Le gène GALIG produit deux protéines, la Mitogaligine et la Cytogaligine. Son expression conduit à la mort cellulaire par un processus encore mal défini. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés principalement à la Cytogaligine et avons précisé qu’elle est localisée dans le cytoplasme et le noyau mais également dans la mitochondrie au niveau de la membrane interne. Un test de complémentation montre que la Cytogaligine interagit avec la Mitogaligine. Cette interaction pourrait être un facteur important dans la mise en place de la voie d’apoptose médiée par l’expression de GALIG. D‘autres protéines interagissant avec la Cytogaligine ont été identifiées, notamment l’α-Synucléine, protéine centrale dans la maladie de Parkinson (MP), qui est connue pour s’agréger dans les cellules et induire la fragmentation des mitochondries. Dans la mesure où la surexpression de l’α-Synucléine conduit à des défauts de l’autophagie et du système Ubiquitine-protéasome dans la MP, nous avons recherché d’éventuels partenaires de la Cytogaligine associés à ces fonctions. De fait, la Cytogaligine interagit, en autre, avec les protéines de l’autophagie LC3B, GABARAP, p62/SQSTM1, la protéine chaperon Hsc70 ainsi que les protéines du système UPS, HUWE1 et UBQLN4. Ces résultats ouvrent de nouvelles pistes sur les conséquences fonctionnelles de l’expression de la Cytogaligine. Dans une deuxième partie, nous avons réalisé une étude clinique visant à évaluer le profil d’expression des gènes précédemment étudiés dans les cellules mononuclées du sang périphérique de patients atteints de la MP. Si l’expression du gène GALIG ne présente pas de variations entre les patients et les contrôles, une dérégulation de l’expression de différents gènes associés au processus de l’autophagie est mise en évidence. Parmi ces données, celles combinant l’expression du couple de gènes LC3B et GAPDH pourraient représenter un marqueur potentiel de la maladie dans le cadre d’un test diagnostic non invasif. / The GALIG gene produces two proteins, Mitogaligin and Cytogaligin. GALIG expression induces cell death by a still poorly defined process. In this context, we focused mainly on Cytogaligin and specified that it is localized in cytoplasm and nucleus but also in mitochondria close to the inner membrane. A functional complementation test showed that Cytogaligin interacted with Mitogaligin. This interaction could be an important factor in the establishment of the apoptosis pathway mediated by GALIG expression. Other proteins interacting with Cytogaligin have been identified, including α-Synuclein, a central protein in Parkinson's disease (PD), which is known to aggregate in cells and induce fragmentation of mitochondria. Since overexpression of α-synuclein leads to autophagy and Ubiquitin-proteasome system disruptions, we have looked for potential Cytogaligin partners associated with these functions. Cytogaligin interacted with the autophagy proteins LC3B, GABARAP, p62/SQSTM1, the chaperone protein Hsc70 as well as the UPS system proteins HUWE1 and UBQLN4. These results open perspectives regarding the functional consequences of the expression of Cytogaligin. In a second part, we carried out a clinical study aimed at evaluating the expression profile of the previously studied genes in the peripheral blood mononuclear cells of PD patients. If the expression of the GALIG gene does not show variations between PD patients and controls, deregulation of the expression of genes associated with autophagy was highlighted. Among these data, those combining the expression of the two genes LC3B and GAPDH could represent a potential marker of the disease as a non-invasive diagnostic test.

