Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Essas proteínas têm atividade inseticida e fungicida, efeitos independentes da sua atividade ureolítica. A atividade inseticida de ureases depende, em parte, da liberação de peptídeos internos através da hidrólise por catepsinas digestivas do inseto. Um desses peptídeos foi isolado e um recombinante chamado Jaburetox –V5 foi produzido em E. coli a partir da sequência da urease. Outra propriedade relevante de ureases é sua atividade antifúngica, que ocorre em concentrações de 10-7 M para certos fungos filamentosos, causando danos à membrana celular, visualizados por microscopia eletrônica de varredura. Moléculas antifúngicas de origem vegetal representam uma alternativa estratégica para o surgimento de espécies resistentes de fungos. Sabendo que a atividade antifúngica das ureases é cerca de 3-4 de magnitude mais ativa do que a maioria das proteínas antifúngicas já descritas, neste trabalho, avaliamos o efeito tóxico da urease de C. ensiformis (JBU) sobre diferentes espécies de leveduras. Além disso, buscamos identificar as regiões responsáveis por essa atividade através da fragmentação da JBU por hidrólise enzimática. Os efeitos tóxicos da JBU também ocorrem em espécies de leveduras, indicando que atividade antifúngica não afeta somente fungos filamentosos. Os efeitos da JBU nas leveduras variam conforme o gênero e a espécie, tanto em termos qualitativos como quantitativos, indicando seletividade espécie-específica. Os efeitos fungitóxicos consistem de inibição da multiplicação, indução de alterações morfológicas com formação de pseudo-hifas, alterações do transporte de H+ e no metabolismo energético, permeabilização de membranas, podendo ocorrer morte celular. Nas condições testadas, não houve produção de espécies reativas de oxigênio associada ao efeito fungitóxico da JBU. A hidrólise da JBU com papaína produziu fragmentos tóxicos com massa molecular ~10 kD. Esses hidrolisados foram analisados por espectrometria de massas e um fragmento contendo parte da sequência N-terminal do peptídeo entomotóxico Jaburetox foi encontrado. A atividade fungitóxica do peptídeo recombinante Jaburetox – V5 foi testada, sendo observada atividade tóxica sobre leveduras e fungos filamentosos. A atividade antifúngica do Jaburetox-V5 requer concentrações 2-3 vezes maiores do que aquela observada para a holoproteína JBU, indicando a possibilidade de que outros domínios da proteína estejam envolvidos nessa atividade. A descoberta de novos agentes antifúngicos é urgente e imperativa, devido ao crescente número de casos de micoses invasivas. Ureases de plantas, como a JBU, e peptídeos derivados, podem representar uma nova alternativa para controle de fungos de importância clínica e fitopatogênicos, principalmente em se considerando a potente atividade, na faixa de 10-6 a 10-7 M . Estudos estrutura versus atividade adicionais, aprofundando a identificação de domínios antifúngicos, e a construção de recombinantes contendo esses domínios, são etapas futuras para avaliar o real potencial fungicida/fungistático das ureases e peptídeos derivados. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These proteins have insecticidal and fungicidal effects not related to their enzyme activity. The insecticidal activity of urease is mostly dependent on the release of internal peptides consequent to hydrolysis of the ingested protein by insect digestive cathepsins. One of these peptides was isolated and its recombinant version, named Jaburetox-V5, was produced in E. coli. Another important property of ureases is their antifungal activity, which occurs at concentrations of 10-7 M for certain filamentous fungi, causing damage to the cell membranes, as visualized by scanning electron microscopy. Antifungal molecules from plants represent an alternative strategy to the emergence of resistant fungal species. Considering that the antifungal activity of urease is about 3-4 orders of magnitude more potent than most of the antifungal proteins already described, in this study, we evaluated the toxic effect of Canavalia ensiformis urease (JBU) on different species of yeast. Furthermore, studies aiming to identify antifungal domain(s) of JBU by enzymatic hydrolysis were carried out. The results showed that JBU exerts toxic effects on yeast species, indicating that antifungal activity is not restricted to filamentous fungi. The effects of JBU in yeast varied according to the genus and species of yeasts, both in qualitative and quantitative terms, indicating a species-specific selectivity. The fungitoxic effects consisted in inhibition of proliferation, induction of morphological alterations with formation of pseudo hyphae, changes in the transport of H+ and carbohydrate metabolism, permeabilization of membranes, eventually leading to cell death. Under the conditions tested, there was no production of reactive oxygen species associated with the antifungal effect of JBU. Hydrolysis of JBU with papain resulted in fungitoxic fragments with molecular mass ~ 10 kD. These peptides were analyzed by mass spectrometry, revealing the presence of a fragment containing the Nterminal sequence of the entomotoxic peptide Jaburetox. We tested the recombinant peptide Jaburetox-V5 for