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Respuesta transcripcional al estrés hídrico en mandarino. Estudio genómico-funcional con micromatrices de cDNA

Gimeno Romeu, Jacinta 07 May 2008 (has links)
La citricultura es una de las ramas de la fruticultura de mayor producción a nivel mundial, siendo España el cuarto productor y primer país exportador mundial de cítricos para consumo en fresco (FAO, 2005). La obtención de nuevas variedades que se adapten a las exigencias de mercado y de cultivo es la clave para continuar siendo competitivos. La reducción de las precipitaciones en muchas zonas agrícolas provoca que el estrés hídrico sea uno de los estreses abióticos que más limita la producción de los cultivos, entre ellos los cítricos. Aunque son numerosos los estudios orientados a conocer mejor la respuesta de la planta ante el estrés hídrico a nivel molecular en especies modelo, son pocos los trabajos realizados en relación a la respuesta al estrés hídrico en cítricos. Este trabajo tiene como objetivo el desarrollo de herramientas que nos permitan conocer mejor la respuesta de los cítricos frente a este estrés que en un futuro puedan utilizarse para conseguir cítricos que sean capaces de aprovechar mejor el agua disponible en condiciones adversas, evitando las importantes pérdidas de cosecha. El análisis global de la respuesta a estrés hídrico en cítricos se ha llevado a cabo a través de un estudio del transcriptoma de los cítricos sometidos a este estrés. Para ello se han utilizado dos abordajes, la generación de ESTs y la hibridación de micromatrices de cDNA, que han permitido identificar genes candidatos a estar implicados en la respuesta a estrés hídrico. La generación de ESTs se ha realizado a partir de la secuenciación de un total de 2296 clones aislados de dos bibliotecas de cDNA sustraido, Drought1 y Drought2, construidas a partir de hojas y raíces de plantas sometidas a estrés hídrico respectivamente. Las ESTs obtenidas han pasado a formar parte de la colección del CFGP (Citrus Functional Genomics Project). Como resultado del estudio de los unigenes resultantes de las bibliotecas construidas con material sometido a estrés hídrico, en relación con el r / Gimeno Romeu, J. (2007). Respuesta transcripcional al estrés hídrico en mandarino. Estudio genómico-funcional con micromatrices de cDNA [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1993 / Palancia
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La tolerancia a litio del mutante cat2 de arabidopsis revela una estrecha relación entre estrés oxidativo y etileno

Bueso Ródenas, Eduardo 23 June 2008 (has links)
Con el fin de investigar los efectos en la homeostasis de iones de un aumento en la concentración celular de peróxido de hidrógeno, se aisló un mutante de inserción de T-DNA en el gen CATALASA 2 de Arabidopsis. El mutante cat2-1 presenta una reducción del 80% de la catalasa de hoja en comparación con genotipos silvestres y acumula más peróxido de hidrógeno en condiciones sin estrés. Además de presentar un tamaño reducido, un color verde más pálido y gran reducción en el número de raíces secundarias, el mutante cat2-1 presenta una marcada sensibilidad a peróxido de hidrógeno, cloruro sódico, norespermidina, alta intensidad lumínica y estrés por frío. Por otra parte, el mutante cat2-1 presenta una tolerancia parcial cuando es crecido en medios con cloruro de litio en comparación con el genotipo silvestre. Este novedoso fenotipo no puede ser explicado por cambios en el transporte de este catión. Realmente, la toma de litio y de otros cationes tóxicos como sodio y norespermidina es mayor en el mutante cat2-1, mientras que los niveles de potasio de la planta son inferiores. La tolerancia a litio de este mutante parece ser resultado de una insensibilidad a la inhibitoria respuesta de etileno producida por el catión y a su reducida capacidad de producción de etileno. De acuerdo con esto, la inducción por etileno de genes de respuesta tales como PR4 y EBP/ERF72 es menor en el mutante cat2-1. Mutantes insensibles a etileno como etr1-1 y ein3-3 son tolerantes a litio y la inhibición de la biosíntesis de etileno con 2-aminoisobutirato protege contra la toxicidad del litio. Análisis de la expresión génica con micromatrices indican que la expresión de genes relacionados al transporte de cationes y a la síntesis y percepción de etileno no están alterados en el mutante cat2-1, lo que nos hace suponer que el peróxido de hidrógeno modula estos procesos a nivel de proteína. Todos estos resultados descubren una estrecha relación entre estrés oxidativo, la homeostasis de cationes y el / Bueso Ródenas, E. (2008). La tolerancia a litio del mutante cat2 de arabidopsis revela una estrecha relación entre estrés oxidativo y etileno [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2341 / Palancia
