O gene humano KIAA0090 mapeia uma região cromossômica (1p36.13) com freqüentes aberrações em cânceres humanos e é superexpresso em muitos tipos de tumores. É um gene altamente complexo cujas seqüências de cDNA oriundas de bases de dados públicas apóiam a existência de mais de 20 transcritos alternativos. Sua RefSeq prediz a codificação de uma proteína altamente conservada com 993aa, cujo ortólogo em S. cerevisae (ECM1) foi proposto recentemente atuar no enovelamento de proteínas transmembrana no retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi adquirir conhecimento sobre a localização e função da proteína KIAA0090, em células e tecidos normais e tumorais, bem como em células expostas a estresse. Geramos anticorpos policlonais (anti-K2) contra a metade C-terminal da proteína e comparamos seu padrão ao tratamento obtido com o anticorpo (anti-K1), previamente gerado contra a metade N-terminal. A proteína endógena foi localizada primariamente no Golgi e na mitocôndria, dependendo se o anticorpo utilizado foi contra a região N- ou C-terminal, respectivamente. Observamos também, embora menos notável, uma marcação sobreposta com a rede do RE e na margem celular, e variáveis graus de marcação dentro do núcleo e associada a pequenas partículas citoplasmáticas. A análise imunohistoquímica forneceu evidências que a KIAA0090 é ubiquamente epressa. O anti-K2 marcou estruturas semelhantes a Golgi em todo tipo celular, predominando assim naquelas com Golgi mais visíveis, como células secretórias. Observamos para a maioria dos tecidos uma marcação leve a moderada para o anti-K1, mas uma forte marcação foi encontrada em grupos restritos de células, como as células reticulares do timo, epitélio ductal das glândulas da língua e na lâmina basal do epitélio escamoso na zona de transição esôfago-gástrica. Em cortes histológicos de melanoma primário, observamos uma forte marcação para o anti-K1, principalmente em vasos e em células invasoras na margem do tumor, enquanto o anti-K2 mostrou um padrão sugestivo de infiltrado inflamatório e/ou células mesenquimais. Em tecidos de câncer de mama, vimos uma forte marcação nas células de carcinoma ductal em comparação ao epitélio ductal normal para o anti-K2, ao passo que o anti-K1, marcou fortemente vasos e células basais no epitélio de revestimento glandular, tanto no tecido normal como no tumoral. Utilizando uma matriz com amostras teciduais de câncer de mama obtidas de 96 pacientes, observamos uma marcação forte a moderada para o anti-K1 em 84% dos casos, enquanto 16% dos casos não apresentaram marcação. Notamos que os casos positivos para o anti-K1 estavam 100, 85 e 71% entre os casos de grade 1, 2 e 3, respectivamente, sugerindo uma tendência de perda da KIAA0090 associada à progressão do câncer de mama. Foi interessante notar que a brefeldina A e MG132 alteraram os níveis de RNAm da KIAA0090 e levaram à redistribuição da proteína endógena. Outros tratamentos de estresse, incluindo tunicamicina, complexo de rutênio doador de óxido nítrico e etoposídeo, também alteraram o padrão de distribuição da proteína. Este estudo fornece evidências preliminares que corroboram os resultados obtidos de estudos de expressão gênica em larga escala, fortalecendo os indícios de que a KIAA0090 desenvolve um papel na homeostase celular e está envolvida no câncer. / Human KIAA0090 gene maps to a chromosomal region (1p36.13) with frequent aberrations in cancer and is overexpressed in many tumor types. It is a highly complex gene with cDNA sequences in databases supporting the occurrence of more than 20 alternative transcripts. The RefSeq transcript is predicted to encode a highly conserved 993 aa transmembrane protein whose S. cerevisiae ortolog (EMC1) was recently proposed to function on transmembrane protein folding in the endoplasmic reticulum (ER). The aim of this work was to gain insight into the localization and function of KIAA0090 protein, in normal and tumor cells and tissues, as well as in cells exposed to stress treatments. We raised a polyclonal antibody (anti-K2) to the C-terminal half of the protein and compared its pattern of staining with an antibody (anti-K1) previously generated in our laboratory to the N-terminal half. The endogenous protein was primarily localized either to mitochondria or Golgi, depending whether the antibody used was to the N- or C-terminal, respectively. Also, less conspicuous staining overlapped with the ER network and cell margin, and variable degrees of labeling was observed within the nucleus and associated to small cytoplasmic particles. Immunohistochemistry survey provided evidence that the KIAA0090 protein is ubiquitously expressed. Anti-K2 labeled in a Golgi-like pattern in every cell type, predominating in those with more conspicuous Golgi, such as secretory cells. Faint to moderate anti-K1 staining was found in most tissues, but very strong staining was seen in restricted groups of cells, such as thymus reticular cells, ductal epithelium of salivary lingual glands and the basal layer of the squamous epithelium in the esophagus-gastric transition zone. In histological sections of primary melanomas, we observed a strong staining for the anti-K1, mostly in vessels and at the invasive tumor margin, while the anti-K2 showed a staining pattern suggestive of infiltrating inflammatory and mesenchymal cells. In breast tissues, stronger staining was seen in ductal carcinoma cells in comparison to normal ductal epithelium for anti-K2 antibody, whereas anti-K1 strongly marked vessels and basal cells in epithelia lining glandular ducts both in normal and tumor tissues. Using a tissue array of breast cancer samples obtained from 96 patients, we observed strong to moderate staining for anti-K1 in 84% of the samples and lack of staining in 16%, interestingly anti-K1 positive cases were 100, 85 and 71% among cases of grades 1, 2 and 3, respectively, suggesting a tendency of KIAA0090 loss associated with breast cancer progression. A positive correlation was found with estrogen receptor expression and the opposite for HER2. Interestingly, Brefeldin A and MG132 altered KIAA0090 mRNA levels and caused endogenous KIAA0090 protein to redistribute. Other stress treatments, including tunicamycin, a ruthenium complex nitric oxide donor and etoposide, also altered KIAA0090 distribution. This study supports the notion that KIAA0090 play a role in cellular homeostasis and is involved in cancer.

