Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) is a growth factor needed to initiate fracture repair and is involved in the differentiation of progenitor cells to the osteochondral lineage. Osteogenesis and angiogenesis are coupled processes, however the mechanism by which these processes are coupled and the role that BMP2 plays in coupling these processes is not well understood. In distraction osteogenesis, a bone regeneration model mediated by mechanical distraction of an osteotomy, BMP2 expression was primarily associated with blood vessels. Therefore, transgenic mice were used to conditionally delete BMP2 expression (BMP2-cKO) in smooth muscle cells during distraction osteogenesis to identify the role of BMP2 in osteogenesis and angiogenesis. Vessel formation was characterized by vascular perfusion of animals with a barium-gelatin solution, which was used as a radiographic contrast agent that allowed vessel formation to be quantified by micro-computer assisted tomography (µCT). Using the same transgenic mice to label those cells in which BMP2 had been deleted, histological analysis was performed to confirm the targeting specificity of the BMP2-cKO. µCT analysis showed less bone formation occurred in the BMP2-cKO animals compared to controls. The µCT analysis further showed vessel volume and thickness were decreased in BMP2-cKO animals at both day 17 and 31, suggesting that there is a relationship between BMP2 and vessel size. Vessel number was greater in controls than the BMP2-cKO animals at day 17, however the BMP2-cKO animals had a larger vessel number than the number by day 31. Histological analysis confirmed knockout of BMP2 expression in smooth muscle cells, as well as in skeletal muscle and chondrocytes. These results suggest the importance of BMP2, not only in bone formation, but also in vessel morphogenesis.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-04-02T13:33:04Z No. of bitstreams: 1 Delsilene Borges. Avaliação...2013.pdf: 2874154 bytes, checksum: 062e7af1c2af767178820b1b4d1d1bc7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-02T13:33:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Delsilene Borges. Avaliação...2013.pdf: 2874154 bytes, checksum: 062e7af1c2af767178820b1b4d1d1bc7 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Na esquistossomose mansônica o fígado é o órgão alvo das agressões patogênicas, onde as lesões hepáticas caracterizam-se principalmente pela presença de granulomas periovulares e formação de fibrose periportal, além de alterações vasculares responsáveis pela hipertensão dentro do sistema venoso portal. A angiogênese precede a maioria dos casos de fibrose, onde se verifica participação direta das células estreladas hepáticas (CEH) e das células endoteliais sinusoidais (CES) que são estimuladas, principalmente por macrófagos do tipo II (M2) – ativados alternativamente. O tratamento para esquistossomose é feito pelo uso do praziquantel (PZQ), o qual é capaz de promover cura parasitológica e reparo das lesões hepáticas, todavia pouco se sabe sobre os componentes celulares envolvidos na angiogênese durante o reparo do fígado. Este trabalho teve como objetivo estudar o remodelamento das lesões hepáticas pós-tratamento e investigar a participação das CEH, CES e macrófagos M2 no processo de reparo das lesões. Após aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-CPqGM), protocolo nº 006/2011, 80 camundongos Swiss Webstar foram utilizados, destes 70 foram infectados com 50 cercárias do Schistossoma mansoni e dez permaneceram intactos. Quatro meses após infecção foi realizado tratamento com PZQ (400mg/Kg) em parte dos animais infectados, formando assim três grupos: um controle, um infectado não tratado e outro infectado e tratado. Em diferentes intervalos de tempo foram realizadas três hepatectomias parciais: a primeira com quatro meses de infecção (antes do tratamento); a segunda com seis meses de infecção e dois meses de tratamento; a terceira com oito meses de infecção e quatro de tratamento. Os fragmentos hepáticos coletados foram submetidos a avaliações morfológicas e estudos imuno-histoquímicos para visualização de componentes celulares – macrófagos M2 (Ym1), CEH (α-SMA) e CES (CD31). Análises morfométricas foram realizadas para quantificação do percentual de tecido fibroso e das células imunomarcadas. Nossos resultados demonstraram que após dois meses de tratamento com PZQ foi possível observar reabsorção do tecido fibroso hepático com redução da expressão de macrófagos M2 e CEH. Quatro meses após a quimioterapia verifica-se aumento no número de células endoteliais. Esses resultados sugerem que macrófagos M2 e CEH têm participação ativa na formação do tecido fibroso, exercendo pouca influência na fase involutiva do granuloma. Todavia, a intensa proliferação de CES nos granulomas involutivos, confirma o importante papel da angiogênese no remodelamento das lesões hepáticas. / The liver is a target for pathogenic attacks during schistosomiasis, showing periovular granulomas and the formation of periportal fibrosis, besides vascular changes responsible for hypertension within portal venous system. Angiogenesis precedes most cases of fibrosis, which can be verified the presence of hepatic stellate cells (HSC) and liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) stimulated mostly by macrophages type II (M2) – alternatively activated. Schistosomiasis treatment is based on praziquantel (PZQ), which enables parasitological cure and resolution of liver cells. However, knowledge regarding active cell components on angiogenesis during liver regeneration is scarce. Our goal was to study the remodeling of liver injuries during post-treatment phase and investigate the role of HSC, LSEC and macrophages (M2) on the process of resolution of injuries. After the approval of ethical committee for animal research of the CPQGM-FIOCRUZ, record number 006/2011, 80 mice Swiss Webstar were used, which 70 were infected by 50 cercariae of Schistossoma mansoni and ten remained intact. Four months after infection a treatment with PZQ (400mg/Kg) was started in part of infected animals, constituting three different groups: normal, non-treated infected and treated and infected. In different times three partial hepatectomias were made: the first on four months of infection (before treatment); the second with six months of infection and two months of treatment; and the third with eight months of infection and four months of treatment. In all liver fragments collected for morphological evaluations were performed and immunohistochemistry studies were made to visualize macrophages M2 (Yml), HSC (α-SMA) and LSEC (CD31). Morphometric analysis was performed to quantify percentage of fibrosis and the immunostainig cells. Our results show that after two months of PQZ treatment it is possible to observe fibrosis resorption in the liver, with reduction of macrophages M2 expression and HSC. Four months after chemotherapy an increase on the number of LSEC was verified. These results suggest that macrophages M2 and HSC are active on the formation of fibrosis tissue, playing little influence on the evolving phase of the granuloma. Nevertheless, intense proliferation of LSEC observed on involute granulomas confirm the important role for angiogenesis on remodeling of liver injuries.

OBJETIVO: demonstrar as alterações histológicas secundárias ao uso de bevacizumabe na aorta descendente de suínos submetida à interrupção dos vasa vasorum. MATERIAIS E MÉTODOS: em doze suínos, divididos em grupos tratamento e controle (n=6 cada) foi realizada dissecção por 5 cm da aorta torácica, ligadura das artérias intercostais e cobertura com polivinil; o grupo tratamento recebeu uma dose endovenosa única de bevacizumabe. Após quinze dias, os animais foram sacrificados para retirada da artéria e preparo das lâminas histológicas dos grupos tratamento, controle e área não manipulada dos dois grupos. As lâminas foram analisadas com relação aos graus de angiogênese, injúria, inflamação e espessamento intimal. A análise estatística foi conduzida através da média e do desvio-padrão dos escores e as comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney. Para obtenção de intervalos de confiança de 95% para as médias das contagens dos escores utilizou-se a distribuição de Poisson, a fim de determinar o efeito estatístico. RESULTADOS: o bevacizumabe causou parefeitos em todos os suínos tratados, com um óbito. As variáveis analisadas através da Escala de Magnitude para Efeito Estatístico, demonstram tendência de redução da angiogênese e da injúria e de aumento da inflamação no limite do moderado. Não ocorreu modificação do espessamento intimal entre os grupos. CONCLUSÃO: a medicação utilizada na lesão da parede arterial induzindo hipóxia, mostrou tendência de redução da angiogênese e da injúria, mas não reduziu o processo inflamatório ou o espessamento intimal da parede arterial. O bevacizumabe mostrou toxicidade no modelo suíno. / OBJECTIVE: To demonstrate histological changes secondary to the use of bevacizumab in the descending aorta of pigs after interruption of vasa vasorum flow. METHODS: Twelve pigs were divided into control and treatment groups (n = 6 each). It was performed a 5-cm dissection of the thoracic aorta, ligation of the intercostal arteries and protection with polyvinyl chloride. Pigs in the treatment group received a single intravenous dose of bevacizumab. After 15 days, the animals were euthanized and the aorta removed. Histological slides were prepared for control and treatment groups and for the non-surgically manipulated part of the aorta in both groups. The slides were analyzed for the degree of angiogenesis, injury, inflammation, and intimal thickening. Data were expressed as mean (SD) of scores and groups were compared using the Mann-Whitney test. The Poisson distribution was used to calculate 95% confidence intervals for the mean scores in order to determine effect statistics. RESULTS: Bevacizumab had adverse effects on all treated pigs, leading to one death. The analysis using a scale of magnitudes for effect statistics showed a trend toward a decrease in angiogenesis and injury and an increase in inflammation for moderate effects. There was no change in intimal thickening in either group. CONCLUSION: The medication used for arterial wall injury inducing hypoxia showed a trend toward reduced angiogenesis and injury, but with no reduction in the inflammatory process or intimal thickening of the arterial wall. Bevacizumab showed toxicity in the porcine model.

Angiogenesis is the process of new blood vessel sprouting from pre-existing vessels and is responsible for generating the majority of nascent vessels during development, tissue regeneration and disease. During angiogenesis, sprouting endothelial cells (ECs) are organised into leading 'tip' cells (TCs) and trailing 'stalk' cells (SCs). This hierarchal organisation of TCs and SCs is essential for the coordinated collective migration of ECs during sprouting. However, the precise mechanisms that define TC verses SC behaviour and identity remains uncertain. Transcriptomic analysis of sprouting vessels in zebrafish embryos led to the identification of a novel TC-associated gene, transmembrane 4 L six family member 1 (tm4sf1). We find that tm4sf1 expression is tightly spatiotemporally restricted to migrating TCs during intersegmental vessel (ISV) sprouting in zebrafish. Furthermore, TC tm4sf1 expression is controlled by the vascular endothelial growth factor receptor (Vegfr) - Notch signalling axis. Morpholino oligonucleotide (MO)-mediated knockdown of tm4sf1 reveals a subtle delay in ISV sprouting upon loss of tm4sf1 expression. Moreover, using multiplexed, real-time imaging approaches and in-depth analysis of TC and SC behaviours at single cell resolution, we reveal that the delay in ISV sprouting is specifically due to reduced TC motility. Furthermore, we find that tm4sf1 functions to induce TC motility in the leading daughter cell following TC mitosis, to rapidly re-establish post-mitotic TC behaviour. Generation of tm4sf1 mutant zebrafish lines using both transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) confirms that Tm4sf1 modulates TC behaviour. Additionally, mechanistic studies in human ECs reveal that tm4sf1 regulates VEGFR-mediated signalling upon VEGF-stimulation, which subsequently controls cell migration and expression of the TC determinants, DLL4 and VEGFR2. Hence, our results suggest that tm4sf1 is a novel modulator of the TC-SC hierarchy and collective EC migration during ISV sprouting. Overall, these findings have potential therapeutic implications since tm4sf1 may be a promising target for the manipulation of pathological angiogenesis in disease.

