Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-25Bitstream added on 2014-06-13T18:41:25Z : No. of bitstreams: 1 cano_vsp_dr_araiq.pdf: 7066563 bytes, checksum: 8a9c3624091ccc481f0a5993a6d2b85a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Em um rastreamento por duplo-híbrido, dois parceiros físicos de eIF5A foram identificados: Dys1 e Lia1 (Ligante de eIF5A). Lia1 foi identificada mais tarde como desoxihipusina hidroxilase. As interações físicas evidenciadas por duplo-híbrido foram confirmadas por copurificação. Mapeamento do sítios de ligação de eIF5A revelou que ambos os domínios N- e C-terminal podem ligar-se a Dys1, enquanto que o domínio Cterminal é suficiente para a ligação com Lia1. Pela primeira vez foi demonstrado in vivo que a estrutura secundária em -hélice, presente na extremidade N-terminal da proteína Dys1, pode modular a atividade da enzima através do impedimento estérico da entrada do substrato eIF5A no sítio ativo. Experimentos de inativação gênica mostraram que, em contraste com eIF5A e Dys1, Lia1 não é essencial para a viabilidade celular. Superexpressão do gene LIA1 não suprime o fenótipo temperatura-sensível de mutantes condicionais de eIF5A. Além disso, os alelos de TIF51A não são sinteticamente letais com a deleção de LIA1. Assim como previamente demonstrado para a enzima humana DOHH, o ferro também é essencial para a atividade hidroxilásica de Lia1. O sítio ativo de Lia1 é compreendido pelos resíduos de aminoácidos H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 e E271. A proteína recombinante é uma mistura de formas ligada e não ligada ao metal, as quais foram separadas por gel nativo ou gel filtração, sugerindo um raio hidrodinâmico maior para a apoenzima. A forma mais alongada adotada por Lia1 na ausência do metal foi confirmada por ensaios de “quenching” da fluorescência do triptofano por acrilamida e SAXS. Além da alteração conformacional e inativação da enzima, a perda do metal levou à maior instabilidade de Lia1 na desnaturação térmica ou química. Os resultados obtidos em conjunto mostram que, além de manter a estabilidade da proteína... / In a two-hybrid screen, two eIF5A binding partners were identified: Dys1 and Lia1 (Ligand of eIF5A). Lia1 was further identified as deoxyhypusine hydroxylase. The two-hybrid interactions were confirmed by GST pulldown. Mapping binding sites for these proteins revealed that both eIF5A domains can bind to Dys1, whereas the C-terminal domain is sufficient to bind Lia1. We demonstrate for the first time in vivo that the N-terminal α-helix of Dys1 can modulate enzyme activity by impairing eIF5A interaction. Gene disruption studies showed that, in contrast to the essential nature of eIF5A and Dys1, Lia1 is not essential for cell viability. Overexpression of LIA1 gene does not suppress temperature-sensitivity of eIF5A mutants. Moreover, these TIF51A alleles are not synthetically lethal with a knockout strain of LIA1. Recently, It was shown that LIA1 encodes the enzyme responsible for the final step of hypusine formation, the metalloenzyme deoxyhypusine hydroxylase. As the hydroxylation step in hypusine synthesis is not required for eIF5A activity, lack of genetic interactions between these two genes is expected. As previously demonstrated for the human enzyme DOHH, iron is also essential for Lia1 hydroxylase activity. Lia1 active site is formed by aminoa cid residues H79, E80, H112, E113, E116, H237, E238, H270 and E271. The recombinat protein is a mixture of iron-bound and iron-free forms, which were separated by native gel or gel filtration, suggesting a bigger hydrodynamic radius for the apoenzyme. The elongated shape adopted by Lia1 in the absence of the metal was confirmed by acrylamide quenching of tryptophan intrinsic fluorescence and SAXS. In addition to the conformational change and enzyme inactivation, loss of iron led to higher instability of Lia1 during thermal or chemical unfolding. Taken together, the results show that, besides the ability of iron to keep the stability of the protein...(Complete abstract click electronic access below)