Introdução: Anemias hemolíticas induzidas por fármacos (AHIF) são caracterizadas por uma anemia hemolítica imune após exposição a um fármaco. Testes sorológicos têm o potencial de confirmar a presença de anticorpo contra fármacos, mas a realização destes testes ainda é um desafio. Os anticorpos IgM e IgG envolvidos na AHIF são principalmente de dois tipos: fármaco-dependentes e fámaco-independentes. Os anticorpos fármaco-independentes reagem com os eritrócitos \"in vitro\" sem a presença do fármaco, e os resultados imunohematológicos são idênticos aos encontrados nas anemias hemolíticas autoimunes idiopáticas. Anticorpos fármaco-dependentes resultam em teste da antiglobulina direto (TAD) positivo e eluato negativo, os anticorpos só reagem \"in vitro\" com os eritrócitos na presença do fármaco. Indivíduos saudáveis podem desenvolver anticorpos contra fármacos, mesmo na ausência de anemia hemolítica. Os indivíduos podem ser sensibilizados durante exposição prévia a fármacos, exposição a antibióticos usados em ração animal, tanques de piscicultura, berçários de criação de suínos ou tratamento de mastite em bovinos. Estes indivíduos apresentam um maior risco de desenvolvimento de AHIF grave na ocasião de uma segunda exposição ao fármaco. Objetivos: Padronizar testes imunohematológicos para a detecção de anticorpos dirigidos contra fármaco-dependentes. Materiais e métodos: Amostras de 162 doadores de sangue foram submetidas a pesquisa de anticorpos fármaco-dependentes anti-cefalexina, anti-rifampicina e anti-diclofenaco de sódio. Amostra de um doador de plaquetas colhidas por aférese com TAD positivo foi investigada para detecção de anticorpos fármaco-dependentes anti-valsartana. Amostras de 8 pacientes com suspeita diagnóstica de AHIF foram investigadas para a presença de anticorpos contra os fármacos que foram prescritos ao paciente no período de duas semanas prévias ou até o momento em que a hemólise aguda foi constatada. Anticorpos fármaco-dependentes que reagem na presença do fármaco ligado covalentemente à membrana da hemácia, ou na presença do fármaco em solução, foram investigados em doadores de sangue (técnicas em gel) e em pacientes (técnicas em tubo e em gel). Resultados: Os testes laboratoriais detectaram a presença de anticorpo anti-valsartana no eluato de um doador de plaquetas colhidas por aférese com TAD positivo e a presença de anticorpo anti-ceftazidima no soro de um paciente com suspeita clínica de AHIF. A investigação de anticorpo anti-cefalexina e anti-rifampicina foi negativa em amostras de doadores de sangue. O teste laboratorial para investigação de anticorpo anti-diclofenaco de sódio não foi finalizado devido a presença de hemólise em hemácias sensibilizadas com o fármaco e após a adição do fármaco na solução de hemácias. Conclusão: A detecção de anticorpo anti-valsartana em um doador de plaquetas colhidas por aférese evidenciou a presença de anticorpo anti-fármaco na ausência de hemólise. A detecção de anticorpo anti-ceftazidima em amostra de um paciente com anemia hemolítica confirmou a suspeita clínica de AHIF. Reconhecer os sinais clínicos da AHIF precocemente e a disponibilidade de testes sorológicos é essencial para confirmação diagnóstica, orientação terapêutica e prevenção de uma hemólise potencialmente fatal. / Introduction: Drug-induced immune hemolytic anemia (DIHA) is characterized by immune hemolytic anemia following exposure to a drug. Serological testing has the potential to confirm the presence of anti-drug antibodies, but the testing is still a challenge. The IgM and IgG antibodies involved in DIHA comprise mainly two types: drug-dependent and drug-independent. Drug-independent antibodies react with erythrocytes in vitro without the presence of the drug, and the immunohematologic results are identical to those found in idiopathic autoimmune hemolytic anemias. Drugdependent antibodies induce positive direct antiglobulin tests (DAT) and negative eluates, and in vitro antibody reactions with erythrocytes are only detected in presence of the drug. Healthy individuals can develop antibodies against drugs even in the absence of hemolytic anemia. Individuals may be sensitized during previous exposure to drugs, exposure to antibiotics used in animal feed, fish culture ponds, swine nurseries or mastitis treatment in bovines. These individuals present higher risk of developing severe DIHA on the second exposition. Aims: To standardize immunohematological tests for detection of anti-drug dependent antibodies. Materials and methods: Samples from 162 blood donors were tested for anti-cephalexin, anti-rifampicin and antidiclofenac antibodies. Sample from one platelet apheresis donor with positive DAT was investigated for anti-valsartan drug-dependent antibody. Samples from 8 patients with suspected DIHA were investigated for the presence of antibodies directed against the drugs that were prescribed to the patient in the period of two weeks prior to or until the time when acute hemolysis was detected. Drug-dependent antibodies that react in presence of the drug covalently attached to the erythrocyte membrane, or in presence of the drug in solution were investigated in samples from blood donors (gel techniques) and from patients (tube and gel techniques). Results: Laboratory tests detected antivalsartan antibody in the eluate of an platelet apheresis donor with positive TAD and anti-ceftazidime antibody in the serum of a patient with clinical suspicion of DIHA. Investigation of anti-cephalexin and anti-rifampicin antibody was negative in blood donor samples. The laboratory test for anti-diclofenac antibody was not possible due to the presence of hemolysis in erythrocytes sensitized with the drug and when the drug in solution was added to the erythrocyte. Conclusion: The detection of anti-valsartan antibody in an platelet apheresis donor revealed the presence of an anti-drug antibody in the absence of hemolysis. Detection of anti-ceftazidime antibody in a patient with hemolytic anemia confirmed the clinical suspicion of DIHA. It is essential to recognizing early clinical signs of DIHA and have serological tests available for diagnostic confirmation, therapeutic guidance and prevention of potentially fatal hemolysis.