antifungal effects and observed fungitoxic activity on yeast and filamentous fungi. The antifungal activity of Jaburetox-V5 requires 2-3 times larger concentrations than those observed for the holoprotein JBU, indicating the possibility that other protein domains are involved in this activity. The discovery of new antifungal agents is imperative to face the increasing number of cases of invasive mycoses. Plant ureases, such as JBU, and its derived peptides, may represent a new alternative to control medically important and phytopathogenic fungi, especially considering their potent activity in the range of 10-6 to 10-7 M. More studies are necessary to clarify the structure versus activity relationships of ureases. Construction of mutants containing ureasederived antifungal domains is one of the necessary steps to assess the real fungicidal/ fungistatic potential of ureases and derived peptides.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-10T22:21:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Aldo César Passilongo da Silva.pdf: 2908680 bytes, checksum: 3c3df9c7f042870bbd0ebb439ab434b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-10T22:21:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Aldo César Passilongo da Silva.pdf: 2908680 bytes, checksum: 3c3df9c7f042870bbd0ebb439ab434b1 (MD5) Previous issue date: 2016-05-16 / O desenvolvimento de novos fármacos é um dos grandes desafios para a indústria farmacêutica que envolve altos investimentos na área de pesquisa e desenvolvimento; apesar do baixo número de moléculas viáveis farmacologicamente, ainda o planejamento de fármacos é considerado como uma etapa crucial na descoberta de novos compostos, para tanto, é necessário implementar diversas estratégias. As tiossemicarbazonas são um grupo de moléculas pertencentes a classe das iminas (-C=N), e apresentam uma versatilidade reacional frente a diversos reagentes e excelentes ligantes orgânicos por sua natureza química. Desta forma, este trabalho teve por objetivo a síntese de 11 compostos derivados (AP-01 a AP-11) de forma indireta, onde as tiossemicarbazonas foram previamente preparadas a partir de reações da hidrazina (NH2-NH2) com isotiocianato e avaliação biológica anti-fungica, antitripanossomida e leshimanicida de novos derivados. A fim de avaliar o modo de interação dos compostos com melhores resultados frente a inibição da enzima cruzaína, foram realizados estudos de docking. Os resultados acerca da atividade antifúngica para os derivados indol-tiossemicarbazonas sintetizados verifica-se a atividade considerável para os derivados AP-05 e AP-07 frente a cepa Cryptococcus neoformans URM 6898. Por outro lado, a cepa de Candida parapsilosis URM4970, demonstrou-se insensível aos derivados testados, onde pode ser observado ausência de atividade na máxima concentração testada (16 μg/mL). Os derivados AP-01, AP-05, AP-06, AP-09 e AP-10 apresentaram valores de IC50 de 4, 4, 4, 4 e 2 μg/mL, respectivamente para a cepa de Candida albicans ATCC, sendo esses valores todos melhores que um dos fármacos padrão utilizados no experimento, o cetoconazol o qual apresentou IC50 8 μg/mL. Para a cepa de Candida krusei, apenas o derivado AP-11 conseguiu resultados mais expressivos na inibição do crescimento desse fungo, apresentando IC₅₀ = 4 μg/mL, sendo esse valor muito semelhante ao apresentado pelo cetoconazol (IC50= 2 μg/mL). Os derivados benzodioxólicos (3a-g e 4a-b) sintetizados e caracterizados foram avaliados no potencial terapêutico frente as formas epimastigotas e tripomastigotas contra Trypanosoma cruzi e a forma promastigotas de Leishmania amazonensis. A maioria dos compostos foi considerado não-tóxico em culturas de células do baço. No que diz respeito à atividade tripanocida, o composto 3c exibiu um nível elevado de atividade contra as formas epimastigota e tripomastigota (IC₅₀ = 1,48 e 3,89 μM, respectivamente). Os compostos 3a, 3f e 3g foram encontrados um elevado índice de atividade contra formas tripomastigota de T. cruzi (IC50=. 1,57, 0,79 e 1,61 μM, respectivamente). No caso de ação contra a L. amazonensis, composto 3d forneceu um resultado promissor, com IC₅₀ = 1,09 μM. A fim de avaliar o modo de interação dos compostos 3a e 3 g frente a cruzaína, foram realizados estudos de docking. No estudo Docking, os resultados demostraram que as interações hidrofóbicas e, especialmente, dois sítios de interação hidrofílicos (ligações de hidrogénio com os resíduos e ASP161 MET68) são importantes para a elevada estabilidade do complexo formado entre o composto 3g e o alvo cruzaína. Portanto, outras avaliações, tais como a avaliação in vivo e protocolos experimentais são necessários para determinar o mecanismo de ação destes compostos tiossemicarbazonas. / The development of new drugs is one of the great challenges for the pharmaceutical industry that involves high investments in the area of research and development. Despite the low number of pharmacologically viable molecules, drug planning is still considered a crucial step in the discovery of new compounds, for which it is necessary to implement several strategies. Thiosemicarbazones are a group of molecules belonging to the class of imines (-C = N), and have a reactional versatility against several reagents