En Drosophila, el desequilibrio en cuanto al contenido de genes ligados al cromosoma X entre hembras (XX) y machos (XY) es corregido mediante la duplicación de la transcripción del único cromosoma X del macho. Este proceso, llamado compensación de dosis, es mediado por un ensamblaje molecular compuesto por al menos cinco proteínas (MSL1, MSL2, MSL3, MLE y MOF) y dos RNAs largos no codificantes (roX1 y roX2), llamado complejo de compensación de dosis (DCC). La compensación de dosis requiere dos condiciones fundamentales: el reconocimiento específico del cromosoma X por el DCC, y la restricción del proceso a moscas macho. La proteína de unión a RNA Upstream-of-N-Ras (UNR) está implicada en la consecución de ambas condiciones, y aquí hemos estudiado los mecanismos moleculares por los que UNR actúa. Hemos encontrado que, en machos, UNR promueve la compensación de dosis facilitando la asociación de roX2 a MLE, necesaria para una correcta formación del DCC y para su unión al cromosoma X. En hembras, UNR inhibe la compensación de dosis, al menos en parte, promoviendo la unión de SXL al extremo 3’ UTR del mRNA que codifica para msl2, lo que resulta en represión de la traducción de msl2 e inhibición de la formación del DCC. / In Drosophila, the imbalance in X-linked gene content between females (XX) and males (XY) is restored through the 2-fold hypertranscription of the single male X-chromosome. This process, which is called dosage compensation, is mediated by the action of the dosage compensation complex (DCC), a ribonucleoprotein assembly composed of at least five proteins (MSL1, MSL2, MSL3, MLE and MOF) and two long non-coding RNAs (roX1 and roX2). Two features are essential for correct dosage compensation: the specific recognition of the X-chromosome by the DCC and the confinement of the DCC function to the male organism. The RNA binding protein Upstream of N-ras (UNR) is involved in the regulation of these two processes and we have dissected the molecular mechanisms by which this regulation occurs. We have found that, in male flies, UNR promotes dosage compensation by facilitating the association of roX2 with MLE, which is required for correct DCC formation and X-chromosome targeting. In female flies, UNR represses dosage compensation in part by enhancing the binding of SXL to the 3’UTR of msl2 mRNA, thus ensuring tight msl2 translational repression and subsequent inhibition of DCC formation.

Las proantocianidinas ejercen efectos beneficiosos sobre algunos desordenes metabólicos que se consideran factores de riesgo de las enfermedades cardiovasculares. La desregulación del metabolismo lipoproteico juega un papel muy importante en los estados lipídicos alterados. Por lo tanto, los objetivos de esta Tesis fueron: estudiar la contribución del hígado y el intestino en la respuesta hipolipidémica de las proantocianidinas y evaluar los efectos de las proantocianidinas en modelos dislipidémicos nutricionales. Para realizar los experimentos se utilizaron tres modelos experimentales: ratas, ratones y células Caco2. Los resultados obtenidos fueron: que en un test de tolerancia lipídica tanto los quilomicrones como las VLDL contribuyen al efecto hipotrigliceridémico de las proantocianidinas pero su influencia depende del tiempo. Además, las proantocianidinas reprimen la secreción de TG por el hígado in vivo y por el intestino in vitro. ACSL se manifiesta como un gen diana de ellas en las células intestinales. Y finalmente, las proantocianidinas corrigen la dislipidemia pero no contrarrestan la ganancia de peso inducida por la dieta aunque estas tienen un efecto bimodal sobre la retención de energía in vivo. / Proanthocyanidins have been shown to exert advantageous actions on several metabolic disorders that are risk factors of cardiovascular diseases. Lipoprotein metabolism plays an important role in altered lipid states. Therefore, the aims of this Thesis were: To assess the contribution of the liver and the intestine in the hypolipidemic response triggered by proanthocyanidins and to evaluate the short-term effect of an oral intake of proanthocyanidins in dyslipidemic nutritional models. For these purposes, three experimental models have been used: Rats, mice and human Caco2 cells. The obtained results are: In a fat tolerance test, both chylomicrons and VLDL contribute to the hypotriglyceridemic action of proanthocyanidins but their influence depends on time. Moreover, proanthocyanidins repress TG secretion by the liver in vivo and by the intestine in vitro. Furthermore, ACSL manifests as their target gene in intestinal cells. Finally, proanthocyanidins correct dyslipidemia but not the weight gain induced by diet though these have a bimodal effect on energy retention in vivo.