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro biológico que tem importância vital em muitos processos fisiológicos e apresenta uma multiplicidade de funções de regulação no corpo humano, tais como neurotrasmissão, vasodilatação, participa nas respostas imunes e em vários processos associados com o desenvolvimento dos tumores. Vários estudos fornecem evidências sobre as propriedades tumoricidas do óxido nítrico e doadores de NO que podem ser usados para o tratamento de tumores malignos e são objetos de interesse na atualidade. Baseado nisto o objetivo deste trabalho foi de sintetizar e descrever aspectos estruturais dos compostos [Ru(bpy)2(dcbpy)] (dcbpy = ácido 4,4\'-dicarboxi-2,2\'-bipiridina, bpy = 2,2\'-bipyridina) [Ru(bpy)(dcbpy)2], cis-[RuCl2(dcbpy)2], cis-[Ru(dcbpy)2NO(L)]n+ (L = cloreto), [Ru(TERPY)(dcbpy)Cl] (TERPY = 2,2\': 6\'\', 2\'\' - terpiridina) and [Ru(TERPY)(dcbpy)NO], além de ensaios de citotoxicidade in vitro para alguns dos complexos sintetizados. Ensaios de citotoxicidade com solução aquosa de complexos rutênio-nitrosilo em linhagem de células metastáticas B16-F10 mostrou resultados relativamente baixos. Medidas de viabilidade celular mostrou que estes decrescem cerca de 10 % em relação ao controle. Este resultado foi interpretado como sendo devido a baixa interação entre o complexo e a célula. Bioconjugação de rutênio-nitrosilo com anticorpo policlonal IgG foi obtido por interação convalente e mostrou maior especificidade com um alvo na célula. Cromatografia de exclusão foi utilizada para separar o bioconjugado --IgG, que foi caracterizado por teste Western Blotting. Após a bioconjugação, o --IgG foi submetido a estudos de citotoxicidade com células metastáticas e a viablidade celular avaliada com ensaios MTT. Os resultados exibiram um incrível aumento na citotoxicidade de células B16-F10. Viabilidade celular foi determinada e valores de morte celular de cerca de 90 % obtida para uma das frações de --IgG. Nossos resultados demonstraram que o bioconjugado --IgG pode aumentar a resposta citotóxica e quiçá ser útil em terapia clínica. / Nitric oxide (NO) is a biological messenger that has vital importance in many physiological processes and shows a multitude of regulatory roles in the human body, such as neurotrasmission, vasodilatation, immune responses and also participates in various processes associated with cancer development. Several studies provide evidences of the tumoricidal properties of NO donors that can be used for the treatment of malignant tumors and nowadays are objects of interest. Based on this the aim of this work was synthesize compounds that in a controlled manner can deliver NO in a biological process. The synthesis, structural aspects, and in vitro cytotoxic properties of [Ru(bpy)2(dcbpy)] (dcbpy = 2,2\'-bipyridine-4,4\'-dicarboxylic acid), 2\'-bipyridine; bpy = 2,2\'-bipyridine) [Ru(bpy)(dcbpy)2], cis-[RuCl2(dcbpy)2], cis-[Ru(dcbpy)2NO(L)]n+ (L = chloride), [Ru(TERPY)(dcbpy)Cl] (TERPY = 2,2\': 6\'\', 2\'\' - terpiridine) and [Ru(TERPY)(dcbpy)NO] are described. Citotoxicity assays with aqueous nitrosyl ruthenium complex in metastatic B16-F10 cells displayed very little effect. Cell viability measurement showed decrease around 10 % in comparison to the control. It was associated due to the low interaction between nitrosyl ruthenium specie and the cell. Bioconjugation of nitrosyl ruthenium specie with polyclonal antibody IgG was achieved by covalent interaction and showed more specific interaction between bioconjugated and target cell. Exclusion chromatography was used to isolate --IgG conjugated, which was characterized by Western Blotting test. Following bioconjugation, the --IgG was submitted to cytotoxic studies with metastatic cells and the viability evaluated by MTT assay. The results displayed incredible increase of citotoxicity for B16F10 cells. Cell viability was achieved to decrease until to 90 % in comparison to the control when one fraction of --IgG was used. Taken together, the present findings demonstrate that the --IgG complex may elicit citotoxicity responses that may find useful applications in clinical therapy.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O CD3 como alvo terapêutico de anticorpos, pode induzir a depleção parcial dos linfócitos T circulantes, provocando uma imunossupressão, que pode ser explorada clinicamente. Com isso, a busca por anticorpos anti-CD3 humanizados tem relevância biotecnológica. Entretanto, o CD3 é um antígeno de membrana de difícil preparação. Desse modo, procuramos obter um antígeno mimético ao CD3 que se ligue com alta afinidade a um anticorpo conhecidamente imunomodulador, o anticorpo monoclonal OKT3, de forma a facilitar a busca de novos anticorpos terapeuticos. Para isso utilizou-se o biopanning, por phage display, para selecionar peptídeos ligantes, a partir de uma biblioteca de peptídeos randômicos constrita de sete resíduos, PhDC7C (Biolabs). Um protocolo de seleção baseado em seleção negativa com IgG2a de camundongo, seguido de três ciclos sucessivos de seleção positiva. Para validação desses biopanning foi feita a titulação dos ciclos comparando-os a uma curva padrão, usando a biblioteca original amplificada por PCR, que foi utilizada para normalizar a quantidade de DNA. Foram obtidas sub-bibliotecas com um título em torno de 106 pfu/mL. Essas sub-bibliotecas foram analisadas por sequenciamento de DNA de alto desempenho e por bioinformática em busca de peptídeos selecionados especificamente pelo paratopo do anticorpo OKT3, um anti-CD3. Com a análise de bioinformática foi permitido à comparação das sequencias obtidas aos bancos de dados, existentes. Assim, foram excluídos, os peptídeos conhecidamente resultante de seleção inespecífica. Em conclusão, não foi possível encontrar um peptídeo ligante ao alvo de interesse. Provavelmente o viés encontrado na biblioteca, interferiu no sucesso da técnica, mas modificações no protocolo de seleção deverão ser considerados na seleção de peptídeos ligantes, que sirvam de mimotopos. / Anti-CD3 antibodies, a target for antibody therapy, may induce partial depletion of circulating T lymphocytes, causing immunosuppression, which can be explored clinically. Thus, a search for humanized anti-CD3 antibodies has a biotechnological relevance. However, CD3 is a difficult-to-prepare membrane antigen. Thus, we aim to obtain a CD3 antigen mimetic that binds with high affinity to a known immunomodulatory anti-CD3, the mouse monoclonal antibody