and excellent organic binders by their chemical nature. The aim of this work was to synthesize 11 indirect compounds (AP-01 to AP-11), where thiosemicarbazones were previously prepared from the reactions of hydrazine (NH2-NH2) with isothiocyanate and anti-biological evaluation Antitrypsomide and leshimanicide of novel derivatives. In order to evaluate the mode of interaction of the compounds with better results against the inhibition of the enzyme cruzaíne, docking studies were performed. The results on the antifungal activity for the indol-thiosemicarbazones synthesized derivatives show the considerable activity for the derivatives AP-05 and AP-07 against the strain Cryptococcus neoformans URM 6898. On the other hand, the strain of Candida parapsilosis URM4970, (16 μg / mL). The results showed that there was no activity at the highest concentration tested (16 μg / mL). The AP-01, AP-05, AP-06, AP-09 and AP-10 derivatives presented IC50 values of 4, 4, 4, and 2 μg / mL, respectively, for the Candida albicans strain ATCC. Values all better than one of the standard drugs used in the experiment, ketoconazole which had IC50 8 μg / mL. For the Candida krusei strain, only the AP-11 derivative achieved more expressive inhibition of the growth of this fungus, with IC50 = 4 μg / mL, which is very similar to that of ketoconazole (IC 50 = 2 μg / mL). The benzodioxolic derivatives (3a-g and 4a-b) synthesized and characterized were evaluated in the therapeutic potential against the epimastigote and trypomastigote forms against Trypanosoma cruzi and the promastigote form of Leishmania amazonensis. Most of the compounds were considered non-toxic in cultures of spleen cells. With respect to trypanocidal activity, compound 3c exhibited a high level of activity against the epimastigote and trypomastigote forms (IC 50 = 1.48 and 3.89 μM, respectively). Compounds 3a, 3f and 3g found a high activity index against trypomastigote forms of T. cruzi (IC 50 = 1.57, 0.79 and 1.61 μM, respectively). In the case of action against L. amazonensis, compound 3d provided a promising result, with IC 50 = 1.09 μM. In order to evaluate the interaction mode of compounds 3a and 3g against cruzaíne, docking studies were performed. In the Docking study, the results demonstrated that hydrophobic interactions, and especially two hydrophilic interaction sites (hydrogen bonds with residues and ASP161 MET68) are important for the high stability of the complex formed between compound 3g and cruzaíne target. Therefore, other evaluations, such as in vivo evaluation and experimental protocols are required to determine the mechanism of action of these thiosemicarbazones compounds.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:31:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8078_1.pdf: 1930607 bytes, checksum: 332bdebb35ef2d06c2f91633bc8c1b4c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / A Pitiríase Versicolor (PV) é o distúrbio de pigmentação cutânea mais freqüente no mundo. Apresenta tendência a cronicidade e recidiva o que compromete a efetividade do tratamento. Atualmente, são reconhecidas sete espécies de Malassezia: M. furfur, M. sympodialis, M. globosa, M. obtusa, M. restricta, M. slooffiae e M. pachydermatis. Dessas, as seis primeiras podem causar a PV. Há uma carência de estudos que avaliem a ocorrência das espécies de Malassezia , assim como a sua suscetibilidade aos antifúngicos no Brasil. Por essa razão, realizou-se o presente estudo tendo por principais objetivos: verificar a distribuição das espécies de Malassezia de acordo com a localização das lesões de PV; avaliar se há correlação entre a distribuição das espécies e as car cterísticas clínicas das lesões; testar a sensibilidade das espécies identificadas aos antifúngicos cetoconazol, itraconazol e fluconazol. O desenho do estudo foi do tipo série de casos, sendo incluídos 389 pacientes com PV de set/2002 a jun/2003 atendidos no ambulatório de Dermatologia do CAME-Primavera João Pessoa/PB. Foram identificadas 127 cepas de Malassezia spp baseando-se nas características de lipodependência, produção de catalase, assimilação de Tween e micromorfologia. O teste de susceptibilidade aos antifúngicos foi realizado utilizando o método de difusão em ágar com discos em 36 cepas identificadas. A foi a mais freqüentemente encontrada (n=82/62,2%), seguida da M. sympodialis (n=17/13,5%). A M. globosa, M. restricta, M. obtusa, M sloofiae foram identificadas respectivamente em quatro, seis, oito e dez amostras. A M. pachydermatis foi a única não iden ficada, visto ser tipicamente encontrada em animais (cães e gatos). A maior parte das espécies testadas foi sensível (n=28/87%) ao cetoconazol e resistente (n=30/93%) ao fluconazol

Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta el 20/1/2021. / Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniero Civil Químico / La acuicultura en Chile es el cuarto rubro exportador más importante, lo que ha hecho necesario el desarrollo de tecnologías que hagan más eficientes sus procesos. En particular, la proliferación de organismos sobre las mallas de cultivo (biofouling) es uno de los problemas relevantes que la tecnología tiene el desafío de resolver. Se trata de una dificultad tanto ambiental como económica, por lo que las estrategias de mitigación se vuelven fundamentales. El objetivo de este trabajo es desarrollar un material polimérico, con partículas de cobre incorporadas, que tenga acción antifouling en las mallas de cultivo producto de la liberación de iones cúpricos. Para llevar a cabo dicho objetivo, se procedió a adquirir y caracterizar tres partículas de cobre metálico con morfología y tamaño diferentes. Por otra parte, se sintetizaron tres partículas mediante la inmersión de algunos soportes inorgánicos (zeolita, óxido de silicio y nanotubos de carbono) en una solución de acetato de cobre. Las partículas obtenidas con el mencionado método, resultaron tener sales de cobre sobre los soportes inorgánicos utilizados. Para cuantificar el potencial anti-biofouling de las partículas adquiridas y sintetizadas, se midió el proceso de liberación de iones cúpricos en agua desionizada. El resultado de esta cuantificación es que las partículas adquiridas liberan iones cúpricos de forma más lenta y, por otra parte, que la cantidad de iones cúpricos liberados al final del ensayo, puede ser explicada mediante un modelo que supone una fase heterogénea en equilibrio, con especies iónicas presenten en la solución. Con las partículas adquiridas y sintetizadas, posteriormente se elaboraron compósitos poliméricos de poliamida y polietileno con 10% en peso de partículas. A partir de lo anterior, se procedió a medir la tasa de liberación de los materiales elaborados en agua de mar, para evaluar si estos superan el umbral de liberación de iones cúpricos, para obtener acción antifouling. El resultado es que en el mejor de los casos, solo superan dicho valor crítico hasta el quinceavo día y la tasa de liberación de iones cúpricos, mejora con el aumento de la polaridad de la matriz polimérica, el aumento del porcentaje de cobre de los rellenos y su disminución de la densidad. A partir de los resultados obtenidos de los ensayos de liberación desde los compósitos con partículas de cobre, y considerando que el polímero más utilizado en la industria acuícola es el polietileno, se evaluó la acción antifouling de algunos de ellos durante dos meses, midiendo las unidades formadoras de colonias por unidad de superficie al final del ensayo. Se encontró que las diferencias entre los blancos y las muestras, no son significativas, como es de esperarse tomando en consideración que estos compósitos solo superan el umbral de acción antifouling hasta el octavo día. Finalmente, la prolongación del tiempo en que la tasa de liberación está sobre el umbral, ayudará a que los materiales poliméricos con partículas de cobre, tengan una acción antifouling significativa. Frente a esto, la incorporación de un relleno como la celulosa, que se caracteriza por mejorar la captación de agua por compósitos poliméricos, ayudaría a prolongar el tiempo en que la tasa de liberación se encuentra sobre el umbral de acción antifouling.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2016. / Micro-organismos patogênicos podem contaminar os alimentos por meio da manipulação, higienização e controle ambiental insatisfatórios. Além da adoção das Boas Práticas, o uso de antimicrobianos em alimentos constituiu um passo importante para o controle de doenças infecciosas. Nos sistemas em que ocorre migração do composto ativo para o alimento devem ser considerados apenas aqueles que são aprovados como aditivos alimentares. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da concentração de sal na ação da natamicina sobre micro-organismos patogênicos visto que este conservante tem sido utilizado em banhos de imersão em diversos laticínios no país. Cepas de Candida albicans, Escherichia coli e Staphylococcus aureus foram inoculadas em diferentes concentrações salinas e em água peptonada e receberam tratamentos com natamicina. Estas soluções foram mantidas a temperatura de 12°C e o comportamento dos micro-organismos avaliados com 0, 24 e 48 horas (T0, T1 e T2). Cada micro-organismo foi avaliado isoladamente bem como a associação de C. albicans e E. coli. Nas condições propostas pela pesquisa, foi possível concluir que a natamicina 0,025% não apresenta eficácia sobre Candida albicans inoculada em concentrações salinas abaixo de 5%. Os resultados obtidos nas contagens de E. coli sugerem que a natamicina pode interferir no seu desenvolvimento mesmo em concentrações que podem ser consideradas baixas (0,1%) e em condições de salinidade de 7,5% a 10%. A associação da natamicina com cloreto de sódio potencializa a sua ação antimicrobiana podendo representar economia e o seu uso ser ampliado pelas indústrias. / Pathogenic microorganisms can contaminate food through manipulation cleaning and environmental control unsatisfactory. Besides the adoption of good practice, the use of antimicrobials in food established an important step for the control of infectious diseases. In systems which there are migration from the active ingredient to the food they should be regarded only those compounds that are approved as food additives. The purpose of this study was to evaluate the influence of the concentration of salt in the action of natamycin over pathogenic micro-organisms since this preservative has been used in immersion baths in several dairy