Human color perception is mediated by cone photoreceptor cells which mainly locate on the fovea of the eye. Bright light activates the photosensitive opsin pigments which are embedded in the outer segment membrane discs of cone retinal cells thereby initiating the complex process of photopic vision with a fast response. The cone visual pigments are G-protein coupled receptors which share analogous structure and functional features with rhodopsin, the most thoroughly studied G-protein coupled receptor from rod photoreceptor cells mediating scotopic vision and distributed throughout the retina. These visual pigments modulate spectral tuning of visible light depending on the molecular variance around the protein bound chromophore, 11-cis-retinal, which is a vitamin A derivative acting as an inverse agonist. Various mutations have been clinically identified in the cone opsin genes and associated with visual dysfunction ranging from mild color blindness to severe cone dystrophies. As the crystal structure of the cone pigments is yet to be resolved, identifying key molecular mechanisms that play major roles in optimal functioning of these photoreceptor proteins, should be helpful in providing a deeper understanding of their function and in designing novel therapeutic strategies for congenital retinal cone dysfunction. In order to study such light sensitive, delicate membrane proteins, the human cone opsin genes have been transiently expressed in mammalian cells, regenerated with their natural chromophore and immunopurified in dark conditions. The purified recombinant chromophore-regenerated cone opsins in solution have been characterized in detail by means of biophysical approaches, including spectroscopic, biochemical, and functional analysis, in order to uncover novel properties that help in optimizing the function of these receptors. Site-directed mutagenesis was employed to obtain the clinically identified mutations in cone opsins related to visual disorders and to compare the structure and function of these mutated opsins with the molecular properties of the wild-type cone opsins expressed in the same way. The results of the present study indicate that the cone opsins are less stable in solution and their retinal binding site is more open than rhodopsin. The ligand binding studies using retinal analogs, show that the photoactivated rhodopsin loses its ability to regenerate with its natural chromophore with time but not with an analog, 9-cis-retinal but cone opsin shows regeneration with both retinal analogs under the same experimental conditions. The highly identical red and green cone opsins exhibit different ligand binding modes during regeneration with their natural chromophore, 11-cis-retinal. A secondary retinal uptake, with a slower kinetics, has been also observed with the red and green cone pigments during regeneration with 11-cis-retinal which is altered in the case of blue cone opsin. The role of specific amino acids involved in the regeneration mechanism has also been clarified. Most of the cone opsin mutants studied, associated with visual disorders, fail to regenerate with the ligand due to protein misfolding resulting in aggregation in solution. R330Q green cone opsin mutant show a regeneration ability similar to that of the native pigment but a compromised transducin binding efficiency. Though the N94K deuteranopic mutant apparently aggregates when expressed in mammalian, chromophore binding to opsin would be through an unprotonated Schiff base linkage. Overall, in the present study the molecular properties of cone opsins have been compared among them and with the well-studied rhodopsin. This has led to the proposal of novel molecular mechanisms for cone opsins. The determined structural differences between visual pigments may be linked to their molecular evolution, and the proposal of secondary retinoid binding to visual pigments may function as a regulatory mechanism of dark adaptation. / La percepción del color humano se realiza a través de las células fotorreceptoras de los conos, localizados en la fóvea del ojo. La luz brillante activa los pigmentos fotosensibles que se encuentran en los discos de membrana del segmento externo de estas células iniciando con ello el complejo y rápido proceso de la visión fotópica. Los pigmentos visuales conos son receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que comparten estructura análoga y características funcionales a la rodopsina, el GPCR más estudiado y localizado en las células fotorreceptoras de los bastones y responsable de la visión escotópica . Estos pigmentos visuales modulan la sintonización espectral de la luz visible, dependiendo de las diferencias moleculares alrededor del cromóforo ligado a la proteína, 11-cis-retinal, que es un derivado de la vitamina A y que actúa como un agonista inverso. Varias mutaciones han sido identificadas clínicamente en los genes de las opsinas de los conos asociadas a disfunciones visuales; desde la leve ceguera al color a la grave distrofia de las células fotorreceptoras. Como la estructura cristalina de los pigmentos de los conos está todavía por resolver, identificar mecanismos moleculares que juegan un papel importante en el funcionamiento óptimo de estas proteínas, ayudará a obtener una comprensión más profunda de su función y al diseño de nuevas estrategias terapéuticas para la disfunción congénita de los conos. Con el fin de estudiar estas proteínas de membrana sensibles a la luz y delicadas, se han expresado transitoriamente en células de mamífero, regenerado con su cromóforo natural, inmunopurificado en oscuridad y se han caracterizado por medio de técnicas biofísicas, bioquímicas, y funcionales, a fin de descubrir nuevas propiedades que ayuden a la optimización de su función. Mutagénesis dirigida se ha utilizado para obtener las mutaciones clínicamente identificados en opsinas de conos relacionados con los trastornos visuales y comparar la estructura y la función de estas opsinas mutadas con las propiedades moleculares de opsina de conos cono salvaje. Los resultados del presente estudio indican que las opsinas de los conos son menos estables y su sitio de unión al retinal es más abierta que en la rodopsina. Estudios de unión al ligando utilizando análogos del retinal, muestran que la rodopsina fotoactivada pierde su capacidad de regenerarse con su cromóforo natural con el tiempo, aunque la mantiene con el análogo 9-cis-retinal, comparado con la regeneración de los conos, que pueden hacerlo con ambos análogos de retinal. Las altamente idénticas opsinas de conos rojo y verde muestran modos de unión diferente al ligando durante la regeneración con su cromóforo natural, 11-cis retinal. También se ha observado una captación secundaria de retinal, con una cinética más lenta, con los pigmentos de los conos rojos y verdes durante la regeneración con 11-cis-retinal que se altera en el caso de los conos azules. También se discute el papel de los aminoácidos específicos implicados en el mecanismo de la regeneración. La mayoría de los mutantes estudiados, no logran regenerar con el ligando debido al mal plegamiento proteico. El cono verde R330Q muestra una capacidad de regeneración similar a la del pigmento nativo, pero con una baja eficacia de unión a la proteína G, transducina. Aunque inicialmente el mutante N94K parece agregado cuando se expresa en células de mamífero, el cromóforo que se une a la opsina a través de una base de Schiff no protonada. En general, este estudio compara las propiedades moleculares de las opsinas de conos entre ellos y con la rodopsina, proponiendo nuevos mecanismos moleculares para las opsinas de conos. Las diferencias estructurales entre determinados pigmentos visuales pueden estar relacionados con su evolución molecular, y la propuesta de la unión secundaria de retinal a estos pigmentos visuales puede funcionar como un mecanismo de regulación de la adaptación a la oscuridad.

La malaltia del fetge gras no alcohòlic (MFGNA) inclou un espectre histològic que va des de la esteatosi simple (SS) a l'esteatohepatitis no alcohòlica (EHNA), sent aquesta última freqüentment progressiva. Donat que l'acumulació hepàtica de lípids sembla ser un mecanisme crucial en la patogènesi de la MFGNA, una millor comprensió dels mecanismes subjacents que condueixen a l'acumulació inicial de lipíds hepàtics podria ser de gran interès per controlar la progressió de la malaltia. El sistema endocannabinoide (SE), mitjançant principalment els receptors cannabinoides CB1 i CB2, sembla ser que juga un paper important en la patogènesi de la MFGNA modulant el metabolisme lipídic. Així, la hipòtesi establerta és que, en pacients amb MFGNA, l'expressió de gens i factors de transcripció implicats en la regulació del metabolisme lipídic hepàtic, així com l'expressió dels receptors cannabinoides pot estar alterada; i aquesta alteració podria estar relacionada amb l'aparició de dany hepàtic. En conseqüència, vam evaluar l'expressió hepàtica d'alguns gens clau involucrats en la síntesi de novo d'àcids grassos (AG), captació i transport d’AG, oxidació d’AG, inflamació, així com l’expressió de CB1 i CB2 en una extensa cohort de dones obeses mòrbides amb MFGNA segons la seva histologia hepàtica. La principal troballa ha estat que, en el fetge de dones obeses mòrbides amb SS, els gens clau involucrats en la síntesis de novo d’AG presenten una relació inversa amb el grau histològic d’esteatosi, suggerint que la via lipogènica podria estar disminuïda en etapes avançades d’SS. Respecte al SE, els nostres resultats suggereixen un paper perjudicial de CB1 en la MFGNA, mentre que el rol de CB2 no és del tot aclarit. / La enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) incluye un espectro histológico que va desde la esteatosis simple (SS) a la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), siendo esta última frecuentemente progresiva. Dado que la acumulación hepática de lípidos parece ser un mecanismo crucial en la patogénesis de la EHGNA, una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes que conducen a la acumulación inicial de lípidos hepáticos podría ser de gran interés para controlar la progresión de la enfermedad. El sistema endocannabinoide (SE), mediado principalmente por los receptores cannabinoides CB1 y CB2, parece juegar un papel importante en la patogénesis de la EHGNA modulando el metabolismo lipídico. Así, la hipótesis establecida es que, en pacientes con EHGNA, la