Dans le cadre d'infections ostéo-articulaire (IOA), l'utilisation de matériels étrangers peut, en cas de contamination, aboutir à la formation d'un biofilm associé à un risque plus important d'échec du traitement et de récidive. Les bactéries sous forme de biofilm sont en effet protégées de l'action du système immunitaire et ont une tolérance plus importante aux antibiotiques. A l'heure actuelle, l'activité des antibiotiques est déterminée par la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice), mais cette valeur ne tient pas compte de la forme sessile des bactéries. C'est pourquoi, la société BioFilm Control a développé un nouveau test, l'Antibiofilmogramme®, permettant de déterminer la CMI biofilm (CMIb) reflétant la capacité préventive des antibiotiques sur l'installation des microorganismes en biofilm. L'objectif de ma thèse a été dans un premier temps de participer à la démonstration de la valeur clinique de ce nouveau test dans le cadre des IOA à Staphylococcus aureus. Nous avons pu mettre en place un recueil prospectif et réaliser les premiers essais in vitro. Nos résultats obtenus pour la cloxacillin ont pu par la suite être confirmés sur un modèle in vivo d'infection sur matériel. Dans un second temps, nous avons pu caractériser la capacité de formation de biofilm des souches cliniques en fonction des profils de résistance obtenus en Antibiofilmogramme®. Nous avons pu mettre en évidence des profils différents liés à la clonalité des souches. Enfin, nous avons pu mettre au point une nouvelle méthode de rinçage et de quantification des biofilms pour les modèles en microplaque via l'utilisation de vapeur. Cette approche simple améliore grandement la reproductibilité des résultats et préserve l'intégrité structurelle des biofilms / In the context of Bone and Joint Infections (BJIs), the orthopedic devices are preferential surface for microorganisms to adhere and form biofilm associated with high rates of failures and relapses. Within biofilm, bacteria are protected from the host immune response and are able to survive in the presence of high concentration of antibiotics. The standard Minimal Inhibitory Concentration (MIC) informs on the antibiotic susceptibility of planktonic bacteria, but is not suited for biofilm. The company BioFilm Control developed a new test named Antibiofilmogram® which measures early-stage biofilm growth in presence of antibiotics, and provides a biofilm Minimal Inhibitory Concentration (bMIC). The aim of my PhD research was first to take part in the demonstration of the clinical value of this new test for Staphylococcus aureus BJIs. We established a prospective collection of data and strains and realized the first in vitro assays. Our results for cloxacillin were confirmed in an in vivo model of catheter-associated infection. Second, we characterized the biofilm formation capacity of various clinical isolates based on the Antibiofilmogram® resistance profile. We showed that the biofilm formation capacity is correlated with clonal lineage. Finally, we were able to develop a new method of washing and quantifying biofilms for microplate system using steam. This simple approach preserves the biofilm integrity and lead to highly reproducible data

A biofilm is any group of microorganisms in which cells stick to each other and adhere to a surface by excreting a matrix of extracellular polymeric substances (EPS). The chemoautotrophic nitrifying bacteria hardly form biofilms due to their extremely low growth rate; however, biofilm formation of nitrifying bacteria trends to attach in carrier by extracellular polysaccharides that facilitate mutual adhesion, the forming biofilm is also beneficial in nitrogen removal in biological filter systems, especially in aquaculture water treatment systems. The microbial activity within bio-carrier is a key factor in the performance of biofilm reactor. Selection the nitrifier bacteria that biofilm formation and immobilization on the carrier for application in ammonium polluted water treatment technologies, especially in aquaculture is our research objective. Therefore, in this study, ten and six strains of ammonia oxidizing bacteria (AOB) and nitrite oxidizing bacteria (NOB) respectively were isolated from six different aquaculture water samples collected from Quang Ninh and Soc Trang. Basing on their high nitrification activity and biofilm forming capacity, six bacterial strains have been selected to take photo by scanning electron microscope (SEM) and carry out in 2 – liter tanks with and without carriers. As the results, the system with carriers (30% of total volume) increased nitrogen compounds elimination efficiency from 1.2 times to 2 times in comparison with the system without carrier. Two representatives of ammonia oxidizing bacterial group (B1.1; G2-1.2) were classification based on characteristics and they were classified as Nitrosomonas sp. and Nitrosococcus sp. / Màng sinh học được hình thành từ vi sinh vật nhờ các tế bào tiết ra các chất cao phân tử ngoại bào (EPS) và dính vào nhau đồng thời được