products in the country. Strains of Candida albicans, Escherichia coli and Staphylococcus aureus were inoculated in different salt concentrations and in peptone water and were treated with natamycin. These solutions were maintained at temperature of 12 ° C and the behavior of micro-organisms assessed at 0, 24 and 48 hours (T0, T1 and T2). Each microorganism was evaluated singly as well as the combination of C. albicans and E. coli. As proposed by the survey it was concluded that the 0.025 % natamycin has no effect on Candida albicans inoculated in salt concentrations below 5 %. The results obtained from the E. coli counts suggests that natamycin can interfere with their development even at concentrations that may be considered low ( 0.1 %) and saline conditions of 7.5 % to 10 %. The combination of natamycin with sodium chloride enhances its antimicrobial activity may represent the economy and its use be extended by industries.

A água é um recurso essencial a todas as formas de vida, e a forma como é explorada se reflete nos âmbitos sociais, econômicos e ambientais. A urbanização em torno de bacias hidrográficas é responsável por diversas alterações de serviços ecossistêmicos importantes. O Arroio Dilúvio, em Porto Alegre, é um importante afluente do Lago Guaíba, que por sua vez é a principal fonte hídrica de abastecimento da cidade. Ao longo da história o Arroio sofreu diversas modificações, além de intensa contaminação através da deposição de esgoto. O estudo da microbiota deste ambiente permite maior elucidação do efeito de contaminantes sobre a diversidade e manifestação de diferentes fenótipos. Leveduras são fungos unicelulares amplamente difundidos no ambiente, e estudos sugerem que há uma correlação positiva entre leveduras e ambientes aquáticos poluídos. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar a diversidade e a resistência à antifúngicos de leveduras isoladas de amostras de água coletadas ao longo do Arroio Dilúvio em Porto Alegre. Isolados de leveduras provenientes do Arroio Dilúvio foram submetidos a testes de suscetibilidade frente a antifúngicos através dos métodos de disco-difusão em ágar e ensaio de concentração inibitória mínima. Para a realização das técnicas moleculares, foi extraído o DNA genômico dos isolados para amplificação da região ITS1-5.8S-IT2 do rDNA utilizando os oligonucleotídeos iniciadores ITS1 e ITS4. A região ITS foi submetida a técnica de PCR-RFLP utilizando as endonucleases HinfI, HaeIII e CfoI e o perfil de restrição permitiu a construção de um dendrograma. Os ensaios de suscetibilidade mostraram alta prevalência de resistência a antifúngicos da classe dos azóis. Dezesseis isolados exibiram resistência a anfotericina B, dos quais 14 foram submetidos ao sequenciamento da região ITS. A análise das sequências permitiu a identificação de leveduras do gênero Candida, incluindo as espécies potencialmente patogênicas C. glabrata, C. parapsilosis e C. tropicalis, e do gênero Debaryomyces. A resistência a antifúngicos em leveduras do Arroio Dilúvio, reforça a importância de estudos da microbiota ambiental e indica que a degradação do ambiente influencia no fenótipo exibido. / Water is an essential resource to all forms of life, and the way it is exploited is reflected in the social, economic and environmental spheres. Urbanization around watershed is responsible for several important ecosystem service changes. In Porto Alegre, Arroio Dilúvio is an important component of Lake Guaiba, which in turn is the main water source of the city. Throughout history, Arroio Dilúvio underwent several changes, and it suffers with intense contamination by the deposition of sewage. The study of the environment's microbiota enables further elucidation of the effect of contaminants on diversity and expression of phenotypes. Yeasts are unicellular fungi widespread in the environment, and studies suggest that there is a positive correlation between yeast and polluted aquatic environments. The aim of this study was to analyze the diversity and resistance to antifungals of yeasts isolated from water samples collected along the Arroio Dilúvio in Porto Alegre. Yeast isolates from the Arroio Dilúvio were subjected to susceptibility testing against antifungals through the agar disk diffusion method and the minimum inhibitory concentration test. For the molecular techniques, the genomic DNA of the isolates was extracted with further amplification of ITS1-5.8S-IT2 using primers ITS1 and ITS4. The ITS region was subjected to PCR-RFLP using the restriction enzymes HinfI, HaeIII and CfoI and the restriction profile allowed the construction of a dendrogram. Susceptibility tests showed high prevalence of resistance to azole antifungals. Sixteen isolates exhibited resistance to amphotericin B, of which 14 were subjected to sequencing of the ITS region. The sequence analysis allowed the identification of Candida species, including the potentially pathogenic species C. glabrata, C. parapsilosis and C. tropicalis, and Debaryomyces genus. The manifestation of resistance to antifungals in yeasts isolated from Arroio Dilúvio reinforces the importance of studies of environmental microbiota and indicates that environmental degradation influences the phenotype displayed.

