Les nucléotides, en tant que seconds messagers (AMPc et GMPc) et qu’agonistes des récepteurs purinergiques (ADP, ATP, UDP et UTP) jouent de nombreux rôles dans la régulation des processus physiologiques et pathologiques. Bien que les réponses physiologiques impliquant les nucléotides ne se limitent pas aux maladies cardiovasculaires, ce projet s’est focalisé sur celles-ci, en particulier sur l’athérosclérose, le dysfonctionnement endothélial et l’anévrisme cérébral étant donné que notre laboratoire s’intéresse de près aux phénomènes inflammatoires liés à ces pathologies. Il est par exemple reconnu que les variations des taux d’AMPc et de GMPc peuvent réguler la fonction de la barrière endothéliale (via les phosphodiestérases qui les hydrolysent respectivement en AMP et GMP inactives et via les cyclases qui les synthétisent à partir des nucléotides triphosphates) et donc causer le dysfonctionnement endothélial qui est une cause sous-jacente de plusieurs conditions pathologiques telle que l’athérosclérose. Mais aussi, que le relargage de l’ATP par les fibres sympathiques dans les cellules musculaires lisses peut causer une augmentation de la pression sanguine et qu’une augmentation de l’ADP extracellulaire mène à l’agrégation plaquettaire (via les récepteurs purinergiques). Ces deux phénomènes sont associés au développement de l’athérosclérose et des anévrismes. Il est également avéré que l’ATP et l’UTP libérés par les globules rouges lors de lésions de ceux-ci permettent une vasodilatation par l’activation de la NO synthase endothéliale. L’UTP libéré peut également être métabolisé en UDP, un agoniste des récepteurs P2Y6 impliqué dans l’activation des macrophages et dans la production de NO. Suite à toutes ces implications des nucléotides dans les processus inflammatoires et le fait que la littérature n’offrait aucune méthode permettant le dosage et la séparation simultanée des neufs nucléotides étudiés dans ce travail, il semblait essentiel de développer et de valider une nouvelle méthode LC-MS/MS permettant ce dosage. Dans un premier temps, deux méthodes d’extraction des nucléotides ont été mises au point, à savoir une méthode par de l’EtOH à froid suivi d’une lyophilisation puis d’une reprise par de l’H2O milliQ ;alternativement, nous avons utilisé une méthode d’extraction par du PCA 8 %. Une méthode analytique LC-MS/MS a été développée et validée pour neuf nucléotides :AMP, vi ADP, ATP, UMP, UDP, UTP, GMP, AMPc et GMPc avec l’avantage de quantifier ces neufs nucléotides simultanément en moins de 10 minutes. Dans un deuxième temps, les résultats obtenus avec la méthode LC-MS/MS pour trois des nucléotides (AMPc, ADP et ATP) ont été comparés à ceux obtenus avec des kits vendus dans le commerce (cAMP Enzyme Immunoassay kit, ADP Assay kit, ATP Bioluminescent Assay kit) pour appuyer la validation de cette méthode de quantification. Les résultats ont montré une erreur relative allant de 6,8 à 11,7 % par rapport aux valeurs obtenues avec les kits qui sont des références en la matière quant à la quantification de ces nucléotides. Dans un troisième temps, la méthode a été testée in vitro sur des cellules endothéliales EA.Hy926 stimulées par du TNF-α, des Ox-LDLs, des LDLs natives ou des Mox-LDLs en présence ou non d’inhibiteurs de phosphodiestérases, et in vivo sur du plasma et des globules rouges de donneurs sains avant et après stase veineuse et de patients atteints d’anévrisme cérébral avant et après la pose d’un stent. Ces analyses ont été possibles grâce à la validation préalable de la méthode et ont permis de nouvelles observations quant à la variation des taux de nucléotides lors de processus inflammatoires. En conclusion, ce travail nous a permis de mettre au point deux méthodes d’extraction des nucléotides et de développer une méthode LC-MS/MS précise, sensible et exacte pour la quantification de neufs nucléotides impliqués dans des phénomènes inflammatoires de pathologies cardiovasculaires. Ce projet a également permis l’analyse in vitro et in vivo de ces neufs nucléotides dans différentes matrices et dans différentes conditions physiopathologiques menant effectivement à des variations des taux de ceux-ci. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Biopharmaceuticals are becoming one of the most promising drugs on the market mainly due to their successful treatment of a vast array of serious diseases, such as cancers, immune disorders, and infections. Structurally, biopharmaceuticals are proteins and it is important to mention that more than 60 % of biopharmaceuticals are glycosylated. Glycosylation is one of the most common posttranslational modifications. It is also the most demanding and the most complex posttranslational modification. The research showed that glycosylation can significantly impact on the safety, efficiency, and quality of the therapeutic glycoproteins. In the first part of the introduction of the present thesis, the development of the therapeutic glycoproteins and their classification were reviewed. Glycosylation process and nomenclature were also discussed. The second part of the introduction revealed current issues in the field of the production and the characterization of the therapeutic glycoproteins. In the context of the doctoral thesis, we introduced new approach, namely hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to a high-resolution mass spectrometer (HILIC-HR-MS) combined with Principal Component Analysis (PCA) and classification through Soft Independent Modelling by Class Analogy (SIMCA) data treatment. Accordingly, N-glycans were first enzymatically released using peptide-N-glycosidase F (PNGase F) and reduced using sodium borohydride. Then those N-glycans were separated by HILIC and detected by HR-MS. PCA and SIMCA simplified interpretation of the MS data collected in the huge tables. PCA was applied to test whether it is possible to visualize N-glycosylation differences between samples and to help identifying within which N-glycans changes occurred. SIMCA, which is a more complex data analysis technique, was applied to build and validate a classification models. SIMCA was also applied to verify whether it is possible to use built models to classify real samples. Described approach enabled us to detect small changes in N-glycosylation of the therapeutic glycoproteins (a change of only 1% in relative glycan abundance). It was applied to assess changes in N-glycosylation of therapeutic glycoproteins. Accordingly, we tested N-glycosylation consistency between batches of infliximab, trastuzumab, and bevacizumab and monitored the N-glycosylation of bevacizumab over storage time in plastic syringes.Furthermore, we worked on the faster sample preparation technique, where online-solid-phase extraction (SPE)-LC was combined to the previously mentioned HILIC-MS-PCA/SIMCA method. Online-SPE-LC allowed us to faster the sample preparation in terms of avoiding time-consuming cleaning steps. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished