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Dans le cadre de situations pathologiques, le rein peut être soumis à de multiples agressions toxiques, ischémiques et immunologiques pouvant favoriser la survenue d'une maladie rénale chronique et le développement d'une insuffisance rénale. En réponse à ces stress, les cellules du parenchyme rénal vont activer des processus biologiques adaptatifs permettant le maintien de la viabilité cellulaire et l'homéostasie de l'organe. Ces réponses adaptatives peuvent également activer l'immunité innée et induire le remodelage tissulaire (fibrogenèse et angiogenèse). Cependant, les mécanismes précis de cette régulation sont mal connus. L'objectif de ce travail a été de caractériser les mécanismes de régulation et les conséquences microenvironnementales (inflammation et angiogenèse) de l'activation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) et de l'autophagie, en réponse à des stress ischémiques et immunologiques. Dans un premier travail, nous avons montré que la réponse UPR est impliquée dans la génération d'une réponse inflammatoire induite par un stress métabolique dans des cellules tubulaires rénales. Le stress métabolique, caractérisé par une carence en glucose, induit un stress du RE et active la réponse UPR. Ce stress active le facteur NF-.B et favorise la transcription de cytokines et chimiokines pro-inflammatoires. La voie PERK/eIF2 : - n'est pas nécessaire à l'activation de l'inflammation mais amplifie l'expression des cytokines alors que la voie IRE1 - est impliquée dans la génération de cette réponse inflammatoire. De plus, l'ischémie aigue active le stress du RE et l'inflammation dans les reins de rat. Enfin, à partir de biopsies de déclampage de greffons rénaux, l'expression de GRP78, marqueur du stress du RE, et de NF-.B p65/RelA dans les tubules rénaux, est significativement plus élevée en comparaison avec des biopsies de greffons rénaux stables, à distance de la greffe. Dans un second travail, nous avons montré que la réponse UPR régule l'angiogenèse dans les cellules tubulaires rénales lors d'une carence en glucose. La voie PERK est un régulateur majeur de l'expression des facteurs angiogéniques (VEGFA, bFGF et angiogénine). De plus, l'expression de l'angiogénine est modulée par les voies PERK et IRE1.. Enfin, l'ischémie aigue induite chez le rat, active la réponse UPR parallèlement à l'augmentation de l'expression de VEGFA, bFGF et de l'angiogénine. Dans un troisième travail, nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme par lequel l'interféron. (IFN.) active l'autophagie dans les cellules tubulaires rénales. Nous avons montré que l'IFN. entraine une déplétion en tryptophane, active la voie GCN2, une kinase eIF2., ce qui conduit à l'augmentation du flux autophagique. De plus, la supplémentation entryptophane et l'utilisation d'ARN interférence dirigés contre GCN2 inhibent l'autophagie induite par l'IFN. Enfin, l'autophagie intervient dans la régulation de la sécrétion de cytokines inflammatoires et de facteurs de croissance en réponse à l'IFN.. En conclusion, nous avons caractérisé dans ce travail des mécanismes originaux de régulation d'une réponse inflammatoire et angiogénique par la réponse UPR et l'autophagie en réponse à des stress ischémiques et immunologiques au sein de l'épithélium tubulaire rénal humain.