Orientador: Carlos Alberto de Souza Costa / Banca: Jacques Eduardo Nör / Banca: Flávio Fernando Demarco / Banca: Joni Cirelli / Banca: Elisa Maria Aparecida Giro / Resumo: Luxações dentárias resultam em injúrias ao feixe vásculo-nervoso, o que pode causar redução significante no nível de oxigênio das polpas dentárias, ou mesmo morte deste tecido conjuntivo especializado. O conhecimento dos mecanismos envolvidos na resposta das células pulpares à hipóxia pode melhorar o prognóstico dos tratamentos das luxações dentárias. O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento de células-tronco (DPSC) e de fibroblastos (HDPF) de polpas dentárias humanas em condições de hipóxia e a capacidade destas em estimular a proliferação e formação de tubos capilares por células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HDMEC). As análises do western blot e imunocitoquímica foram realizadas para avaliar o efeito da hipóxia na ativação do fator de transcrição induzido pela hipóxia 1 (HIF-1alfa). A expressão dos fatores de crescimento vascular endotelial (VEGF) e fibroblástico básico (bFGF) foi avaliada pelos testes de imunoensaio ELISA. O efeito do HIF-1alfa na expressão do VEGF foi avaliado pelo tratamento das células DPSC e HDPF com 40 μM YC-1, inibidor do HIF-1alfa. Para a avaliação da angiogênese in vitro, os testes de proliferação celular (WST-1) e de formação de tubos capilares em gel de colágeno foram realizados após tratamento das células HDMEC com os meios de acondicionamento das células DPSC ou HDPF, em condições de normóxia ou hipóxia.. A análise dos dados obtidos foi realizada por testes estatísticos não-paramétricos com nível de significância de 5%. Aumento da atividade do HIF-1alfa e da expressão de VEGF foram observados nas células DPSC e HDPF em condições de hipóxia. Entretanto, não foram observadas alterações nos níveis de expressão de bFGF. A expressão do HIF-1alfa foi inibida... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dental luxations can result in the severing of the dental pulp and the creation of a hypoxic environment that might lead to the death of the pulp tissue. Improved understanding of the mechanisms underlying the response of dental pulp cells to hypoxic conditions might lead to better treatment of dental luxations. The purpose of this work was to evaluate the behavior of Dental Pulp Stem Cells (DPSC) and Human Dental Pulp Fibroblasts (HDPF) under hypoxia and their ability to stimulate proliferation and sprouting of endothelial cells. Western blots and immunohistochemistry were used to evaluate the effect of hypoxia on the activation of the transcriptional factor HIF-1α. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and Basic Fibroblastic Growth Factor (bFGF) expression was evaluated by ELISA. The effect of HIF-1αon VEGF expression was evaluated by treating DPSC or HDPF with 40 μM YC-1, an inhibitor of HIF-1α. To evaluate the angiogenic potential of dental pulp cells in vitro, human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) were treated with conditioned medium from DPSC or HDPF in normoxia or hypoxia. Sprouting and WST-1 assays were used to evaluate capillaries tubes-like formation and cell proliferation rate,respectively. The statistic analysis was performed by non-parametric tests. HIF-1αactivity and VEGF expression were up-regulated in DPSC and HDPF under hypoxic conditions. However, no changes in the expression levels of bFGF were observed. YC-1 40μM was able to inhibit HIF-1alpha in both cell lines and it also reduced VEGF expression in DPSCs in hypoxia. HDPF under hypoxia increased HDMEC sprouting by 50% when compared to HDPF in normoxia, and by 30% when compared to DPSC in hypoxia. Notably, HDPF under hypoxia stimulated HDMEC proliferation by 30% when compared to DPSC in hypoxia. It was concluded... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