A natamicina é um composto antifúngico bastante utilizado na indústria alimentar, pois é seguro para o consumo e não afeta a qualidade dos alimentos. Recentemente surgiu uma preocupação em relação ao seu uso aditivo em bebidas e iogurtes, uma vez que a natamicina poderia exercer pressão seletiva e desencadear o desenvolvimento de resistência aos polienos in vivo na microbiota comensal do hospedeiro. Diante dessa incerteza, abordamos o possível desenvolvimento da resistência contra a natamicina. Uma seleção de 17 isolados de Candida spp. foi submetida a concentrações crescentes de natamicina durante um tempo prolongado. A exposição à natamicina provocou um aumento de MIC em 14 dos 17 isolados testados e o desenvolvimento de resistência à natamicina foi evidenciado em 5 destes 14 isolados. Dezesseis isolados apresentaram aumento de MIC para anfotericina B e 4 destes isolados mostraram resistência à anfotericina B. A capacidade de formação de biofilmes desses isolados também foi realizada e 3 isolados apresentaram aumento da capacidade de formação de biofilmes após indução de resistência à natamicina. Foi possível evidenciar que a resistência adquirida à natamicina foi maior em isolados que apresentavam baixa suscetibilidade antes da exposição à natamicina. Em vista dos resultados acima mencionados, ressalta-se a importância do monitoramento da natamicina aditivada nos alimentos, pois seus níveis residuais em concentrações elevadas podem exercer uma pressão seletiva sobre as espécies de Candida constituintes da microbiota comensal humana gastrointestinal, no que tange a sua virulência e resistência. / Natamycin is a antifungal compound used in the food industry because it is safe for consumption and has no effect on quality of foods. Recently a concern has arisen over its additive use in beverages and yogurts since natamycin could exert selective pressure and trigger the development of polyene resistance in vivo in the commensal microbiota of host. In view of this uncertainty, we address the possible development of resistance against the natamycin. A selection of 17 isolates of Candida spp. was subjected to increasing concentrations of natamycin for prolonged time. The natamycin-exposure caused an increase of M.I.C. in 14 out of 17 tested isolates and the development of natamycin resistance was evidenced in 5 of these 14 isolates. Sixteen isolates showed increased of M.I.C to amphotericin B and 4 of these isolates showed resistance to amphotericin B. The biofilm forming capacity of the isolates also was performed and 3 isolates presented increasing the capacity to form biofilms after induction of natamycin resistance. It was possible to show that acquired natamycin resistance was increased in isolates that showed low susceptibility before natamycin exposure. In view of the aforementioned results, the importance of the monitoring of natamycin in food is highlighted, since its residual levels in high concentrations may exert a selective pressure on Candida species constituting the gastrointestinal human commensal microbiota, in relation to its virulence and resistance.

Las terapias utilizadas actualmente para el tratamiento de infecciones fúngicas invasoras causadas por hongos filamentosos oportunistas están lejos de ser las óptimas. Estas infecciones se clasifican según su localización anatomoclínica en superficiales, cutáneas, subcutáneas y sistémicas. El objetivo de la presente tesis es contribuir al desarrollo experimental de nuevos tratamientos o a la mejora de los tratamientos ya existentes de un tipo de micosis subcutánea, la cromoblastomicosis, y de micosis sistémicas tales como las feohifomicosis y la aspergilosis. Para ello, se han realizado estudios in vitro e in vivo en modelos animales adecuados que han permitido comprobar la eficacia de diferentes fármacos. / The conventional antifungal therapies commonly used for the treatment of fungal infections due to filamentous fungi are far to be the optimal. These infections can be classified according to their anatomical location in superficial, cutaneous, subcutaneous and systemic. The main objective of this thesis was to evaluate both in vitro and in murine models, the efficacy of new therapeutical strategies against a subcutaneous infection such as chromoblastomycosis, and systemic infections such as phaeohyphomycoses and aspergillosis. Posaconazole was the most effective drug in treating experimental infections caused by dematiaceous fungi, i.e. chromoblastomycoses caused by Fonsecaea pedrosoi or Cladophialophora carrionii, and systemic phaeohypomycoses caused by Fonsecaea monophora or Exophiala spp. Anidulafungin, alone and in combination with voriconazole, showed a high efficacy in the treatment of aspergillosis caused by emerging species of the genus Aspergillus, such as Aspergillus flavus and Aspergillus niger.