Le foie est un organe essentiel à la vie chez tous les mammifères. C'est un organe central du métabolisme énergétique et de la détoxification des substances xénobiotiques auxquelles l'individu est exposé. Le foie est la cible d'agressions diverses, telles que les virus, l'alcool, les substances chimiques présentes dans l'alimentation ou l'environnement. Il peut également subir destransformations pathologiques profondes, lors du diabète ou de l'obésité par exemple.La stéatose hépatique, caractérisée par une accumulation de triglycérides sous forme de vésiculesgénérant une réponse inflammatoire, est connue depuis de nombreuses années. Son étude a permisde définir un modèle en deux étapes (" two hits ") indispensables à la genèse d'une stéatohépatite ou NASH. La première est l'accumulation de lipides, la seconde consiste en la genèse d'un stress oxydant et la libération de cytokines. La NASH est une des conséquences pathologiques du syndrome métabolique au cours duquel une résistance des tissus à l'insuline se développe.Récemment, la composition des lipides accumulés dans la NASH a été décrite et montre la présence de cholestérol libre et de différents métabolites des acides gras dont la toxicité est grande mais variable. De façon surprenante, une nouvelle hypothèse tend à émerger quant aux rôles protecteurs de certaines catégories de lipides. En effet, le stockage des triglycérides sous forme de vésicules pourrait être un mécanisme de survie cellulaire (Neuschwander-Tetri, 2010). Il s'agirait principalement d'une tolérance à la mort cellulaire par nécrose ou apoptose. Dans ce contexte,l'activation de l'autophagie serait capitale et la nécrose ne serait plus un mécanisme non contrôlé,mais au contraire un système finement régulé.Des données expérimentales récentes suggèrent l'existence d'un réseau complexe d'interactions moléculaires qui lient, dans la NASH comme dans le cas de la cancérogenèse, le métabolisme énergétique, la réponse inflammatoire systémique et tissulaire et des altérations subcellulaires, telles que les lésions des mitochondries et du réticulum endoplasmique.Nous avons utilisé le cas particulier du préconditionnement ischémique, une technique chirurgicale qui consiste, grâce à de courtes périodes d'occlusion vasculaire avant l'ischémie, à conférer au tissu une protection contre les lésions d'ischémie/reperfusion (I/R), pour étudier les mécanismes de survie mis en place par les hépatocytes stéatosiques au cours d'un stress d'I/R. Dans deux contextes différents, celui d'une ischémie chaude au cours d'une hépatectomie partielle et celui d'une ischémie froide au cours de la transplantation hépatique, nous avons montré que l'autophagie peut jouer un rôle central dans la protection des hépatocytes stéatosiques. Cependant, il est envisageable qu'un dysfonctionnement de l'autophagie pourrait conduire à la genèse d'altérations cellulaires comme une instabilité génomique, caractéristique de la transformation cancéreuse. L'équilibre entre la survie et la mort cellulaire dépend donc de l'intégration de cette signalisation complexe, qui concerne l'état énergétique de la cellule, la réponse aux stress transitoires et l'adaptation aux stress chroniques. Dans ce contexte, l'autophagie semble jouer un rôle central dans l'intégration de la réponse aux stress (Kroemer et al 2010), ce qui pourrait favoriser directement ou indirectement la transformation cancéreuse d'une cellule.L'amélioration de la compréhension des mécanismes impliqués dans la tolérance et la survie des hépatocytes chargés de lipides en réponse à un stress inflammatoire, ischémique ou du réticulum endoplasmique semble donc essentielle. Elle permettrait en effet la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient améliorer la prise en charge des patients, augmenter le nombre de greffons disponibles pour les greffes, et la prévention des risques cancérogènes pour le foie.

Les β2-agonistes sont couramment utilisés pour prévenir et réduire les symptômes de l'asthme et de la bronchoconstriction induite par l'exercice. Mais, pris en quantités supérieures aux doses thérapeutiques, les β2-agonistes ont un effet anabolisant qui a été clairement démontré in vivo. Un certain nombre d'acteurs sont mis en jeu dans la réponse biologique du tissu musculaire aux β2-agonistes. L'un de ces acteurs est la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR, voie d'initiation de la traduction, ayant un rôle majeur dans la synthèse protéique. Dans ce contexte, notre première étude avait pour objectif de déterminer la cinétique des événements moléculaires responsables de l'hypertrophie du muscle squelettique de rat après administration de formotérol pendant 1 jour (J1), 3 jours (J3) et 10 jours (J10). Nous avons montré que l'administration de formotérol induisait une hypertrophie musculaire à J3 et J10 associée à l'activation transitoire de la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR (J1 et J3), et à une diminution de l'expression de l'E3 ubiquitine ligase MAFbx/Atrogin-1 (J3). La voie autophagie lysosome ne semblait pas être affectée. Ainsi, l'ensemble de ces résultats suggère que l'activation de la voie PI3K/Akt/mTOR est associée à la voie ubiquitine-protéasome mais pas à la voie autophagie-lysosome. La régulation transitoire de la voie PI3K/Akt/mTOR suggère que d'autres voies de signalisation sont impliquées dans l'hypertrophie musculaire induite par le formotérol. Le 007-AM, analogue de l'AMPc, a été décrit comme pouvant stimuler la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR via l'activation de la protéine Epac, suggérant que le 007-AM puisse constituer une molécule de substitution à l'utilisation des β2-agonistes. Notre seconde étude avait pour but de déterminer si le 007-AM avait une action anabolisante sur le tissu musculaire, mais également de déterminer si la 007-AM était une molécule stable permettant d'envisager son usage dans un cadre pharmacologique. L'administration de 007-AM pendant 7 jours chez des souris n'engendrait pas d'hypertrophie musculaire. En revanche, in vitro sur cellules C2C12, le 007-AM activait la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR comme en témoignait l'augmentation de la phosphorylation des protéines rpS6 et 4E-BP1. Nos résultats montraient également que le 007-AM était instable dans le plasma alors que son produit de dégradation, le 007 était plus stable. Pris ensembles, ces résultats suggèrent qu'un traitement de 7 jours au 007-AM n'est pas suffisant pour induire une hypertrophie musculaire et que l'absence d'hypertrophie musculaire pourrait provenir de l'instabilité du 007-AM dans le plasma. Toutefois, des études supplémentaires seront nécessaires pour confirmer ces résultats

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L’activation constitutive de la voie NF-κB est une étape cruciale dans le processus de transformation des lymphocytes T par le virus humain T-lymphotrope de type 1 (HTLV-1). La protéine virale Tax y joue un rôle majeur en recrutant la protéine régulatrice IKKγ. De précédents travaux effectués par notre équipe ont montré que l’activation de la voie NF-κB parTax est promue par le recrutement des facteurs celluaires Optineurine (OPTN) et Tax1-binding protein 1 (TAX1BP1), deux protéines récemment décrites comme des membres de la famille de récepteurs autophagiques Sequestosome-Like Receptors (SLR), posant la question des liens fonctionnels entre la signalisation NF-κB et la machinerie autophagique.Notre étude décrit l’interaction de Tax avec le récepteur p62, autre membre de la famille des SLR. L’interaction est directe et indépendante de l’ubiquitination de Tax. Les facteurs Tax, p62 et IKKγ forment des complexes localisés au niveau de membranes autophagiques. Le facteur p62 promeut spécifiquement l’activation de la voie NF-κB médiée par Tax. Étonnamment, la sur-expression de p62 limite la capacité de Tax à activer la voie NF-κB, en induisant la déplétion cytosolique de Tax. Ces résultats indiquent que p62 peut exercer des effets antagonistes sur Tax selon son taux d’expression. Des données préliminaires suggèrent que Tax lie également d’autres membres de la famille des SLR, avec des conséquences variables sur l’activation de la voie NF-κB.Ce travail apporte des connaissances nouvelles concernant les relations entre Tax, la signalisation NF-κB et la machinerie autophagique, suggérant l’utilisation des membranes autophagiques comme plateformes de signalisation virale. / NF-κB constitutive activation is a key step in the HTLV-1-mediated T lymphocytes transformation process. This activation is mainly driven by the viral protein Tax, which recruits the IKKγ regulator factor. Previous work performed in our lab showed that Tax-induced NF-κB activation is promoted by the interaction with several cellular factors such as Optineurin (OPTN) and Tax1-binding protein 1 (TAX1BP1), two members of the Sequestosome-Like Receptors (SLR) family, rising the hypothesis of functional interplay vetween NFκB signaling and the autophagic pathway.Our study demonstrates that Tax interacts with the p62 receptor, which is another SLR member, in a direct, ubiquitin independent manner. Tax and p62 form complexes located at autophagic membranes, together with IKKγ. P62 potentiates the Tax-mediated NF-κB activation. Unexpectedly, p62 over-expression inhibits Tax-mediated NF-κB activation by inducing Tax cytoplasmic depletion. These results show that p62 plays a dual role on Tax in a dose-dependent manner. Preliminary data suggest that Tax is also able to interact with other SLR, with various consequences on activation of the NF-κB pathway.This work contributes to the further caracterization of the complex interplay between Tax, NF-κB signaling and the autophagic pathway, suggesting the use of autophagic membranes as viral signaling platforms.