L'utilisation de nanoparticules (NPs) comme vecteur de médicaments est actuellement en plein développement de vectoriser des principes actifs dans l'organisme pour en diminuer les effets secondaires. Cependant peu d'études portent sur l'activité biologique de ces NPs et plus particulièrement sur leur toxicité intrinsèque. Récemment, une formulation orale d'Héparine de Bas Poids Moléculaire à base de NPs composées d'un mélange de deux polymères, polycaprolactone et Eudragit® RS, a été développée au sein de l'EA3452. Nous avons entrepris d'étudier la cytotoxicité de ces NPs vides ainsi que celles chargées avec le médicament par deux méthodes d'encapsulation : la nanopréciptation et la double émulsion. La toxicité observée des NP vides a été étudiée. Elles sont toxiques pour la lignée de macrophages de rat NR8383 d'une manière dose- et temps-dépendante. La microscopie électronique a montré que les NPs pénétraient dans la cellule, de façon unitaire, par endocytose et gagnent les mitochondries déclenchant un phénomène de mitophagie alors qu'aucune image évoquant une apoptose n'a été observée. Ceci est confirmé par l'étude des voies métaboliques par « microchip arrays » et RT-PCR quantitative. Les voies métaboliques conduisant à l'autophagie sont activées (en particulier le gène atg1611) sans que l'apoptose soit mise en jeu. La désorganisation des structures mitochondriales est associée à une répression de l'expression du gène opa1. Ces résultats obtenus doivent être confirmé sur des macrophages humains. Cependant ils tendent à montrer que les NPs seules ont des effets biologiques qui doivent être pris en compte avant toute utilisation chez l'homme / Nanoparticles (NPS) are more and more used in medicine, in imaging and as vector for drugs. In this case, NPs are used to lessen the toxicity of the active product. However, a possible toxicity of these carriers is seldom taken into account. In the EA3452, low molecular weight heparin (LMWH)-based NPs have been devised a mix of two polymers, polycaprolactone (PCL) and Eudragit® RS (ERS). Preliminary works has shown that these NPs preparations, obtained by either nanopreciptation or double emulsion, are cytotoxic per se. on a rat macrophage cell line, NR8383 in a dose-dependent (15 - 40 µg/mL) and time-dependent (4 - 24 h) manner which was further investigated. Electron microscopy has shown that NPs enter the cell unitarily by endocytosis. They enter the mitochondria inducing a phenomenon of mitophagy but no pictures evocating apoptosis were observed. Then, we have investigated the metabolic pathways using microchip array and quantitative RT-PCR. The pathways conducting to autophagy are activated (e.g. gene atg1611) while there is no activation of the pathways conducing to apoptosis. The alteration of the morphology of the mitochondria was associated to an underexpression of opa1. Although these results were obtained with animal cell line, and should be confirmed with human macrophages, they show that NPs have biological effects that have to be evaluated before their use in human

Le travail de cette thèse s’est articulé autour de l’étude de CRMP5 au cours du développement du système nerveux central. Nous avons mis en évidence une interaction directe entre CRMP5 et la tubuline, conduisant à une inhibition de la pousse neuritique dans différentes lignées cellulaires, ainsi qu’à une inhibition d’élongation uniquement au niveau des dendrites et non de l’axone, dans des cultures primaires de neurones de l’hippocampe. De plus, nous avons montré que CRMP5 pouvait annuler l’action de CRMP2, connue pour promouvoir la pousse neuritique, de façon dominante mais dépendante de la présence sur CRMP5 du site de fixation à la tubuline. Contrairement à CRMP2, l’expression de CRMP5 étant transitoire pendant la différentiation neuronale, elle permettrait de restreindre de façon spatio-temporelle l’effet de CRMP2 sur la pousse neuritique, régulant ainsi la polarité neuronale. D’autre part, nous avons également rapporté la présence de CRMP5 au niveau mitochondrial où elle pourrait jouer un rôle dans le processus d’autophagie des mitochondries. Enfin, nous nous sommes intéressés à l’étude de la CRMP5 exprimée en conditions pathologiques, et nous avons observé une nouvelle localisation nucléaire de la protéine dans certaines cellules cancéreuses. Etant localisée dans plusieurs compartiments subcellulaires et impliquée dans différents mécanismes moléculaires, l’ensemble de ce travail décrit donc la protéine CRMP5 comme une protéine « multi-fonctionnelle ». / The purpose of this work is to focus on the study of CRMP5 during development of the central nervous system. We have demonstrated a direct interaction between CRMP5 and tubulin, leading to inhibition of neurite outgrowth in different cell lines, and inhibition of growth only at dendritic but not axonal level, in hippocampal neurons. Furthermore, we showed that CRMP5 could counteract the previously described CRMP2 effect on neurite outgrowth. The CRMP5 acted as a dominant signal to counteract CRMP2 outgrowth promotion and this function is also dependent on the tubulin-binding capacity of CRMP5.Unlike CRMP2, the CRMP5 expression being transient during neuronal differentiation, it would imply in the spatiotemporal regulation of the CRMP2 effect on neurite outgrowth, thereby regulating neuronal polarity. In another part, we also reported the presence of CRMP5 at mitochondrial level in vivo where it could play a role in mitochondrial autophagic process.Finally, we were interested in the study of CRMP5 expressed in pathological conditions, and we discovered a new nuclear localization of the protein in some cancer cells. Being localizedin several subcellular compartments and involved in different molecular mechanisms, this work describes CRMP5 as a "multi-functional" protein.