gắn lên một bề mặt vật thể lỏng hoặc rắn. Vi khuẩn nitrate hóa tự dưỡng có thể tạo ra màng sinh học nhưng khá khó khăn do tỷ lệ sinh trưởng rất chậm của chúng. Tuy nhiên vi khuẩn nitrate hóa tạo màng sinh học thường có xu thế bám lên giá thể nhờ sự gắn kết của các polisaccarit ngoại bào. Sự hình thành màng sinh học cũng là lợi thế để loại bỏ các hợp chất nitơ trong các hệ thống lọc sinh học, đặc biệt là trong các hệ thống xử lý nước nuôi trồng thủy sản. Hoạt tính vi sinh vật cùng với giá thể sinh học là một yếu tố quan trọng để thực hiện trong các bể phản ứng màng sinh học. Trong nghiên cứu này, mục tiêu của chúng tôi là lựa chọn được các vi khuẩn nitrate hóa có khả năng tạo màng sinh học và cố định chúng lên giá thể để ứng dụng trong các công nghệ xử lý nước bị ô nhiễm ammonia đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản. Kết quả cho thấy, từ sáu mẫu nước nuôi trồng thủy sản khác nhau từ Quảng Ninh và Sóc Trăng, 10 chủng vi khuẩn oxy hóa ammonia (AOB) và 6 chủng vi khuẩn oxy hóa nitrite (NOB) đã được phân lập. Dựa vào hoạt tính nitrate hóa và khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được 6 chủng điển hình đã được lựa chọn để chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét và được ứng dụng trong hai bể sinh học với dung tích 2 lít có chứa và không chứa chất mang (giá thể). Sau 7 ngày, hệ thống sinh học chứa giá thể (chiếm 30% thể tích) có hiệu suất loại bỏ các hợp chất nitơ tăng hơn từ 1,2 đến 2 lần so với bể sinh học không chứa chất mang. Hai đại diện của nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonia (B-1.1 và G2-1.2) đã được phân loại sơ bộ dựa vào một số đặc điểm sinh học và chúng đã được xác định thuộc chi Nitrosomonas và chi Nitrosococcus.

La dissémination du VIH-1 par contacts cellulaires est plus efficace que sa transmission par particules virales libres. Cependant, la nature du matériel infectieux transféré à la jonction reste très mal connue. Nos travaux révèlent que l'infectivité du VIH-1 associée aux lymphocytes T est majoritairement portée à la surface cellulaire dans un biofilm viral. Initialement décrit pour le rétrovirus lymphotrope HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus type-1), le biofilm viral est une colonie extracellulaire de particules virales infectieuses enchâssées dans un cocon de matrice extracellulaire (MEC). Par un panel de techniques de microscopie, nous décrivons la présence de biofilms viraux à la surface de lymphocytes T infectés par le VIH-1 (lignées chroniquement infectées, lymphocytes CD4+ primaires infectés in vitro par des souches de laboratoire et des isolats primaires, lymphocytes de patients). Nous identifions certains éléments de la MEC enrichis dans le biofilm du VIH-1 et démontrons que certains de ces composants, modulés par l'infection, favorisent la transmission du VIH-1. En effet, le biofilm viral joue un rôle clé dans la transmission directe (entre lymphocytes T) et indirecte (trans-infection) du VIH-1. De plus, le biofilm du VIH-1 confère une infectivité accrue aux particules virales, avantage préservé en présence d'antirétroviraux et d'anticorps neutralisants.L'ensemble de notre travail identifie une nouvelle entité infectieuse cruciale pour la dissémination du VIH-1 par contacts cellulaires. Ce nouveau mécanisme de transmission, potentiellement généralisable à d'autres virus, sera désormais à prendre en compte dans l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. / HIV-1 cell-to-cell spread is thousands fold more efficient than cell-free infection; yet the nature of the infectious material transferred at the junction remains poorly documented. We found that HIV-1 T cell-associated infectivity mostly resides at the cell surface in a viral biofilm. Initially described for HTLV-1, a viral biofilm is defined as extracellular viral particles aggregated within a scaffold of extracellular matrix (ECM) components exposed at the surface of infected cells. Using a combination of microscopy techniques, we report the presence of HIV-1 biofilms at the surface of HIV-1 infected T cells (chronically infected T cells lines as well as primary CD4+ T cells infected in vitro with HIV-1 laboratory strains as well as primary isolates). Importantly, we show that CD4+ T cells isolated from HIV-1 patients produce a viral biofilm as well. We partially characterize the composition of HIV-1 biofilm in ECM components and unravel their contribution to HIV-1 transmission. We show that HIV-1 biofilm is transferred both between T cells and during dendritic-cell (DC)-mediated trans-infection and confers viral particles with an increased infectivity as compared to their cell-free counterparts. This increased infectivity is preserved in the presence of antiretroviral treatment and neutralizing antibodies. Our findings hence identify HIV-1 biofilm as a new infectious entity central for the efficiency of HIV-1 cell-to-cell transmission. This new mechanism of intercellular transmission might be shared by other viruses and will require appraisal in the design of future therapeutical strategies.

