L'étude des virus d'archaea, la manière dont ils sont capables d'infecter leurs hôtes et éventuellement de réaliser le transfert de certains gènes est d'intérêt pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui ont permis le brassage de l'information génétique dans le phylum des archaea. Notre modèle d'étude est le fusellovirus SSV1 qui infecte certaines souches du genre Sulfolobus, dont Sulfolobus shibatae et Sulfolobus solfataricus. Le cycle viral de SSV1 est actuellement très peu connu, mais comprend l'intégration du génome viral dans celui de l'hôte à un site spécifique et la production de particules virales, sans lyse cellulaire, lors d'irradiation UV des cultures infectées. Nous avons initié l'étude de ce virus en analysant les propriétés biochimiques de son intégrase. Nous avons ainsi montré que l'intégrase virale était un membre à part entière de la famille des tyrosine recombinases, une classe de recombinases spécifiques de site que l'on trouve chez les procaryotes eubactériens mais également chez les eucaryotes. L'étude biochimique de l'intégrase de SSV1 nous a permis de mettre en évidence le caractère hybride du mécanisme de recombinaison spécifique de site chez les archaea. En effet, si l'organisation des sites de recombinaison est similaire à celle de systèmes phagiques eubactériens, celle du site actif de la recombinase est de type eucaryote, puisqu'il est assemblé à l'interface de deux protomères fournissant chacun des résidus intervenant dans la catalyse. Nous continuerons l'étude de l'organisation spatiale de ce système mosaïque en cristallisant l'intégrase sur un site synthétique. Une autre originalité du système archaéen est que le gène de l'intégrase est disrupté lors de l'intégration du génome viral dans celui de son hôte. Cette particularité, conservée chez tous les fusellovirus séquencés à ce jour, ouvre de nombreuses hypothèses quant au rôle de la recombinaison spécifique de site dans leur cycle réplicatif. La compréhension du mode de réplication, du maintien et de la mobilisation de ces virus lors de signaux environnementaux tels que l'irradiation UV est essentielle non seulement pour évaluer leur rôle dans la plasticité des génomes d'archaea, mais également pour leur utilisation future comme outils génétique chez leurs hôtes naturels, les Sulfolobales.<br />Nous exploiterons les résultats obtenus in vitro pour évaluer le rôle de l'intégration dans le maintien du virus sous forme stable, en replaçant des mutations inactivant soit l'intégrase soit le site viral de recombinaison dans le génome de SSV1. Le devenir de ces virus recombinants réintroduits dans Sulfolobus solfataricus sera évalué et nous permettra de déterminer si l'intégration du génome viral dans celui de son hôte est essentiel au maintien et à l'amplification du virus. Une analyse biochimique réciproque consistera à déterminer si une forme tronquée de l'intégrase (correspondant au produit de la disruption intégrative) est fonctionnelle pour le processus d'excision. La directionalité des évènements d'intégration et d'excision peut reposer soit sur la forme active de la recombinase (tronquée ou non) soit, et de manière non exclusive, par l'intervention de protéines accessoires fournies soit par l'hôte soit par le virus. L'identification de ces partenaires éventuels sera réalisée en utilisant des approches biochimiques classiques (co-immunoprécipitation, affinité, séquence peptidique) dans différentes conditions de croissance induisant ou non la production virale. Les résultats seront confrontés aux informations obtenues par les analyses transcriptomiques des effets des radiations réalisées sur Sulfolobus mais également Thermococcus ou Pyrococcus. L'analyse du pool de gènes induits lors d'une irradiation devrait contribuer à l'identification des facteurs de l'hôte intervenant dans la production virale en réponse au stress.<br />Outre le rôle de l'intégration dans le cycle viral, nous évaluerons dans une approche plus globale le rôle des différentes protéines codées par le virus. En effet, sur les 34 protéines potentiellement produites par SSV1 seules 4 ont une fonction identifiée. Par ailleurs, l'analyse comparative des différents génomes de fusellovirus montre que seules 18 ORFs (dont l'intégrase) sont communes à tous ces virus, suggérant que les protéines correspondantes assurent les fonctions minimales essentielles au développement viral. Chacune de ces ORFs sera délétée par LI-PCR. Cette stratégie devrait nous permettre de nous affranchir d'effets secondaires transcriptionnels liés à l'organisation polycistronique du génome viral. L'effet de l'inactivation de chaque ORF sera évalué en prenant en compte différentes étapes du développement viral (stabilité du génome dans la cellule hôte, production de particules virales, infectivité...). Nous espérons ainsi définir la fonction de ces protéines qui n'ont pour l'heure aucun homologue dans le vivant.