Avant d'être libéré dans la fente synaptique, le glutamate est accumulé dans les vésicules présynaptiques par les transporteurs vésiculaires du glutamate (VGLUTs). Il existe 3 types de VGLUTs. VGLUT3 possède une distribution anatomique et des fonctions atypiques. Au sein du système nerveux central, VGLUT3 est exprimé dans des neurones glutamatergiques mais aussi non glutamatergiques, dans lesquels il assure les fonctions de co-transmission ou de synergie vésiculaire. On le retrouve notamment dans certains neurones sérotoninergiques du raphé. Au sein de l'oreille interne, VGLUT3 est l'unique VGLUT décrit dans les cellules ciliées internes (CCI). La sérotonine joue un rôle essentiel dans le contrôle respiratoire néonatal. En étudiant la respiration de souriceaux n'exprimant plus le VGLUT3, nous avons démontré le rôle de VGLUT3 dans l'adaptation au stress hypoxique néonatal. Une mutation de VGLUT3 a été mise en évidence dans une surdité humaine très proche cliniquement de la presbyacousie et appelée DFNA25. En étudiant le phénotype auditif de souris exprimant cette mutation, nous avons prouvé l'implication de cette mutation dans l'atteinte des CCI à l'origine de la surdité DFNA25. L'étude des processus biochimiques mis en jeu nous a permis d'envisager un rôle indirect de VGLUT3 dans l'activation de la mort autophagique, via la protéine Becline 1 et une possible interaction au sein de la voie de la Culline 3. L'ensemble de ce travail nous a permis de mettre en évidence un rôle de VGLUT3 dans l'adaptation aux conditions extrêmes telles que le développement néonatal ou le processus de vieillissement. Il ouvre de nouvelles perspectives sur les diverses fonctions des VGLUTs. / Before its release into synaptic cleft, glutamate is accumulated in presynaptic vesicles by vesicular glutamate transporters (VGLUTs). There are 3 types of VGLUTs. VGLUT3 presents atypical functions and anatomical distribution. In the central nervous system, VGLUT3 is expressed in glutamatergic and non glutamatergic neurons, in which it performs the co-transmission and the vesicular synergy. Particularly, we can observe VGLUT3 in serotoninergic neurons of raphe. In the inner ear, VGLUT3 is the unique VGLUT described in the inner hair cells (IHCs). Serotonin plays a key role in the neonatal respiratory control. By exploring the respiration of VGLUT3 knock out mice pumps, we have demonstrated the role of VGLUT3 in the response to neonatal hypoxic stress. One VGLUT3 mutation has been described in a human deafness clinically very close to presbycusis, the DFNA25 deafness. By studying the auditory phenotype of mice expressing this VGLUT3 mutation, we have proved the implication of this mutation in the IHCs impairment at the origin of DFNA25 deafness. Biochemical analysis have helped us to consider an indirect role of VGLUT3 in the autophagic death. Beclin 1 and a possible interaction between VGLUT3 and the Cullin3 pathways could be implicated. All of our results allowed us to highlight a role of VGLUT3 in the adaptation to extreme conditions like neonatal development or aging process. They open new perspectives on the various functions of VGLUTs.