Les eaux minérales naturelles se distinguent de l’eau potable par leur contenu en sels minéraux et en éléments traces. Leur utilisation à des fins thérapeutiques s’effectue sous contrôle médical dans des établissements thermaux. La gestion des réseaux de distribution ainsi que la qualité microbiologique de l’eau font l’objet de réglementations. Malgré la mise en place de procédures spécifiques, les établissements thermaux sont régulièrement confrontés à des contaminations microbiologiques majoritairement dues à P. aeruginosa. Ce pathogène opportuniste possède d’importantes capacités d’adaptation, de résistance et de persistance dans l’environnement, notamment sous forme de biofilms. L’objectif de ces travaux de thèse est d’apporter des éléments de compréhension sur le comportement de P. aeruginosa dans les réseaux de distribution d’eau minérale naturelle et de valider l’efficacité de produits de traitement. L’influence de la composition minérale de 3 eaux sur les capacités à former du biofilm de 9 souches de P. aeruginosa d’origines diverses a pu être démontrée. Il apparait que les quantités de biofilms produites au bout de 24 h sont moins importantes pour la minéralisation forte. La modulation de la production de facteurs de virulence en fonction de la qualité de l’eau est corrélée à l’action spécifique de certains ions et à la biodisponibilité du fer. En conditions de minéralisation forte il a été montré que les matériaux organiques favorisent la formation de biofilm de P. aeruginosa tandis que les matériaux métalliques ont tendance à la défavoriser. L’efficacité d’une séquence de traitement de postes de soins a pu être validée sur un modèle de biofilm âgé de 24 h et sur tous les matériaux. / Natural mineral waters are distinguished from drinking water bytheir content in minerals and trace elements. Their use for therapeuticpurposes under medical control is performed in spas. Management ofdistribution networks and the microbiological quality of water are subjectto regulations. Despite the establishment of specific procedures, spas areregularly confronted with microbiological contamination mainly due to P.aeruginosa. This opportunistic pathogen has substantial adaptive capacity,resistance and persistence in the environment, under biofilm.The aim of this thesis work is to bring understanding on the P.aeruginosa behaviour in the natural mineral water distribution networksand validate the effectiveness of treatment products.The influence of the mineral composition of 3 waters on biofilmformation capacity of 9 P. aeruginosa strains of various origins could bedemonstrated. It appears that the amount of biofilm produced after 24 hare less important for the strong mineralization. Modulation of theproduction of virulence factors depending on the water quality iscorrelated to the specific action of certain ions and iron bioavailability. Inhigh mineralization conditions it has been shown that organic materialspromote biofilm formation of P. aeruginosa while metallic materials tendto disadvantage it. The efficiency of a treatment sequence of a patient pointof use has been validated on the 24 h biofilm model and on all materials.

Les PLLs sont une famille d’enzyme dont l’activité catalytique est double. L’activité lactonase permet entre autre de détruire les AHLs, molécules médiatrices de la communication chez les bactéries Gram négatives, empêchant ainsi la synchronisation à l’échelle de la population de la sécrétion de facteurs de virulence ou la formation de biofilm. Elles sont non seulement capables d’hydrolyser les molécules possédant un noyau lactone, mais aussi les phosphotriésters par promiscuité de substrat. L’activité phosphotriestérase permet de dégrader les composés organophosphorés (OPs) hautement toxiques, que ce soit les insecticides (Paraoxon) ou les agents neurotoxiques de guerre (Sarin, VX). Les travaux effectués ont consisté à évaluer l’efficacité de la PLL SsoPox, provenant de l’archée extrêmophile Sulfolobus solfataricus, pour empêcher la mise en place de la virulence et du biofilm chez Pseudomonas aeruginosa PAO1. Cette évaluation a été effectuée in vitro et in vivo via un modèle d’infection pulmonaire chez le rat. D’autre part, une étude in vitro a été réalisée sur 73 souches cliniques de P. aeruginosa isolés sur des patients atteints de pied diabétique, en évaluant la quantité de pyocyanine et l’activité protéolytique. Enfin, une phase prospective pour identifier de nouvelles PLLs a permis la caractérisation enzymatique et structurale de 2 nouvelles enzymes, SacPox et VmoLac, contribuant ainsi à affiner la connaissance sur cette famille et leur potentiel d’amélioration par ingénierie protéique. Au final, les PLLs offrent un intérêt biotechnologique majeur et peuvent mener à une valorisation concrète pour la santé humaine mais également pour la bioremédiation des OPs. / Phosphotriesterase-Like Lactonases (PLLs) are a family of enzyme displaying a dual catalytic activity. Lactonase activity allows for, among others, the destruction of Acyl Homoserine Lactones (AHLs). These molecules mediate the communication in Gram negative bacteria, allowing them to synchronize group behavior like virulence factor secretion or biofilm formation. Beside their ability to hydrolyze molecules with a lactones moiety, PLL also show substrate promiscuity for hydrolyzing highly toxic organophosphate compounds (OPs), such as pesticides (i.e. Paraoxon) or Chemical Warfare Nerve Agents (CWNAs) (e.g. Sarin & VX). The work described here consisted in evaluating the efficacy of the PLL SsoPox, originating from the extremophile Archaea Sulfolobus solfataricus, to prevent virulence and biofilm formation on the model strain Pseudomonas aeruginosa PAO1. This evaluation was performed both in vitro and in vivo, by using a rat pulmonary infection model. A study has been performed on a strain collection of 73 clinical strains of P. aeruginosa isolated from diabetic foot, to assess the enzyme effects on pyocyanin secretion and protease activity. Finally, a prospective phase to identify new PLLs allowed for the enzymatic and structural characterization of two new enzymes, SacPox and VmoLac, thus contributing to refine the knowledge about this enzyme family and their engineering potential. In conclusion, PLLs are of prime biotechnological interest and could lead to developments in human health, but also for OPs bioremediation with a non aggressive decontamination solution.

