Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [204]-227. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Les coproduits de crabe des neiges (Chionoecetes opilio) riches en chitine sont majoritairement utilisés dans le compost. Toutefois, ils sont aussi riches en biomolécules actives tels les peptides antibactériens notamment générés par une hydrolyse enzymatique. Cependant, l’origine et la localisation de ces peptides dans les coproduits de C. opilio n’ont pas encore été élucidées. Diverses matrices composant les coproduits de C. opilio ont été isolées puis hydrolysées avec le mélange d’enzymes commerciales Protamex®. Chaque hydrolysat des différentes matrices a été fractionné en utilisant une colonne de chromatographie d’interactions hydrophobes de type Sep-pack C18 et l’activité antibactérienne a été vérifiée contre trois souches bactériennes indicatrices : Escherichia coli ATCC 25922, Listeria innocua HPB13 et Vibrio parahemolyticus ATCC 17802. Une activité antibactérienne contre Listeria innocua HPB13 a été décelée dans un extrait peptidique provenant de l’hépatopancréas. L’analyse en chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) a permis d’identifier quatre peptides ayant des homologies supérieures à 80% avec des peptides antibactériens connus. Parmi ces peptides (Odorranain-C7, YFGAP : Yellowfin tuna GAPDH-related antimicrobial peptide, crustine, peptide antibactérien prédit), la crustine est le seul peptide provenant des crustacés retrouvé majoritairement dans l’hémolymphe, mais n’a jamais été identifié chez C. opilio. L’extraction protéique de l’hémolymphe de C. opilio, suivie par une purification en chromatographie liquide des protéines à basses pressions (FPLC) et une migration protéique par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE), a permis de visualiser des bandes de protéines correspondant à la taille moyenne de la crustine. L’analyse en spectrométrie de masse d’ionisation par électronébulisation (ESI-MS/MS) a permis d’identifier un peptide ayant une homologie avec la crustine qui était supérieure à 80 %. Ces analyses ont été complétées par une amplification du gène codant pour la crustine avec plusieurs combinaisons d’amorces suivie par un séquençage. Les résultats obtenus ont permis de confirmer la présence d’une activité antibactérienne provenant de l’hépatopancréas de C. opilio et d’identifier une homologie avec le peptide antibactérien apparenté à la crustine. Le résultat obtenu à partir du SDS-PAGE suggère aussi la présence de ce peptide dans l’hémolymphe de C. opilio contrairement aux résultats, moins concluants, de l’amplification du gène codant pour la crustine. De nouvelles stratégies d’amplification seraient nécessaires pour confirmer les résultats obtenus en biochimie / Snow crab (Chionoecetes opilio) by-products rich in chitin are mainly used in compost. However, they are also rich in active biomolecules such as antibacterial peptides that could be generated by enzymatic hydrolysis. However, the origin and location of these peptides from C. opilio by-products have not been elucidated yet. Various matrices constituting C. opilio by-products were isolated and then hydrolyzed with the commercial enzyme mixture Protamex®. Each hydrolysate of the different matrices was fractionated using a hydrophobic interaction Sep-pack C18 column and the antibacterial activity was verified against three indicative strains: Escherichia coli ATCC 25922, Listeria innocua HPB13 and Vibrio parahemolyticus ATCC 17802. Antibacterial activity was detected from the hepatopancreas’ peptide extract against Listeria innocua HPB13 only. Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LCMS/MS) analysis has allowed identifying four peptide fractions with homologies greater than 80% with known antibacterial peptides (Odorranain-C7, YFGAP: Yellowfin tuna GAPDHrelated antimicrobial peptide, crustin, predicted antibacterial peptide). Among these peptides, crustin is the only peptide derived from crustaceans found mainly in the haemolymph, but not identified in C. opilio. Protein extraction from the C. opilio hemolymph, followed by Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) purification and protein migration on denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), allowed visualizing bands associated with proteins having the average size of crustin. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis allowed identifying a peptide with homology greater than 80% with crustin. Complementary analyzes were performed by amplification of the gene coding for crustin with several combinations of primers followed by sequencing. The results confirmed the presence of an antibacterial activity from C. opilio hepatopancreas and allowed identifying a homology with the crustin-like antibacterial peptide. The SDS-PAGE results also suggest the presence of this peptide in the hemolymph of C. opilio contrary to the gene coding for crustin amplification, which were less conclusive. Further amplification strategies would be needed to confirm the results obtained from biochemistry.