Les protéasomes sont de larges protéases ATP-dépendante impliquées dans la dégradation des protéines régulatrices et des protéines anormales dans la cellule. Cette thèse porte sur l'étude de deux AAA-ATPases : Pans A et Pans B régulatrices du protéasome chez les archaea halophiles. Une partie de ce manuscrit est consacrée à la caractérisation du mode de régulation des deux Pans chez l'Archaea halophile extrême Halobacterium salinarium. Les expériences montrent l'existence de deux isoformes des protéines Pans dans les cellules. Les modifications portent sur la région N-ter des deux protéines et mettent probablement en jeu l'utilisation alternative de deux départs de traduction. La cartographie des régions 5' non codantes des transcrits révèle l'existence d'une hétérogénéité au niveau des ARNm des pans. Le travail s'intéresse ensuite aux états d'oligomérisation et d'association in cellulo des protéines PANs. Des études de fractionnement par ultracentrifugation sur gradient de sucrose indiquent un état de faible oligomérisation des PANs et l'absence de complexes stables avec le protéasome 20S. La dernière partie du travail porte sur la régulation de l'expression des gènes panA et panB au cours de la réponse aux stress salin et thermique. Ce travail montre que les deux protéines Pans, activatrices potentielles du protéasome, ne sont pas régulées de façon identique en réponse à un stress environnemental.

<p>The third domain of life, Archaea is one of the three main evolutionary lineages together with the Bacteria and the Eukarya domains. The archaea are, despite their prokaryotic cell organisation, more closely related to eukaryotes than to bacteria in terms of the informational pathways (DNA replication, transcription and translation). Organisms from the archaeal hyperthermophilic genus <i>Sulfolobus</i> thrives in a hot (80°C), acidic (pH 2-4) and sulphur-rich environment.</p><p>In my thesis, I have used a variety of different approaches to study the <i>Sulfolobus</i> cell cycle. After dilution of a stationary phase cell culture with fresh medium, synchronous cell cycle progression was obtained. From the synchronised cell culture experiment we could conclude that the major cell cycle events (nucleoid segregation, cell division and chromosome replication) were tightly coupled to each other and to cellular mass increase. </p><p>Inhibitors of the elongation stage of chromosome replication, and of cell division, as well as drugs arresting the cell cycle in the post-replicative phase, were found in an in vivo screening of a range of antibiotics. The cell cycle was found to be regulated such that the previous cell cycle step had to be successfully accomplished before the next could initiate, except for DNA replication which could occur without an intervening cell division event.</p><p>The replication pattern of <i>Sulfolobus solfataricus</i> was analysed using a marker frequency assay. From the results, we were able to determine that a single origin is utilized in vivo, that the replication directionality is bidirectional, and also an approximate location of the replication origin within the genome.</p><p>Intracellular virus production in vivo of SIRV2 (<i>Sulfolobus islandicus</i> rod-shaped virus2) in <i>Sulfolobus islandicus</i> was also analysed. The effects on the host cell were determined, including loss of cell viability, inhibited initiation of replication at virus infection and DNA degradation and loss of cell integrity at the time of virus release. Also, for the first time intracellular virus DNA was visualized with flow cytometry.</p>