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Evaluación de riesgos ambientales del uso de plaguicidas empleados en el cultivo del arroz en el Parque Natural de la Albufera de Valencia

Andreu Sánchez, Oscar Enrique 23 June 2008 (has links)
El fallado del arroz, producido por Pyricularia oryzae, es una importante enfermedad de este cereal que, en los años en que se presenta, causa graves pérdidas económicas. Por ello, actualmente, se utilizan sistemáticamente fungicidas para prevenir su posible aparición, tratamientos que en la mayor parte de los casos están injustificados, debido a que no se dan las condiciones necesarias para el desarrollo de este patógeno. Los tratamientos fitosanitarios, conllevan la emisión periódica o puntual de xenobióticos que, como residuos procedentes de estas tareas, llegan a los ecosistemas acuáticos a través de acequias, canales de desagüe e incluso vía aérea, ocasionando con ello importantes efectos sobre la biota. Estas sustancias pueden ser bioacumuladas por diferentes eslabones de las cadenas tróficas y llegar a alcanzar niveles altamente perjudiciales para el ecosistema. Aunque los niveles de la gran mayoría de productos fitosanitarios suelen encontrarse en proporciones suficientemente bajas como para no causar la muerte directa y repentina de los organismos acuáticos, es necesario conocer la capacidad de las especies para resistir y por lo tanto vivir en estos medios periódicamente contaminados y, además, acumular en sus tejidos los tóxicos del mismo (bioconcentración), sobre todo cuando el destinatario final puede ser el hombre. Para establecer el riesgo derivado del uso de plaguicidas es necesario realizar una serie de estudios encaminados a evaluar el riesgo potencial para el medio ambiente (ERA), para dicha evaluación del riesgo se han llevado a cabo los siguientes estudios: 1. Determinar las pautas de evolución de los fungicidas considerados, en sistemas acuáticos, estudiando experimentalmente sus constantes de degradación por hidrólisis, biodegradación por microorganismo y algas. 2. Determinar la toxicidad, efectos subletales y actividad bioacumulativa de los plaguicidas empleados contra Pyricularia oryzae en P.N. de L'Albufera de Valencia en diferentes organ / Andreu Sánchez, OE. (2008). Evaluación de riesgos ambientales del uso de plaguicidas empleados en el cultivo del arroz en el Parque Natural de la Albufera de Valencia [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2342 / Palancia
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Análisis funcional del gen OCP3

Ramirez Garcia, Vicente 19 May 2009 (has links)
El gen OCP3 codifica un factor de transcripción de la familia Homeobox. En trabajos anteriores se ha demostrado que la pérdida de función de este gen en Arabidopsis thaliana causa un notable incremento de la resistencia a infecciones por hongos necrotrofos como Botrytis cinerea o Plectosphaerella cucumerina. Además esa resistencia es dependiente de la correcta señalización mediada por ácido jasmónico (JA), una de las fitohormonas más ampliamente relacionadas con el establecimiento de las respuestas defensivas en plantas junto con el ácido salicílico (SA). A través del balance entre las señalizaciones de estos dos reguladores (JA y SA), la planta es capaz de disparar la respuesta defensiva más apropiada dependiendo del tipo de patógeno que la ataca. Así pues, el estudio de las interrelaciones entre JA y SA y los componentes que transducen las respectivas señales es de gran utilidad para desentramar la compleja red de regulación que compone la respuesta inmune de las plantas. Mediante el estudio de dobles mutantes, se ha demostrado un nuevo papel de OCP3 en la interconexión entre SA y JA en respuesta a Pseudomonas syringae e Hyaloperonospora arabidopsidis, dos patógenos de tipo biotrofo. Además