La résistance aux antibiotiques représente l'une des menaces les plus sérieuses à la santé publique pour les années à venir. En effet, l'utilisation massive et parfois excessive de ces molécules phares de la médecine moderne a mené au développement de microorganismes capables de résister à leur action, posant alors un défi important lié au traitement des infections qu'ils engendrent. Ainsi, depuis déjà plusieurs années, la communauté scientifique déploie des efforts considérables afin de développer de nouvelles molécules antimicrobiennes qui pourraient servir d'alternatives à ces antibiotiques traditionnels. Ces recherches sont aussi très pertinentes pour le secteur alimentaire, car la demande pour des agents de conservation efficaces, sûrs et d'origine naturelle est grandissante en réponse aux inquiétudes par rapport à l'utilisation des molécules actuellement disponibles à cet effet (benzoates, nitrates, etc.). Les efforts de recherche soutenus dans les dernières décennies ont permis d'identifier une classe de molécules particulièrement prometteuse : les peptides antimicrobiens (PAMs). Ces petites molécules constituées d'acides aminés présentent plusieurs avantages qui en font de bons candidats comme alternatives aux molécules antibiotiques classiques, notamment leur spectre d'action étendu, leur faible propension à induire de la résistance microbienne et, dans plusieurs cas, leur origine naturelle. D'ailleurs, les biomasses marines, dont les poissons, sont de très bonnes sources de PAMs. Par exemple, plusieurs PAMs ont été isolés à partir de poissons de la famille des Scombridés (maquereaux, thons, etc.), dont certains montrent une forte homologie avec une enzyme ubiquitaire dans le monde naturel, soit la glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase (GAPDH). C'est donc sur la base d'une littérature scientifique étoffée que l'hypothèse directrice de ce projet, selon laquelle la modulation des propriétés physico-chimiques de PAMs issus de poissons de la famille des Scombridés et apparentés à la GAPDH permet d'améliorer leur activité antimicrobienne, a été émise. L'objectif général visé par le projet était d'étudier les relations structure-activité et les mécanismes d'action de ces PAMs afin de développer des peptides analogues dont l'activité antimicrobienne est améliorée. Cet objectif principal a été décliné en trois objectifs spécifiques permettant de mettre ladite hypothèse à l'épreuve. Le premier objectif spécifique du projet était d'établir des relations entre la structure chimique de ces peptides provenant de Scombridés et homologues à la GAPDH et leurs activités antibactérienne et antifongique. Pour ce faire, huit peptides ont été synthétisés, dont un PAM natif déjà connu dans la littérature et sept analogues chimiques dans lesquels certains résidus d'acide aminé ont été substitués. L'activité antimicrobienne de ces huit peptides a été testée sur plusieurs souches bactériennes et fongiques afin d'obtenir des valeurs de concentrations minimales inhibitrices. Leurs propriétés chimiques (notamment la charge nette et l'hydrophobicité) ont été déterminées et leurs structures secondaires ont été évaluées dans différents environnements chimiques par dichroïsme circulaire et par une méthode de prédiction bio-informatique. Les résultats de ces expériences ont permis de mettre en évidence que les analogues dont le caractère cationique était augmenté avaient une plus forte activité antimicrobienne, tandis qu'un autre analogue, plus hydrophobe, a montré une activité antifongique particulièrement intéressante. La structure secondaire des peptides, quant à elle, n'a pas d'impact majeur sur leur activité antimicrobienne. Le deuxième objectif spécifique était d'élucider le mécanisme d'action de ces différents analogues peptidiques. Parmi les huit analogues synthétisés et dont l'activité antimicrobienne a été testée, cinq ont été sélectionnés pour l'étude de leur mécanisme d'action. Les interactions entre ces peptides et les différents phospholipides sous forme de liposomes ont été analysées par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. Leur pouvoir de perméabilisation membranaire a aussi été évalué par une méthode expérimentale basée sur l'utilisation de deux colorants d'acides nucléiques présentant une capacité de perméabilisation membranaire différentielle en fonction de l'intégralité membranaire des microorganismes. Enfin, un grand nombre de simulations bio-informatiques