The third domain of life, Archaea is one of the three main evolutionary lineages together with the Bacteria and the Eukarya domains. The archaea are, despite their prokaryotic cell organisation, more closely related to eukaryotes than to bacteria in terms of the informational pathways (DNA replication, transcription and translation). Organisms from the archaeal hyperthermophilic genus Sulfolobus thrives in a hot (80°C), acidic (pH 2-4) and sulphur-rich environment. In my thesis, I have used a variety of different approaches to study the Sulfolobus cell cycle. After dilution of a stationary phase cell culture with fresh medium, synchronous cell cycle progression was obtained. From the synchronised cell culture experiment we could conclude that the major cell cycle events (nucleoid segregation, cell division and chromosome replication) were tightly coupled to each other and to cellular mass increase. Inhibitors of the elongation stage of chromosome replication, and of cell division, as well as drugs arresting the cell cycle in the post-replicative phase, were found in an in vivo screening of a range of antibiotics. The cell cycle was found to be regulated such that the previous cell cycle step had to be successfully accomplished before the next could initiate, except for DNA replication which could occur without an intervening cell division event. The replication pattern of Sulfolobus solfataricus was analysed using a marker frequency assay. From the results, we were able to determine that a single origin is utilized in vivo, that the replication directionality is bidirectional, and also an approximate location of the replication origin within the genome. Intracellular virus production in vivo of SIRV2 (Sulfolobus islandicus rod-shaped virus2) in Sulfolobus islandicus was also analysed. The effects on the host cell were determined, including loss of cell viability, inhibited initiation of replication at virus infection and DNA degradation and loss of cell integrity at the time of virus release. Also, for the first time intracellular virus DNA was visualized with flow cytometry.

(S)-3-O-Geranylgeranylglyceryl Phosphate Synthase (GGGPS) is a TIM (βα)8 barrel protein found in Archaea and the enzyme catalyzing the first step in the biosynthesis of archaeal membrane lipids. The TIM (βα)8 barrel protein fold is thought to have evolved by duplication and fusion of (βα)4 half barrels. We propose that the GGGPS has also evolved from (βα)4 half barrels. One way to test this hypothesis is to generate putative half-barrels experimentally. GGGPS from Archaeaglobus fulgidus, is a dimer of (βα)8 barrels. Thus, before constructing half barrels, a stable monomer is needed to be engineered. Introducing three substitutions into the dimer interface formed the GGGPS monomer. AUC showed ~50 % of the protein is in the monomeric state. CD experiments confirmed that the engineered protein was properly folded but had decreased thermal stability. In an enzymatic assay, the monomeric GGGPS protein proved as active as the WT protein on a subunit basis.

(S)-3-O-Geranylgeranylglyceryl Phosphate Synthase (GGGPS) is a TIM (βα)8 barrel protein found in Archaea and the enzyme catalyzing the first step in the biosynthesis of archaeal membrane lipids. The TIM (βα)8 barrel protein fold is thought to have evolved by duplication and fusion of (βα)4 half barrels. We propose that the GGGPS has also evolved from (βα)4 half barrels. One way to test this hypothesis is to generate putative half-barrels experimentally. GGGPS from Archaeaglobus fulgidus, is a dimer of (βα)8 barrels. Thus, before constructing half barrels, a stable monomer is needed to be engineered. Introducing three substitutions into the dimer interface formed the GGGPS monomer. AUC showed ~50 % of the protein is in the monomeric state. CD experiments confirmed that the engineered protein was properly folded but had decreased thermal stability. In an enzymatic assay, the monomeric GGGPS protein proved as active as the WT protein on a subunit basis.