OKT3. We use a seven-residue, phage display peptide library PhDC7C (Biolabs) to select for OKT3 mAb ligands peptides. The screening involves a negative selection with mouse IgG2a and three successive positive selection cycles. The validation of biopanning was done with PCR, which was used to quantify the amount of DNA. Sub-libraries with a titer of about 106 pfu / ml were obtained. These sub-libraries were analyzed by high-throughput DNA sequencing and by bioinformatics in search peptides selected specifically for the paratope of the OKT3 molecule. With a bioinformatics analysis it was possible to compare the sequences with the existing databases. Thus, peptides known as non-specific binding were excluded. However, a peptide binding to the target of interest could not be found. Further improvement in selection techinique may yield to specific OKT3 binding mimotopes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2008-11-20T16:07:21Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BarbaraSidouPimentel.PDF: 1043256 bytes, checksum: 65ef75685867db084b16fb852bfea0e1 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-03T17:53:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BarbaraSidouPimentel.PDF: 1043256 bytes, checksum: 65ef75685867db084b16fb852bfea0e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-03T17:53:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BarbaraSidouPimentel.PDF: 1043256 bytes, checksum: 65ef75685867db084b16fb852bfea0e1 (MD5) / Atualmente no Brasil ocorrem cerca de 20.000 acidentes ofídicos anuais, sendo 90% deles causados por serpentes do gênero Bothrops. A soroterapia ainda é o tratamento mais comum para acidentes com animais peçonhentos, apesar da toxicidade gerada pela utilização de anticorpos eqüinos. Esse tratamento pode induzir inflamação, falência renal e até choque anafilático. Entretanto atualmente vários estudos vêm sendo desenvolvidos no intuito de minimizar esses efeitos colaterais, incluindo o desenvolvimento de anticorpos mais específicos e menos imunogênicos, que poderiam substituir ou até mesmo atuar em conjunto com a soroterapia convencional. A fosfolipase A2 (PLA2) é o principal antígeno encontrado no veneno da serpente Bothrops atrox e é o responsável pela miotoxicidade, inflamação e necrose. Anticorpos monoclonais (mAbs) contra esse antígeno foram produzidos em camundongos e se mostraram capazes de neutralizar eficientemente a atividade miotóxica dessa PLA2 (Kanashiro et al., 2002). O objetivo desse trabalho foi então humanizar o anticorpo anti-PLA2 A85/9-4 produzido por Kanashiro e colaboradores (2002), visando o seu uso clínico no tratamento de envenenamentos com essa serpente. Inicialmente os genes codificadores das cadeias variáveis leve e pesada do mAb foram seqüenciadas a partir da clonagem do cDNA de imunoglobulina vindo do hibridoma. Para humanizar esse anticorpo as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) murinas foram transferidas para arcabouços humanos germinais escolhidos em bancos de dados devido a sua alta similaridade com as seqüências murinas. A porção variável (Fv) humanizada proposta tem apenas 16 resíduos de aminoácidos não-humanos na cadeia leve e 9 na cadeia pesada. As seqüências codificadoras das porções variáveis foram sintetizadas e clonadas na forma de scFv (fragmento variável de cadeia única) em vetor de expressão em Pichia pastoris. Entretanto, durante a expressão do scFv verificou-se a formação de agregados no sobrenadante de cultura, dificultando sua purificação e comprometendo o rendimento. Para diminuir essa agregação as porções variáveis do anti-PLA2 foram então clonadas e expressas na forma de FvFc o que tornou possível a purificação e a realização dos testes de afinidade do anticorpo humanizado. O fragmento FvFc recombinante se mostrou capaz de reconhecer tanto o extrato bruto da peçonha quanto a fosfolipase purificada, além de ter sua ligação inibida pela presença do mAb original. Os testes in vitro sugerem que os FvFcs humanizados possam apresentar desempenho similar ao mAb em futuros testes de neutralização in vivo. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Nowadays in Brazil there are about 20000 snake accidents annualy and 90% of them are with the Bothrops species. The serotherapy is the commonest treatment to animal poison accidents, despite of the toxicity triggered by equine antibody utilization. This conduct can induce inflammation, kidney failure and anaphylactic shock. Nowadays several studies have been developed to minimize these collateral effects included the developing of more especific and less immunogenic antibodies that could be used to substitute the conventional serotheraphy or in association with this treatment. The Phospholipase A2 (PLA2) is the principal antigen found in the Bothrops atrox venom and causes miotoxicity, inflammation and necrosis. Monoclonal antibodies (mAbs) against this antigen were produced in mice and were able to neutralize the miotoxic activity of PLA2 efficiently (Kanashiro et al., 2002). The objective of this work was to develop a humanized form of the antibody anti-PLA2 A85/9-4 produced by Kanashiro et al (2002), aiming its clinical use for snake poisoning treatment. Initially the light and heavy chains of the mAb were determined by cloning Ig cDNA from mAb´s hybridoma. To humanize this antibody, the light and heavy chain’s CDRs of the murine mAb were transferred to a human framework, chose on the database of human germline V genes because their high similarity with the murine sequences. The proposed Fv has 16 non-human residues in the light chain and 9 in the heavy chain. The sequences of the variables regions were synthesized and initialy cloned as a scFv (single chain variable fragment) in expression vector for Pichia pastoris heterologous expressions. But during the expression this form induced agregation and couldn’t be purified. To minimize this agregation the variable regions of the anti-PLA2 were cloned as a FvFc fragment and in this form was possible the purification and tests of afinity of the humanized form. The recombinant FvFc antibody fragment was able to recognize the total venom and the purified PLA2. And was inhibit by the original mAb. The results of the in vitro tests suggest that the humanized FvFcs can be similar results of the original mAb in in vivo neutralization tests.