Les interactions allélopathiques sont définies comme la libération par un organisme de composés chimiques inhibant les compétiteurs. Dans les milieux aquatiques, elles sont reconnues comme un facteur de la dynamique des communautés de phytoplancton. Malgré les conditions favorables créées par l'organisation des microorganismes en biofilms, l'allélopathie a été beaucoup moins étudiée dans les communautés de microorganismes phototrophes benthiques. L'objectif de cette thèse était d'étudier des interactions allélopathiques, au travers d'un cas particulier, entre les microorganismes dans les biofilms phototrophes d'eau douce. Ainsi le travail s'est focalisé sur les effets allélopathiques d'une algue verte filamenteuse, Uronema confervicolum Lagerheim, sur des diatomées benthiques. L'hypothèse principale est que, dans certaines conditions, U. confervicolum libère suffisamment de composés allélopathiques pour inhiber significativement le développement des diatomées épiphytes. Cette hypothèse soulève trois questions (i) quels sont les composés allélopathiques, (ii) leur production dépend-elle des conditions environnementales et (iii) quel est l'effet des composés allélopathiques produits sur les diatomées ? Cette interaction a été étudiée au travers de multiples approches. L'activité d'extraits de biomasse algale et de filtrat de culture a été testée sur la croissance, la photosynthèse, l'adhésion et la motilité des diatomées. Les techniques de fractionnement guidé par bioessais et de profilage métabolomique ont été utilisées pour identifier les composés allélopathiques produits. Les effets des facteurs environnementaux (limitations en nutriment, apports de lumière et de gaz) et de la phase de croissance sur la production et la libération de différents composés allélopathiques ont également été étudiés. Une étude approfondie de l'effet sur les diatomées des composés allélopathiques anti-adhésion a été réalisée en combinant le profilage métabolomique, la transcriptomique et la microscopie électronique à balayage. Les extraits d'U. confervicolum ont montré un effet négatif sur la croissance, la photosynthèse, l'adhésion et la motilité des diatomées. Deux acides gras polyinsaturés (acides linoléique et a-linolénique) ont été identifiés comme des composés allélopathiques inhibant la croissance et la photosynthèse des diatomées. L'inhibition de l'adhésion des diatomées est, par contre, causée par d'autres composés allélopathiques non identifiés. L'augmentation de l'intensité lumineuse a accru la production de composés allélopathiques, à l'instar des composés défensifs des plantes. Cependant, aucune des théories classiques sur les défenses chimiques des plantes n'a permis d'expliquer l'ensemble des résultats obtenus sur les questions de régulation. En plus de l'inhibition de l'adhésion, le filtrat d'U. confervicolum inhibe la formation de la matrice constituée de substances polymériques extracellulaires, impacte le métabolisme énergétique et induit une modification globale du transcriptome et du métabolome des diatomées. Une partie des gènes et métabolites les plus fortement impliqués dans la réponse des diatomées à l'inhibition de l'adhésion ont été identifiés. Ce travail a permis de mieux évaluer l'activité allélopathique de l'algue verte filamenteuse U. confervicolum et son impact potentiel sur la structure et le fonctionnement des biofilms phototrophes. D'autres approches seront nécessaires, à l'avenir, pour mieux comprendre le rôle global de l'allélopathie dans des biofilms phototrophes complexes. / Allelopathic interactions are defined as the release, by an organism, of chemicals that inhibit competitors. In aquatic environments, they are recognised as a driver of phytoplankton community dynamics. Despite the favourable conditions created by the organisation of microorganisms in biofilms, allelopathy has been much less studied in benthic phototrophic microorganism communities. The objective of this thesis was to increase our comprehension of allelopathic interactions amongst phototrophic microorganisms in biofilms by analysing several aspects of a specific allelopathic interaction. The model chosen was the allelopathic effect of Uronema confervicolum Lagerheim, a filamentous green alga isolated from river biofilms, on diatoms from the same environment. The main hypothesis was that, at least in specific environmental conditions, U. confervicolum produce and release sufficiently large amounts of allelopathic compounds to inhibit significantly the development of epiphytic diatoms. Three questions arised from this hypothesis: (i) what are the allelopathic compounds implied, (ii) do their production and release depend on environmental factors and (iii) what is the effect of these compounds on epiphytic diatoms? This interaction has been studied using multiple approaches. Activity of algal biomass extracts and culture filtrates have been tested on diatom growth, photosynthesis, adhesion and