Staphylococcus aureus est capable d’être internalisé par les cellules eucaryotes, notamment au cours des infections osseuses, puis d’induire la mort de la cellule. Deux principaux mécanismes ont été décrits comme associés à la cytotoxicité de S. aureus : l’échappement phagosomal et le détournement de l’autophagie. Nous avons exploré ces deux mécanismes et le rôle de plusieurs toxines staphylococciques majeures (alpha-toxine (Hla), phenol-soluble modulins (PSM), bêta-toxine (Hlb)) dans la mort cellulaire, grâce à un modèle in vitro d’infection intracellulaire et des mutants isogéniques. L’échappement phagosomal nécessitant l’expression d’Hlb, inactivée par l’insertion d’un phage chez la majorité des souches cliniques, nous avons testé l’hypothèse d’une excision de ce phage induite par le stress intracellulaire. Nous avons montré que la restauration de l’expression d’Hlb par excision du phage existe de manière spontanée mais n’est pas induite par le passage intracellulaire et n’est pas associée à une hausse de la cytotoxicité. Dans un second temps, nous avons exploré la cytotoxicité d’une souche de S. aureus hypervirulente et avons montré qu’elle est associée à un détournement de l’autophagie via l’inhibition de la fusion autophagosome-lysosome, ceci étant associé à l’expressions des PSMa. Au contraire, Hla, les PSMß et la d-toxine ne semblent jouer aucun rôle intracellulaire chez les S. aureus hypervirulents. Enfin, nous avons mis en évidence que, dans un autre fond génétique de S. aureus, associé au pied diabétique, la cytotoxicité est principalement liée à la capacité de multiplication intracellulaire de la souche, modulée par la présence d’un phage / Staphylococcus aureus is able to invade eukaryotic cells, in particular during bone infections, and induce cell death. Two mechanisms have been described as associated with S. aureus cytotoxicity: phagosomal escape and autophagy subversion. We investigated these two mechanisms and the respective roles of several staphylococcal toxins, alpha-toxin (Hla), phenol-soluble modulins (PSMs) and beta-toxin (Hlb), in cell death, using an in vitro intracellular infection model and isogenic mutants of S. aureus. Because Hlb is required for phagosomal escape but this toxin is inactivated by a prophage inserted into the hlb gene in most of clinical isolates of S. aureus, we tested the hypothesis of an excision of this phage induced by intracellular stress. We showed that restoration of Hlb expression due to the excision of hlb-converting phage exists spontaneously but is not induced by intracellular environment and does not increase the cytotoxicity of the strain. In a second part, we explored the cytotoxicity of an hypervirulent strain of S. aureus and demonstrated that it is associated with a subversion of host cell autophagy via an inhibition of autophagosome-lysosome fusion, in a PSMa-dependent manner. Conversely, Hla, PSMß and d-toxin appear to have no intracellular role in the cytotoxicity of hypervirulent S. aureus strains. Finally, we showed that, in another genetic background of S. aureus associated with diabetic foot ulcer, cytotoxicity was linked to the ability of intracellular replication of the strain, which was modulated by the presence of a phage

Le carcinome hépatocellulaire est un grand problème de santé publique et la troisième de mortalité lié au cancer dans le monde. Il a été démontré qu'au sein des tumeurs se trouve un petite population des cellules cancéreuses avec des propriétés de cellules souches cancéreuses. Elles sont responsables de l'initiation des tumeurs ainsi que de la récidive post-traitement et résistance aux thérapies. Peu de choses sont connues par rapport à la biologie de ces cellules mais l'identification des facteurs favorisant leur existence pourrait conduire vers des nouvelles pistes thérapeutiques.Nous avons trouvé que le facteurs de transcription p73 est surexprimé chez les patients dans les tumeurs du carcinome hépatocellulaire sous forme de deux types d'isoformes, les isoformes complets et les isoformes tronqués. Les isoformes complets sont des suppresseurs de tumeurs et corrèlent avec un meilleur taux de survie alors que les isoformes tronqués agissent comme dominants négatifs de ces premiers et favorisent la récidive post-chirurgie.Les résultats in vitro ont montré que les isoformes tronqués de p73 sont surexprimés dans les cellules souches cancéreuses du carcinome hépatocellulaire et favorisent leur emergence / Hepatocellular carcinoma (HCC) is a major public health problem, being the second most lethal cancer with an