L'exposition à des nanoparticules manufacturées (NP) peut entraîner des effets sur la santé, notamment au niveau respiratoire, où elles peuvent induire des phénomènes de remodelage pulmonaire. Toutefois, les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces effets et l'influence des caractéristiques physico-chimiques des NP dans ces effets sont encore loin d'être compris. L'objectif de cette thèse était d'évaluer la réponse macrophagique à des NP présentant différentes caractéristiques physico-chimiques (taille/longueur, composition chimique, forme, structure cristalline ou propriétés de surface) en se concentrant particulièrement sur leurs effets sur l'autophagie. Nous avons montré que l'exposition de macrophages murins à des nanotubes de carbone multi-parois (MWCNT) induisait un blocage de l'autophagie tandis que l'exposition à des NP sphériques induisait une autophagie fonctionnelle. Le blocage du flux autophagique par les MWCNT est associé à une accumulation de lysosomes non fonctionnels. Par ailleurs, les MWCNT induisaient une réponse oxydante et pro-inflammatoire plus importante que les particules sphériques qui pourrait être lié à leur blocage de l'autophagie. Ces résultats montrent un rôle prépondérant de la forme des nanomatériaux sur le processus autophagique, et ouvrent de nouvelles voies pour l'interprétation et la compréhension de la toxicité des nanomatériaux / L'exposition à des nanoparticules manufacturées (NP) peut entraîner des effets sur la santé, notamment au niveau respiratoire, où elles peuvent induire des phénomènes de remodelage pulmonaire. Toutefois, les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces effets et l'influence des caractéristiques physico-chimiques des NP dans ces effets sont encore loin d'être compris. L'objectif de cette thèse était d'évaluer la réponse macrophagique à des NP présentant différentes caractéristiques physico-chimiques (taille/longueur, composition chimique, forme, structure cristalline ou propriétés de surface) en se concentrant particulièrement sur leurs effets sur l'autophagie. Nous avons montré que l'exposition de macrophages murins à des nanotubes de carbone multi-parois (MWCNT) induisait un blocage de l'autophagie tandis que l'exposition à des NP sphériques induisait une autophagie fonctionnelle. Le blocage du flux autophagique par les MWCNT est associé à une accumulation de lysosomes non fonctionnels. Par ailleurs, les MWCNT induisaient une réponse oxydante et pro-inflammatoire plus importante que les particules sphériques qui pourrait être lié à leur blocage de l'autophagie. Ces résultats montrent un rôle prépondérant de la forme des nanomatériaux sur le processus autophagique, et ouvrent de nouvelles voies pour l'interprétation et la compréhension de la toxicité des nanomatériaux

Les nanotubes de carbone (CNT) sont des nanomatériaux (1D<100 nm) présentant des propriétés physico-chimiques uniques, qui ont conduit à des applications déjà nombreuses dans l'industrie. Cette utilisation croissante des CNT soulève la question de leur potentielle toxicité. De nombreuses études ont été réalisées sur les effets de ces nanomatériaux, et il a été montré que les CNT pouvaient être toxiques, entraînant du stress oxydant et de l'inflammation d'intensité variable selon leurs caractéristiques physico-chimiques. Parmi ces caractéristiques, la longueur et la chimie de surface semblent jouer un rôle important. Néanmoins, les mécanismes sous-jacents de cette toxicité n'ont pas été complètement identifiés à ce jour. Il a été montré que l'autophagie pouvait moduler la réponse oxydante et inflammatoire, et que les CNT pouvaient être internalisés par endocytose dans la cellule et se retrouver dans les lysosomes, ce qui pourrait relier l'autophagie à la toxicité des CNT. De plus, le devenir des CNT dans les cellules (localisation, et intégrité de leur structure) a été très peu étudié à ce jour, alors que mieux connaître ce devenir pourrait nous donner des informations supplémentaires sur le mécanisme de toxicité des CNT. L'objectif de ce travail était donc 1) d'évaluer le rôle de l'autophagie dans la réponse de macrophages exposés à différents CNT, et 2) d'étudier le devenir des CNT dans ces cellules. Pour cela, il a été synthétisé quatre CNT de différentes longueurs et chimies de surface : des courts (S-), courts fonctionnalisés (SF-), longs (L-) et longs fonctionnalisés (LF-) CNT, qui ont été caractérisés. Des macrophages murins ont été exposés à ces différents CNT, et leurs effets sur l'autophagie ont été analysés, ainsi que leur devenir dans ces cellules. Nous avons montré que tous les CNT entraînaient une accumulation des autophagosomes avec un blocage du flux autophagique et un dysfonctionnement lysosomal. Ce dysfonctionnement lysosomal était dépendent du type de CNT, tous les CNT sauf les SF-CNT entraînant une basification du pH lysosomal. Il a aussi été démontré que tous les CNT sauf les SF-CNT étaient modifiés au contact des cellules. Ces résultats montrent donc que les CNT peuvent interagir avec l'autophagie, et peuvent être modifiés, selon leurs caractéristiques physico-chimiques. Ceci ouvre de nouvelles possibilités quant à l'interprétation et la compréhension de la toxicité