Les dinoflagellés sont des microorganismes marins (phytoplanctons) qui ont démontrés être source importante de toxines. Une attention particulière a été donnée au genre Amphidinium, qui a la particularité de vivre en symbiose avec des vers plats marins (plathelminthe) présents dans la baie d’Okinawa. L’équipe du professeur Kobayashi a isolé différentes espèces d’Amphidinium et élucidé les structures de ces métabolites secondaires: les amphidinolides. Kobayashi et ses collaborateurs ont ensuite déterminé l’activité cytotoxique de ces molécules. En particulier, nous nous sommes tournés vers la synthèse de l’amphidinolide N car il a montré une puissante activité cytotoxique : CI50= 0.08nM sur cellules L1210 (lymphome), CI50= 0.09 nM sur cellules KB (carcinome). Afin d’obtenir cette molécule, nous avons développé une stratégie convergente basée sur l’assemblage de quatre fragments principaux : C1-C5, C6-C12, C13-C17 et C18-C29. Le fragment C1-C5 a été synthétisé en suivant deux stratégies différentes : la première nous a donné le composé souhaité en six étapes avec un rendement global de 8,4%, la deuxième stratégie a permis d’obtenir ce fragment en sept étapes avec un rendement global de 3,8%. Les deux procédures ont permis la formation de ce synthon en contrôlant la configuration des centres stéréogènes, néanmoins la deuxième stratégie a permis l’obtention d’intermédiaires plus stables. Le synthon C6-C12 a pu être formé au bout de dix étapes avec un rendement global satisfaisant de 9,4%. La chimie développée est robuste et les réactions sont répétables avec des bons rendements. Le fragment C13-C17 a été formé en trois étapes avec un rendement global de 40,6% ; la configuration absolue a été assurée par le produit naturel utilisé au cours de la synthèse. Le dernier fragment, C18-C29, a pu être synthétisé au bout de neuf étapes avec un rendement global de 19,4% à partir de l’acide D-glutamique, produit d’origine naturelle. L’assemblage des fragments C1-C5 et C6-C12 a été réalisé grâce au couplage de Stille. Malgré tout, il faudrait envisager une solution alternative pour l’obtention du fragment C1-C12 à cause de la mauvaise reproductibilité du couplage de Stille. La partie C13-C29 a pu être couplée avec succès grâce à des réactions d’ouverture d’époxydes. D’autres études et essais seraient requis pour coupler les deux macro-fragments (C1-C12 et C13-C29) et terminer ainsi la synthèse totale de l’amphidinolide N. / The dinoflagellates are marine organisms (phytoplancton) that have shown to be a major source of toxins. Special attention was given to gender Amphidinium, which has the particularity of living in symbiosis with marine flatworms present in the bay of Okinawa (Japan). The team of professor Kobayashi has isolated different species of Amphidinium and elucidated the structures of their secondary metabolites: the amphidinolides. Kobayashi and colleagues then determined the cytotoxic activity of these molecules. In particular we decided to synthesize amphidinolide N because of his cytotoxic activity: IC50 = 0.08 nM on L1210 cells (lymphoma), IC50 = 0.09 nM on KB cells (carcinoma). To achieve this molecule we have developed a strategy based on a convergent assembly of four main fragments: C1-C5, C6-C12, C13-C17 and C18-C29. C1-C5 fragment has been synthesized following two different strategies: the first one gave us the desired compound in six steps and with a global yield of 8.4%, the second strategy allowed us to obtain this fragment in seven steps with a global yield of 3.8%. The two procedures gave us the C1-C5 portion controlling the configurations of the stereogenic centres, although the second strategy gave us the possibility to obtain more stables intermediates. C6-C12 fragment has been obtained in ten steps with a good global yield of 9.4%. The chemistry developed is strong; the reactions are repeatable with good results. C13-C17 fragment has been synthesized in three steps with a global yield of 40.6%; the absolute configuration has been assured by the natural compound used as starting material. The last fragment, C18-C29, has been obtained from natutal D-glutamic acid in nine steps, with a global yield of 19.4%. The assembly of C1-C5 fragment and C6-C12 has been realized with Stille’s coupling, although an alternative strategy is needed because of the lack of reproducibility. C13-C29 fragment has been successfully obtained by epoxydes opening reactions. Further studies and trial are needed to couple the two macro-fragments (C1-C12 and C13-C29) and finish the total synthesis of amphidinolide N.