de dynamique moléculaire ont été réalisées afin de visualiser et de quantifier les interactions à l'échelle atomique entre les analogues peptidiques et deux modèles membranaires de compositions lipidiques différentes simulant précisément les membranes des bactéries à Gram négatif et des bactéries à Gram positif. L'analyse des différentes données obtenues a permis de conclure que les peptides interagissent avec les phospholipides membranaires et que dans plusieurs cas, ils sont capables de perméabiliser la membrane cytoplasmique des microorganismes. Un lien évident, mais pas complètement limpide, entre cette capacité de perméabilisation membranaire et l'activité antimicrobienne a aussi pu être mis en évidence, suggérant un mécanisme mixte d'action impliquant aussi des cibles intracellulaires. En troisième lieu, la stabilité et l'innocuité de ces analogues peptidiques ont été évaluées. Ainsi, l'impact du pH et différentes concentrations de cations monovalents et divalents sur l'activité antimicrobienne des peptides ont été testés, de même que leur résistance à la dégradation thermolytique. La toxicité des peptides a été évaluée sur la base de tests d'activité hémolytique. Finalement, la stabilité dans le tractus gastro-intestinal de deux des peptides a été étudiée avec un modèle dynamique de digestion *in vitro* (TIM-1), lequel est un système spécifiquement conçu pour simuler le processus de digestion dans le tractus gastro-intestinal humain, ainsi que des analyses de chromatographie et de spectrométrie de masse. Les résultats obtenus ont montré que l'activité antimicrobienne des analogues était favorisée à pH acide, qu'elle était diminuée en présence de cations monovalents et complètement inhibée par la présence de cations divalents. De plus, il a pu être conclu que les peptides étudiés étaient très rapidement dégradés dans l'estomac et qu'ils avaient une activité hémolytique négligeable. Pour conclure, les travaux expérimentaux et *in silico* accomplis dans le cadre de ce projet de thèse ont permis de mettre en lumière des liens importants entre la structure chimique, l'activité antimicrobienne et le mécanisme d'action de ces PAMs issus de Scombridés et apparentés à la GAPDH. La stabilité et l'innocuité de ces peptides ont aussi été caractérisées, de sorte qu'un intéressant potentiel d'applications cliniques et alimentaires a pu être mis en évidence. Les fruits de ces efforts, ayant fait l'objet de publications scientifiques, représentent donc une contribution originale à la recherche portée sur le développement de nouvelles molécules antimicrobiennes qui pourraient, éventuellement, offrir des solutions au problème criant posé par la résistance des microorganismes aux antibiotiques classiques. / Antibiotic resistance represents one of the most serious threats to public health in the years ahead. Indeed, the massive and sometimes excessive use of these hallmark molecules of modern medicine has led to the development of microorganisms capable of resisting their action, posing a major challenge to the treatment of the infections they cause. For several years now, the scientific community has been making considerable efforts to develop new antimicrobial molecules that could serve as alternatives to these traditional antibiotics. This research is also highly relevant to the food sector, as the demand for effective, safe preservatives of natural origin is growing in response to concerns about the use of molecules currently available for this purpose (benzoates, nitrates, etc.). Sustained research efforts in recent decades have identified a particularly promising class of molecules: antimicrobial peptides (AMPs). These small molecules made up of amino acids offer several advantages that make them good candidates as alternatives to conventional antibiotic molecules, notably their broad spectrum of action, their low propensity to induce microbial resistance and, in many cases, their natural origin. Marine biomasses, including fish, are excellent sources of AMPs. For example, several AMPs have been isolated from fish of the Scombrids family (mackerel, tuna, etc.), some of which show strong homology with a ubiquitous enzyme in the natural world, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). It was therefore on the basis of an extensive scientific literature that the guiding hypothesis of this project - that modulation of the physico-chemical properties of GAPDH-related AMPs from Scombrids