motility. Bioassay-guided fractionation and metabolomic profiling have been used to identify the allelopathic compounds produced. The effect of environmental factors (nutrient limitation, light and gas supply) and growth phase on the production and release of the different allelopathic compounds have also been studied. In-depth study of the effect of anti-adhesion allelochemicals on diatom by combining metabolomic profiling, transcriptomics and scanning electron microscopy have been carried out. The extracts of U. confervicolum exhibited negative effects on diatoms growth, photosynthesis, adhesion and motility in bioassays. Two polyunsaturated fatty acids (linoleic and a-linolenic acids) have been identified as allelopathic compounds affecting growth and photosynthesis but not adhesion ability of diatoms. The inhibition of diatom adhesion was caused by other allelopathic compounds, unidentified so far. Increasing light intensity enhanced the production of U. confervicolum allelopathic compounds as predicted by plant defence theories, but the regulation of allelopathic activity was not completely explainable by any classic plant defence theory. Finally, beside an inhibition of diatom adhesion U. confervicolum filtrate was also found to inhibit the formation of diatom extracellular polymeric substances matrix, affect energy metabolism and induce global modification of diatom transcriptome and metabolome. Some of the genes and metabolites implied in the response of diatoms to adhesion inhibition have been identified. These results indicate the strong potential of the filamentous green alga U. confervicolum to impact biofilm community by its allelopathic activity. Results on the allelopathic activity of this alga and the effect on diatoms in laboratory experiments provide the basis for further experiments to access the role of allelopathy in complex biofilms. These findings will encourage researchers working on biofilms to consider allelopathy when phototrophic biofilm ecology is studied.

Cette thèse s'intéresse à l'application d'un modèle mathématique unidimensionnel de formation et de croissance de biofilms multi-espèces. Le modèle se compose d'un système d'équations non linéaires aux dérivées partielles hyperboliques, décrivant la croissance d'espèces microbiennes dans le biofilm, et un système d'équations semi-linéaires aux dérivées partielles paraboliques, qui régit la diffusion de substrat de la phase aqueuse vers la matrice du biofilm. L'ensemble conduit à un problème de valeur limite libre, essentiellement hyperbolique. Dans une première étude, l'analyse et la simulation de la phase initiale de croissance du biofilm ont été examinées. Le problème mathématique résultant a été discuté en utilisant la méthode des caractéristiques et le théorème du point fixe a été utilisé pour déterminer l'existence et l'unicité des solutions mathématiques. Un deuxième aspect de la thèse porte sur l'analyse et la prévision de la dynamique des populations microbienne dans plusieurs types biofilms pour le traitement des eaux usées. Le modèle a été appliqué pour simuler la compétition bactérienne et évaluer l'influence de la diffusion du substrat sur la stratification microbienne des biofilms multi-espèces, en incluant les bactéries nitrifiantes, Anammox et bactéries sulfato-réductrices. Dans les deux cas, la méthode des caractéristiques a été utilisée à des fins numériques et l'équation de conservation de masse joue un rôle crucial pour vérifier l'exactitude des simulations. Les résultats des simulations montrent que le modèle est en mesure d'évaluer correctement les effets des conditions limites qui s'exercent sur la concurrence bactérienne. Enfin, ce modèle a été étendu pour inclure le phénomène de colonisation microbienne. Le nouveau modèle est capable de prendre en compte l'invasion de nouvelles espèces en se basant sur un ensemble d'équations non linéaires aux dérivées partielles hyperboliques pour ce qui concerne le processus de croissance. De plus, le processus d'invasion biologique d'espèces nouvelles dans le biofilm a été modélisé par un système d'équations non linéaires aux dérivées partielles paraboliques. Ce modèle d'invasion a été appliqué avec succès pour simuler l'invasion des bactéries hétérotrophes dans les biofilms autotrophes / This dissertation relates to the applications of a one-dimensional mathematical model for multispecies biofilm formation and growth. The model consists of a system of nonlinear hyperbolic partial differential equations, describing the growth of microbial species in biofilms, and a system of semilinear parabolic partial differential equations, which governs substrate diffusion from the surrounding aqueous phase into the biofilm. Overall, this leads to a free boundary value problem, essentially hyperbolic. In a first study, the analysis and simulations of the initial phase of biofilm growth have been addressed. The resulting mathematical problem has been discussed by using the