<p>Antibody-drug conjugates (ADCs) combine the cytotoxicity of traditional chemotherapy with the site-specificity of antibodies by conjugating payloads to antibodies with immunoaffinity. However, the conjugation alters the physicochemical properties of antibodies, increasing the risks of various types of degradation. The effects of common risk factors such as pH, temperature, and light on the stability of ADCs differ from their effects on monoclonal antibodies (mAb) due to these altered physicochemical properties. </p> <p>To date, ADC researchers have developed linkers with improved <i>in vivo</i> stability, and begun to understand the deconjugation mechanisms <i>in vivo</i>. In contrast, the <i>in vitro</i> stability of ADCs has not gained comparable attention. All nine of the U.S. FDA approved ADCs are lyophilized to minimize the potential for degradation. However, there are few studies on the solid-state stability of ADCs. To evaluate lyophilized solids, pharmaceutical development relies heavily on accelerated stability studies, which take months to determine the best formulation. Characterization methods that are often used orthogonally with accelerated studies include Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), Raman spectroscopy, near-infrared spectroscopy (NIR), differential scanning calorimetry (DSC), and x-ray powder diffraction (XRPD). Results from these methods are often poorly correlated with stability, however. Thus, stability evaluation of solid-state ADC products, and other recombinant protein drugs, is often a bottleneck in their development.</p> <p>To provide knowledge on how to improve the <i>in vitro</i> stability of lyophilized ADC formulations, the solid-state stability of ADC formulations with varying risk factors was studied in this dissertation project. The first study investigated interactions between an ADC and excipients in terms of solid-state stability enhancement. The second study investigated the process-driven instability of ADCs during lyophilization using various concentrations of ADCs. The first two studies incorporate a new method called solid-state hydrogen/deuterium exchange coupled with mass spectrometry (ssHDX-MS) as an analytical predictor of solid-state stability. The last study investigated the effects of pH on the stability of labile hydrazones, as a model for common linker chemistry used in ADCs. </p>

In der vorliegenden Arbeit werden drei neue Klassen von modular zugänglichen Elektrophilen für die Biokonjugation von Cystein vorgestellt. Diethynyl-phosphinate (DPs) wurden als bisreaktive Elektrophile für die cysteinselektive Markierung von Peptiden, Proteinen und Antikörpern entwickelt. In diesen Molekülen können beide elektronenarmen Dreifachbindungen unter physiologischen Bedingungen mit Thiol-Nukleophilen reagieren und die erhaltenen Konjugate sind in menschlichem Plasma und in Gegenwart großer Mengen an reduziertem Glutathion stabil. Darüber hinaus wurden DPs in der selektiven Herstellung verschiedener Protein-(Doppel)-Konjugate angewandt. Neben der klassischen Proteinmodifikation können DPs auch zur kovalenten Verbrückung der Disulfidbrücken von Antikörpern eingesetzt werden. Weiters wurde mit Hilfe von Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen werden Ethinyl-triazolyl-phosphinate (ETP) als eine neue Klasse hochreaktiver Elektrophile für die Cystein-Biokonjugation entdeckt. Die Berechnungen zeigen, dass sowohl die elektronenziehenden als auch die π-Elektronen donierenden Eigenschaften des Triazolrings die Reaktivität erhöhen. Vor allem aber wird gezeigt, dass ETP-Elektrophile über die chemoselektive Cu(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition in ein azidhaltiges Molekül eingebaut werden können. Da diese Reaktion problemlos in wässrigen Puffersystemen abläuft, konnte eine Vielzahl funktioneller Elektrophile, einschließlich elektrophiler Peptide und Proteine, aus DPs erzeugt werden. Schließlich wurden Diethinylphosphinoxide als chemoselektive Reagenzien zur Disulfidvererbrückung untersucht. Insbesondere Diethinyl-Triazolyl-Phosphinoxide (DTP) sind vielversprechende Kandidaten, da sie die modulare Synthese von ETP-Elektrophilen mit den beiden reaktiven Gruppen in DPs kombinieren. Die Fähigkeit der DTP-Reagenzien, Disulfide zu verbrücken, wurde durch die Bildung mehrerer funktioneller Antikörperkonjugate gezeigt. / The present work introduces three new classes of modular accessible electrophiles for cysteine bioconjugation. Diethynyl-phosphinates (DPs) were developed as bisreactive electrophiles for the cysteine-selective modification of peptides, proteins and antibodies. Both electrophilic alkynes can react with thiol-nucleophiles under physiological conditions. The corresponding double-conjugates are stable in human plasma and in the presence of a large excess reduced glutathione. Furthermore, the general applicability of diethynyl phosphinates for cysteine selective bioconjugation was established by the generation of various protein-(double)-conjugates and their application in cell experiments. Additionally, DPs can be employed to covalently rebridge the interchain disulfides of therapeutically relevant IgG1 antibodies. Furthermore, with the help of density functional theory based calculations, ethynyl-triazolyl-phosphinates (ETP) were discovered as a new class of highly reactive electrophilic warheads for cysteine bioconjugation. According to the calculations, both the electron withdrawing as well as the π-electron donating properties of the triazole-ring enhance the reactivity of the electrophile. Most importantly, it was demonstrated that ETP electrophiles can be incorporated into a given azide containing molecule via the chemoselective CuI-catalyzed azide alkyne cycloaddition. ETP-reagents were used to obtain functional peptide-, protein- and antibody-conjugates, as well as site-specifically linked diubiquitins. Finally, diethynyl phosphine oxides were explored as chemoselective reagents for disulfide rebridging. Especially diethynyl-triazolyl-phosphine oxides (DTP) are promising candidates since they combine the modular synthesis of ETP-electrophiles with the two reactive groups present in diethynyl phosphinates. The capability of DTP-reagents to rebridged disulfides was proven by the formation several functional antibody conjugates.

