. For biochanin A only the retention in the epidermis was increased. HPβCD was the cyclodextrin that showed the best results for formononetin as permeation promoter, providing an increasing in the epidermis and dermis of 113%. Both cyclodextrins improved the biochanin A permeation in the same proportion in the epidermis (37%). When the isoflavones were incorporated into hydrogels together (1:1 ratio), formononetin showed less retention in both skin layers (0.1 μg/cm2 in the epidermis and 0.4 μg/cm2 in the dermis) and biochanin A remained with similar performance when added alone. In the presence of cyclodextrins, no significant effect was observed in the promotion of skin permeation of isoflavones in mixtures, except for formononetin, in the epidermis. Taken together, the results indicated that formononetin and biochanin A present skin permeation being mostly retained in the epidermis and dermis, revealing its potential use in cosmetic products preparations for preventing skin aging. Cyclodextrins presented a marked skin permeation promoting effect only on formononetin, which molecule presents lower permeability.

A formononetina e a biochanina A são as isoflavonas majoritárias nas partes aéreas de Trifolium pratense L. (trevo-vermelho) relacionadas com as principais atividades farmacológicas da planta. São chamadas de fitoestrógenos, pois possuem estrutura similar ao do 17-β-estradiol, e são capazes de se ligar aos receptores estrogênicos (ERβ e ERα). As isoflavonas agliconas são moléculas de baixa hidrossolubilidade, o que pode limitar sua aplicação em produtos para pele e a expressão de sua atividade biológica. O presente trabalho tem como objetivo obter uma fração enriquecida em isoflavonas de T. pratense e avaliar a permeação cutânea das agliconas formononetina e biochanina A individualmente e associadas. Adicionalmente, o efeito de promoção da permeação cutânea em pele de orelha suina também foi objeto do estudo. A fração foi preparada por maceração e após precipitação das isoflavonas agliconas por evaporação do etanol, o precipitado foi separado por filtração e purificado por cromatografia em coluna de poliamida. O produto foi seco e apresentou concentração de isoflavonas de 2,8 mg/g de formononetina e 2,7 mg/g de biochanina A. No entanto, essa concentração ainda não foi suficiente para posterior incorporação em uma formulação visando testes de permeação cutanea. Neste contexto, os estudos de permeação em pele de orelha de suíno (Franz cells) foram realizados com as isoflavonas majoritárias de referência incorporadas à hidrogéis de hidroxipropilmetilcellulose (HPMC). Para avaliar o teor de isoflavonas nas formulações e nas diferentes camadas da pele foi desenvolvido método bioanalítico utilizando cromatografia líquida de alta eficiência, o qual mostrou-se linear, específico, exato, preciso e robusto. Os hidrogéis foram desenvolvidos utilizando como polímero HPMC (3,5%, m/v) e as isoflavonas (0,1%) foram incorporadas à essa base, individualmente ou associadas, em presença ou ausência de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD) ou metil-β-ciclodextrina (MβCD). Os resultados obtidos na avaliação da permeação cutânea revelaram que as isoflavonas permearam mais quando incorporadas individualmente na base especialmente a formononetina. A biochanina A apresentou maior capacidade de permeação do que a formononetina, alcançando concentrações na epiderme de 0,5 ug/cm2 e na derme de 1,5 μg/cm2, representando cerca de 2,7 vezes mais comparando com a concentração de formononetina (respectivamente, 0,2 μg/cm2 e 0,4 μg/cm2). uso de ciclodextrinas aumentou significativamente a permeação da formononetina, tanto na epiderme quanto na derme. Para a biochanina A, apenas a retenção na epiderme foi aumentada com a presença de ciclodextrinas. A HPβCD foi a ciclodextrina que apresentou os melhores resultados de promoção da permeação da formononetina na derme e epiderme, proporcionando um aumento de 113%. Para a biochanina A, as duas ciclodextrinas aumentaram a sua concentração na epiderme na mesma proporção (37%). Quando as duas isoflavonas foram incorporadas em misturas 1:1 no hidrogel, a formononetina apresentou menor retenção, tanto na epiderme (0,1 μg/cm2) quanto na derme (0,4 μg/cm2). Contrariamente, a biochanina A apresentou retenção semelhante àquela apresentada quando foi incorporada isoladamente no hidrogel, caracterizando-se como uma molécula mais permeável e não