expresión de genes y factores de transcripción implicados en la regulación del metabolismo lipídico hepático, así como la expresión de los receptores cannabinoides puede estar alterada; y esta alteración podría estar relacionada con la aparición de daño hepático. En consecuencia, evaluamos la expresión hepática de algunos genes clave involucrados en la síntesis de novo de ácidos grasos (AG), captación, transporte y oxidación de AG, inflamación, así como la expresión de CB1 y CB2 en una extensa cohorte de mujeres obesas mórbidas con EHGNA según su histología hepática. El principal hallazgo fue que, en el hígado de mujeres obesas mórbidas con SS, los genes clave involucrados en la síntesis de novo de AG presentan una relación inversa con el grado histológico de esteatosis, sugiriendo que la via lipogénica podría estar disminuida en estadios avanzados de esteatosis. Respecto al SE, nuestros resultados sugieren un papel perjudicial de CB1 en la EHGNA, mientras que el papel de CB2 no es del todo esclarecido. / Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) encompasses a histological spectrum from simple steatosis (SS) to non-alcoholic steatohepatitis (NASH), with the latter being more frequently progressive. Due to lipid accumulation in the human liver seems to be a crucial mechanism in the NAFLD pathogenesis, an improved understanding of the underlying mechanisms leading to the initial hepatic lipid accumulation could be of great interest for controlling the progression of NAFLD. It has also been reported that the endocannabinoid (EC) system, mediated mainly by CB1 and CB2 cannabinoid receptors, plays an important role in NAFLD pathogenesis by modulating lipid metabolism. We therefore hypothesized that in patients with NAFLD, the expression of genes and transcription factors involved in the regulation of hepatic lipid metabolism, as well as the expression of cannabinoid receptors could be altered; and this alteration may be related to the onset of liver damage. Consequently, we wished to further investigate the fatty acid (FA) metabolism and the EC system by evaluating the hepatic expression of some key genes involved in de novo synthesis FA, FA uptake and transport, FA oxidation, and inflammation; as well as CB1 and CB2 expression in an extensive cohort of morbidly obese (MO) women according to their liver histology. The major finding is that, in liver of MO women with SS, the key genes related to de novo fatty acid synthesis have an inverse relationship with the histological degree of simple steatosis; suggesting that the lipogenic pathway seems to be down-regulated in advanced stages of SS. Regarding the EC system, our results suggest a deleterious role of CB1 in NAFLD, while the role of CB2 is not fully clarified.

Protein-DNA interactions are indispensable players in the daily activities of cells. DNA-binding proteins regulate gene expression and are responsible of DNA replication, packaging, repair and recombination. Among them, transcription factors activate/repress gene transcription by binding to specific genomic sites. Hence, the characterization of transcription factor binding sites turns out to be crucial in order to understand gene regulation. In this context, the development of computational tools is foremost. Here, I show the prediction of redundant transcription factors in yeast using a combination of homology-based tools and protein-protein interactions. The approach was automated and incorporated into ModLink+, an online and user-friendly tool to infer the fold of remote homologs. Moreover, I describe split-statistical potentials for protein-DNA interactions. Finally, I present SHAITAN, a statistical/homology-based approach that can be used to both predict transcription factor binding sites and infer the more likely transcription factors to bind a DNA sequence of interest. / Les interaccions proteïna-ADN són indispensables en l’activitat diària de les cèl•lules. Les proteïnes que participen en aquestes interaccions s’encarreguen de la regulació de l'expressió gènica i són responsables de la replicació, l'empaquetament, la reparació i la recombinació de l’ADN. Entre aquestes proteïnes, els factors de transcripció activen/reprimeixen la transcripció de gens mitjançant la unió a llocs específics dins el genoma. Per tant, la caracterització dels llocs d'unió dels diferents factors de transcripció és crucial per tal d’entendre com funciona la regulació gènica. En aquest context, desenvolupar eines computacionals és importantíssim. En aquesta tesi predict redundància entre factors de transcripció de llevat eines fent servir eines basades en homologia i interaccions proteïna-proteïna. Aquesta aproximació va ser automatitzada i incorporada a ModLink+, una eina accessible des d’internet i fàcil d'usar per a inferir el plegament de proteïnes a partir d’homòlegs remots. D'altra banda, descric potencials estadístics fraccionats per a interaccions proteïna-ADN. Finalment presento SHAITAN, una aproximació basada en homologia i potencials estadistics que pot ser utilitzada per a predir els llocs d'unió de factors de transcripció així com per saber quins factors de transcripció són més probables que s’uneixin a una determinada seqüència d'ADN.

