Dans la rétine, on retrouve deux types de photorécepteurs appelés cônes et bâtonnets. Les bâtonnets, qui sont impliqués dans la vision scotopique, comprennent un segment externe qui s'appose sur une couche de cellules appelée epithelium pigmentaire rétinien (EPR). L'absorption de la lumière dans les disques du segment externe des bâtonnets est possible grâce à la rhodopsine, qui est composée d'une protéine appelée opsine et du 11 -cis rétinal. La lumière entraîne l'isomérisation du 1 l-cis rétinal en tout-trans rétinal qui se dissocie alors de la rhodopsine. L'isomère tout-trans est ensuite traité par un processus appelé "cycle visuel des rétinoïdes" qui permet la reconversion du tout-trans rétinal en 11-c/s-rétinal par une série de réactions enzymatiques qui sert à régénérer la rhodopsine. Parmi les enzymes impliquées dans ce cycle visuel, on retrouve les rétinol déshydrogénases (RDH) qui sont responsables de la formation du rétinol à partir du rétinal et vice versa. Il existe plusieurs isoformes des RDH, dont la RDH11 et la RDH8, qui sont localisées respectivement dans l'EPR et dans le segment externe des photorécepteurs, mais aucune structure n'est connue encore au sein de cette famille de protéines. L'objectif ultime de ce travail de recherche était de détenniner la structure d'un membre de la famille des RDH. Cependant, notre objectif à court terme était d'identifier et de caractériser un type de RDH qui serait suffisamment soluble pour satisfaire les conditions nunimales de cristallisation de ces protéines. Nous avons donc surexprimé et purifié la RDH 11 et la N-del-RDHll et détenriiné leur niveau de solubilité qui était insuffisant pour entreprendre des essais de cristallisation. Nous avons ensuite clone et surexprimé la RDH8 en fusion avec la GST afin de trouver une RDH plus soluble pour cristalliser un membre de cette famille de protéines.

Le mélanome uvéal, qui origine de la transformation anormale des mélanocytes de l’uvée, et représente la tumeur intraoculaire la plus fréquente chez l’adulte. Plus de 40% des patients ne ressentent ni douleur, ni troubles visuels lors du développement de la tumeur oculaire, ce qui explique le dépistage tardif de ce cancer et la présence de métastases au foie lors du diagnostic initial dans près de la moitié des cas. Une méta-analyse a souligné l’inefficacité des thérapies disponibles étant donné le peu d’études cliniques de phase III complétées dans les 30 dernières années pour traiter le mélanome uvéal métastatique. L’objectif général de mon projet de doctorat consistait à caractériser des mécanismes moléculaires à potentiel thérapeutique dans la progression des métastases du mélanome uvéal qui pourraient être ciblés pour traiter les patients ayant reçu un mauvais pronostic. Mon premier objectif consistait à caractériser les effets de la répression pharmacologique du récepteur 2B de la sérotonine (HTR2B) dans les cellules cancéreuses métastatiques du mélanome uvéal. Nous avons démontré que l’antagoniste sélectif PRX-08066 réduit la viabilité des cellules du mélanome uvéal et la population en mitose et altère leur potentiel d’auto-renouvellement et de migration avec une sensibilité variable d’une lignée à l’autre. De plus, nous avons observé une diminution de la phosphorylation de kinases des voies de signalisation classiquement activées par HTR2B, ainsi que des kinases β-caténine, PYK2 et STAT5 dans les cellules traitées. Mon second objectif consistait à caractériser le profil d’hydroxyméthylation (5-hmC) de l’ADN durant la progression du mélanome uvéal. Nous avons montré une réduction du niveau global de 5-hmC dans les lignées cancéreuses du mélanome uvéal comparativement à la choroïde et aux mélanocytes. De plus, nos analyses ont révélé une diminution de l’expression de l’enzyme IDH1 dans les cellules cancéreuses et une seule lignée comportait une mutation dans ce gène. Mon troisième objectif consistait à tester différents taux d’oxygène (3% vs 21%O2) pour la culture in vitro des lignées mélanocytaires. Nous avons démontré que la morphologie des mélanocytes et leur pigmentation sont légèrement changées lorsqu’exposés à 3% O2 comparativement aux cellules cancéreuses. De plus, leur temps de doublage était significativement plus rapide dans ces conditions. Le profilage génique des mélanocytes choroïdiens n’a pas révélé une longue liste de transcrits considérablement dérégulés entre les deux concentrations d’oxygène : seul le transporteur de lactate MCT4 était dérégulé de manière significative à 3% O2 chez tous les donneurs. Mes travaux de doctorat ont donc permis l’avancement des connaissances sur le promoteur de métastases HTR2B de la signature moléculaire pronostique, l’hydroxyméthylation de l’ADN et l’hypoxie dans le mélanome