des CNT / Carbon nanotubes (CNT) are fibre-shaped nanomaterials (at least 1D<100 nm). They are widely used in various industries because of their unique properties. As a result, an important literature has been published with the aim to evaluate the impact of CNT on health. It is now understood that CNT can be toxic, and, although inflammation and oxidative stress have been proposed as two mechanisms potentially relevant to CNT toxicity, the exact underlying mechanisms remain to be elucidated. It has been demonstrated that autophagy can repress oxidative stress and inflammation, and that CNT can be internalized in the cells by endocytosis, ending up in the lysosomes, which could link autophagy to CNT toxicity. Moreover, little is known about the fate of CNT inside the cells, where they go and if they are modified, although better knowledge about this fate could help us understand CNT toxicity. The aim of this project was therefore 1) to evaluate the role of autophagy in the response of murin macrophages to CNT, and 2) to elucidate the fate of CNT in these cells. Moreover, and because a large contribution of CNT physico-chemical characteristics has been described in their pathogenic response, we choose to synthesized four CNT varying in length and/or in surface properties: short (S-), short functionalized (SF-), long (L-), and long functionalized (LF-) CNT. Here we demonstrated that exposure to all CNT lead to the accumulation of autophagosomes, with the blockage of the autophagic flux and an impairment of lysosomal activity. Interestingly, lysosomal impairment was dependent on the type of CNT, as we observed a basification of lysosomal pH in response to all but SF-CNT. We also showed that all CNT but SF-CNT are modified when in contact with the cells. These results indicate that CNT can interact with the autophagy pathway, and can be modified, depending on their physic-chemical characteristics. This opens new ways in the interpretation and understanding of CNT toxicity

La muqueuse des patients atteints de cancer colorectal (CCR) est anormalement colonisée par des souches d’Escherichia coli porteuses de l’îlot pathogène pks (E. coli/pks+), responsable de la synthèse de la génotoxine colibactine. Les E. coli/pks+ induisent des cassures double brin de l’ADN, l’accumulation d’aberrations chromosomiques ainsi que la sénescence, et favorisent le développement tumoral dans des modèles murins de CCR. L’autophagie est un processus des cellules eucaryotes qui permet la dégradation d’éléments cytoplasmiques par les lysosomes et est activé pour permettre l’adaptation des cellules en réponse à un stress. Un dysfonctionnement de l’autophagie est associé à plusieurs pathologies humaines, notamment les cancers. L’objectif de ce travail de thèse était d’étudier le rôle de l’autophagie dans la défense de l’hôte suite à l’infection par les E. coli/pks+. Nous avons montré une augmentation de l’expression des gènes de l’autophagie dans la muqueuse colique des patients atteints de CCR colonisée par des E. coli/pks+ comparativement à celle colonisée par des E. coli ne portant pas l’îlot pks. L’infection des cellules épithéliales intestinales humaines HCT-116 par des souches d’E. coli isolées de patients atteints de CCR entraîne l’activation de l’autophagie de façon dépendante de la présence de l’îlot pks. Les cellules déficientes pour l’autophagie présentent une augmentation des dommages à l’ADN induits par les E. coli/pks+, associée à un défaut de recrutement au niveau du noyau de la protéine de réparation des dommages à l’ADN, RAD51, ainsi qu’une augmentation de la sénescence et de la prolifération cellulaire induites par ces souches. Dans un modèle murin de CCR, le modèle de souris Apc Min/+ , déficient pour le gène de l’autophagie Atg16l1 spécifiquement dans les cellules épithéliales intestinales, nous avons montré un rôle complexe de l’autophagie dans la carcinogenèse colorectale. En effet, en condition non infectée, chez les souris Apc Min/+ , l’autophagie joue un rôle pro-tumoral. Cependant, suite à l’infection par la souche d’E. coli/pks+, 11G5, les souris déficientes pour l’autophagie présentent une augmentation de la tumorigénèse, accompagnée par une augmentation des dommages à l’ADN, de la prolifération cellulaire et de l’inflammation. Ces résultats suggèrent que l’autophagie est nécessaire pour inhiber les effets pro-tumoraux des souches d’E. coli/pks+ et ainsi limiter la carcinogenèse colorectale induite par ces dernières. De nombreuses perspectives d’études sur les mécanismes sous-jacents impliqués dans la progression tumorale induite par les souches d’E. coli/pks+ feront suite à ce projet. Notamment, l’impact du microenvironnement immunitaire et du microbiote sur la carcinogenèse colorectale seront analysés. Plus largement, cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de l’autophagie dans la défense de l’hôte pour lutter contre les E. coli associés au CCR. À plus long terme, ce travail pourrait également contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur la modulation de l’autophagie chez les patients présentant une colonisation par les souches d’E. coli/pks+. / Several studies have shown a role of intestinal microbiota in