OBJETIVO: demonstrar as alterações histológicas secundárias ao uso de bevacizumabe na aorta descendente de suínos submetida à interrupção dos vasa vasorum. MATERIAIS E MÉTODOS: em doze suínos, divididos em grupos tratamento e controle (n=6 cada) foi realizada dissecção por 5 cm da aorta torácica, ligadura das artérias intercostais e cobertura com polivinil; o grupo tratamento recebeu uma dose endovenosa única de bevacizumabe. Após quinze dias, os animais foram sacrificados para retirada da artéria e preparo das lâminas histológicas dos grupos tratamento, controle e área não manipulada dos dois grupos. As lâminas foram analisadas com relação aos graus de angiogênese, injúria, inflamação e espessamento intimal. A análise estatística foi conduzida através da média e do desvio-padrão dos escores e as comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney. Para obtenção de intervalos de confiança de 95% para as médias das contagens dos escores utilizou-se a distribuição de Poisson, a fim de determinar o efeito estatístico. RESULTADOS: o bevacizumabe causou parefeitos em todos os suínos tratados, com um óbito. As variáveis analisadas através da Escala de Magnitude para Efeito Estatístico, demonstram tendência de redução da angiogênese e da injúria e de aumento da inflamação no limite do moderado. Não ocorreu modificação do espessamento intimal entre os grupos. CONCLUSÃO: a medicação utilizada na lesão da parede arterial induzindo hipóxia, mostrou tendência de redução da angiogênese e da injúria, mas não reduziu o processo inflamatório ou o espessamento intimal da parede arterial. O bevacizumabe mostrou toxicidade no modelo suíno. / OBJECTIVE: To demonstrate histological changes secondary to the use of bevacizumab in the descending aorta of pigs after interruption of vasa vasorum flow. METHODS: Twelve pigs were divided into control and treatment groups (n = 6 each). It was performed a 5-cm dissection of the thoracic aorta, ligation of the intercostal arteries and protection with polyvinyl chloride. Pigs in the treatment group received a single intravenous dose of bevacizumab. After 15 days, the animals were euthanized and the aorta removed. Histological slides were prepared for control and treatment groups and for the non-surgically manipulated part of the aorta in both groups. The slides were analyzed for the degree of angiogenesis, injury, inflammation, and intimal thickening. Data were expressed as mean (SD) of scores and groups were compared using the Mann-Whitney test. The Poisson distribution was used to calculate 95% confidence intervals for the mean scores in order to determine effect statistics. RESULTS: Bevacizumab had adverse effects on all treated pigs, leading to one death. The analysis using a scale of magnitudes for effect statistics showed a trend toward a decrease in angiogenesis and injury and an increase in inflammation for moderate effects. There was no change in intimal thickening in either group. CONCLUSION: The medication used for arterial wall injury inducing hypoxia showed a trend toward reduced angiogenesis and injury, but with no reduction in the inflammatory process or intimal thickening of the arterial wall. Bevacizumab showed toxicity in the porcine model.

abstract: Patients with malignant brain tumors have a median survival of approximately 15 months following diagnosis, regardless of currently available treatments which include surgery followed by radiation and chemotherapy. Improvement in the survival of brain cancer patients requires the design of new therapeutic modalities that take advantage of common phenotypes. One such phenotype is the metabolic dysregulation that is a hallmark of cancer cells. It has therefore been postulated that one approach to treating brain tumors may be by metabolic alteration such as that which occurs through the use of the ketogenic diet (KD). The KD is high-fat, low-carbohydrate diet that induces ketosis and has been utilized for the non-pharmacologic treatment of refractory epilepsy. It has been shown that this metabolic therapy enhances survival and potentiates standard therapy in mouse models of malignant gliomas, yet the anti-tumor mechanisms are not fully understood. The current study reports that KetoCal® (KC; 4:1 fat:protein/carbohydrates), fed ad libitum, alters hypoxia, angiogenic, and inflammatory pathways in a mouse model of glioma. Tumors from animals maintained on KC showed reduced expression of the hypoxia marker carbonic anhydrase 9 (CA IX), a reduction in hypoxia inducible factor 1-alpha (HIF-1α) and decreased activation of nuclear factor kappa B (NF-κB). Animals maintained on KC also showed a reduction in expression of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) and decreased microvasculature in their tumors. Further, peritumoral edema was significantly reduced in animals fed the KC and protein analysis showed significantly altered expression of the tight junction protein zona occludens-1 (ZO-1) and the water channeling protein aquaporin-4 (AQP4), both of which have been implicated in malignant processes in glioma, including the formation of peritumoral edema in patients. Taken together the data suggests that KC alters multiple processes involved in malignant progression of gliomas. A greater understanding of the effects of the ketogenic diet as an adjuvant therapy will allow for a more rational approach to its clinical use. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Biology 2014