In this study, possible involvement of the small heat shock proteins (sHsps) from a thermoacidophilic archaeon, Thermoplasma (Tp) volcanium in the stress response was investigated. Our results showed that heterologous, high level expression of TVN0775/sHsp gene in E.coli increased its thermotolerance at 53&deg / C for two hours. But, the second sHsp of the Tp. volcanium, TVN0984/sHsp was not effective in improvement of the thermal resistance of the mesophilic bacterium (i. e., E.coli). The expression of the TVN0775/sHsp and TVN0984/sHsp genes increased about 3 fold after heat-shock at 65&deg / C, as revealed by Real-Time PCR analysis. Although expression of the both genes was induced at 70&deg / C, TVN0984/sHsp gene expression was increased higher (about 5 fold) than that of the TVN0775/sHsp gene expression (about 1.5 fold). Tp. volcanium cells were exposed to high pH (pH: 3.5, pH: 4.0, pH: 4.5, pH: 5.0), and the change in the sHsp genes&rsquo / expression profile were analyzed. The results showed that TVN0775/sHsp gene expression was more sensitive to increased pH than TVN0984/sHsp gene expression. The TVN0775/sHsp gene transcription induced at most 2.5 fold at pH 4.0 and the gene expression either reduced or did not change at higher pH values (i.e., pH 4.5 and 5.0). On the other hand, TVN0984/sHsp gene expression did not change at pH 4.0 but significantly reduced at higher pH values. The effect of oxidative stress on the expression of TVN0775 and TVN0984 genes was investigated by treatment of Tp. volcanium cells with 0.01 mM, 0.02 mM, 0,03 mM and 0.05 mM H2O2. For both sHsp genes, transcription was induced at lower concentrations of H2O2 (0.01 mM and 0.02 mM). At higher concentrations of H2O2 expression of both genes&rsquo / transcription either did not changed or down regulated. Lastly, in this study we have purified the recombinant TVN0775/sHsp, as an Nterminal 6x his-tag fusion to homogeneity on Ni-NTA affinity column. Purified protein samples were used in the chaperone activity assays using bovine glutamate dehydrogenase enzyme (boGDH) as substrate. We have found that the recovery of glutamate dehydrogenase activity at 45&deg / C, 50&deg / C and 53&deg / C in the presence of the Tp. volcanium sHsps was higher than that of spontaneous refolding. Also, TVN0775/sHsp increased the recovery of the boGDH enzyme that was denatured at 2.5 M GdnHCl concentrations for 30 min.

Gewässersedimente stellen für den Stoffkreislauf ein wichtiges Ökosystem dar. Durch die Stoffwechselleistungen einer komplexen mikrobiellen Lebensgemeinschaft wird sowohl das Sediment selbst, sein Interstitialwasser, das überstehende Freiwasser als auch die Atmosphäre und die darin lebenden Mikro- und Makroorganismen beeinflusst. Die grundlegenden chemischen Prozesse im Sediment sind bereits gut untersucht. Auch sind die mikrobiellen Großgruppen im Sediment bekannt. Im Hinblick auf die Diversität der Mikroorganismen, insbesondere in Süßwassersedimenten, gibt es noch Forschungsbedarf. Das Auengebiet des Nationalparks „Unteres Odertal“ stellt durch seine jährlich kontrollierten Flutungen ein interessantes und wegen seiner Vielfalt verschiedenartiger Gewässertypen einen idealen Ort zur Untersuchung mikrobieller Biozönosen in Gewässersedimenten dar. Ziel dieser Arbeit war es, eine erste Charakterisierung der mikrobiellen Biozönose in den Gewässersedimenten des Auennationalparks „Unteres Odertal“ durchzuführen und mit den Ergebnissen der Talsperre Saidenbach und der Elbaue bei Dornburg zu vergleichen. Hierfür kam ein breites Spektrum an Methoden zum Einsatz, das klassische mikrobiologische Methoden und molekularbiologische Techniken umfasste. Die Analysen sollten dabei über mehrere Jahre hinweg