uvéal, ce qui contribuera au développement d’une thérapie adjuvante ou épigénétique pour améliorer la survie des patients. / Uveal melanoma (UM) originates from the abnormal transformation of uveal melanocytes and is the most common intraocular tumor in adults. More than 40% of patients do not experience pain or visual disturbances during the development of their ocular tumor, which explains the late detection of this cancer in nearly half of the cases, and the presence of liver metastases at the initial diagnosis. A meta-analysis highlighted the ineffectiveness of available therapies given the limited number of phase III clinical studies completed in the past 30 years to treat metastatic UM. The general objective of my PhD project was to characterize molecular mechanisms with therapeutic potential in the metastatic progression of UM that could be targeted to treat patients with poor prognosis. My first objective was to characterize the effects of the pharmacological repression of the serotonin 2B receptor (HTR2B) in metastatic UM cells. We demonstrated that the selective antagonist PRX-08066 reduces both the viability of UM cells and the population in mitosis, and alters their potential for self-renewal and migration, with an interindividual variability in sensitivity. In addition, we observed a decrease in the phosphorylation of kinases of the signaling pathways classically activated by HTR2B, as well as new targets such as β-catenin, PYK2 and STAT5 in the treated cells. My second objective was to characterize the DNA hydroxymethylation profile (5-hmC) during UM progression. We have shown a reduction in the overall level of 5-hmC in UM cell lines compared to choroid and uveal melanocytes. Furthermore, our analyzes revealed a decrease in the expression of the IDH1 enzyme in UM cells and only one UM cell line showed a mutation in this gene. My third objective was to test different levels of oxygen (3% vs 21% O2) for the in vitroculture of melanocytic lines. We showed that the morphology of melanocytes and their pigmentation are slightly changed when exposed to 3% O2compared to UM cells. Moreover, their doubling time was significantly faster under these conditions. The gene profiling of choroidal melanocytes did not reveal a long list of significantly deregulated transcripts between both oxygen concentrations : only the lactate transporter MCT4 was significantly deregulated in all donors at 3% O2. My doctoral work enabled the advancement of knowledge on the HTR2B metastasis promoter from the prognostic molecular signature, DNA hydroxymethylation and hypoxia in UM, which will contribute to the development of an adjuvant or epigenetic therapy to improve patient survival.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / Le récepteur Bj (RBi) des kinines émerge présentement comme une cible thérapeutique de choix pour le traitement de l'inflammation et de la douleur inflammatoire. Bien que les mécanismes régissant l'expression du RBi en conditions pathologiques soient relativement bien documentés au niveau transcriptionnel, peu de données sont disponibles sur sa régulation post-traductionnelle. Les travaux présentés dans cette thèse, principalement basés sur des modèles cellulaires exprimant des RBi recombinants ou naturels, de même que sur des essais de contractilité exploitant des vaisseaux sanguins isolés, visaient à améliorer notre connaissance du RBi et de ses ligands à l'échelle moléculaire. La première partie des études traite des processus enzymatiques qui affectent négativement la puissance de divers ligands peptidiques du RBi dans l'aorte de lapin. L'identification de l'aminopeptidase N exprimée par les cellules musculaires lisses en tant que voie d'inactivation majeure des ligands peptidiques du RBi, a mené à la synthèse de nouveaux antagonistes résistants au métabolisme de cette enzyme. Un prototype d'une nouvelle classe de médicaments inhibant à la fois le RBi et l'aminopeptidase N a aussi été découvert. Le deuxième volet des travaux a démontré que le RBi exprimé à la surface cellulaire est instable et rapidement internalisé en absence de stimulation par l'agoniste. De plus, la démonstration que de nouveaux antagonistes non peptidiques du RBi peuvent agir comme chaperons pharmacologiques en optimisant la maturation du récepteur, a permis de mettre en lumière l'existence d'une forme hautement glycosylée et sensible à l'agoniste du RBi. De façon globale, ces travaux ont mis en évidence l'instabilité moléculaire du RBi et de ses ligands. Les études de pharmacologie moléculaire présentées dans cette Thèse soulèvent aussi plusieurs questions, et ouvrent la voie à de nouvelles investigations sur la régulation du RBi des kinines dans un modèle cellulaire humain.