Orientador: Valéria Marçal Félix Lima / Banca:Gisele Fabrino Machado / Banca:Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: A leishmaniose é uma doença imunossupressora causada por protozoários do gênero Leishmania, tendo os cães como reservatório doméstico. A molécula Programmed Cell Death 1 (PD-1) é altamente expressa em células leucocitárias de cães com leishmaniose visceral e promove a exaustão dos linfócitos T e a supressão da secreção de citocinas. Como o PD-1 tem função supressiva em relação à imunidade celular, avaliamos o efeito de anticorpos bloqueadores de PD-1 na produção de NO, ROS, interleucina 17 (IL-17) e na carga parasitária em cultura de leucócitos esplênicos de cães naturalmente infectados. In vitro, o bloqueio de PD-1 promoveu aumento dos níveis de NO intracelular e reduziu os de IL-17 no sobrenadante da cultura, além de reduzir a carga parasitária, más não alterou os níveis de ROS. Concluímos que a PD-1 participa na regulação da resposta imune e que o anticorpo bloqueador é efetivo na restauração da atividade microbicida do hospedeiro. Isso pode ser investigado em estudos imuno-terapêuticos no futuro. / Abstract: Leishmaniasis is an immunosuppressive disease caused by protozoa of the genus Leishmania for which dogs are the domestic reservoir. The programmed cell death 1 molecule (PD-1) is highly expressed in leukocyte cells of dogs with visceral leishmaniasis, and it promotes T lymphocyte exhaustion and suppression of cytokine secretion. Because PD-1 has a suppressive function regarding cell immunity, we evaluated the effect of PD-1 blocking antibodies on NO, ROS and interleukin 17 (IL-17) production and on parasite load in spleen leukocyte cultures from naturally infected dogs. In vitro, PD-1 blocking promoted increased levels of intracellular NO and reduced the levels of IL-17 in the culture supernatant, in addition to reducing the parasite load, but do not change ROS levels. We conclude that PD-1 participates in regulation of the immune response and that the blocking antibody is effective in restoring host microbicidal activity. This can be investigated in an immuno-therapeutic study in the future. / Mestre

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-16T14:28:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 605491 bytes, checksum: 3d6eb9f3a272ae7d5ab2a5509a143dac (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-16T14:28:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 605491 bytes, checksum: 3d6eb9f3a272ae7d5ab2a5509a143dac (MD5) Previous issue date: 2007-04-10 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O vírus da doença infecciosa bursal (IBDV) é o agente etiológico de uma das mais importantes doenças para a indústria avícola mundial, e se caracteriza por ser altamente contagioso e produzir um estado de imunodepressão nas aves, trazendo falhas na vacinação e susceptibilidade a outras doenças, o que resulta em perdas econômicas ao setor avícola. O Brasil é o maior exportador de frango de corte do mundo o que motiva ao setor de sanidade avícola a oferecer alternativas de diagnóstico confiáveis, e rápidas, com tecnologia nacional. Por este motivo, a proposta do presente trabalho foi a produção de anticorpos monoclonais (AcM) de alta afinidade contra o vírus da doença infecciosa bursal (IBD), para uma possível utilização futura em testes de imunodiagnóstico do tipo imunofluorescência, imunohistoquímica ou ELISA de captura. Para a produção dos AcM se usou vírus inteiro proveniente de uma vacina comercial, estirpe intermediaria (Bur-706) o qual se multiplico em células VERO e foi purificado por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, foi utilizado para a imunização dos camundongos BALB/c, usando como adjuvante saponina, o que permitiu a obtenção de anticorpos policlonais capazes de revelar a enzima por ELISA. A fusão das células esplênicas dos camundongos imunizados e o mieloma SP2/0 resultou na obtenção de 2 famílias de hibridomas (2H11 e 5C7) secretores de anticorpos. Após clonagem por diluição limitante, foram obtidos 3 clones secretores de AcM da classe IgG. Os três AcM obtidos foram capazes de revelar as proteínas virais VPX e VP2 por ”western blotting”, reconhecendo a proteína de 47 kDa e 41 kDa. A definição dos isótipos reconhecidos pelos AcM obtidos devem ser objeto de investigações futuras, de modo a permitir a utilização dos anticorpos em ensaios imunoenzimáticos para estudos epidemiológicos da doença o para diferenciar vírus vacinal e de campo. / The infectious bursal disease virus (IBDV) causes highly contagious and immunosuppressive disease for the world poultry, resulting in an impaired response to vaccination and susceptibility to other diseases, and severe economical losses to the poultry activity. Brazil is the world ́s largest exporter of chicken meat, condition which demands reliable and rapid procedures for diagnosis. The proposal of the present work is the production of monoclonal antibodies (MAbs) of high affinity against IBDV. The IBDV was strain S 706 (the intermediate vaccine) was replicated in VERO cell and purified by sucrose gradient, for ELISA and mice inoculation. For the immunization of the mice BALB/c using as a saponin adjuvant, that allowed an inflammation reaction which enhanced the antibody response, detectable by ELISA. The fusion of splenic cells of the immunized mice and the mieloma SP2/0 resulted in 2 hybridoma families (2H11 and 5C7). After cloning by limiting dilution, 3 clones secretors of MAbs from IgG class were obtained. The 3 obtained MAbs were capable to reveal the proteins turn VPX and VP2 by "western blotting", respectively of 47 kDa and 41 kDa. The definition of the isotypes recognized by obtained MAbs must be object of future characterization to allow the use of the antibodies in immunodiagnostic tests such as immunofluorescence, immunocitochemistry or capture ELISA, for epidemiologic of the disease researches or to differentiate vaccine’s virus of the field virus.