sofrendo interferência da formononetina na sua permeação e retenção. Não foi observado efeito significativo da presença das ciclodextrinas na promoção da permeação cutânea das isoflavonas nas misturas, exceto para a formononetina, na epiderme. O conjunto dos resultados demonstrou que a formononetina e biochanina A são capazes de permear a pele sendo majoritariamente retidas na epiderme e na derme, revelando o seu potencial uso em preparações cosméticas destinadas à prevenção do envelhecimento cutâneo. As ciclodextrinas apresentaram acentuado efeito promotor da permeação cutânea apenas para a formononetina, que apresenta menor permeabilidade. / The main isoflavones present Trifolium pratense L. (red clover) aereal parts are the isoflavones formononetin and biochanin A, related to its pharmacological activities. These compounds are known as phytoestrogens due to its similarity to the structure of 17-β-estradiol, being able to bind to the estrogen receptor (ERβ and ERα). Aglicones of isoflavones display low water solubility limiting its incorporation in products for the skin and expression of its biological activity. The present work aims to develop a isoflavones-enriched fraction of T. pratense and to evaluate the skin permeation of the aglicones formononetin and biochanin A individually, and in association. Moreover the promoter effect of cyclodextrins on their skin permeation will also be evaluated. The enriched-fraction was prepared by maceration in ethanol 40% (v/v). The ethanol was evaporated and the dispersion was filtered. The supernatant was purified using a column chromatography packet with polyamide. The final product was dried and presented a concentration of 2.8 mg/g of formononetin and 2.7 mg/g of biochanin A. However, these amounts of isoflavones were not enough for subsequent incorporation into a formulation to proceed the cutaneous permeation tests. In this context, the permeation studies were performed using the chemical reference formononetin and biochanin A, incorporated into the hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) hydrogels for the permeation studies on porcine ear skin (Franz cells). To evaluate the isoflavone concentration in the formulations and in the different skin layers, a bioanalytical method was validated using high performance liquid chromatography (HPLC), which showed linearity, specificity, accuracy, precision and robusteness. Hydrogels were developed using HPMC (Methocel® K4M) polymer (3.5%, m/v) and the isoflavones were incorporated into this base individually or in combination, in the presence or absence of hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) or methyl-β-cyclodextrin (MβCD). The results obtained in the cutaneous permeation tests showed higher permeation values when the isoflavones were individually incorporated into the formulations especially for formononetin. Biochanin A showed higher permeation capacity when compared to formononetin, reaching 0.5 μg/cm2 in the epidermis and 1.5 μg/cm2 in the dermis, representing about 2.7 times the concentration of formononetin (0.2 μg/cm2 and 0.4 μg/cm2). The use of cyclodextrins increased significantly the permeation values of formononetin, both in the epidermis and in the dermis. For biochanin A only the retention in the epidermis was increased. HPβCD was the cyclodextrin that showed the best results for formononetin as permeation promoter, providing an increasing in the epidermis and dermis of 113%. Both cyclodextrins improved the biochanin A permeation in the same proportion in the epidermis (37%). When the isoflavones were incorporated into hydrogels together (1:1 ratio), formononetin showed less retention in both skin layers (0.1 μg/cm2 in the epidermis and 0.4 μg/cm2 in the dermis) and biochanin A remained with similar performance when added alone. In the presence of cyclodextrins, no significant effect was observed in the promotion of skin permeation of isoflavones in mixtures, except for formononetin, in the epidermis. Taken together, the results indicated that formononetin and biochanin A present skin permeation being mostly retained in the epidermis and dermis, revealing its potential use in cosmetic products preparations for preventing skin aging. Cyclodextrins presented a marked skin permeation promoting effect only on formononetin, which molecule presents lower permeability.

Diss. (sammanfattning). Umeå : Sveriges lantbruksuniv. / Härtill 4 uppsatser.