CRC etiology, which is the third cause of death by cancer in the world. Especially, colonic mucosa of CRC patient is abnormally colonized with E. coli strains which often carry the pathogenic pks island, leading to the synthesis of a genotoxin called by colibactin. Colibactin-producing E. coli strains induce DNA double strand breaks, chromosomic aberration and senescence in host cells enhancing the cellular proliferation and tumorigenesis in mouse models of CRC. The aim of this study is to investigate the role of autophagy, a key process in cellular homeostasis, in host defense against infection by pks-harboring E. coli (E. coli/pks+). We showed the increased expression of different autophagy-related genes in the mucosa of CRC patients colonized with E. coli/pks+ compared to that of patients colonized with E. coli without the pks island. In vitro and in vivo, we showed that autophagy is activated in intestinal epithelial cells upon infection in order to limit the pro-tumoral effects of E. coli/pks+. In a murine model of CRC, the ApcMin/+ mouse model, deficient for the Atg16l1 autophagy gene specifically in intestinal epithelial cells, we have shown a complex role of autophagy in colorectal carcinogenesis. Indeed, in uninfected conditions, autophagy plays a pro-tumoral role. However, following infection with the E. coli/pks+ 11G5 strain, mice deficient for autophagy exhibit increased tumorigenesis, accompanied by increased DNA damage, cell proliferation, and inflammation. These results suggest that autophagy is necessary to inhibit the pro-tumoral effects of E. coli/pks+ strains and thus limit the colorectal carcinogenesis induced by the latter. Future works using mouse models of CRC are required to study the role of autophagy in colonic tumorigenesis suppression following infection with E. coli/pks+. Different mechanism such as inhibition of cellular proliferation and immune response, modification of the composition of the gut microbiota will be analyzed. Together, those results will highlight the role of autophagy as a host defense mechanism against the pro-tumoral effects of pks-harboring E. coli strains. This work could also open the door to new therapeutic options in the treatment of CRC and therefore have a great impact on public health.

Les données existantes sur le rôle de l’autophagie dans la mort cellulaire radio-induite sont controversées et proviennent d’études pour lesquelles sont utilisées des drogues : l’action se produit donc de manière indirecte. Certains suggèrent que l’induction combinée de l’apoptose et de l’autophagie améliore le traitement par radiations ionisantes. D’autres indiquent que l’induction de l’autophagie favoriserait la radiorésistance des cellules tumorales et que l’utilisation d’inhibiteurs de l’autophagie augmenterait la réponse des tumeurs aux radiations ionisantes. L'autophagie, ou «self-eating», est un processus cellulaire activé par diverses conditions de stress, par lequel les cellules peuvent dégrader les protéines et les organites. Nous avons au cours de cette étude cherché à déterminer le rôle de l'autophagie dans la mort cellulaire radio-induite. Selon nos observations, l'autophagie est nécessaire pour la libération de l'ATP après un traitement par radiothérapie: en effet, le knockdown de gènes essentiels à l'autophagie limite la sécrétion d'ATP. Nous avons également constaté que des cellules déficientes pour l'autophagie traitées par radiothérapie sont incapables d’immuniser des souris contre une injection de cellules vivantes. En outre, les tumeurs déficientes pour l’autophagie répondent moins bien à un traitement par radiations ionisantes dans des souris immunocompétentes et continuent à proliférer, contrairement aux tumeurs “wild-type”. De plus, nous avons montré que les cellules déficientes pour l'autophagie ne sont pas en mesure de recruter des cellules dendritiques dans le lit tumoral. A l'inverse, l'inhibition des enzymes de dégradation de l’ATP extracellulaire accroît les concentrations d'ATP dans les tumeurs déficientes pour l'autophagie, ce qui rétablit le recrutement des cellules immunitaires dans le lit tumoral et restaure la réponse à la radiothérapie des cancers déficients pour l'autophagie. Ainsi, cette étude a montré l'importance de l'autophagie dans la réponse anti-tumorale spécifique, après traitement par radiations ionisantes. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour comprendre la mort cellulaire radio-induite. Il reste cependant à découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents pour développer de nouvelles thérapies ciblées qui amélioreront l’efficacité de la radiothérapie. / Most of the available data on autophagy and tumor response to IR comes from indirect conclusions after concomitant drug-IR exposure. Some authors suggest that concurrent induction of apoptosis and autophagy enhances radiation therapy. Oppositely, others indicate that the induction of autophagy contributes to the radioresistance of tumor cells and suggest that autophagy inhibitors may be employed to increase the sensitivity radioresistant tumors cells to ionizing radiation. Autophagy literally ‘self-eating’ is a cellular process activated in response to various conditions