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Observa-se exacerbaÃÃo do processo angiogÃnico em diversas doenÃas, entre elas pode ser citada a neovascularizaÃÃo de cÃrnea. Para o tratamento dessas doenÃas, sÃo estudados diversos fÃrmacos com propriedades antiangiogÃnicas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficÃcia do fÃrmaco LASSBIO-596, estruturalmente designado como um hÃbrido da talidomida, sildenafil e arilsulfonamida, na angiogÃnese corneana inflamatÃria. Dezoito coelhos foram submetidos a uma cauterizaÃÃo alcalina pontual na regiÃo superior da cÃrnea direita. Os animais foram randomicamente alocados em trÃs grupos: veÃculo, dexametasona 4,0% e LASSBio-596 1,0%. Os tratamentos foram administrados em forma de colÃrio trÃs vezes por dia durante 21 dias. AvaliaÃÃes foram realizadas nos dias 3, 6, 9, 12, 15, 18 e 21 pÃs-cauterizaÃÃo. Nesses momentos, imagens digitalizadas da cÃrnea foram capturadas de uma forma padronizada. A resposta angiogÃnica foi mensurada utilizando-se um software que foi desenvolvido especificamente para esta finalidade. Foram calculados os seguintes parÃmetros: Ãrea de neovascularizaÃÃo (AN), comprimento vascular total (CT) e nÃmero de vasos sanguÃneos (NV). A partir da AN, calculou-se a taxa de angiogÃnese (TA) em cada grupo estudado. Observou-se que a dexametasona diminuiu significativamente AN, CT e NV durante todas as avaliaÃÃes. Portanto, a dexametasona inibiu completamente a angiogÃnese inflamatÃria da cÃrnea com uma TA de -0,001  0,006 mm2/dia, que foi significativamente menor (p < 0,001) do que a observada apÃs o tratamento com o veÃculo (0,078  0,024 mm2/dia) e LASSBio-596 (0,054  0,012 mm2/dia). Apesar de o LASSBio-596 ter reduzido o processo de angiogÃnese em relaÃÃo ao veÃculo, conforme AN, CT e NV, essa diferenÃa nÃo foi estatisticamente significante. No entanto, verificou-se que a TA medida no grupo LASSBio-596 foi significativamente menor (p < 0,05) do que a observada nos animais controle, indicando um potencial efeito antiangiogÃnico. ConcluÃmos que a aplicaÃÃo tÃpica de LASSBio-596 a 1,0% tem um efeito inibitÃrio parcial sobre a angiogÃnese corneana inflamatÃria em coelhos. / There is exacerbation of the angiogenic process in various diseases, especially in corneal neovascularization. For the treatment of these diseases, several drugs were studied with antiangiogenic properties. The aim of this study was to evaluate the effect of LASSBio-596, structurally designed as a hybrid of thalidomide, sildenafil and arilsulfonamide, on inflammatory corneal angiogenesis. Eighteen rabbits were submitted to an alkaline cauterization in the right cornea. The animals were randomly allocated in three groups: vehicle, dexamethasone, and LASSBio-596 group. Drugs were administrated by eye drops three times per day for 21 days. Evaluations were performed on days 3, 6, 9, 12, 15, 18, and 21 post-cauterization. At these time points, digital images of the cornea were captured in a standard fashion. Angiogenic response was measured using software that was developed specifically for this purpose. It calculated the following parameters: neovascularization area (NA), total vascular length (TVL), and blood vessel number (BVN). It was observed that dexamethasone significantly decreased NA, TVL, and BVN during all assessments. From NA it was calculated the angiogenesis rate (AR) in each group. Therefore, dexamethasone completely inhibited the inflammatory corneal angiogenesis with angiogenesis rate (AR) of -0.001  0.006 mm2/day, which was significantly lower (p < 0.001) than that observed after treatment with vehicle (0.078  0.024 mm2/dia) and LASSBio-596 (0.054  0.012 mm2/dia). Although LASSBio-596 reduced angiogenesis in relation to vehicle, according to NA, TVL and BVN values, this difference was not statistically significant. However, it was found that the AR as measured in the LASSBio-596 group was significantly lower (p < 0.05) than that seen in control animals, indicating a potential antiangiogenic effect. We conclude that topical application of LASSBio-596 at 1.0% has a partial inhibitory effect on inflammatory corneal angiogenesis in rabbits.