La méthode d’auto-assemblage développée au Laboratoire d’Organigénèse Expérimentale (LOEX) est très efficace afin de produire des substituts cutanés autologues absents d’agents exogènes. Une adaptation possible de cette méthode permet d’obtenir un substitut cutané présentant un phénotype psoriasique. L’objectif de ce travail a été de poursuivre la validation du modèle de substitut cutané produit par la méthode d’auto-assemblage en évaluant la capacité métabolique des substituts via l’emploi de molécules antipsoriasiques comme le tazarotène. Pour ce faire, des tests de perméabilité cutanée combinés à une détection par chromatographie ultra performante ont été envisagés afin d’évaluer d’une part les structures adéquates des peaux reconstruites et d’autre part d’établir des liens avec ces résultats et les capacités de métabolisation du modèle. Les résultats obtenus démontrent une capacité métabolique chez les substituts cutanés. De plus, des différences au niveau de la perméabilité sont observées entre les différents types de peau utilisés, confirmant que le modèle est de plus en plus représentatif. / The self-assembly method developed at the LOEX is very effective to produce autologous skin substitutes free of exogenous agents. A possible adaptation of this method allows the reconstruction of a skin substitute having many features of a psoriatic phenotype. The objective of this work was to follow the validation of the skin substitutes produced by the self-assembly method by the evaluation of the skin substitutes metabolism using antipsoriatic molecules like tazarotene. Percutaneous absorption combined with an ultra performance liquid chromatography has been selected in order to evaluate on one hand the appropriate structures of the reconstructed skins and on the other hand, to establish some links with these results and their capacity of metabolism. Results obtained from shown that metabolization has been detected in skin substitutes. Moreover, permeability differences have been observed of each kind of skin used on this study. This confirms that our skin model is more and more representative.