タンデトロン加速器質量分析計業績報告

Les dinoflagellés jouent un rôle très important dans l’écologie des océans en y réalisant une grande partie de la production primaire, en formant une association symbiotique avec les coraux et en ayant la capacité de produire des fleurs d’algues potentiellement toxiques pour les communautés côtières humaines et animales. Malgré tout, la biologie moléculaire des dinoflagellés n’a que très peu été étudiée dans les dernières années, les connaissances de processus de base comme la régulation de la transcription y étant fortement limitées. Une tentative pour élucider ce mécanisme a été réalisée chez les dinoflagellés photosynthétiques Lingulodinium polyedrum et Amphidinium carterae. Une expérience d’induction de la transcription du gène de la Peridinin chlorophyll-a binding protein, le complexe majeur de collecte de lumière, a été réalisée par une baisse de l’intensité lumineuse et a montré une faible augmentation (moins de 2 fois) du transcrit à court et long terme. Des expériences de simple-hybride et de retard sur gel (EMSA) ont été faits pour identifier de potentielles interactions protéine-ADN dans la région intergénique du gène PCP organisé en tandem. Ces essais ont été infructueux pour identifier de telles protéines. Une analyse du transcriptome de L. polyedrum a été effectuée, montrant une importante sous-représentation de domaines de liaison à l’ADN classique (comme Heat-shock factor, bZIP ou Myb) et une surreprésentation du domaine d’origine bactérienne Cold shock en comparaison avec d’autres eucaryotes unicellulaires. Ce travail suggère que les mécanismes de régulation transcriptionnelle des dinoflagellés pourraient différer substantiellement de ceux des autres eucaryotes. / Dinoflagellates are an important part of the ocean’s ecology due to their large contribution to global carbon fixation, the symbiotic association they can make with corals and by their ability to form algal blooms potentially toxic for humans and animals in coastal communities. However, the molecular biology of dinoflagellates has been poorly studied in the past. Basic knowledge, such as regulation of gene expression, is severely limited. An attempt at deciphering basic gene regulation has been undertaken in the photosynthetic dinoflagellate Lingulodinium polyedrum and Amphidinium carterae using a reduction in available light intensity to induce the expression of the peridinin chlorophyll-a binding gene encoding the major light harvesting complex protein. A small increase in transcript abundance (less than 2 fold) was found in both short and long term experiments, yet neither yeast one-hybrid assays nor electrophoretic mobility shift assays (EMSA) showed any potential protein interactions with sequence derived from the intergenic spacer of the PCP tandem gene array. Interestingly, an analysis of the recently sequenced L. polyedrum transcriptome revealed an important under-representation of classic DNA-binding domains (such has Heat-shock factor, bZIP and Myb) and an over-representation of the bacterial cold-shock DNA-binding domain. This suggested that components of the transcription regulation machinery may be at least partially different in dinoflagellates.

Les dinoflagellés jouent un rôle très important dans l’écologie des océans en y réalisant une grande partie de la production primaire, en formant une association symbiotique avec les coraux et en ayant la capacité de produire des fleurs d’algues potentiellement toxiques pour les communautés côtières humaines et animales. Malgré tout, la biologie moléculaire des dinoflagellés n’a que très peu été étudiée dans les dernières années, les connaissances de processus de base comme la régulation de la transcription y étant fortement limitées. Une tentative pour élucider ce mécanisme a été réalisée chez les dinoflagellés photosynthétiques Lingulodinium polyedrum et Amphidinium carterae. Une expérience d’induction de la transcription du gène de la Peridinin chlorophyll-a binding protein, le complexe majeur de collecte de lumière, a été réalisée par une baisse de l’intensité lumineuse et a montré une faible augmentation (moins de 2 fois) du transcrit à court et long terme. Des expériences de simple-hybride et de retard sur gel (EMSA) ont été faits pour identifier de potentielles interactions protéine-ADN dans la région intergénique du gène PCP organisé en tandem. Ces essais ont été infructueux pour identifier de telles protéines. Une analyse du transcriptome de L. polyedrum a été effectuée, montrant une importante sous-représentation de domaines de liaison à l’ADN classique (comme Heat-shock factor, bZIP ou Myb) et une surreprésentation du domaine d’origine bactérienne Cold shock en comparaison avec d’autres eucaryotes unicellulaires. Ce travail suggère que les mécanismes de régulation transcriptionnelle des dinoflagellés pourraient différer substantiellement de ceux des autres eucaryotes. / Dinoflagellates are an important part of the ocean’s ecology due to their large contribution to global carbon fixation, the symbiotic association they can make with corals and by their ability to form algal blooms potentially toxic for humans and animals in coastal communities. However, the molecular biology of dinoflagellates has been poorly studied in the past. Basic knowledge, such as regulation of gene expression, is severely limited. An attempt at deciphering basic gene regulation has been undertaken in the photosynthetic dinoflagellate Lingulodinium polyedrum and Amphidinium carterae using a reduction in available light intensity to induce the expression of the peridinin chlorophyll-a binding gene encoding the major light harvesting complex protein. A small increase in transcript abundance (less than 2 fold) was found in both short and long term experiments, yet neither yeast one-hybrid assays nor electrophoretic mobility shift assays (EMSA) showed any potential protein interactions with sequence derived from the intergenic spacer of the PCP tandem gene array. Interestingly, an analysis of the recently sequenced L. polyedrum transcriptome revealed an important under-representation of classic DNA-binding domains (such has Heat-shock factor, bZIP and Myb) and an over-representation of the bacterial cold-shock DNA-binding domain. This suggested that components of the transcription regulation machinery may be at least partially different in dinoflagellates.