of cellular stress, whereby cells can liberate energy resources via the degradation of proteins and organelles. In this project we aimed to determine the potential role of autophagy in IR –induced cell death. We found that autophagy is required for the release of ATP in response to radiotherapy, as we observed that the knockdown of essential autophagy-related genes abolished its secretion. Furthermore, autophagy deficient tumors growing on immunocompetent mice did not respond to radiotherapy and continued proliferating in contrast to autophagy proficient tumors. We showed that autophagy deficient cells were neither able to recruit DCs into the tumor bed. Conversely, the inhibition of extracellular ATP degrading enzymes increased extracellular ATP concentrations in autophagy deficient tumors, which reestablished the recruitment of immune cells into the tumor bed, and restored radiotherapeutic responses in autophagy-deficient cancers.Altogether, this study showed the importance of autophagy in tumor-specific immune response after radiotherapy. Thus giving new insights into the concept of IR-induced cell death. However, there is still much that is unknown about molecular mechanisms that undergo IR-induced cell death. Understand these molecular mechanisms will help to develop new targeted therapies that will improve the effectiveness of radiotherapy.

Les lymphocytes « Natural Killer » (NK) sont des effecteurs de l’immunité innée, capables de lyser les cellules cancéreuses grâce au relargage de la protéase cytotoxique Granzyme B (GzmB). Récemment, de nouvelles stratégies anti-cancéreuses, basées sur l’utilisation des cellules NK, ont émergé et se sont révélées très prometteuses. Il est maintenant clairement établi que le microenvironnement tumoral hypoxique influence la réponse immunitaire et constitue, de ce fait, un obstacle majeur pour établir des protocoles d’immunothérapies efficaces. Des études récentes ont montré que l’autophagie est un régulateur important de l’immunité innée dans le microenvironnement tumoral, mais les mécanismes de régulation impliqués restent encore peu connus. Nous avons montré in vitro que l'hypoxie diminue la sensibilité des cellules de carcinome mammaire à la lyse dépendante des cellules NK par un mécanisme impliquant l'activation de l'autophagie. De manière intéressante, cette diminution de lyse est reversée par l’inhibition de l’autophagie. Nous avons démontré que la résistance des cellules tumorales hypoxiques à la lyse par les cellules NK n'est liée ni à un défaut de reconnaissance des cellules cibles, ni à une altération de l’activité cytotoxique des effecteurs. Nous avons mis en évidence que l'activation de l’autophagie conduit à la dégradation de GzmB dans les lysosomes des cellules hypoxiques. Ainsi, ces cellules deviennent résistantes à l’apoptose, qui est normalement induite par GzmB, transféré par les cellules NK. L’invalidation génétique et pharmacologique de l'autophagie permet de restaurer le niveau intracellulaire de GzmB et réduit la résistance des cellules cibles hypoxiques in vitro. Nos résultats mettent en évidence que l'autophagie est un régulateur primordial de la réponse immunitaire anti-tumorale dépendante des cellules NK. Nous avons validé ce concept in vivo en montrant que l’inhibition de l'autophagie favorise de manière significative la prise en charge de la tumeur par les cellules NK dans des modèles murins de mélanome et de carcinome mammaire. Cette étude contribue à l’avancé des connaissances sur la manière dont l'autophagie, induite par l'hypoxie, affecte la lyse dépendante des cellules NK et ouvre la voie à la formulation de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-tumorales combinant l’utilisation des cellules NK à des inhibiteurs d'autophagie. / Natural killer (NK) cells are effectors of the antitumor immunity, able to kill cancer cells through the release of the cytotoxic protease granzyme B. NK-based therapies have recently emerged as promising anticancer strategies. However, it is well established that hypoxic microenvironment interferes with the function of antitumor immune cells and constitutes a major obstacle for cancer immunotherapies. Recent studies demonstrated that autophagy is an important regulator of innate immune response in this microenvironment, but the mechanism by which autophagy regulates NK cell-mediated antitumor immune responses remains elusive. Here, we demonstrate that hypoxia impairs breast cancer cell susceptibility to NK-mediated lysis in vitro via the activation of autophagy. This impairment was not related to a defect in target cell recognition by NK cells but to the degradation of NK-derived granzyme B in autophagosomes of hypoxic cells. Inhibition of autophagy by targeting beclin1 (BECN1) restored granzyme B levels in hypoxic cells in vitro and induced tumor regression in vivo by facilitating NK-mediated tumor cell killing. Together, our data highlight autophagy as a mechanism underlying the resistance of hypoxic tumor cells to NK-mediated lysis and provides a cutting-edge advance in our understanding of the underlying mechanism. This study might pave the way for the formulation of more effective NK cell-based antitumor therapies.