Les spermatozoïdes complètent l'acquisition de leur pouvoir fécondant lors d'un processus de maturation post-éjaculatoire nommé la capacitation. Ce processus nécessite un ensemble de modifications membranaires et intracellulaires, dont l'augmentation de la phosphorylation en tyrosine des protéines. Différentes enzymes à activité tyrosine kinase participent à cette augmentation mais aucune n'a été trouvée responsable de la totalité des événements de phosphorylation en tyrosine associés à la capacitation. L'expression de la Janus kinase (JAK) 1 fut récemment démontrée dans les spermatozoïdes. Toutefois, sa contribution à l'augmentation du contenu en phosphotyrosine des protéines n'est pas déterminée. Dans les cellules somatiques, les substrats des JAKs sont des facteurs de transcription de la famille des signal transducer and activator of transcription (STAT). Cette cascade de signalisation intervient dans une multitude de processus biologiques et est activée en réponse à la liaison des cytokines et des facteurs de croissance. Bien que l'expression du récepteur de l'interleukine-6 (IL-6) et de certains membres de la famille des STATs a préalablement été rapportée dans les spermatozoïdes, leur rôle lors du processus de capacitation n'est pas encore déterminé. Le but de ce projet de doctorat consistait donc à caractériser les intermédiaires de la voie JAK/STAT présents dans les spermatozoïdes humains. J'ai d'abord confirmé la présence du récepteur de 1TL-6 à la surface membranaire des spermatozoïdes sans qu'il soit possible, toutefois, de démontrer son activation et d'identifier des substrats potentiels de JAK1. De façon surprenante, les facteurs de transcription STAT1, 3, 4, 5 et 6 sont tous détectés dans les spermatozoïdes. À l'exception de STAT4, présent au niveau de la thèque périnucléaire, tous ces intermédiaires sont associés aux structures cytosquelettiques du flagelle. La localisation cellulaire des STATs ajoutée à l'absence d'activité de transcription dans les spermatozoïdes suggèrent fortement que ces protéines jouent un rôle moins classique dans les gamètes mâles matures. L'inhibition de STAT3 lors du processus de capacitation produit une baisse de la motilité et une altération de la fonction mitochondriale. Les résultats de cette étude sont en accord avec un rôle de STAT3 dans des activités indépendantes de son activité de facteur de transcription et reliées à la survie des spermatozoïdes lors des événements précédents la fécondation. Enfin, j'ai tenté d'explorer l'implication de STAT3 dans la voie dépendante de l'AMPc. Cette dernière étude suggère qu'une voie de signalisation commune mène à l'activation de la protéine kinase dépendante de l'AMPc et a permis d'identifier un nouveau substrat potentiel de cette enzyme dans les spermatozoïdes, soit la triosephosphate isomérase.

La polykystose rénale et le cancer colorectal sont caractérisés par la perte de la polarité apico-basale des cellules épithéliales. La polarité épithéliale est régulée, entre autres, par un complexe protéique articulé autour de la protéine CRB3. Cette dernière est également essentielle pour la ciliogenèse et la croissance du domaine apical. La taille du domaine apical définie les dimensions des tubules épithéliaux qui constituent l’unité fonctionnelle des reins. La dimension des tubules épithéliaux définit la mécanique des fluides corporels. Finalement, CRB3 réprime des voies de signalisation soutenant la croissance tumorale. Ce travail visait à définir le rôle de CRB3 dans la morphogenèse des tubules rénaux, étant donné que le contrôle de la taille du domaine apical, la formation du cil et la répression de la voie Hippo sont des fonctions essentielles de CRB3, et que leurs altérations mènent à des pathologies rénales. D’un autre coté, CRB3 agit comme suppresseur de tumeurs chez la souris et que CRB3 réprime la prolifération de lignées épithéliales cancéreuses humaines, nous pensons que CRB3 soit un suppresseur de tumeurs chez l’humain. Afin de valider ces hypothèses, nous avons généré des souris surexprimant CRB3 ou exprimant une forme tronquée de CRB3 dans les reins pour répondre au premier objectif. En ce qui concerne le deuxième objectif, nous avons analysé l’expression de CRB3 par immunohistochimie dans des échantillons de cancer du côlon. La surexpression de CRB3 résulte en une accumulation lipidique dans les cellules proximales du rein. Cette fonction n’est pas spécifique aux cellules rénales, puisque une surabondance de CRB3 provoque un phénotype similaire dans des cellules épithéliales de différentes origines en culture. L’expression de la forme tronquée amène une diminution du nombre de cils. Finalement, la perte de CRB3 est tardive dans le processus tumoral et coïncide avec la transition épithélio-mésenchymateuse. En conclusion, ce travail montre un nouveau rôle de CRB3 dans le métabolisme lipidique. De plus, nos travaux montrent que la perte de CRB3 corrèle avec un phénotype agressif dans le cancer du côlon.