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O melanoma cutaneo e um tumor originado a partir da proliferacao descontrolada de melanocitos. A incidencia do melanoma maligno tem aumentado significativamente nas ultimas decadas e se tornado um problema de saude publica em muitos paises. Na imunoterapia contra o cancer, anticorpos monoclonais (mAbs) sao utilizados como ferramentas para diagnostico, monitoramento e tratamento da doenca. A descoberta de novos alvos terapeuticos para mAbs em celulas tumorais, e a determinacao dos mecanismos de citotoxicidade gerados pelos mesmos pode ampliar significativamente as possibilidades e o sucesso dos tratamentos. Anteriormente em nosso laboratorio, Dobroff e colaboradores (2002) isolaram um mAb (mAb A4) que foi citotoxico in vitro sobre celulas de melanoma murino B16F10-Nex2 e sobre algumas celulas tumorais humanas, efeito independente do complemento, mas aumentado por este. O mAb A4 reduziu o desenvolvimento do melanoma murino B16F10-Nex2 in vivo, aumentando a sobrevida dos animais. O alvo do mAb A4 na superficie celular e a proteina Protocaderina ƒÀ13 (PCDHƒÀ13), membro da superfamilia das caderinas. A interacao entre ambos levou as celulas tumorais a morte, em processo sugestivo de apoptose (Dobroff et. al., 2010, em publicacao). Neste trabalho, verificamos a reatividade do mAb A4 com celulas do melanoma murino e com algumas outras linhagens tumorais humanas atraves de ELISAQuimioluminescente e Imunofluorescencia Indireta. A expressao do gene PcdhƒÀ13 foi verificada por RT-PCR nao quantitativo e a expressao da proteina PCDHƒÀ13, por Immunoblotting. Verificou-se que, somente celulas que expressam a proteina PCDHƒÀ13 na membrana plasmatica sao suscetiveis a acao do mAb A4. O mAb A4 foi citotoxico in vitro contra o melanoma murino e contra linhagens tumorais humanas, incluindo melanoma, carcinoma de colon, carcinoma de cervice uterino e glioblastoma. O mAb A4 nao foi citotoxico contra linhagens humanas de carcinoma de mama e contra a linhagem de melanocitos murinos imortalizados melan A, que nao expressam a PCDHƒÀ13. A interacao do mAb A4 com celulas B16F10-Nex2.1 in vitro ocasionou a endocitose do mAb A4 em vesiculas, rapida reducao nos niveis de ƒÀ-catenina livre no citoplasma e do fator de transcricao TCF-4, redistribuicao da ƒÀ-catenina para a periferia celular, ativacao das caspases-9, -3 e -6, exposicao de fosfatidilserina na membrana plasmatica, condensacao da cromatina e degradacao internucleossomal do DNA, corroborando a inducao de um processo de morte por apoptose pela via intrinseca nessa celula tumoral. Adicionalmente, observou-se o aumento da producao de especies reativas de oxigenio, que podem amplificar o processo apoptotico. A inibicao da via de sinalizacao da ƒÀ-catenina sugere que vias de sinalizacao intracelular que regulam o crescimento e a sobrevivencia foram inibidas pela interacao entre o mAb A4 e seu alvo na celula. A presenca de vesiculas sugestivas de autofagossomos nas imagens de microscopia de transmissao eletronica pode indicar a inducao de um processo de autofagia em paralelo ao processo apoptotico. Concluimos que o mAb A4 demonstrou ser um potencial agente anti-tumoral com atividade contra diversos tipos de tumores murinos e humanos. A proteina PCDHƒÀ13 pode ser um potencial marcador de malignidade para o melanoma. A interacao entre o mAb A4 e a PCDHƒÀ13 levou a celula de melanoma a morte atraves da inibicao da via de sinalizacao intracelular b-catenina/TCF-4 e da inducao de apoptose pela via intrinseca. O processo de autofagia pode ter uma possivel participacao no efeito anti-tumoral induzido pelo mAb A4. / Malignant melanoma is a highly metastatic skin cancer which arises from malignant transformation of melanocytes. Incidence of melanoma has been increasing in the last decades, becoming a major public health problem in many countries. Monoclonal antibodies (mAbs) have been used in cancer immunotherapy as tools for diagnosis, monitoring and treatment of tumors. The discovery of new therapeutic targets for mAbs in tumor cells, and the establishment of their cytotoxic mechanisms might significantly improve the possibilities and efficacy of cancer treatments. Previously in our research group, Dobroff and collaborators (2002) produced a mAb, named A4, which was cytotoxicity in vitro against B16F10-Nex2 murine melanoma cells and some human tumor cell lines. This effect was independent of complement, although enhanced by it. MAb A4 decreased B16F10-Nex2 murine melanoma development in vivo, significantly increasing animal survival. This mAb recognizes Protocadherin â13 (PCDHâ13) at tumor cell surface, a protein that belongs to the cadherin superfamily, and preliminary results suggested that mAb A4/PCDHâ13 interaction leads tumor cell to apoptosis (Dobroff et. al., 2010, in press). In the present work, mAb A4 reactivity with murine melanoma cells and several human tumor cell lines was verified by Chemoluminescent ELISA and Indirect Immunofluorescence assays. Pcdhâ13 mRNA expression was detected by nonquantitative RT-PCR and PCDHâ13 protein expression by Immunoblotting assay. Only PCDHâ13-expressing tumor cells were susceptible to mAb A4 cytotoxicity. MAb A4 was cytotoxic in vitro to murine melanoma and to human tumor cell lines, including melanoma, colon carcinoma, cervical uterine epithelioid carcinoma and glioblastoma. MAb A4 had no activity against breast carcinoma cell lines and murine immortalized melanocytes melan A, which do not express PCDHâ13. MAb A4 interaction with B16F10-Nex2.1 cells in vitro triggered mAb A4 endocytosis, rapid reduction of free cytoplasmic â-catenin and TCF-4 concentrations, redistribution of â-catenin to cell periphery, caspases-9, -3, and -6 activation, phosphatidilserine translocation to cell membrane, chromatin condensation and internucleossomal DNA fragmentation, confirming the induction of mitochondrialdependent apoptosis in that tumor cell line. Additionally, mAb A4 induced overproduction of oxygen reactive species, which can amplify the apoptotic process. The inhibition of â-catenin signaling suggests that signaling pathways that regulate cell survival and growth were inhibited by mAb A4 interaction with its target on the cell surface. Transmission electron microscopy images revealed the presence of autophagosomes, suggesting the simultaneous induction of autophagy and apoptosis by mAb A4. We conclude that mAb A4 may represent a new therapeutic agent with antitumor activity against murine and human tumors. PCDHâ13 is a potential melanoma marker. MAb A4 interaction with PCDHâ13 induced cell death through inhibition of b-catenin/TCF-4 signaling pathway and induction of the apoptosis intrinsic pathway. The autophagic process might be also implicated in mAb A4 cytotoxic effect. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:38:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) ana_fernandes_ipcec_dout_2011.pdf: 1168893 bytes, checksum: 8127e15ae5d45011b8d8ba254de4a33d (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A citotoxicidade mediada por células desempenha um importante papel na regulação da infecção pelo HPV e na formação de tumores. Apoptose é regulada por diferentes vias envolvendo genes que promovem (BAX) ou inibem (BCL2) a morte celular. Avaliamos a presença de células cervicais inflamatórias, marcadores apoptóticos (BAX, BCL-2, FasL, NOS2, perforina) e o marcador de degranulação (CD107a) em mulheres HPV e HPV/HIV através da técnica de imunohistoquimca. Uma alta porcentagem de células T CD4+ e CD8+ foram observadas em ambos os grupos, com baixa contagem de células T CD4+ em mulheres HPV/HIV. Houve poucas células expressando FasL, BAX e BCL-2 em ambos os grupos. A expressão de NOS2 estava presente especialmente em queratinócitos na camada basal do epitélio em ambos os grupos. Perforina foi idenficada em poucas células cervicais. Contudo, CD107a foi detectado na camada basal do epitélio e estroma, principalmente em mulheres HPV. Determinamos se os SNPs em promotores dos genes BCL2 (-938C>A) e BAX (-248G>A) estariam associados com o risco de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) A frequência observada desses SNPs estavam em equilíbrio de Hardy\2013Weinberg nos casos e controles. Nenhuma diferença estatística na frequência genotípica e alélica do polimorfismo de BCL-2 (-938C>A) foi observada entre casos e controles. Contudo, uma forte associação foi identificada na freqüência do genótipo GG de BAX (-248G>A) entre os casos e controles. Quando os grupos de LSIL e HSIL foram comparados, nenhuma diferença estatística foi observada, indicando que o genótipo GG pode influenciar no aparecimento de lesões cervicais, mas não na gravidade da doença. Analisamos a expressão de RNAm de genes associados a apoptose (BAX, BCL2, p53 e pRb) e citotoxicidade (perforina e Fas). Quando a expressão de RNAm de Perforina e Fas foram avaliadas, diferença estatística foi observadas em pacientes portadoras de NIC III e câncer Observamos diferença estatística entre os controles e todos os casos, quando analisamos a expressão de RNAm de p53, mas não de pRb, sendo observada diferença apenas nos controles e NIC II e III. Na analise de RNAm de BCL2, notamos uma baixa expressão no grupo de câncer quando comparado com NIC II, III e controle. Em conclusão, a infecção pelo HIV pode induzir redução na degranulação de células inflamatórias, corroborando para a progressão de infecção pelo HPV, e que carreadoras do alelo G na região promotora de BAX (-248G>A) pode estar associado ao desenvolvimento de NIC quando comparado com as carreadoras do alelo A, possuindo papel protetor; contudo o alelo G não está correlacionado com a gravidade da doença / Cell - mediated cytotoxicity plays an important role in the regulation of HPV infection, and in tu mor formation. Apoptosis is regulated by different pathways involving a number of genes that either prom ote ( BAX gene)or inhibit ( BCL2 gene) the cell death. We evaluated the presence of cervical inflammatory cells, apoptotic (Bax, Bcl - 2, FasL, NOS2, perforin) markers and the degranulating expressing cell marker (CD107a) from HPV and HPV/HIV women. Higher per centage of cervical CD4 + and CD8 + T cells were observed in both groups, with lower CD4 + T cells count observed in HPV/HIV women. There were few FasL, Bax and Bcl - 2 inflammatory cervical expressing cells in both groups. NOS2 expression was present especially in the epithelium basal layer on keratinocytes in both groups. Perforin was identified in few cervical cells. However, CD107a was detected in the epithelium basal layer and stroma, meanly on HPV women. We determined whether the SNPs of BCL2 ( - 938C>A) and BAX ( - 248G>A) promoters are associated with risk of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) outcome. The observed genotype frequencies of these SNPs were in agreement with Hardy – Weinberg equilibrium in cases and control groups. No statistical difference i n genotype and allelic frequency of BCL - 2 ( - 938C>A) polymorphism was observed between all cases and control groups. However, a strong association was identified in GG genotype frequency of BAX ( - 248G>A) polymorphism between cases and controls. When LSIL an d HSIL groups were compared, no statistical difference was observed, indicating that GG genotype may influence the risk of CIN but not the lesion severity. We analyzed the mRNA expression of apoptosis - associated genes ( BAX, BCL2, p53 and pRb ) and cytotoxic ity - related genes ( perforin and Fas ). When Fas and Perforin mRNA expressions were evaluated, the statistical difference between CIN III and cancer was seen. We observed a statistical difference between control and all cases, when we analyzed p53 mRNA, but in pRb mRNA, we observed difference between control group and CIN II or CIN III. In BCL2 mRNA evaluation, we observed low expression in cancer group when compare with CIN II, III and control. In relation to BAX mRNA, a statistical difference was evaluated with all cases and control. In conclusion, HIV infection may induce reduction on inflammatory cervical cells degranulation corroborating to HPV progression and allele G carriers in the promoter regions of BAX ( - 248G>A) can be related to CIN development whe n compared with allele A carriers that play a protective role; however, allele G was not correlated with the disease severity