erfolgen, um die Variabilität der mikrobiellen Populationen in Abhängigkeit von sich ändernden Umweltparametern zu erfassen. Die Charakterisierung der Umweltparameter erfolgte durch Messungen chemisch-physikalischer Parameter im Freiwasser, Sediment und seinem Interstitialwasser. Die untersuchten Probenahmestellen unterschieden sich in ihren chemischen Profilen. Damit waren Unterschiede in der mikrobiellen Zusammensetzung dieser Probenahmestellen zu erwarten. Die Identifizierung und Quantifizierung der Prokaryoten mittels CARD FISH wies auf eine hohe Abundanz von Alpha- und Beta-Proteobakterien sowie Bacteroidetes, Planctomycetes, Verrucomicrobia und Chloroflexi in den Proben des Odertals hin. Die Proben Dornburgs wurden von Planctomyceten und die Proben des Haselbachs von Alpha-Proteobakterien oder Verrucomicrobien dominiert. Obwohl die Hybridisierbarkeit der Proben gut war, wurde mit den angewendeten Sonden in der Summe weniger als 50 % der Gesamtzellzahl erfasst. Die Anwendung der ARISA Methode zeigte strukturelle Unterschiede zwischen den untersuchten Proben in Abhängigkeit von der Sedimenttiefe und dem Probenahmemonat. Die größte Ähnlichkeit besaßen die Biozönosen des Anglerteichs und des Bogengrabens. Ein Einfluss der Flutung auf die Zusammensetzung der mikrobiellen Biozönose konnte deutlich gezeigt werden. Die Identifikation der Eubakterien in den Proben des Odertals durch die Erstellung von 16S rDNA Eubakterien Klonbanken ergab eine Dominanz der Beta-Proteobakterien und Bacteroidetes und wies auf die Bedeutung der Delta-Proteobakterien hin. Die eubakterielle Lebensgemeinschaft im Haselbach wurde von Alpha-Proteobakterien und Acidobakterien dominiert. Variabilitäten im Zusammenhang mit dem Probenahmedatum und der Flutung des Odertals konnten gezeigt werden. Die größte eubakterielle Biodiversität wurde im Sediment der Oder-Zollstation (April 2007) geschätzt. Die Anwendung der Pyrosequenzierung ergab eine hohe Biodiversität in allen Proben und bestätigte die Dominanz der Beta-Proteobakterien im Anglerteich. Im Bogengraben dominierten die Delta-Proteobakterien knapp vor den Beta-Proteobakterien. In der Oder waren neben den Beta-Proteobakterien die Bacteroidetes abundanter. Die genannten Taxa dominierten auch die Bibliotheken der Talsperre Saidenbach. Die höchste Biodiversität wurde für die Bibliothek des Bogengrabens angegeben, dessen Lebensgemeinschaft die meisten Gemeinsamkeiten mit der Bibliothek des Anglerteichs aufwies. Sulfatreduzierende Bakterien (SRB) wurden durch die Sequenzierung von Klonbanken und die Anwendung der Fingerprintmethoden T-RFLP und DGGE charakterisiert. Die hohe Biodiversität der SRB konnte je nach erstellter Klonbank unterschiedlich gut beschrieben werden. Neben zahlreichen nicht identifizierbaren Vertretern waren Desulfobacterales und Clostridiales abundant. Die größte Diversität wurde wiederum in der Bibliothek des Bogengrabens nachgewiesen. Die Zusammensetzung der SRB in den Klonbanken variierte in Abhängigkeit der Parameter gelöster reaktiver Phosphor (SRP), organische Substanz, DOC und Nitrat. Mit T-RFLP und DGGE konnte eine sedimenttiefenabhängige Variabilität der SRB festgestellt werden, die sich zwischen den Proben Anglerteich und Bogengraben am meisten glich. Mit der DGGE erfolgte eine erste zeitabhängige Untersuchung, die deutlich verschiedene Biozönosen zwischen der Talsperre Saidenbach und den Proben des Nationalparks „Unteres Odertal“ zeigte. Das enorm hohe Bandenspektrum erschwerte die Analyse der zeitlichen Variabilität. Die Nitrat-Stickstoffkonzentrationen waren in den Sedimenten mit zunehmender Tiefe unverändert niedrig, was sich in einer mit T-RFLP untersuchten niedrigen Diversität der Denitrifikanten wiederspiegelte, die