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval comme exigence partielle du programme de maîtrise en médecine expérimentale-génétique des populations humaines offerts à l'Université du Québec à Chicoutimi en vertu d'un protocole d'entente avec l'Université Laval pour l'obtention du grade ès sciences (M.Sc.)" / L’asthme est une affection respiratoire chronique caractérisée par des processus inflammatoires. Ceux-ci sont provoqués par l’interaction de différentes cellules effectrices avec la muqueuse bronchique, ce qui engendre un remodelage des tissus. Le macrophage, étant donné sont implication dans l’autorégulation du processus inflammatoire dans l’asthme, s’est avéré une cible intéressante pour mieux comprendre les bases moléculaires de ce trait. Dans un premier temps, la technologie des puces d’ADN a été utilisée lors de ce projet de recherche pour identifier des biomarqueurs relatifs au rôle du macrophage alvéolaire dans l’asthme, dans le but de mieux documenter le phénotype de cette cellule dans le contexte de l’asthme allergique. D’ailleurs, une famille de gène ayant une implication probable dans la pathologie de l’asthme, les HSP, plus précisément le HSP60, a pu être mis en évidence. Dans un deuxième temps, le potentiel anti-inflammatoire d’un composé isolé d’origine naturelle, la querciméritrine, a pu être testé en utilisant le macrophage comme modèle cellulaire, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, les recherches ayant pour cible le macrophage ou ses médiateurs pourraient permettre de mieux comprendre sont rôle dans l’asthme et mener au développement de nouvelles thérapies pour le contrôle des maladies inflammatoires.

Le cancer épithélial de l’ovaire (CEO) représente 4% de tous les cancers chez la femme et est la première cause de décès parmi les tumeurs gynécologiques. Dans la plupart part des cas le CEO est diagnostiqué dans les stades avancés de la maladie. Le traitement repose sur la chirurgie cytoréductive suivie de la chimiothérapie combinant les dérivés de platine et de taxanes avec un taux de réponse de plus de 80%, cependant, la plupart part des patientes font une récidive par l’émergence de la résistance. Les bases moléculaires du déclenchement et de la progression du cancer de l’ovaire sont encore mal connues empêchant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques et de diagnostique. Au cours d’un cancer, l’hyperméthylation des ilots CpG de certains promoteurs géniques conduit souvent à l’inactivation des gènes suppresseurs de tumeur. L’hypométhylation des ilots CpG de certains promoteurs est également impliquée dans la réactivation des proto-oncogènes et des gènes pro-métastatiques. Cependant l’hypométhlation de l’ADN dans le cancer de l’ovaire est très peu étudiée. En utilisant la méthode d’immunoprécipitation de l'ADN méthylée combinée à une analyse sur puce (MeDIP-chip), nous avons trouvé que l’hyperméthylation de l'ADN se produit dans les stades précoces du cancer ovarien, tandis que les stades avancés de la maladie sont liés à l’hypométhylation de l’ADN des oncogènes impliqués dans la progression de la tumeur, l’invasion/métastase et probablement dans la chimiorésistance. Cette approche épigénomique a conduit à l’identification de nouveaux oncogènes hypométhylés dans le CEO. Dans cette étude, RUNX2 est identifié comme un gène hypométhylé dans les cellules post-chimiothérapeutiques et GALNT3 et BCAT1 sont parmi les gènes hypométhylés identifiés particulièrement dans le CEO de type séreux. L’analyse fonctionnelle de ces trois gènes montre qu’ils sont associés à la prolifération (y compris le contrôle du cycle cellulaire pour GALNT3 et BCAT1), de la migration et de l'invasion cellulaire dans le CEO séreux, suggérant qu’ils ont un fort potentiel oncogène dans la progression de la tumeur et pourraient être des nouvelles cibles thérapeutiques au niveau du CEO. / Epithelial ovarian cancer (EOC) accounts for 4% of all cancers in women and is the leading cause of death from gynecologic malignancies. Most of EOC cases are diagnosed at advanced stage, which is associated with poor outcome. Despite the good initial response to chemotherapy, recurrence occurs in the majority of patients, resulting in chemotherapy resistance leading to a fatal disease. The molecular basis of EOC initiation and progression is still poorly understood, thus hindering the development of new diagnostic and