fish can improve their antimicrobial activity - was put forward. The overall aim of the project was to study the structure-activity relationships and mechanisms of action of these AMPs, in order to develop analogous peptides with enhanced antimicrobial activity. This main objective was broken down into three specific objectives to put the hypothesis to the test. The first specific objective of the project was to establish relationships between the chemical structure of these Scombrid-derived peptides homologous to GAPDH and their antibacterial and antifungal activities. To this end, eight peptides were synthesized, including a native AMP already known in the literature and seven chemical analogs in which certain amino acid residues were substituted. The antimicrobial activity of these eight peptides was tested on several bacterial and fungal strains to obtain minimum inhibitory concentration values. Their chemical properties (notably net charge and hydrophobicity) were determined, and their secondary structures were evaluated in different chemical environments using circular dichroism and a bioinformatics prediction method. The results of these experiments revealed that analogs with increased cationic character had stronger antimicrobial activity, while another, more hydrophobic analog showed particularly interesting antifungal activity. The secondary structure of the peptides had no major impact on their activity. The second specific objective was to elucidate the mechanism of action of these different peptide analogs. Of the eight analogs synthesized and tested for antimicrobial activity, five were selected for investigation of their mechanism of action. Interactions between these peptides and various phospholipids in liposome form were analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy. Their capacity for membrane permeabilization was also assessed by an experimental method based on the use of two nucleic acid dyes with differential membrane permeabilization capacity as a function of microorganism membrane integrity. Finally, many molecular dynamics bioinformatics simulations were carried out to visualize and quantify the atomic-scale interactions between the peptide analogs and two membrane models with different lipid compositions, precisely simulating the membranes of Gram-negative and Gram-positive bacteria. Analysis of the various data obtained led to the conclusion that peptides interact with membrane phospholipids and, in several cases, are capable of permeabilizing the cytoplasmic membrane of microorganisms. An obvious, but not completely clear, link between this membrane permeabilization capacity and antimicrobial activity has also been demonstrated, suggesting a mixed mechanism of action involving intracellular targets. Thirdly, the stability and safety of these peptide analogs were assessed. The impact of pH and different concentrations of monovalent and divalent cations on the antimicrobial activity of the peptides was tested, as was their resistance to thermolytic degradation. Peptide toxicity was assessed based on hemolytic activity tests. Finally, the stability in the gastrointestinal tract of two of the peptides was studied with a dynamic *in vitro* digestion model (TIM-1), which is a system specifically designed to simulate the digestion process in the human gastrointestinal tract, as well as chromatography and mass spectrometry analyses. The results obtained showed that the antimicrobial activity of the analogs was enhanced at acidic pH, diminished in the presence of monovalent cations and completely inhibited in the presence of divalent cations. It was also concluded that the peptides were rapidly degraded in the stomach and had negligible hemolytic activity. In conclusion, the experimental and *in silico* work carried out as part of this thesis project has revealed important links between the chemical structure, antimicrobial activity and mechanism of action of these GAPDH-related AMPs from Scombrids. The stability and safety of these peptides were also characterized, so that an interesting potential for clinical and food applications could be highlighted. The fruits of these efforts, which have been the subject of scientific publications, thus represent an original contribution to research into the development of new antimicrobial molecules that could eventually offer solutions to the glaring problem posed by microorganism resistance to conventional antibiotics.