se propone a OCP3 como un nuevo componente de la denominada Resistencia Sistémica Inducida (ISR). Existe cierto grado de solapamiento entre las respuestas de las plantas frente a estreses bióticos y abióticos. La identificación de los componentes comunes a estas dos rutas es de gran valor para conocer cómo las plantas se adaptan ante situaciones de estrés diferentes. Mediante un rastreo por doble híbrido en levadura, se identificaron cuatro proteínas que interaccionan con OCP3. Todas ellas están implicadas en la señalización mediada por ABA, una fitohormona que regula, entre otros procesos, la respuesta frente al estrés hídrico. En el presente trabajo se aportan numerosas evidencias que indican que OCP3 regula el cierre estomático promovido por ABA, y con ello la tolerancia a / Ramirez Garcia, V. (2008). Análisis funcional del gen OCP3 [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4683 / Palancia
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Estudio transcriptómico y metabolómico del desarrollo partenocárpico del fruto de tomate y aplicaciones biotecnológicas

Hueso Estornell, Leandro 20 April 2010 (has links)
El objetivo de la primera parte de la tesis fue el de averiguar qué genes están involucrados en el proceso formación del fruto de tomate mediado por hormonas, para ello se realizó un análisis transcriptómico comparativo del desarrollo temprano tanto de frutos fertilizados, como de ovarios inducidos a fructificar mediante tratamiento hormonal. El análisis de los resultados reveló que los transcriptomas presentan las mayores diferencias en los primeros días tras la inducción, probablemente debido a la mayor rapidez de las auxinas en estimular la fructificación. Posteriormente, los transcriptomas se van acercando gradualmente entre ellos con independencia del estímulo hormonal inductor. El estudio reveló que existen elementos que configuran los programas de desarrollo del fruto tanto en una componente general independiente del agente inductor, como en la componente específica de la hormona. Además, en el caso específico de giberelinas, el estudio transcripcional de frutos silenciados en el gen SlDELLA mostró que este represor controla al menos una parte de la respuesta transcripcional a esta hormona en el fruto. Esta respuesta parece incluir una serie de mecanismos de defensa que se activan en los ovarios alrededor de antesis. Por otra parte, el estudio transcriptómico y metabolómico del pericarpo de los frutos inducidos por tratamiento hormonal en fase de maduración reveló que el efecto del tratamiento hormonal inductor afecta la expresión de genes relacionados con la síntesis de etileno y da lugar a frutos con alteraciones importantes en la expresión de genes del metabolismo de azúcares. Además, y con objeto de ampliar el rango de herramientas disponibles para ingeniería genética en frutos, se aprovechó el análisis de micromatrices para identificar genes de expresión específica en el ovario/fruto y se clonaron sus secuencias promotoras. / Hueso Estornell, L. (2010). Estudio transcriptómico y metabolómico del desarrollo partenocárpico del fruto de tomate y aplicaciones biotecnológicas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/7528 / Palancia
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Estudio de efectos protectores y mecanismos de acción frente a estrés abiótico de bioestimulantes de fertilizantes en Saccharomyces cerevisiae

Caballero Molada, Marcos 11 July 2016 (has links)
[EN] ABSTRACT This PhD thesis is based on a collaboration between Professor Dr. Ramon Serrano's laboratory and the fertilizer company Fertinagro Nutrientes and it's motivated by the increasing need in agriculture to increase crop productivity while minimizing its impact on the environment. Fertinagro Nutrientes supplied the following six bioestimulants for analyzing its effects on tolerance to abiotic stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae, providing no (or very limited in some cases) information about its composition: Seaweed extract, Vinacillas, Phosphite, Humic Acid, Amino22 and Potassium fulvate. The broad conservation of metabolic pathways and the molecular mechanisms involved in abiotic stress response between yeast and plants allows the use of S. cerevisiae as a suitable model system for this study. All bioestimulants showed, to