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Soroconversão de galinhas. 2012pdf.pdf: 1498234 bytes, checksum: 68fe5d461b9add9fdefa51341bf5faa6 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A Leishamaniose Visceral (LV) é transmitida pela picada de insetos da espécie vetora Lutzomyialongipalpis através da inoculação dos parasitas juntamente com a saliva na pele do hospedeiro durante a alimentação sanguínea. A saliva deste vetor desempenha um papel importante na obtenção do repasto, sendo também capaz de modular o sistema imune do hospedeiro. Algumas proteínas salivares são imunogênicas e podem induzir a produção de anticorpos específicos. Neste sentido, a presença de anticorpos anti-saliva pode ser utilizada como marcador de exposição ao vetor. Na LV, a presença de galinhas em área endêmica é considerada um fator importante na manutenção da fauna flebotomínica, além de ser citada como um importante fator de risco para a transmissão da doença. Entretanto, o papel da galinha na cadeia epidemiológica da LV ainda não é bem compreendido. Nosso objetivo neste estudo foi detectar nestes animais a presença de anticorpos contra o sonicado de glândula salivar (SGS) a serem utilizados como marcadores de exposição a L. longipalpis e investigar o potencial papel destas aves como sentinela para a presença do vetor em área endêmica. Para isso, quarenta galinhas foram distribuídas em cinco residências em Cavunge, área endêmica para LV na Bahia e naturalmente expostas a picadas de flebotomíneos durante oito meses. Para avaliar a densidade vetorial armadilhas luminosas foram distribuídas e monitoradas mensalmente nas mesmas residências. Amostras de sangue destas aves foram coletadas a cada dois meses e monitorada a soroconversão para SGS. O teste de ELISA foi realizado para avaliar o reconhecimento de SGS onde, após quatro meses do início da exposição 26% das aves se tornaram positivas e com seis meses de exposição detectamos uma soroconversão de 100% das galinhas. Após oito meses, todas apresentavam altos títulos de anticorpos anti-SGS, aumentado 2,7 vezes sobre o valor do cut-off. Além do SGS foram utilizadas as proteínas recombinantes LJM17 e LJM11 da saliva da L. longipalpisque apresentaram desempenho semelhante ao SGS. O teste de correlação aplicado entre a densidade flebotomínica e os níveis de anticorpos específicos após oito meses de exposição não foi positivo, porém pôde-se observar que independente da variação na densidade de vetores, após a soroconversão, galinhas são capazes de manter os níveis de anticorpos IgY anti-SGS constantes. Para avaliar a reatividade cruzada para o reconhecimento a saliva da L. longipalpis, foram utilizados soros de galinhas expostas a picadas de barbeiros e Aedes aegypti, onde identificamos o reconhecimento de duas proteínas da saliva da L. longipalpis com peso de 61 e 79kDa. A proteína recombinante LJM11 não apresentou reatividade cruzada quando testada. Estes resultados demonstram que a exposição natural de galinhas ao vetor L. longipalpis resulta na produção de anticorpos IgY específicos anti-saliva sugerindo o uso destes animais como indicadores da presença do vetor, levantando a possibilidade da utilização de galinhas como um animal sentinela para a detecção da L. longiplapisem áreas endêmicas. / Visceral Leishmaniasis (VL) is transmitted by Lutzomyia longipalpis , when saliva and parasites are injected into the host skin during blood feeding. Saliva has an important role not only in the blood meal process but it is also able to modulate the host’s immune response. Some salivary proteins are immunogenic inducing production of anti-saliva antibodies in the host that can be used as markers of exposure to the vector. In VL, the presence of chicken in the endemic area is indicated as an important source for a blood meal and is often considered as a risk factor for transmission. However the role of the chicken in the VL epidemiology has not been defined. Here we investigate if the detection of antibodies against salivary gland sonicate (SGS) from L. longipalpis could be used as exposure markers to L. longipalpis and the potential role of the chicken as a sentinel animal. Forty chickens were distributed in five houses in Cavunge, a VL endemic area in Bahia, where they were naturally exposed to sand flies during eight months. To evaluate vector density, light traps were distributed and monitored monthly in the same houses. Blood samples were collected every two months to monitor the development of anti-SGS antibodies. ELISA was performed for the recognition of SGS and, after 4 months 26% of the exposed chickens became positive and 6 months later 100% were positive. After 8 months all of them were positive with high antibodies titers against SGS, 2.7x above cut-off value. Beside SGS we also used LJM17 and LJM11 and these recombinants proteins showed similar performance as SGS. There was no correlation between specific anti-saliva antibody levels and sandfly density. Although a cross-reactivity test using sera from chicken exposed to triatomines and Aedes aegypti demonstrated that the proteins of 61 and 79 kDa salivary proteins were only detected in animals exposed to triatomines, LJM11 recombinant protein was shown to be specific to L. longipalpis exposure. Altogether these results show that chicken naturally exposed to the vector develop high titers of anti-saliva antibodies and may be used as important indicators of vector presence, raising the possibility of using chicken as a sentinel animal in endemics areas.