C. albicans est un microorganisme opportuniste présent chez plus de 60% de la population. La pathogénicité de C. albicans est contrôlée par le système immunitaire de l’hôte, grâce entre autres aux peptides antimicrobiens (PAMs). Ces PAMs peuvent être de différentes origines. Notre étude a pour but d’évaluer l’effet d’un PAM d’amphibiens, la dermaseptine-S1 (DS1), sur la croissance, la transformation et l’expression de certains gènes de virulence de C. albicans. C. albicans (ATCC-SC5314) a été cultivé en présence ou en absence de la DS1 à 10, 50, et 100 μg/ml, pendant 24 h puis la croissance a été évaluée par un teste de numération cellulaire. Le passage de la forme levure à la forme hyphe a été évalué par microscopie optique et électronique à balayage après culture en présence ou en absence de la DS1 pendant 3 et 6 h à 37°C et ce en présence de 10% de sérum de veau foetal. L’effet de la DS1 sur la formation de biofilm a été évalué par un test MTT et par microscopie électronique à balayage. Enfin, l’expression de certains gènes protéase aspartique sécrétée (Saps 1, 2, 3, 9, 10 et Hwp1) a été évaluée par qRT-PCR. Nous avons montré que la DS1 réduit de façon significative la croissance de C. albicans. La DS1 inhibe le passage de C. albicans de sa forme blastospore à la forme hyphe, ainsi que la formation du biofilm. L’effet de la DS1 sur C. albicans pourrait passer par un contrôle de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la sécrétion d’enzyme protéolytique. En effet, la DS1 diminue de façon significative l’expression des gènes Saps 1, 2, 3, 9 et 10 ainsi que du gène Hwp1. L’ensemble de nos travaux démontre que la DS1 peut contrôler la pathogénicité de C. albicans. / Candida is an opportunistic microorganism present in more than 60% of the population. The pathogenicity of Candida is controlled by the host immune system, such as antimicrobial peptides (AMPs). These PAMs can be of different origins. Our study is to evaluate the effect of an amphibian-isolated antimicrobial peptide, dermaseptin-S1 (DS1) on the growth, transformation and the expression of certain C. albicans virulence genes. C. albicans (ATCC-SC5314) was cultured in the presence or the absence of DS1 at 10, 50, and 100 μg / ml for 24 h and then the growth of yeast was assessed by cell count. The transformation of yeast was evaluated at 3 and 6 h of culture under conditions conducive to transformation (37°C in the presence of 10% of serum) by optical and scanning electron microscopy. Biofilm formation was assessed using a collagen scaffold, after incubation for 30 min at 30°C, with MTT assay and scanning electron microscopy. Finally, the expression of some secreted aspartic protease genes (Saps 1, 2, 3, 9, 10 and Hwp1) was evaluated by qRT-PCR. The results showed that DS1 significantly reduces the growth of C. albicans. This effect is proportional to the concentration of the peptide. This peptide inhibits the passage of C. albicans from the blastospore to the hypha form. The effect of DS1 on C. albicans involves controlling the expression of several genes. Indeed, DS1 significantly decreases the expression of Sap 1, 2, 3, 9 and 10 genes as well as Hwp1 gene. All of our work demonstrates that DS1 can control the pathogenicity of C. albicans.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Titre de l'écran-titre (visionné le 29 novembre 2004). Bibliogr.

Pseudomonas aeruginosa (Pa) est un pathogène opportuniste et constitue un facteur de morbidité et de mortalité important chez les patients atteints de fibrose kystique II est responsable d'infections pulmonaires chroniques. Sa capacité à se maintenir chez l'hôte et à causer des infections résulte de l'expression de nombreux facteurs de virulence. Le traitement à l'aide d'antibiotiques fonctionne pour une durée limitée selon la capacité de Pa à développer de la résistance. Il est donc impératif de trouver d'autres alternatives afin de traiter les patients atteints de ce type d'infections chroniques. Les peptides antibactériens sont une des avenues envisagées puisque leurs cibles sont différentes et qu'ils n'engendrent pas de résistance. Par contre, les modes d'action des peptides antibactériens comme la pré-élafine sont encore mal connus. La pré-élafine est une protéine humaine