method of characteristics and the fixed-point theorem has been used to obtain existence, uniqueness and properties of solutions. A second aspect of the thesis deals with the analysis and prediction of population dynamics in multispecies biofilms for wastewater treatment. The model has been applied to simulate the bacterial competition and to evaluate the influence of substrate diffusion on microbial stratification for a nitrifying multispecies biofilm including Anammox bacteria and a sulfate-reducing biofilm. In both cases, the method of characteristics has been used for numerical purposes and the mass conservation equation plays a crucial role in checking the accuracy of simulations. The simulation results reveal that the model is able to evaluate properly the effects that boundary conditions exert on bacterial competition. Finally, the biofilm model has been extended to include the colonization phenomenon. The new model is able to take into account the invasion of new species diffusing from bulk liquid to biofilm, still based on a set of nonlinear hyperbolic partial differential equations for what concerns growth process. Indeed, the biological invasion process of new species into the biofilm has been modeled by a system of nonlinear parabolic partial differential equations. The invasion model has been successfully applied to simulate the invasion of heterotrophic bacteria in a constituted autotrophic biofilm and viceversa

Les bactéries dans la nature existent principalement en biofilm, qui est une communauté structurée et adhérente de microbes enveloppés dans des matrices polymériques. Dans le corps humain, la plupart de biofilms sont composés de microorganismes commensaux et le tractus gastro-intestinal est le site le plus fortement colonisé. L’attachement bactérien à la couche de gel de mucus couvrant l’épithélium intestinal est fondamental à l’établissement d’une microflore commensale stable. Cependant, les interactions entre les bactéries et le gel de mucus restent mal décrites. En plus, la complexité et la diversité du microbiote intestinal lui-même est un obstacle pour les analyses de son fonctionnement biologique. Les fonctions du microbiote sont le produit de communautés bactériennes complexes, et des interactions entres les différentes espèces qui les composent. De nouvelles approches sont nécessaires pour étudier la génétique de l’espèce la plus étudiée du microbiote de l’intestin humain, Escherichia coli. Cette thèse est consacrée à l’exploration de la réponse transcriptionnelle d’E. coli à différents facteurs présents dans l’intestin humain à travers la réalisation de 3 objectifs principaux. La première partie de mon travail concerne la conception et l’optimisation d’outils génétiques permettant de détecter E. coli au sein de biofilms multi-espèces tout en mesurant simultanément l’activité d’un gène d’intérêt. L’utilisation du gène codant la protéine fluorescente verte (GFP) et de ses dérivés a permis d’importantes avancées sur le marquage des cellules entières ainsi que le suivi d’activité transcriptionnelle. Par contre, l’utilisation de marqueurs fluorescents rouges s’est révélée décevante. Dans un deuxième temps, grâce aux outils mis au point dans la première partie de mon travail, l’influence de la mucine sur la capacité d’E. coli à former des biofilm a pu être étudiée. J’ai montré que la mucine augmente la formation du biofilm d’E. coli par modulation transcriptionnelle de structures d’adhérences telles que les curli et les pili de type 1. Enfin, l’influence de la culture en biofilms multi-espèces constitués d’E. coli et de bactéries commensales (K. pneumoniae and E. faecalis) sur la croissance de chacun des partenaires a été analysée, en focalisant notre attention sur l’influence possible de structures d’adhérence telles que les curli. Les résultats indiquent que la production de curli en biofilm augmente le développement d’E. coli en co-culture avec K. pneumoniae alors qu’elle favorise l’interaction synergique entre E. coli et E. faecalis. Les implications basées sur ces données ont été examinées. Ce travail contribue à l’amélioration des connaissances sur la réponse d’E. coli à l’environnement intestinal et apporte les fondations pour construire des outils plus puissants pour la poursuite des investigations sur les biofilms multi-espèces. / Bacteria in nature mostly exist in biofilms, which are structured adherent communities encased in polymeric matrices. In the human body, most biofilms are composed of commensal microorganisms with the gastrointestinal tract being the most heavily colonized site. Bacterial attachment to the overlying mucus gel layer of the intestinal epithelium is fundamental to the establishment of a stable commensal microflora. However the interaction of bacteria with the complex mucus gel is poorly described. Moreover, the complexity and diversity of the gut microbiota is itself an obstacle to studying its biology. Microbiota functions are the