therapeutic strategies for more effective EOC treatment. In cancer, the hypermethylation of gene promoter CpG islands leads to inactivation of tumor suppressor genes, and CpG islands hypomethylation is associated with proto-oncogenes and pro-metastasis genes. Similar to all malignancies, aberrant DNA methylation occurs in EOC. However, DNA hypomethylation in ovarian cancer is very briefly studied. Using methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) coupled to CpG island tiling arrays, we found that DNA hypermethylation occurred in less invasive/early stages of ovarian tumorigenesis, while advanced disease was associated with DNA hypomethylation of a number of oncogenes, implicated in cancer progression, invasion/metastasis and probably chemoresistance. This epigenomic approach has led to the identification of a number of novel oncogenes hypomethylated in EOC. In this thesis study, RUNX2 gene was identified as hypomethyleted gene in post-chemotherapy primary cells cultures and GALNT3 gene and BCAT1 gene were among the genes identified to be notably hypomethylated in serous EOC tumors. Subsequent functional analyses of these three genes demonstrated that they were associated with EOC cell proliferation (including cell cycle control for GALNT3 and BCAT1), migration and invasion, suggesting that they have strong oncogenic potential in serous EOC progression and that they might be novel EOC therapeutic targets.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Pendant l'évolution des métazoaires, les mécanismes moléculaires qui contrôlent le remodelage de la morphologie des mitochondries sont changés. Ceci a permis le recrutement de cette organelle dans le développement, la signalisation du calcium, et l'apoptose. Une protéine centrale au remodelage des mitochondries est la protéase rhomboïde PARL (presenilin-associated rhomboid-like), mais ces mécanismes de régulation sont toujours inconnus. Dans cette étude, nous démontrons que la phosphorylation et le clivage d'un domaine N-terminal de PARL règlent la morphologie des mitochondries. Dans ce clivage, le domaine C-terminal de PARL joue un rôle structural essentiel. Nos résultats démontrent que la phosphorylation et le clivage de PARL ont un impact sur la dynamique des mitochondries, ce qui nous fournit un modèle pour étudier l'évolution moléculaire de la morphologie des mitochondries. / Remodeling of mitochondria is a dynamic process coordinated by fusion and fission of the inner and outer membranes of the organelle, mediated by a set of conserved proteins. In metazoans, the molecular mechanism behind mitochondrial morphology has been recruited to govern novel functions, such as development, calcium signalling, and apoptosis, which suggests that novel mechanisms should exist to regulate the conserved membrane fusion/fission machinery. Here we show that phosphorylation and cleavage of the vertebrate-specific Pbeta domain of the mammalian presenilin-associated rhomboidlike (PARL) protease can influence mitochondrial morphology. Phosphorylation of three residues embedded in this domain, Ser-65, Thr-69, and Ser-70, impairs a cleavage at position Ser(77)-Ala(78) that is required to initiate PARL-induced mitochondrial fragmentation. Our findings reveal that PARL phosphorylation and cleavage impact mitochondrial dynamics, providing a blueprint to study the molecular evolution of mitochondrial morphology.

La protéine BACE (?-site APP Cleaving Enzyme) joue un rôle clé dans la production du peptide amyloïde ? (A?) à l'origine de l'établissement de la maladie d'Alzheimer. À cause de son rôle central dans la maladie, BACE représente une cible potentielle dans le développement de thérapies. Récemment, un premier rôle physiologique pour BACE a été identifié, remettant en doute les approches thérapeutiques visant son inhibition. Des stratégies alternatives ciblant des modulateurs de l'activité de BACE pourraient représenter une approche plus sécuritaire pour traiter la maladie. Dans cette étude, nous avons tenté de développer un essai pour cribler des modulateurs de l'activité de BACE en utilisant deux systèmes différents : le système raporteur luciférase et un système basé sur le Bioluminescence Resonance Energy Transfert 2 (BRET2). Malgré les nombreuses optimisations réalisées, nous n'avons pas réussi à mettre au point un essai efficace permettant de cribler des modulateurs de l'activité de BACE.