sécrétée notamment par les cellules épithéliales. Elle possède des propriétés inhibitrices contre certaines peptidases à serine ainsi que des propriétés antimicrobiennes contre différentes souches de levures et de bactéries, incluant Pa. Nous avons étudié le mode d'action antibactérien de la pré-élafine contre Pa à l'aide de différentes approches. Nous avons d'abord observé que toutes les souches de Pa ne sont pas affectées de la même manière par la pré-élafine. La souche PA33348 est particulièrement sensible. Nous avons montré que cette hypersensibilité résulte de l'inhibition spécifique par le domaine élafine d'une peptidase sécrétée par cette souche, la peptidase IV, ce qui, affecte la croissance et/ou la viabilité en milieu complexe. Nous avons également montré que la pré-élafine et chacun de ses deux domaines se lie aux membranes. Le domaine N-terminal, ou cementoïne, qui est polycationique se lie plus particulièrement aux membranes chargées négativement. À l'aide de différentes techniques dont le dichroïsme circulaire et la résonance magnétique nucléaire, nous avons montré que ce domaine est peu structuré en solution aqueuse, mais adopte une conformation en hélices a dans un environnement hydrophobe. Cette caractéristique est commune à un grand nombre de peptides antimicrobiens, la plupart ayant la capacité de détruire l'intégrité des membranes microbiennes. Toutefois, et contrairement à ces peptides, les domaines cementoïne, élafine et la pré-élafine ne possèdent qu'une faible activité lytique. Par contre, nos résultats suggèrent que la pré-élafine aurait la capacité de traverser les membranes biologiques sans causer de lyse. Bien que d'autres expériences soient nécessaires pour confirmer cette hypothèse de la translocation au travers des membranes de la pré-élafine, nous avons montré que in vitro le domaine élafine et la pré-élafine, mais non la cementoïne, peuvent se lier à l'ADN. De plus nous avons noté une corrélation entre cette caractéristique et le fait que ces deux peptides permettent de diminuer l'expression de plusieurs facteurs de virulence de Pa. En résumé, nos travaux ont contribué à mieux comprendre les mécanismes d'action de la pré-élafine contre Pa. Cette protéine pourrait devenir une solution dans le traitement des patients atteints de fibrose kystique. Des études à l'aide de modèles animaux seraient le moyen idéal de confirmer notre travail et poursuivre la recherche sur le potentiel thérapeutique de la pré-élafine ou de ses domaines.

L’impact des infections bactériennes couplé à l’émergence des mécanismes de résistance aux antibiotiques suscite un besoin urgent de nouvelles classes d’agents antibactériens. D’ailleurs, la résistance du pathogène opportuniste P. aeruginosa diminue l’efficacité de traitement et met en danger la vie des personnes infectées. Dans le but d’identifier de nouveaux antimicrobiens, nous exploitons la machinerie de division cellulaire bactérienne en tant que cible. Ainsi, les protéines de division cellulaire FtsZ et FtsA de P. aeruginosa ont été utilisées afin d’identifier des inhibiteurs protéiques spécifiques à l’aide de la technique de présentation phagique. Nous avons identifié des peptides détenant une affinité pour les enzymes FtsZ et FtsA puis nous avons caractérisé 3 peptides inhibiteurs de l’activité GTPase de FtsZ. Le peptidomimétisme devrait permettre le développement d’une nouvelle classe d’agents antimicrobiens à partir de ces peptides. / The impact of bacterial infections and emergence of antibiotic resistance led to a serious need to develop new class of antibacterials. The acute resistance of the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa lowers the treatment efficiency of infected cystic fibrosis patients and immuno-compromised individuals. In the perspective of finding new antimicrobial agents, we are using the bacterial cell division machinery of as a new target. Thus, P. aeruginosa cell division proteins FtsZ and FtsA have been used to identify inhibitory peptides with the phage-display technique. We identified FtsZ and FtsA tight binding peptides and we characterized three inhibitory peptides of FtsZ GTPase activity. Peptidomimetism will allow the development of new antimicrobial agents with these leader peptides.