product of communities of bacteria and interactions between multiple species. New approaches are needed to study this aspect of even the most well-studied member of the human gut microbiota, Escherichia coli. This thesis was devoted to the exploration of the transcriptional response of E. coli facing different elements of human gut following 3 main objectives. First, the initial part of my work was related to the conception and optimization of appropriate genetic tools to both track E. coli within the multispecies context that constitute human gut commensals, and survey the expression of genes of interest. Use of the Green Fluorescent Protein (GFP) genes allowing enhanced fluorescence and shortened half-life has permitted significant progress both in whole cell tagging as well as transcriptional reporting, while the red fluorescent counterparts were disappointing. Second, using the subset of tools that has been validated to be reliable, influence of mucin on the biofilm formation ability of E. coli has subsequently been studied. I have shown that mucin promotes E. coli biofilm formation through transcriptional modulation of surface adhesion structures such as curli and type 1 pili. Third, concurrently, E. coli’s population relationship to commensal bacteria (K. pneumoniae and E. faecalis) was investigated and demonstrated, with the possible influence of surface adhesion structures such as curli as the biological focus. The results suggest that curli production in biofilm increases the fitness of E. coli when co-cultured with K. pneumoniae while promoting synergistic interaction between E. coli and E. faecalis. The implication based on the data is discussed. This work improves the understanding of E. coli response to the gut environment, and provides foundations to build more powerful tools for further investigations.

Les bactéries lactiques (BL), communément employées en industrie agroalimentaire, font à présent l’objet d’études visant à les utiliser pour de nouvelles applications telles que le développement de vaccins vivants ou la délivrance de molécules d’intérêt biothérapeutique chez l’hôte. Dans cette optique, différents systèmes de présentation de protéines à la surface des bactéries à Gram positif ont été développés. L’un d’entre eux est basé sur l’activité d’enzymes, les sortases, liant de façon covalente les protéines à la paroi bactérienne. Nous avons utilisé la BL modèle, Lactococcus lactis, afin d’étudier les sortases, jusqu’alors étudiées essentiellement chez les bactéries pathogènes. La sortase A (SrtA) est responsable de l’ancrage d’au moins cinq protéines à motif LPxTG à la surface. Une seconde sortase, de classe C (SrtC), a été identifiée et caractérisée. Nous avons mis en évidence la capacité de L. lactis à produire des pili à sa surface qui sont polymérisés par SrtC et ancrés à la paroi par SrtA. Ces pili résultent de la polymérisation de la piline majeure YhgE qui peut être surplombée par la piline mineure de coiffe YhgD. La production de pili chez L. lactis entraîne un changement de comportement des cellules résultant à des phénotypes particuliers. Nous avons pu l’associer à l’auto-agrégation des cellules en culture liquide, à la formation de biofilms hétérogènes et aériens, et à l’adhésion à la mucine gastrique de porc. Plus précisément, YhgE a été impliquée dans l’auto-agrégation et les biofilms atypiques, et une troisième piline, dont l’appartenance au pilus n’a pas été démontrée, semble aussi impliquée dans la production de biofilms atypiques. / Lactic acid bacteria (LAB), which are commonly used in food industry, are now being studied for their use in new applications such as biotherapeutic molecule delivery vehicules in human host or as live vaccines. Recently, surface protein delivery systems have been developed in Gram positive bacteria and one of them is based on enzymes, the sortases which covalently bind proteins to the cell wall. We used the LAB model, Lactococcus lactis, in order to study the sortases of these non-pathogenic bacteria. This work has functionally characterized the sortase A (SrtA) responsible for cell wall anchoring of at least five LPxTG proteins. A second sortase, from class C (SrtC), has been identified and characterized. We demonstrated the ability of L. lactis to produce pili on its surface that are polymerized by SrtC and cell wall anchored by SrtA. These pili result from polymerization of the YhgE major pilin and can be topped by the YhgD tip minor pilin. Pili production in L. lactis leads a change in cell behavior resulting in individual phenotypes. We were able to associate it with the self-aggregation of cells in liquid cultures, heterogeneous and aerial biofilm formation and bacterial adhesion onto pig gastric mucin. Specifically, YhgE was involved in both self-aggregation and atypical biofilm formation, while a third pilin, whose pilus membership has not been established, was also involved in the production of atypical biofilms.