Orientador: Jose Vassallo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T20:55:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moreira_LucianaRegina_D.pdf: 5414614 bytes, checksum: f35e45f7f891a1120abd69e0862a2875 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Contexto: A angiogênese e linfangiogênese são processos em que as células endoteliais se dividem e migram para a formação de novos capilares, dando suporte para a progressão tumoral. A mensuração destes processos pode discriminar diferentes extratos prognósticos no câncer. O valor prognóstico da determinação da angiogênese e linfangiogênese no carcinoma colorretal (CRC) é assunto controverso na literatura. Isto pode ser devido a variações na forma de análise, como local de quantificação dentro da amostra tumoral, escolha do marcador imunoistoquímico e o método de quantificação. No presente trabalho, a angiogênese e linfangiogênese são estudadas através de programas de análise de imagem, comparando métodos de quantificação (densidade microvascular - MVD versus estimativa da área vascular total - TVA), diferentes marcadores imunoistoquímicos (pan-endoteliais versus vasos neoformados) e áreas de análise (campo central da lesão versus periferia versus campo de invasão mais profunda no carcinoma). Objetivos: Comparar esses parâmetros entre adenomas de pacientes sem e com carcinoma na mucosa adjacente; compará-los nos tecidos colorretais não neoplásicos, em adenomas e carcinomas, além de encontrar um meio de quantificação de angiogênese e linfangiogênese que fosse mais fidedigno como fator prognóstico no CRC. Métodos: 60 CRC esporádicos, 30 adenomas e 10 tecidos colorretais não neoplásicos foram submetidos a estudo imunoistoquímico para a detecção dos antígenos CD31, CD34, CD105, VEGF-A, VEGF-C e D2-40. Imagens dos preparados imunoistoquímicos foram capturadas para avaliar a MVD e a TVA em um programa de análise de imagem. Também foram analisadas a porcentagem e a intensidade de expressão protéica de VEGF-A e VEGF-C nas células carcinomatosas. Resultados: A imunocoloração da maioria dos marcadores, bem como a expressão de VEGF-A e VEGF-C, mostraram aumento estatisticamente significante nos adenomas e carcinomas quando comparados com tecido não neoplásico para MVD e TVA nos diversos campos da lesão. Os adenomas de pacientes com carcinoma apresentaram aumento estatisticamente significante na TVA determinada pelo CD105 (p= 0,019) e na MVD determinada pelo D2-40 (p= 0,041), quando comparadas com os adenomas de pacientes sem carcinoma. Dentre os carcinomas, apenas a MVD determinada pelo marcador CD34 no campo central da lesão diferencia-se estatisticamente com a recorrência/metástase (p= 0,04) e a sobrevida (p= 0,02). Conclusões: Os achados apóiam o fato da angiogênese e o aumento da vascularização linfática ocorrer precocemente, ainda nos adenomas. Também corroboram o fato de que angiogênese e aumento da contagem de vasos linfáticos ocorram mais em adenomas de pacientes com carcinomas na mucosa adjacente, possivelmente influenciados por fatores produzidos pelo tumor. A MVD na área central do carcinoma determinada pelo marcador imunoistoquímico CD34 adiciona critério prognóstico, associando-se com recidiva/metástase e sobrevida, enquanto os outros meios de quantificação vascular e de expressão de fatores de crescimento não apresentaram resultados estatisticamente significantes. Este método é um fator prognóstico independente e adicional no CCR / Abstract: Background: Angiogenesis and lymphangiogenesis play an important role in the progression of solid tumors, and its quantification may be associated with prognostic stratification. However, the prognostic value of the assessment of angiogenesis and lymphangiogenesis in colorectal cancer (CRC) is still controversial. This may be due to variations in the methods of analysis, as the precise location of assessment within a tumor sample, the choice of immunohistochemical markers and the quantification system. In the present study, angiogenesis and lymphangiogenesis were assessed using image analysis software, comparing two methods of quantification (microvessel density - MVD versus estimation of the total vascular area - TVA), different immunohistochemical markers (pan-endothelial versus neovessel) and areas of analysis (periphery versus inner portions of the lesion versus the deepest invasion area of carcinoma). Objectives: To compare angiogenic and lymphangiogenic patterns in adenomatous polyps from patients without and with sporadic CRC; to compare angiogenesis and lymphangiogenesis in non neoplasic colorectal tissue, adenomas and cancer, and to search for a reliable approach to quantify angiogenesis and lymphangiogenesis, which could be of clinical value as prognostic factor in CRC. Methods: 60 sporadic CRC, 30 colorectal adenomas and 10 non neoplasic colorectal tissues were submitted to immunohistochemical analysis for CD31, CD34, CD105, VEGF-A, VEGF-C and D2-40. MVD and TVA were determined by digitalizing the immunohistochemical reactions and examining them by computer image analysis. Immunostaining for