La résistance aux antibiotiques est devenue un problème majeur dans la prévention et le traitement des infections bactériennes. Comme elles démontrent des activités inhibitrices in vitro contre un grand nombre de bactéries pathogènes cliniquement importantes, les bactériocines sont de plus en plus considérées comme une alternative potentielle aux antibiotiques conventionnels. Malgré cet énorme potentiel, leur utilisation est grandement limitée par les coûts élevés associés à leur production par fermentation. La synthèse chimique de ces dernières a été envisagée, mais aucune approche n’a donné jusqu’à maintenant un rendement qui puisse faire diminuer significativement les coûts de production. Dans le but de développer une voie de synthèse efficace pour ces peptides antibactériens, nous avons utilisé comme modèle la pédiocine PA-1, une bactériocine de classe IIa avec une activité anti-Listeria. L’optimisation de l’approche synthétique nous a permis d’augmenter les rendements de 1% à 45% et de concevoir des analogues avec des propriétés pharmacologiques améliorées comme une plus grande résistance à l’oxydation et à la lyse enzymatique. Cette importante réalisation nous a non seulement permis de produire la bactériocine en grande quantité, mais aussi déterminer sa structure tridimensionnelle et d’évaluer son impact sur le microbiote au niveau du tractus gastro-intestinal humain. L’approche développée s’est également avérée efficace pour la production d’autres bactériocines de la classe II comme la bactofencine A et permet de cibler davantage de pathogènes qu’on retrouve dans les différents secteurs alimentaire, vétérinaire et médical. En plus de décrire la synthèse et les études structure-activité de la bactofencine A, cet ouvrage présente les stratégies utilisées pour produire et déterminer la structure de la pédiocine PA-1 ainsi que les études sur son activité antimicrobienne et ses effets sur le microbiote dans le tractus gastro-intestinal. / Antibiotic resistance has become a major problem in the prevention and treatment of bacterial infections. As they demonstrate in vitro inhibitory activities against a large number of clinically important pathogenic bacteria, bacteriocins are increasingly seen as a potential alternative to conventional antibiotics. Despite this enormous potential, their use is greatly limited by the high costs associated with their production by fermentation. The chemical synthesis of the latter has been considered, but no approach has yielded so far a yield that can significantly reduce production costs. In order to develop an efficient synthetic route for these antibacterial peptides, we used as model the pediocin PA-1, a class IIa bacteriocin with anti-Listeria activity. Optimization of the synthetic approach allowed us to increase yields by 1% to 45% and to design analogues with improved pharmacological properties such as greater resistance to oxidation and enzymatic lysis. This important achievement allowed us to not only produce bacteriocin in large quantities but also to determine its three-dimensional structure and to evaluate its impact on the microbiota in the human gastrointestinal tract. The approach developed has also been shown to be effective for the production of other class II bacteriocins such as Bactofencin A and allows targeting more pathogens found in the different food, veterinary and medical sectors. In addition to describing the synthesis and structure-activity studies of Bactofencin A, this book presents the strategies used to produce and determine the structure of pediocin PA-1 as well as studies on its antimicrobial activity and its effects on microbiota. the gastrointestinal tract.

En endodontie, les peptides antimicrobiens (AMP) pourraient résoudre les limitations potentielles liées à l'utilisation d'antibiotiques. L’objectif de cette étude était d’évaluer l’effet du KSL-W sur l’adhésion, la prolifération et la migration des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC). Méthodes : Les DPSC ont été cultivées en présence et en l'absence de KSL-W à différentes concentrations ou d’une combinaison de deux (ciprofloxacine et métronidazole ; DAP) ou trois (ciprofloxacine, métronidazole et minocycline ; TAP) antibiotiques. L'adhésion cellulaire a été évaluée à l’aide de coloration au cristal violet et d’observations microscopiques. La viabilité/l’activité métabolique (V/AM) des DPSC a été étudiée par un test MTT. L'effet de KSL-W sur la migration cellulaire / la guérison des blessures a été évaluée à l'aide du test de blessure de la culture dite ″scratch test″. Les données collectées ont été analysées par ANOVA. Une différence significative a été considérée à P ≤ 0.05. Résultats : Le KSL-W n’a pas d’effet inhibiteur sur l’adhésion des DPSC, comparativement au DAP et au TAP. Ces observations sont confirmées par nos analyses de viabilité/activité métaboliques (V/AM) des cellules. En effet, les résultats du MTT ont montré une V/AM plus adéquate en présence de KSL-W. À titre d’exemple, les cellules en présence de KSL-W à 10 et 50 µg/ml, montrent une V/AM comparable au contrôle (cellules non traitées). Il est important de noter que le KSL- W a favorisé la migration cellulaire après une blessure. Les DPSC ont pu migrer et recouvrir la blessure plus rapidement avec KSL- W qu’avec les antibiotiques. Conclusion : Comparativement aux antibiotiques, le KSL-W n’a pas d’effets négatifs sur l'adhésion et la V/AM. Ce peptide semble favoriser la migration cellulaire. Ces travaux suggèrent l’utilisation du KSL-W comme un agent antimicrobien pouvant être utilisé en endodontie.