Les exopolysaccharides - des polymères de sucres exportés - sont impliqués dans des fonctions essentielles de la physiologie bactérienne. Ce sont en effet des composants majeurs, respectivement, de la paroi bactérienne, des polymères secondaires attachés à cette paroi, des capsules, et de la matrice du biofilm. Bacillus thuringiensis est une bactérie entomopathogène, appartenant au groupe Bacillus cereus, capable de former un biofilm à l’interface air-liquide. Ce biofilm comporte deux structures distinctes: une pellicule flottant sur le milieu de culture et, en périphérie, en continuité avec celle-ci, un anneau adhérent sur les surfaces solides. Pour identifier les exopolysaccharides constitutifs de la matrice du biofilm chez cette bactérie, j'ai recherché, dans le génome séquencé de la souche 407 de B. thuringiensis, les différents loci chromosomiques susceptibles d'être impliqués dans la production de ces exopolymères. Deux loci ont étés identifiés, que nous avons appelé eps1 et eps2. Le locus eps1 avait déjà été décrit comme n'ayant aucun rôle dans la formation des biofilms chez B. cereus et sa fonction était restée inconnue. Nous avons montré que l'exopolysaccharide Eps1, dépendant du locus eps1, forme une capsule en phase stationnaire et en condition d'hypoxie. Cette capsule, qui présente des propriétés adhésives importantes sur des surfaces biotiques et abiotiques, permet l'adhésion du biofilm sur les surfaces solides et est requise pour la formation de l'anneau du biofilm. En accord avec ces résultats, nous avons observé que Eps1 n'est présent que dans l'anneau du biofilm. En revanche, l'exopolysaccharide Eps2 dépendant du locus eps2 est un élément essentiel de la matrice du biofilm et est nécessaire pour la formation de la pellicule. Enfin, à l'aide de marqueurs fluorescents, nous avons montré que deux souches mutantes capables de ne produire, respectivement, que Eps1 ou Eps2, se distribuent de façon hétérogène dans le biofilm lorsqu'elles sont mises en co-culture. En effet, la souche ne produisant que Eps1 est localisée dans l'anneau tandis que la souche ne produisant que Eps2 est localisée dans la pellicule. L'étude de la régulation de la transcription des loci eps1 et eps2 montre que ces deux loci sont régulés de façon identique. Le répresseur SinR, qui contrôle la formation de la composante protéique de la matrice du biofilm chez B. thuringiensis, n'a aucun effet sur la transcription de eps1 et eps2 chez cette bactérie. En revanche, cette transcription est activée par Spo0A et réprimée par AbrB. Enfin, le régulateur CodY réprime l’expression de ces loci en phase exponentielle, mais stimule cette expression en phase stationnaire tardive. Nos résultats montrent également un rétrocontrôle négatif d’Eps2 sur la production d’Eps1, suggérant l'existence d'une bascule ne permettant la production, au niveau d'une cellule isolée, que d'un seul de ces exopolysaccharides. / Exopolysaccharides - polymers of exported sugars - are involved in essential functions of bacterial physiology. Exopolysaccharides are in fact major components, of the bacterial wall, secondary polymers attached to this wall, the capsules, and finally the biofilm’s matrix. Bacillus thuringiensis is an entomopathogenic bacterium of the cereus group, capable of forming a biofilm at the air-liquid interface. This biofilm has two distinct structures: a floating pellicle on the culture medium and, at the periphery, in continuity with the pellicle, a ring adhering to the solid surfaces. To identify the exopolysaccharides, which constitute the biofilm matrix in B. thuringiensis, I investigated the various chromosomal loci in the sequenced genome of B. thuringiensis strain 407. Two loci have been identified and were called eps1 and eps2. To date, no role in the formation of biofilms in B. thuringiensis had been attributed to eps1 locus. Our data showed that the exopolysaccharide Eps1, depending on the eps1 locus, forms a capsule in the stationary phase and in hypoxic conditions. This capsule, which has significant adhesive properties on biotic and abiotic surfaces, allows adhesion of the biofilm to the solid surfaces, thus forming of the biofilm ring. Consistently with these results, we observed that Eps1 is present only in the biofilm ring. We found that Eps2 exopolysaccharide depending on the eps2 locus is an essential element of the biofilm matrix and is necessary for the formation of the pellicle. We have shown using fluorescent markers that two mutant strains capable of producing only type of exopolysaccharides Eps1 or Eps2 are distributed heterogeneously in the biofilm when they are cocultured. The mutant strain producing only Eps1 is localized in the ring while the mutant strain producing only Eps2 is located in the pellicle. Our data show that the transcription of eps1 and eps2 loci is regulated identically by the same set of regulators. The SinR repressor, which controls the formation of the protein component of the biofilm’s matrix in B. thuringiensis, has no effect on the transcription of eps1 and eps2 in this bacterium. The transcription is activated by Spo0A and repressed by AbrB. The CodY regulator represses the expression of these loci in exponential phase, but activates it in the late stationary phase. Our results also show a negative feedback from Eps2 on the production of Eps1, suggesting the existence of a switch, allowing only one of these exopolysaccharides to be produced in an isolated cell.