In der vorliegenden Arbeit wird eine modulare Reaktionssequenz von zwei aufeinanderfolgenden chemoselektiven Umwandlungen vorgestellt: Es wird gezeigt, dass Vinyl- und Ethynylphosphonamidate chemoselektiv mit Cysteinen von Proteinen und Antikörpern reagieren. Weiterhin wird gezeigt, dass elektrophile Phosphonamidate durch eine vorhergehende chemoselektive Staudinger-Phosphonit Reaktion zwischen Aziden und ungesättigten Phosphoniten in das gewünschte Molekül eingebaut werden können. Hierbei wird ein elektronenreiches Phosphonit in ein elektronenarmes Phosphonamidat umgewandelt, welches somit für die nachfolgende Thiol-Addition aktiviert wird. Die beschriebene Methode erweitert das bestehende Repertoire von Biokonjugationen durch die Einführung eines neuen Konzepts: Eine chemoleselektive Reaktion, die Reaktivität für eine nachfolgende Biokonjugation induziert. Da Phosphonamidat-Konjugationen an Cysteine herausragende Eigenschaften, wie hohe Selektivität für Cysteine, saubere Reaktionsprodukte und eine hervorragende Stabilität mitbringen, wird im zweiten Teil beschrieben wie Phosphonamidate für die Anbindung von zytotoxischen Wirkstoffen an tumor-bindende Antikörper genutzt werden können um Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) herzustellen. Ein einfaches Syntheseprotokoll für die Herstellung, ausgehend von einem nicht gentechnisch veränderten Antikörper mit nur geringen Überschüssen des Wirkstoffs wird vorgestellt. Phosphonamidat-verbundene ADCs zeigen im direkten Vergleichen zum zugelassenen, Maleimid-verbundenen Adcetris überlegende Eigenschaften, wie eine erhöhte Stabilität in Serum und eine erhöhte in vivo Wirksamkeit in einem Tumor Mausmodel. Zusammenfassend verbindet die hier vorgestellte Methode einen einfachen synthetischen Zugang mit hoher Selektivität, überragender Konjugat-Stabilität und der Möglichkeit hochwirksame Wirkstoffkonjugate herzustellen und wird daher aller Voraussicht nach einen großen Beitrag zum Gebiet der zielgerichteten Therapie leisten. / The present work introduces a modular reaction sequence of two chemoselective manipulations in a row. It is shown that vinyl- and ethynylphosphonamidates react selectively with cysteine residues on proteins and antibodies. Most importantly, those electrophilic phosphonamidates can be incorporated into a given molecule in another preceding chemoselective Staudinger-phosphonite reaction (SPhR) from unsaturated phosphonites and azides. During this reaction, an electron-rich phosphonite is transformed into an electron-deficient phosphonamidate that is thereby activated for the subsequent thiol addition. The described technique thereby extends the existing repertoire of bioconjugations by introducing a new concept in protein synthesis: A chemoselective reaction that induces reactivity for a subsequent bioconjugation. Since phosphonamidate conjugations to cysteine hold outstanding features such as high selectivity for cysteine, clean reaction products and excellent stability of the protein adducts in biological environments, it is described in the second part of the present work how ethynylphosphonamidates can be employed for the conjunction of tumor-sensing antibodies and cytotoxic drugs to generate Antibody-Drug-Conjugates (ADCs). A simple synthetic protocol starting from unengineered antibodies, using only a slight excess of the desired drug in a one-pot synthesis protocol is introduced. In a direct comparison to the maleimide containing FDA-approved Adcetris, phosphonamidate linked ADCs show a superior behaviour in terms of linkage stability in serum, combined with an increased in vivo efficacy in a tumor xenograft mouse model. Taken together, the method described herein combines simple synthetic access with high selectivity, superior conjugate stability and the possibility to synthesize highly efficacious drug conjugates and is therefore likely to have a great contribution to the field of targeted therapeutics.