Les prothèses intraosseuses transcutanées pour amputations (ITAP) représentent une alternative prometteuse par rapport aux prothèses orthopédiques actuellement utilisées en clinique puisqu’elles pourraient diminuer, entre autres, la douleur et l’inconfort chez les patients. Cependant, l’infection, surtout à l’interface implant /peau, reste une complication importante dans ce type de chirurgie orthopédique. Le but de ce projet de recherche est donc de limiter les infections sur une prothèse en alliage de titane (Ti6Al4V ELI).Deux approches ont été établies. La première consiste à promouvoir l’adhésion des cellules de la peau par les peptides d’adhésion KRGDS et KYIGSR, ce qui permettrait de sceller la partie de l’implant qui sort de l’os et ainsi limiter les infections et la deuxième à agir directement sur les bactéries en les éliminant, par le peptide antimicrobien, Magainine 2 (Mag 2).Pour ce travail de thèse, les deux peptides d’adhésion, soit KRGDS et KYIGSR et le peptide antimicrobien, Mag 2, ont été greffés de façon covalente et stable via les bras d’ancrage phosphonates et dopamine à la surface du matériau Ti6Al4V ELI. La caractérisation physico-chimique de ces surfaces a permis de valider le greffage covalent et stable de ces peptides. Des tests cellulaires et bactériens ont été effectués sur les surfaces Ti6Al4V ELI brutes et fonctionnalisées par les différents peptides. Pour les tests cellulaires, il y aune bonne adhésion et prolifération cellulaire des fibroblastes dermiques pour les 4types de matériaux Ti6Al4V ELI. Par contre, la viabilité cellulaire est améliorée pour les échantillons avec peptides greffés, surtout KRGDS et Mag 2. D’autant plus, l’attachement dermique est nettement meilleur sur les surfaces fonctionnalisées par Mag 2 également. Concernant les tests de microbiologie, les résultats obtenus avec les bactéries Staphylococcus epidermidis ATCC-12228 montrent un léger effet antibactérien de la Mag 2 greffée sur la surface Ti6Al4V ELI. Dans le cadre de ce projet, la fonctionnalisation de surface par le peptide antimicrobien Mag 2 est la meilleure alternative pour limiter les infections sur les matériaux Ti6Al4V ELI. / Intraosseous Transcutaneous Amputation Prostheses (ITAPs) represent apromising alternative to orthopedic prostheses currently used in the clinic since they could reduce, among other things, pain and discomfort in patients. However, infection, especially at the implant / skin interface, remains a significant complicationin this type of orthopedic surgery. The aim of this research project is therefore to limit infections on a titanium alloy prosthesis (Ti6Al4V ELI). Two approaches have been established. The first is to promote the adhesion of skin cells by using the KRGDS and KYIGSR peptides, which would seal the part of the implant that comes out of the bone and thus limit infections and the second to act directly on bacteria by eliminating them, by using the antimicrobial peptide, Mag 2. For this thesis work, the two adhesion peptides, either KRGDS or KYIGSR and the antimicrobial peptide, Mag 2, were covalently grafted via the phosphonate and dopamine anchor arms to the surface of the Ti6Al4V ELI material. The physico-chemical characterization of these surfaces made it possible to validate the covalent and stable grafting of these peptides. Cellular and bacterial tests were carried out on bare Ti6Al4V ELI surfaces and functionalized by the various peptides. For cellular assays, there is good celladhesion and proliferation of dermal fibroblasts on the 4 types of Ti6Al4V ELI samples. In contrast, cell viability is improved for samples with grafted peptides,especially KRGDS and Mag 2. Moreover, dermal attachment is significantly betteron surfaces functionalized by Mag 2 as well. Regarding microbiology tests, the results obtained with Staphylococcus epidermidis ATCC12228 bacteria show a slight antibacterial effect of Mag 2 grafted onto the Ti6Al4V ELI surface. Within the framework of this project, the surface functionalization by the antimicrobial peptide Mag 2 is the best alternative to limit infections on Ti6Al4V ELI materials