nur wenige vertikale oder zeitliche Varianzen zeigten. Die Anwendung von Kultivierungsversuchen ermöglichte die Isolation und eine erste Charakterisierung von Cyano- und Eisenbakterien. Insbesondere fädige Cyanobakterien der Gattungen Leptolyngbya, Nostoc und Pseudanabaena wiesen ein interessantes Sekundärmetabolitspektrum auf. Die Untersuchung erster Extrakte (Firma Cyano Biotech) wies auf biologisch aktive Substanzen hin. Die Untersuchung hygienisch relevanter Mikroorganismen zeigte ein höheres Vorkommen coliformer Bakterien im Sediment der Oder-Zollstation als im Anglerteich oder Bogengraben. Neben den Eubakterien wurde die Lebensgemeinschaft der Archaea durch Sequenzierung generierter Klonbanken identifiziert sowie die vertikale und temporale Variabilität ihrer Struktur untersucht (T-RFLP, DGGE). Die für aquatische Sedimente vergleichsweise hohe archaeale Diversität unterschied sich enorm zwischen den Klonbibliotheken. Die höchste Diversität wurde in der Klonbank der Probe Dornburgs festgestellt, die neben Vertretern des „Rice Clusters V“ (RC-V) überwiegend aus Crenarchaea bestand. RC-V Archaea dominierten, bis auf die Oder-Zollstation, alle generierten Bibliotheken. Methanogene Archaea waren besonders abundant in der Bibliothek der Oder-Zollstation (Methanomicrobiaceae, Methanosaetaceae) und des Haselbachs (Methanospirillaceae). Einflussnehmende Umweltfaktoren waren Sulfat (Dornburg), Nitrat (Entnahmestelle), DIC (Anglerteich), Sauerstoff (Haselbach) und Ammonium (Oder-Zollstation). Die T-RFLP Analyse zeigte die methanogenen Archaea Methanosarcinales/Methanomicrobiales (Msm) als besonders abundant an. Eine erwartete tiefenabhängige Varianz konnte mit T-RFLP gezeigt werden. Die Unterschiede zwischen den Probenahmestellen waren jedoch deutlicher und zeigten anhand der DGGE Analyse ein breiteres Msm Bandenspektrum für den Anglerteich und Bogengraben im Vergleich zur Oder-Zollstation und zum Haselbach. Die zeitabhängige Variabilität der Archaea und Msm konnte mit T-RFLP und DGGE gezeigt werden. Der Einfluss der Flutung war im Vergleich zu allen anderen Probenahmedaten nicht so ausschlaggebend wie erwartet. Insgesamt zeigen die Ergebnisse eine hohe Biodiversität der Mikroorganismen im Nationalpark Unteres Odertal. Die Flutung hatte insbesondere auf die Eubakterien einen großen Einfluss. Zeitliche Variabilität der Zusammensetzung der Lebensgemeinschaften der Prokaryoten lässt sich im Odertal nicht mit einer Jahreszeit in Zusammenhang bringen. Hingegen sind die mikrobiellen Biozönosen im Haselbach nachweislich von den wechselnden Zirkulationsphasen beeinflusst. Die hier verwendeten Methoden sind zur Charakterisierung mikrobieller Biozönosen in der Umweltmikrobiologie weit verbreitet. Die Anwendung der neuen Pyrosequenzierungsmethode ermöglichte trotz enormer Anzahl analysierter Sequenzen keine vollständige Erfassung der hohen Biodiversität, aber durch das Fehlen des Klonierungsschrittes wurde eine Fehlerursache in der Darstellung der realen Biozönose ausgeschlossen. Unstimmigkeiten in den Ergebnissen der verschiedenen Experimente beruhen meist auf methodischen Limitationen. Die DNA Isolationsmethode, die Vorauswahl von Primern, die bevorzugte Amplifikation, die allen PCR-basierten Methoden zu Grunde liegen, verschieben die reale Darstellung der Struktur einer Biozönose. Die fehlende Aussagekraft über die Aktivität der Mikroorganismen durch DNA basierte Analysen kann durch die Beobachtung der zeitlichen Änderungen ihrer Abundanz reduziert werden. Erste einflussnehmende Umweltparameter konnten ermittelt werden. Zusätzliche Analysen weiterer Elektronenakzeptoren über einen längeren Zeitraum sind jedoch nötig, um eine hinreichend sichere Aussage treffen zu können.