Les conjugués anticorps-médicament (ADC) représentent une avancée révolutionnaire dans la thérapeutique du cancer en délivrant de manière sélective des médicaments cytotoxiques aux cellules tumorales, minimisant ainsi la toxicité systémique. Les ADC se composent de trois composants principaux : un anticorps monoclonal (mAb) ciblant un antigène spécifique associé à la tumeur, un médicament cytotoxique et un lien qui conjugue le médicament à l’anticorps. Malgré leur potentiel thérapeutique, la fabrication des ADC est confrontée à d’importants défis, nécessitant l’optimisation de plusieurs paramètres, en particulier pour obtenir une technologie de conjugaison optimale et un ratio médicament-anticorps (DAR) optimal. Les méthodes de conjugaison traditionnelles basées sur la chimie donnent souvent lieu à des mélanges hétérogènes avec des DAR variables, ce qui peut affecter négativement l’efficacité thérapeutique et la sécurité du produit final. Pour résoudre ce problème, la conjugaison spécifique au site a émergé comme une méthode plus précise, garantissant que les médicaments cytotoxiques sont attachés à des sites spécifiques sur la molécule d’anticorps. Cette technique vise à produire des ADC homogènes avec des DAR constants, améliorant ainsi leur pharmacocinétique et leur pharmacodynamie. Cependant, les conjugaisons spécifiques au site ne sont pas exemptes de limitations. L’un des principaux défis réside dans la complexité de l’ingénierie des modifications nécessaires. L’introduction de sites de conjugaison spécifiques nécessite un génie génétique précis, ce qui peut être techniquement difficile et chronophage. De plus, les processus de fabrication des ADC spécifiques au site sont plus complexes et nécessitent des techniques sophistiquées et des mesures étendues de contrôle qualité. Ces facteurs peuvent donc affecter la production d’ADC basée sur la conjugaison spécifique au site. Le travail présenté dans cette thèse de doctorat propose l’utilisation d’une paire de peptides hétérologues à haute affinité, à savoir les coiled-coils E/K, pour produire des ADC avec une homogénéité améliorée et un DAR contrôlable. Pour commencer, nous avons conçu, produit et purifié une bibliothèque d’anticorps monoclonaux (trastuzumab) marqués avec divers peptides Ecoil et évalué leur manufacturabilité via une transfection transitoire dans des cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) et avons étudié les caractéristiques des anticorps marqués produits. Nos données montrent que l’ajout de peptides Ecoil aux extrémités C-terminales des chaînes d’anticorps (chaînes légères, chaînes lourdes ou les deux) n’entrave pas la production de constructions chimériques de trastuzumab. De plus, les tests analytiques et cellulaires ont confirmé que les constructions de trastuzumab marquées avec Ecoil ont maintenu leur bioactivité. La position, le nombre et la longueur des peptides Ecoil n’ont eu aucune influence sur l’affinité de liaison et la stabilité des anticorps marqués à leur antigène. Dans le cadre d’une étude supplémentaire et d’une étape supplémentaire pour démontrer la polyvalence des peptides E/K, nous avons également évalué la capture et la libération du trastuzumab marqué avec Ecoil produit à partir d’hydrogels de dextrane macroporeux fonctionnalisés avec le peptide Kcoil (le partenaire de liaison du peptide Ecoil). Ensemble, ces données ont révélé que les peptides Ecoil, quelle que soit leur longueur, leur nombre et leur position sur l’anticorps, n’avaient aucun effet significatif sur la manufacturabilité, la capacité de liaison ou le schéma de libération de l’hydrogel. Sur la base de cette fondation, nous avons exploré l’utilisation de deux peptides d’affinité complémentaires, E-coil (EVSALEK) et K-coil (KVSALKE), pour développer des ADC avec une homogénéité améliorée et un DAR contrôlable. En utilisant une méthode d’analyse par résonance plasmonique de surface (SPR) sur mesure et une chromatographie d’exclusion stérique, nous avons mesuré la dissociation cinétique et la stabilité des complexes formés par le trastuzumab marqué avec Ecoil et la protéine fluorescente rouge monomérique (mRFP) marquée avec Kcoil en tant que substitut de médicament. La stabilité in vitro a également été évaluée dans le sérum sanguin à l’aide d’un test ELISA en interne avant les études in vivo. Ensuite, pour évaluer les performances in vivo, nous avons mené des études de biodistribution et de localisation tumorale dans des modèles de souris xénogreffées HER2. Ces expériences ont démontré la stabilité de nos ADC dans la circulation sanguine et leur accumulation efficace sur le site de la tumeur. En général, ce projet vise à démontrer la faisabilité et la polyvalence du système d’affinité E/K pour la conjugaison spécifique au site de molécules thérapeutiques sur le squelette d’anticorps sans modifications