RNA-binding proteins (RBPs) control the fate of a multitude of coding and non-coding transcripts. Formation of ribonucleoprotein (RNP) complexes fine-tunes regulation of post-transcriptional events and influences gene expression. Recently, it has been observed that non-canonical proteins with RNA-binding ability are enriched in structurally disordered and low-complexity regions that are generally involved in functional and dysfunctional associations. Therefore, it is possible that interactions with RNA protect unstructured protein domains from aberrant associations or aggregation. Nevertheless, the mechanisms that prevent protein aggregation and the role of RNA in such processes are not well understood. In this work, I will describe algorithms that I have developed to predict protein solubility and to estimate the ability of proteins and transcripts to interact. I will illustrate applications of computational methods and show how they can be integrated with high throughput approaches. The overarching goal of my work is to provide experimentalists with tools that facilitate the investigation of regulatory mechanisms controlling protein homeostasis. / Las proteínas de unión de ARN son responsables de controlar el destino de una multitud de transcriptos codificantes y no codificantes. De hecho, la formación de complejos de ribonucleoproteínas (RNP) afina la regulación de una serie de eventos post-transcripcionales e influye en la expresión génica. Recientemente, se ha observado que las proteínas con capacidad no canónica de unión al ARN se enriquecen en las regiones estructuralmente desordenadas y de baja complejidad, que son las que participan generalmente en asociaciones funcionales y disfuncionales. Por lo tanto, es posible que interactuar con el ARN pudiera ser una manera de proteger las proteínas no estructuradas de asociaciones aberrantes o de agregación. Sin embargo, los mecanismos que impiden la agregación de proteínas y la función del ARN en tales procesos no están bien descritas. En este trabajo, se describen los me ́todos que he desarrollado para predecir la solubilidad de proteínas y para estimar la capacidad de transcriptos y proteínas de interactuar. De otra parte, voy a ilustrar sus aplicaciones y explicar como los métodos de bajo rendimiento han evolucionado a un mayor rendimiento. El objetivo final es proporcionar instrumentos a los investigadores experimentales que se pueden utilizar para facilitar la investigación de los mecanismos reguladores que controlan la homeostasis molecular.

La composición lipídica de las membranas celulares determina en última instancia sus propiedades biofísicas, afectando así las dinámicas y organización de proteinas transmembrana claves como los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs). El objetivo de esta tesis es avanzar en la comprensión y el alcance de la interacción entre lípidos de membrana y GPCRs. Para ello, hemos utilizado simulaciones de dinámicas moleculares para estudiar la complejidad de las membrana biológicas y su efecto en la organización de las GPCRs. Así, hemos desarrollado on marco computacional para analizar con detalle las simulaciones de bicapas lipídicas y de sistemas proteina-membrana. Además, combinando simulaciones computacionales y experimentos con células vivas, demostramos por primera vez que los lípidos de membrana poliinsaturados pueden modular la organización de las GPCRs. Estos resultados podrían abrir en el futuro nuevas puertas al tratamiento de enfermedades como la esquizofrenia o la enfermedad de Parkinson, donde se ha demostrado que las GPCRs juegan un papel vital. / The lipid composition of cell membranes ultimately determines their biophysical properties, thereby affecting the dynamics and organization of key transmembrane proteins like G protein-couple receptors (GPCRs). The aim of this thesis is to make a step forward towards a better understanding of the nature and extent of the interplay between membrane lipids and GPCRs. We have used molecular dynamics simulations to study the complexity of biological membranes and the effect of the membrane environment on the organization of GPCRs. Thus, we developed a computational framework to comprehensively analyze the properties of lipid bilayers and membrane--protein simulations. In addition, by combining computer simulations and experiments in living cells we demonstrate for the first time that membrane polyunsaturated lipids can modulate the organization of GPCRs. These findings could open new doors to the treatment of several conditions like schizophrenia or Parkinson's disease, where GPCRs have been shown to play an vital role.