Infecções fúngicas causadas por leveduras oportunistas de Candida não – albicans (CNA) têm aumentado drasticamente nas últimas décadas, podendo estar relacionadas com o elevado número de pacientes imunocomprometidos, mais susceptíveis a essas infecções. CNA possuem maior resistência aos antifúngicos tradicionais como o fluconazol (FLZ), fármaco de escolha para o tratamento de infecções por Candida spp. A resistência antifúngica conduz a falhas na terapia clínica podendo levar ao aumento das taxas de morbidade e mortalidade. Associações entre fármacos e substâncias naturais pode ser uma alternativa viável para superar a resistência antifúngica em CNA. Acca sellowiana (O.Berg) Burret, é uma goiabeira pertencente à família Myrtaceae, possuindo diversas atividades biológicas comprovadas. Assim, o objetivo deste estudo foi determinar a atividade antifúngica de frações ativas obtidas a partir do extrato aquoso liofilizado de folhas de A. sellowiana frente a isolados resistentes de CNA. Como resultado, isolados de Candida glabrata foram os mais susceptíveis as frações ativas quando comparados aos demais isolados. As frações ativas F1, F2 e F3 apresentaram melhor atividade antifúngica comparadas às demais, sendo a fração ativa F2, a mais eficaz. Foi demonstrado efeito sinérgico em 80% dos isolados de C. glabrata entre a combinação de FLZ e a fração ativa F2. Na determinação de compostos fenólicos foi identificada a presença de catequina nas frações ativas. A análise dos espectros no UV dos demais picos cromatográficos encontrados nessas frações indica a presença de flavonoides e compostos fenólicos, correlacionando a possível atividade antifúngica dessas frações com a combinação dessas substâncias. O ensaio do sorbitol indicou que a ação da fração ativa F2 ocorre na parede celular das leveduras, corroborando com o dano estrutural observado através de microscopia eletrônica de varredura (MEV). / Fungal infections caused by opportunistic yeast non - albicans Candida (NAC) have dramatically increased in recent decades and could be related to the high number of immunocompromised patients. NAC have greater resistance to traditional antifungal agents such as fluconazole (FLZ), the drug of choice for the treatment of infections caused by Candida spp. The antifungal resistance leads to failures in clinical therapy and may cause an increase in morbidity and mortality rates. Associations between drugs and natural substances can be a feasible alternative to overcome antifungal resistance in NAC. Acca sellowiana (O.Berg) Burret is a guava tree belonging to the Myrtaceae and has several proven biological activities. Thus, the aim of this study was to evaluate the antifungal activity of fractions obtained from the freeze-dried aqueous extract of leaves of A. sellowiana against resistant isolates of NAC. As a result, Candida glabrata isolates were the most susceptible to active fractions when compared to the others isolates. The F1, F2 and F3 active fractions showed the better antifungal activity and the F2 active fraction was the most effective. Synergistic effect of FLZ with F2 active fraction was demonstrated in 80% of C. glabrata isolates. The UV spectra analysis of the chromatographic peaks found in these other fractions indicate the presence of flavonoids and phenolic compounds, correlating the antifungal activity of these fractions with the combination of these substances. The sorbitol test indicates that the action of F2 active fraction possibly occurs in the cell wall of yeasts, confirming structural damage observed by scanning electron microscopy (SEM).