chimiques complexes/préjudiciables. La fabrication simplifiée des ADC en utilisant cette méthode de “conjugaison en une seule étape” présentée ici ouvre la voie au développement de nouvelles méthodes dans la production d’ADC avec potentiellement une pharmacocinétique, une bioactivité et une stabilité améliorée. / Antibody-drug conjugate (ADC) represents a transformative breakthrough in cancer therapeutics by selectively delivering cytotoxic drugs to tumor cells, thereby minimizing systemic toxicity. ADC consists of three main components: a monoclonal antibody (mAb) targeting a specific tumor-associated antigen, a cytotoxic drug, and a linker that conjugates the drug to the antibody. Despite their therapeutic potential, the manufacturing of ADCs faces significant challenges, requires the optimization of several parameters particularly in achieving optimal conjugation technology and drug-to-antibody ratio (DAR). Traditional chemical-based conjugation methods often result in heterogeneous mixtures with variable DARs, which can adversely affect the therapeutic efficacy and safety of the final product. To address this issue, site-specific conjugation has emerged as a more precise method, ensuring that cytotoxic drugs are attached to specific sites on the antibody molecule. This technique aims to produce homogeneous ADCs with consistent DARs, thereby enhancing their pharmacokinetics and pharmacodynamics. However, site-specific conjugations are not exempt from limitations. One of the main challenges is the complexity involved in engineering the necessary modifications. Introducing specific conjugation sites requires precise genetic engineering, which can be technically challenging and time-consuming. Moreover, site-specific ADC manufacturing processes are more complex and require sophisticated techniques and extensive quality control measures. These factors can therefore affect ADC production based on site-specific conjugation. The work presented in this doctoral thesis proposed use of a high-affinity peptide pair, namely the E/K coiled-coils, to produce ADCs with improved homogeneity and controllable DAR. To begin with, we designed, produced, and purified a library of monoclonal antibodies (trastuzumab) tagged with various Ecoil peptides and evaluated their manufacturability via transient transfection in Chinese hamster ovary (CHO) cells and investigated the characteristics of the produced tagged antibodies. Our data show that the addition of Ecoil tags at the C-termini of antibody chains (light chains, heavy chains, or both) does not hinder the production of chimeric trastuzumab constructs. Further, analytical and cell-based assays confirmed that the Ecoil-tagged trastuzumab constructs maintained their bioactivity. The position, number, and length of the Ecoil tags had no influence on the binding affinity and stability of tagged antibodies to HER2 antigen. As an additional study and an extra step towards demonstrating the versatility of the E/K affinity peptides, we also evaluated the capture and release of produced Ecoil-tagged trastuzumab from macroporous dextran hydrogels functionalized with Kcoil peptide (the Ecoil peptide binding partner). Together, these data revealed that the Ecoil tags, regardless of their length, number, and position on the antibody, had no significant effect on manufacturability, binding capacity, or release pattern from the hydrogel. Building on this foundation, we explored the use of two complementary affinity peptides, E-coil (EVSALEK) and K-coil (KVSALKE), to develop ADCs with improved homogeneity and controllable DAR. Using a tailored surface plasmon resonance (SPR) assay and size exclusion chromatography(SEC), we measured the kinetics of dissociation and stability of the complexes formed by Ecoil-tagged trastuzumab and Kcoil-tagged monomeric red fluorescent protein (mRFP) as a drug surrogate. The in vitro stability was also assessed in blood serum using an in-house enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) prior to the in vivo studies. Next, to evaluate the in vivo performance, we conducted biodistribution and tumor localization studies in HER2 xenograft mouse models, specifically using SKOV-3 cells, which exhibit deregulated HER2 expression. These experiments demonstrated the stability of our ADCs in blood circulation and their effective accumulation at the tumor site. Overall, this project aims to demonstrate the feasibility and versatility of the E/K coiled coil affinity system for site-specific conjugation of the payload to the antibody backbone without complex/detrimental chemical modifications. The simplified manufacturing of ADCs using this “single-step conjugation” method shown here paves the way for developing new methods in production of ADCs with potentially enhanced pharmacokinetics, bioactivity, and stability.