a greater or lesser extent, positive effects on yeast tolerance against at least one of the abiotic stresses in study. Seaweed extract improves growth under salt stress. Phosphite and Vinacillas protect against salt stress and heat shock. Humic acid increases tolerance to oxidative stress and heat shock. The two most versatile bioestimulants, Amino22 and Potassium fulvate, were further investigated in order to identify their mechanisms of action. Amino22, which is the most effective biostimulant, considerably improves growth in the absence of stress and under osmotic stress and, to a lesser extent, it also enhances growth under salt stress conditions. Amino22 also provides tolerance against oxidative stress and heat shock. By comparison with an acid casein peptone it was confirmed that the active substance in Amino22 are amino acids. Analysis of global gene expression using DNA microarrays showed that Amino22 treatment represses both Gcn4 regulated genes (which are involved in amino acid and vitamin biosynthesis) and Aft1 regulated genes (which are involved in iron homeostasis). The positive effect of amino acids on growth and stress tolerance is related, at least in part, to the activation of TORC1 pathway and it also requires a partial inhibition of GAAC pathway. By contrast, this positive effect is independent of the Aft1 regulon repression. Following the observation that amino acid treatment represses iron regulon expression, we studied more in depth the relationship between amino acid and iron homeostasis in S. cerevisiae. We suggest a regulation model according to which the activation of GAAC pathway induces nuclear localization of Aft1 and subsequent expression of its target genes, whereas inhibition of this pathway by amino acids may have the opposite effect. Aft1 activity may be controlled through eIF2a phosphorylation and, hypothetically, it would involve regulation Fe/S biosynthesis. Potassium fulvate improves tolerance to osmotic, oxidative and heat stress. Microarray and qRT-PCR expression analysis indicate that Potassium fulvate represses Aft1 regulon. This repression can be explained by an increase in intracellular iron content, whose absorption depends on an oxidoreductase encoded by the FET3 gene. Tolerance to abiotic stress by Potassium fulvate also depends on FET3, therefore it is concluded that the mechanism of action of this biostimulant is based on an increased iron availability, which is accumulated in yeast cells without causing oxidative damage. / [ES] RESUMEN Este trabajo se basa en una colaboración entre el laboratorio del profesor doctor Ramón Serrano y la empresa de fertilizantes Fertinagro Nutrientes y está motivado por la necesidad creciente de incrementar la productividad de los cultivos agrícolas al mismo tiempo que se minimiza el impacto que la agricultura tiene sobre el medio ambiente. Fertinagro Nutrientes facilitó los siguientes seis bioestimulantes para el análisis de sus efectos sobre la tolerancia a estrés abiótico en la levadura Saccharomyces cerevisiae, aportando escasa (o nula en algunos casos) información acerca de su composición: Extracto de algas, Vinacillas, Fosfito, Ácido húmico, Amino22 y Fulvato potásico. La amplia conservación de rutas las metabólicas y de los mecanismos moleculares de defensa frente a estrés abiótico entre levadura y plantas justifican el uso de S. cerevisiae como sistema modelo para este estudio. Todos los bioestimulantes tienen, en mayor o menor medida, efectos positivos sobre la tolerancia de la levadura frente a al menos uno de los tipos de estrés abiótico estudiados. El Extracto de algas mejora el crecimiento en condiciones de estrés salino. El Vinacillas y el Fosfito protegen frente a estrés salino y choque térmico. El Ácido húmico incrementa la tolerancia a estrés oxidativo y choque térmico. Los dos bioestimulantes más polivalentes, el Amino22 y el Fulvato potásico, fueron estudiados en mayor profundidad con el objetivo de identificar sus mecanismos de acción. El Amino22, que es el bioestimulante más efectivo de los estudiados, mejora considerablemente el crecimiento en ausencia de estrés y bajo estrés osmótico y, en menor medida, también resulta beneficioso para el crecimiento en condiciones de estrés salino. Asimismo, el Amino22 proporciona tolerancia frente a estrés oxidativo y