increasing incidence around the world. The only approved systemic drug is the multikinase inhibitor Sorafenib, which prolongs patients’ survival by only three months. HCC is refractory to known chemotherapeutic drugs and more than 50% of patients relapse after surgical tumor removal. These phenomena are thought to be due to the existence of a population of poorly differentiated cancer cells, largely known as liver cancer stem cells (CSCs). Recent studies revealed that CSCs activate similar pathways as normal stem cells. They are therefore highly resistant to therapies and are thought to be capable of self-renewal and generation of tumor’s heterogeneous cell mass. The understanding of mechanisms proper to liver CSCs should allow the development of innovative drugs with original mechanism of action against liver CSC, likely to improve patients’ outcome. However, the development of new therapies against HCC is penalized by the limited number of experimental models.According to these current challenges in the field of HCC research, my PhD thesis project covers three main axes: Development of novel models of disease (IMODI consortium)The Innovative Models of Disease (IMODI) consortium is mainly dedicated to the development of innovative experimental models for 7 different types of cancer. Our participation to the project concerned 3 main objectives i) development of HCC patient-derived xenografts ii) development of new HCC cell lines and iii) set up a cryoconservation method of primary human hepatocytes (PHHs) in the aim to employ them in humanizing murine livers. 30 patients planned for HCC tumor resection were recruited and their clinicopathological data were collected. Fresh tumor specimens were subcutaneously xenografted in immune-deficient mice and dissociated for in-vitro tumor cell culture. One tumor led to the development of a moderately differentiated HCC PDX model, as confirmed by histological characterization. Several studies showed the importance of PDX models in drug discovery as they recapitulate the drug-sensitivity patterns seen in patients from which they derive but very few models have been described in the literature for HCC. In vitro, primary HCC cells could be maintained in culture for a limited period of time, in average 30 days. No HCC cell lines developed due to cells entering replicative senescence, as previously described

Nos travaux sur 26 gènes de la famille des WDR a permis d’en identifier sept (Atg16l1, Coro1c, Dmxl2, Herc1, Kif21b, Wdr47, Wdr89) associés à des anomalies cérébrales majeures. Cette grande famille de protéines reste pourtant peu explorée quant à ses rôles dans le développement du système nerveux central. Nous avons choisi d’étudier WDR47, dont la fonction est totalement inconnue en dépit d’une très grande similarité structurale avec LIS1, protéine à l’origine de la lissencéphalie. En combinant trois modèles expérimentaux (souris, siRNA et levure), nous avons démontré que Wdr47 est essentiel pour la survie de l’organisme et est impliqué dans la coordination motrice et le maintien de l’homéostasie énergétique avec une origine probablement centrale. Au niveau cellulaire, Wdr47 assure un rôle clé dans la dynamique des microtubules et la stabilisation du cône de croissance au travers d’interaction protéiques avec Reelin et SCG10. En outre, Wdr47 est aussi impliqué dans la prolifération neuronale et la macroautophagie. Ces résultats ont permis d’établir un lien de causalité entre une duplication de 200 kb contenant Wdr47 et des troubles de coordination motrice et une obésité hyperphagique chez un jeune patient. / WD40-repeat (WDR) proteins are one of largest eukaryotic family, however little is known about their role in neurodevelopment. We investigated 26 WDR genes, and found 7 (Atg16l1, Coro1c, Dmxl2, Herc1, Kif21b, Wdr47, Wdr89) with a major impact in brain structure when inactivated in mice. We chose WDR47 for further investigation, as it is a completely unknown protein that shares striking domain similarity with LIS1. Using three independent model systems (mice, siRNA and yeast), we found an essential role of Wdr47 in survival, and key neuronal processes involving microtubule dynamics such as proliferation, autophagy and growth cone stabilization. Next we identified Reelin and superior cervical ganglion 10 (SCG10) as top interacting proteins of WDR47. Interestingly, a 200-kb duplication encompassing WDR47 was linked to poor coordination in one patient, recapitulating mouse behavioural anomalies. Together our data help unravel for the first time a key role of Wdr47 in brain.