De nombreuses études ont mis en évidence l’importance du contrôle qualité des protéines, c’est à dire des mécanismes de reconformation (chaperons moléculaires) et de dégradation (autophagie, proteasome) des protéines dans différentes pathologies musculaires telles que la dystrophie musculaire d’Ullrich (UCMD), de Duchenne (DMD) ou d’Emery-Dreifuss (EDMD) ; cependant, à l’heure actuelle, aucune n’a été menée sur l’ensemble de ces mécanismes dans un seul et même modèle et sur des cellules musculaires avant leur différenciation en muscles. Nous nous sommes donc intéressés à la fonctionnalité des mécanismes de Contrôle Qualité des Protéines et à leurs interconnexions dans des myoblastes immortalisés de donneurs sains ou de patients atteints de DMD. Nous avons observé une augmentation de l’agrégation protéique dans les cellules DMD. Ce phénomène s’accompagne d’une dérégulation des mécanismes de séquestration par les chaperons moléculaires, conséquence d’une modulation de l’expression des protéines HSPB5 et HSPB8. Les mécanismes de dégradation sont également dérégulés; en effet, nous avons observé d’une part, une diminution de l’activité enzymatique du protéasome ainsi que des molécules d’adressage des protéines multiubiquitinées au protéasome et d’autre part, une augmentation de l’activité du facteur de transcription NF?B, de l’expression de protéines intervenant dans l’autophagie et des complexes BAG3/HspB8 conduisant à une augmentation du flux autophagique. L’ensemble de ces dérégulations reflète l’existence d’un stress d’agrégation protéique dans les myoblastes issus de patients DMD. Dans ce contexte, la modulation pharmacologique du PQC dans ces cellules pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour la Dystrophie Musculaire de Duchenne / Various studies have highlighted the importance of Protein Quality Control (PQC), including protein refolding (molecular chaperones) and degradation (autophagy, proteasome) mechanisms in inherited muscle disorders such as Ullrich Congenital Muscular Dystrophy (UCMD), Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) or Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy (EDMD); however, to date, no extensive study has been conducted on these mechanisms in a same model, in muscle cells before muscle differentiation. Thus, we were interested in PQC mechanisms functionality and their interconnection in human immortalized myoblasts from healthy donors or patients suffering from DMD. We observed an increase of protein aggregation in DMD cells. This phenomenon is accompanied by a deregulation of sequestration mechanisms by molecular chaperones, reflected by the modulation of HSPB5 and HSPB8 expression. Degradation mechanisms are also deregulated; indeed, we observed on one hand a decrease of proteasome enzymatic activity and multiubiquitinated proteins UPS-adressing molecules and on the other hand, an increase of NF?B transcription factor’s activity, involved in autophagy, and of BAG3/HSPB8 complexes, leading to an increase of the autophagic flux. These PQC defects reflect the existence of a protein aggregation stress in myoblasts coming from DMD patients. In this context, pharmacological modulation of PQC in these cells could represent a new therapeutic strategy for Duchenne Muscular Dystrophy