En el laboratorio se utiliza como sistema modelo la levadura Schizosaccaromyces pombe para poder estudiar la respuesta a estrés oxidativo. Las dos rutas principales de respuesta a estrés oxidativo son las del factor de transcripción Pap1 y la de la MAP quinasa Sty1. Cuando aplicamos a la célula bajas dosis de H2O2, Pap1 que se encuentra en el citoplasma en estado reducido, sufre un cambio conformacional, se oxida, y activo viaja al núcleo, donde se une a diferentes promotores para activar su transcripción. La caracterización de Pap1 como sensor de H2O2 y como factor de transcripción centran el trabajo de esta tesis. Respecto al mecanismo molecular de activación de Pap1, esta proteína necesita de varias cisteínas que son esenciales para su activación. Así como intentar averiguar qué papel juegan las diferentes proteínas que componen el sistema tiorredoxina en la activación-inactivación de Pap1. Con respecto al estudio de Pap1 como factor de transcripción, se ha visto que la expresión de genes Pap1 dependientes tiene diferentes requerimientos dependiendo de la localización y el estado de oxidación de Pap1, dando lugar a dos grupos de genes; antioxidantes y de resistencia a drogas. Para activar el primer grupo de genes, se necesita a Pap1 reducido y además la actividad conjunta con otra proteína, Prr1. Ambas necesitan de la presencia de la otra para llevar a cabo correctamente su función. Por el contrario, para activar los genes de resistencia a drogas es sólo suficiente con la localización nuclear de Pap1. / In our laboratory we used as a model the fission yeast S. pombe; which has specific sensors for oxidative stress, such as the transcription factor Pap1 (pombe AP-1-like). At the beginning of this project, it was known that the activation of Pap1, which is reduced and in the cytosol before stress, occurs mainly at low hydrogen peroxide (H2O2) concentrations, in a thioredoxin peroxidase (Tpx1)-dependent manner. With this work we have characterized Pap1 as a sensor of H2O2 and as a transcriptor factor. Regarding its role as a sensor of H2O2, we studied the molecular mechanism for its activation, the role of its different cysteine residues, and the participation of Tpx1, Trx1 and Trr1 in the activation and inactivation of Pap1-dependent manner. Secondly, we have studied the Pap1-dependent gene expression program. The expression of some Pap1-induced genes have different requirements regarding Pap1 activity/subcellular localization/oxidation state leading to two subsets of genes: the antioxidant and the drug resistance genes. Oxidized Pap1 forms a heterodimer with the constitutively nuclear transcription factor Prr1 to induce the antioxidant response. The ability of Pap1 to bind and activate drug tolerance promoters is independent on Prr1, whereas its ability to bind to the antioxidant promoters is significantly enhanced upon association with Prr1. Prr1 is recruited to promoters in an oxidized Pap1-dependent manner.

En los últimos años hemos sido testigos de la identificación de múltiples familias de receptores inmunológicos. En este contexto encontramos la recientemente descrita familia IREM/CD300 localizada en la región cromosómica 17q25.1 y restringida en expresión a las células de origen mieloide. El locus humano se compone de dos genes codificantes para receptores con propiedades inhibidoras (IRp60/CD300a y IREM-1/CD300f), dos genes codificantes para receptores con naturaleza activadora (IREM-2/CD300e y IREM-3/CD300b) y dos genes codificantes para receptores con características que no permiten su inclusión en ninguno de los anteriores grupos (CMRF-35/CD300c i IREM-4/CD300d). El presente trabajo describimos la caracterización molecular del receptor IREM-3/CD300b, las vías de señalización intracelular utilizadas por esta molécula y la relación funcional existente entre los diferentes miembros pertenecientes a la familia IREM/CD300. / In the last years, different multigenic families of immune receptors have been identified. In this context, we find the recently described IREM/CD300 family of immune receptors which maps in the 17q25.1 chromosomical region and is restricted in expression to the cells with a myeloid origin. The human locus is composed by two genes encoding for inhibitory receptors (IRp60/CD300a and IREM-1/CD300f), two genes encoding for activating receptors (IREM-2/CD300e and IREM-3/CD300b) and two genes encoding for receptors with features that make its classification uncertain (CMRF-35/CD300c and IREM-4/CD300d). In the present work we describe the molecular characterization of IREM-3/CD300b receptor, the dissection of the intracellular signaling pathways engaged by this molecule and the functional relationship between the different IREM/CD300 family members.