VEGF-A and VEGF-C was evaluated using a parameter based on the percentage of tumor area stained and staining intensity. Results: Staining for most markers, as well as for VEGF-A and VEGF-C, exhibited significant increase in adenomas and carcinomas, when assessment of MVD and TVA in different tumor fields was compared with non neoplastic colorectal tissues. Adenomas from patients with carcinoma showed significantly higher values of TVA determined by immunostaining for CD105 (p = 0.019) and of lymphatic MVD determined by D2-40 (p = 0.041) when compared with adenomas from patients without cancer. Among patients with CRC, only MVD determined by immunostaining for CD34 in the central areas of the tumor was significantly correlated with recurrence/metastasis (p=0.04) and survival rates (p=0.02). Conclusions: Our results support that angiogenesis and lymphatic vascularization, plays a role in early tumor development at the stage of adenoma formation. The findings further support the notion that neoangiogenesis and elevated lymphatic vessel counts occur in colorectal adenomas from patients with CRC when compared to those without carcinoma, possible under the influence of factors produced by the carcinoma. Our results suggest that MVD determined with staining for CD34 in the inner part of the tumor is more closely related with relapse/metastasis and survival than other means of vascular quantification. The method is an additional prognostic factor in CCR / Doutorado / Anatomia Patologica / Doutor em Ciências Médicas

A angiogênese é um processo fundamental e fisiológico de organismos vertebrados, sendo responsável pela formação de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes. Entretanto, a angiogênese pode ocorrer também em condições patológicas, como causa ou consequência de doenças. Um exemplo disso está nos tumores, que para crescer além de alguns milímetros cúbicos, necessitam de um suprimento adequado de oxigênio e nutrientes, e, portanto, dependem da angiogênese. Por isso, compostos que inibem a angiogênese já estão em uso na clínica, não só para o tratamento de tumores, mas também de outras doenças dependentes da angiogênese, as retinopatias. Neste projeto, daremos continuidade à linha de pesquisa do nosso grupo, que procura identificar e validar peptídeos com potencial translacional (pré-fármacos), por apresentarem atividade anti-angiogênica. Utilizando a metodologia do Phage Display, nosso grupo identificou e caracterizou um hexapeptídeo, que foi selecionado por interagir com os receptores do principal fator iniciador da angiogênese, o VEGF (fator de crescimento endotelial vascular). Os receptores de VEGF (ou VEGFR) são proteínas do tipo receptor tirosina quinase, expressos em células endoteliais e essenciais para a iniciação e progressão da neovascularização. O hexapeptídeo identificado em nosso laboratório liga-se ao VEGFRs e inibe a formação de vasos sanguíneos in vivo em modelos animais de angiogênese. Neste trabalho, procuramos estender os estudos com este hexapeptídeo para identificar o sítio de ligação do mesmo no VEGFR e avançar em modelos que permitam a determinação dos requisitos estruturais de interação peptídeoreceptor. Com estes conhecimentos, poderemos num futuro próximo, caminhar para o desenvolvimento racional de moléculas peptideomiméticas com propriedades anti-angiogênicas. / Angiogenesis is a fundamental and physiological process for vertebrate organisms, being responsible for the formation of new blood vessels, sprouting from the existent ones. However, angiogenesis may occur in pathological conditions, being cause or consequence of diseases. One example is tumor development. To grow beyond a few cubic millimeters, tumors need a suitable supply of oxygen and nutrients, and, therefore, they are dependent of angiogenesis. In fact, anti-angiogenic compounds are already in therapeutic use, targeting not only tumors but other angiogenesis dependent diseases, like retinopathies. In this project, we expand research from our own group to identify and develop anti-angiogenic peptides with translational potential (pre-drugs). Using Phage Display methodology, our group identified and characterized a hexapeptide, that was selected based on its capacity to interact with the receptors for the main initiator factor of angiogenesis, the VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). VEGF receptors (VEGFR) are tyrosine kinase proteins, expressed by endothelial cells and essential for neovascularization initiation and progress. The hexapeptide identified in our lab binds to VEGFRs and inhibit blood vessel formation in vivo when tested in an angiogenesis animal model. In this study, we seek to further understand the interaction of this hexapeptide with its receptor by identifying its binding domain on VEGFR and develop models that will allow the determination of the structural requirements for interaction of this receptor ligand pair. With this knowledge, we can in a near future progress to a rational development of novel peptidemimetic molecules with angiogenic properties similar to this hexapeptide.