SOUZA, D. P. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos: atividade e mecanismo de ação. 2010. 82 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-27T19:51:27Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_dpsouza.pdf: 1334612 bytes, checksum: 821c6e352d0748426181f7445a3c5d3d (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T20:20:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_dpsouza.pdf: 1334612 bytes, checksum: 821c6e352d0748426181f7445a3c5d3d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T20:20:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_dpsouza.pdf: 1334612 bytes, checksum: 821c6e352d0748426181f7445a3c5d3d (MD5) Previous issue date: 2010 / Canal systems containing secretions, such as latex, are widely disseminated in the plant kingdom. These fluids are chemically complex and exhibit intense metabolism. Despite their origin, latex is the cytoplasm of specialized cells growing intrusively into organized tissues and organs, forming an interconnected network allowing latex exudation immediately after tissue damage. Insecticidal effects of latex proteins have been described, however minor studies were devoted to investigate antifungal activities in latex. In this study proteins extracted from latex of Calotropis procera (Ait.) R.Br (PLCp), Plumeria rubra L.(PLPr), Carica candamarcensis Hook F.(P1 G10), Cryptostegia grandiflora (PLCg), and Euphorbia tirucalli L. (PLEt) were tested for antifungal activity against six phytopathogens (Fusarium solani, F. oxysporium, Aspergilus niger, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. and Colletrotricum gloerosporioides). PLCp, PLCg and P1G10 exhibited antifungal activity and PLPr and PLEt were not efetive. Inhibitory activity of the protein fractions correlated with the cysteine-type proteolytic activity found in these fractions. The endogenous proteolytic activity and inhibitory activity on fungal growth were both increased when samples were first activated with DTT, a cysteine proteinase activator. Conversely, pre-treatment of samples with iodoacetamide, an inhibitor of these proteases rendered all samples deficient of both, proteolytic and antifungal activities. Antifungal of activity of cysteine proteinases of latex origin was also confirmed when papain, obtained from latex of Caryca papaya was tested while purified trypsin and chemotrysin, two serine-type proteases were not antifungal. A cysteine proteinase was thus, purified form PLCg by ion exchange chromatography on a Mono-S Sepharose matrix monitored by a FPLC system. The protein, named Cg24-I exhibited molecular mass of 26.118 KDa determined by MALDI spectrometry; maximum of proteolysis at pH 8.0 and inhibited by iodoacetamide and E-64 when assayed with azocazein or BANA as substrates. Cg24-I inhibited germination of F. solani and altered membrane permeability of spores at a minimum concentration of 90 ng/ml. Results present here suggest that cysteine proteinases of laticifer fluids are proteins with antifungal activity capable of damaging spore structure and inhibiting hyphae growth. Reports of antifungal activity of latex proteases are still scarce in literature and this work appears as an important contribution to this field. Furthermore, this work gives important evidence for the multiple defensive role of latex in plants. / Um relevante número de espécies vegetais é descrito como plantas produtoras de um fluido leitoso comumente denominado de látex. Nestas espécies, o látex é sintetizado e armazenado sob pressão em um sistema de canais formados por células altamente especializadas denominadas de laticíferas, em cujos citoplasmas estão presentes todas as estruturas eucariontes em meio à água, borracha e inúmeras moléculas, muitas das quais específicas deste conteúdo. Muitos estudos têm sugerido que moléculas produzidas nestes fluidos participam da defesa vegetal. Neste trabalho, o látex de 5 espécies foi coletado e processado em laboratório para obtenção de suas frações protéicas e estas foram avaliadas quanto a atividade sobre fungos fitopatogênicos através de ensaios de inibição da germinação de esporos e crescimento de hifas. Proteínas do látex de C. procera (PLCp), Cryptostegia grandiflora (PLCg) e Carica candamarcensis (P1 G10) apresentaram atividade antifúngica enquanto que Plumeria rubra (PLPr) e Euphorbia tirucalli (PLEt) não apresentaram atividade sobre qualquer dos fungos avaliados (Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger). A atividade inibitória das frações protéicas se correlacionou diretamente com a presença de atividade proteolítica do tipo cisteínica presente nas amostras de PLCp, PLCg e P1G10. A atividade antifúngica foi aumentada na presença de DTT, um ativador destas proteases e foi diminuída ou eliminada quanto às amostras foram pré-tratadas com iodoacetamida (IAA), um inibidor específico de proteases cisteínicas. Além disso, a atividade antifúngica foi observada quando papaína, uma protease cisteínica purificada do látex de Carica papaya foi avaliada, mas tripsina e quimotripsina, duas proteases serínicas não apresentaram atividade. Através de cromatografia em coluna de Mono-S Sepharose acoplada ao sistema de FPLC, uma protease cisteínica foi isolada de PLCg. A proteína purificada (Cg24-I) apresentou massa molecular de 24,118 KDa. A Cg24-I apresentou atividade proteolítica máxima em pH 8,0 e foi inibida por IAA e E-64, utilizando azocaseína e BANA como substratos, respectivamente. Cg24-I inibiu a germinação de F. solani e foi capaz de alterar a permeabilidade das membranas dos esporos na concentração de 90 ng/ml. Esse conjunto de resultados sugere que proteinases cisteínicas de fluidos laticíferos participam da defesa das plantas contra fungos fitopatogênicos e que o provável mecanismo de ação destas proteínas seja a alteração da permeabilidade da membrana plasmática destes microrganismos. A descrição de atividade antifúngica de proteases cisteínicas oriundas de fluidos laticíferos não é ainda descrita em detalhes na literatura, sendo este um trabalho com caráter original.