Methane is a greenhouse gas and a major contributor to climate change. Methanogenic Archaea produce more than 1 billion tons of this gas each year through methanogenesis, the anaerobic reduction of CO₂ to methane. Coenzyme B (CoB) is one of eight coenzymes required for methanogenesis and it is unique to methanogens. Therefore, this coenzyme is a potential target for inhibiting methanogenesis. To further elucidate the CoB biosynthetic pathway, genes from Methanocaldococcus jannaschii were cloned and expressed in an effort to identify the CoB homoaconitase. From this study, the MJ0499-MJ1277 pair of proteins was identified as the methanogen isopropylmalate isomerase involved in leucine and isoleucine biosynthesis. The MJ1003-MJ1271 pair of proteins was characterized as the homoaconitase required for CoB biosynthesis. This enzyme exhibited broad substrate specificity, catalyzing the isomerization of cis-unsaturated tri-carboxylates with [gamma]-chains of 1-5 methylenes in length. Previously characterized homoaconitases only catalyzed half of the predicted reactions in the isomerization of homocitrate. The MJ1003-MJ1271 proteins function as the first homoaconitase described to catalyze the full isomerization of homocitrate to homoisocitrate. Also, the CoB homoaconitase was identified as specific for (R)-homocitrate and cis-unsaturated intermediates, contrary to a previous study that suggested the substrate specificity of this enzyme included (S)-homocitrate and trans-homoaconitate. The M. jannaschii isopropylmalate isomerase and homoaconitase share more than 50% sequence identity and catalyze analogous reactions. Site directed mutagenesis of the MJ1271 protein was used to identify residues involved in substrate specificity. Arg26 of MJ1271 was critical for the specificity of the CoB homoaconitase. Mutation of this residue to the analogous residue in the M. jannaschii isopropylmalate isomerase, Val28, altered the substrate specificity of the homoaconitase to include the substrates of isopropylmalate isomerase. These homologs of aconitase require a [4Fe-4S] cluster for coordinating their respective substrates at the enzyme active site. However, methanogens lack most of the proteins required for iron-sulfur cluster assembly. Therefore, genes homologous to the Salmonella enterica ApbC iron-sulfur scaffold protein were characterized from methanogens. The MMP0704, MJ0283, and SSO0460 proteins from Methanococcus maripaludis, M. jannaschii, and Solfolobus solfataricus, respectively, were identified as scaffold proteins involved in methanogen iron-sulfur cluster biosynthesis. / text

The effect of engineered nanoparticles (ENPs) mixture consisting of silver oxide, (Agg0[Silver Oxide Nanopartical], 20 nm), titanium dioxide, (TiO2[Titanium dioxide], 30-40 nm) and zinc oxide, (ZnO, 20 nm) compared with their bulk metal salts was evaluated against unspiked activated sludge (control) using 3 parallel pilot-scale treatment plants. The total concentration of the ionic species of Ag+ Ti[Silver + Titanium] and Zn(2+) in the effluent of the ENP spiked activated sludge (AS) was below limits of detection and> 99% of the spiked ENP were found in the waste activated sludge (WAS), whereas 39 – 58 % of Ag0[Silver Oxide Nanopartical], 51 – 63 % and 58 – 74 % of ZnO ion concentrations were recovered in the anaerobic digestate (AD) cake suggesting higher affinity of ENPs to WAS than to anaerobic digestate. ENPs induced a 2-fold increase of the microbial community specific oxygen uptake rate (SOUR) compared with the control and > 98 % of ammonia and 80 % of COD were removed from the AS suggesting that the heterotrophic biomass retained their ability to nitrify and degrade organic matter at the spiked ENP concentration. The floc size and cultivable microbial abundance was reduced in the ENP spiked AS with no apparent disruption of the overall AS process efficiency. However, scanning electron microscopic analysis clearly showed damage to specific microbial cells. The lipid fingerprint and 16S rRNA gene-based pyrosequencing evidenced the dominance of Proteobacteria, Firmicutes, and Bacteriodetes with a clear temporal shift in microbial community structure. The prominent nano-tolerant bacterial species identified were Acidovorax, Rhodoferax, and Comamonas whereas Methanocorpusculum and Methanosarcina were recovered in AS and were the dominant Archaea in the AD with 99 and 98 % similarities to the closest culturable relative. Their presence in the AS suggests tolerance to ENPs and oxygen-dependent respiration. V. fisheri activity was not sensitive to the ionic concentrations of the ENP or metal salt mixture in the digestate samples and illustrates the need to develop bioassay using indigenous wastewater microorganisms to detect the potential effect of ENP. Overall, unlike other xenobiotic compounds, ENPs can hasten the natural selection of microbial species in activated sludge and anaerobic digestion processes.