choque térmico. Mediante la comparación con una peptona de caseína ácida se comprobó que el principio activo responsable del efecto del Amino22 son los aminoácidos que contiene. El análisis del efecto del Amino22 sobre la expresión global de genes empleando micromatrices de DNA muestra que el bioestimulante reprime tanto genes regulados por Gcn4 e involucrados en la biosíntesis de aminoácidos y vitaminas como genes regulados por Aft1, implicados en la homeostasis de hierro. El efecto positivo de los aminoácidos sobre el crecimiento y tolerancia a estrés está relacionado, en parte al menos, con la activación de la ruta TORC1 y, además, requiere la inhibición parcial de la ruta GAAC. En cambio, dicho efecto positivo es independiente de la represión del regulón de Aft1. A raíz de la observación de que los aminoácidos reprimen el regulón de hierro, se profundizó en el estudio de la relación entre la homeostasis de aminoácidos y la de hierro en S. cerevisiae llegando a un modelo de regulación según el cual la activación de la ruta GAAC induciría la localización nuclear de Aft1 y la consiguiente expresión de sus genes diana, mientras que la inhibición de dicha ruta por la presencia de aminoácidos tendría el efecto contrario. La actividad de Aft1 sería controlada a través del estado de fosforilación de eIF2a e, hipotéticamente, implicaría la regulación de la formación de complejos Fe/S. El Fulvato potásico mejora la tolerancia a estrés osmótico, oxidativo y térmico. Los análisis de expresión mediante micromatrices y qRT-PCR indican que el tratamiento con Fulvato potásico reprime el regulón de Aft1. Esta represión se puede explicar por un aumento en el contenido intracelular de hierro, cuya entrada depende de la oxidorreductasa codificada por el gen FET3. La tolerancia a estrés abiótico que proporciona el Fulvato potásico también depende de FET3, por lo que se concluye que el mecanismo de acción de este bioestimulante se basa en un incremento de la disponibilidad de hierro, el cual se acumula en las células sin producir daño oxidativo extra. / [CAT] RESUM Aquest treball es basa en una col·laboració entre el laboratori del professor doctor Ramón Serrano i l'empresa de fertilitzants Fertinagro Nutrientes i està motivat per la necessitat creixent d'incrementar la productivitat dels cultius agrícoles al mateix temps que es minimitza l'impacte de l'agricultura sobre el medi ambient. Fertinagro Nutrientes va facilitar els següents sis bioestimulants per a l'anàlisi dels seus efectes sobre la tolerància a estrés abiòtic en el llevat Saccharomyces cerevisiae, aportant escassa (o nul·la en alguns casos) informació sobre la seua composició: Extracte d'algues, Vinacillas, Fosfit, Àcid húmic, Amino22 i Fulvat potàssic. L'àmplia conservació de les rutes metabòliques i dels mecanismes moleculars de defensa front a l'estrés abiòtic entre llevat i plantes justifiquen l'ús de S. cerevisiae com a sistema model per a este estudi. Tots els bioestimulants tenen, en major o menor mesura, efectes positius sobre la tolerància del llevat front a almenys un dels tipus d'estrés abiòtic estudiats. L'Extracte d'algues millora el creixement en condicions d'estrés salí. El Vinacillas i el Fosfit protegeixen front a l'estrés salí i xoc tèrmic. L'Àcid húmic incrementa la tolerància a estrés oxidatiu i xoc tèrmic. Els dos bioestimulants més polivalents, l'Amino22 i el Fulvat potàssic, van ser estudiats en major profunditat amb l'objectiu d'identificar els seus mecanismes d'acció. L'Amino22, que és el bioestimulant més efectiu dels estudiats, millora considerablement el creixement en absència d'estrés i baix estrés osmòtic i, en menor mesura, també resulta beneficiós per al creixement en condicions d'estrés salí. Així mateix, l'Amino22 proporciona tolerància front a l'estrés oxidatiu i xoc tèrmic. Mitjançant la comparació amb una peptona de caseïna àcida es va comprovar que el principi actiu responsable de l'efecte de l'Amino22 són els aminoàcids que conté. L'anàlisi de l'efecte de l'Amino22 sobre l'expressió global de gens emprant micromatrius de DNA mostra que el bioestimulant reprimeix tant gens regulats per Gcn4 i involucrats en la biosíntesi d'aminoàcids i vitamines com gens regulats per Aft1, implicats en l'homeòstasi del ferro. L'efecte positiu dels aminoàcids sobre el creixement i tolerància a estrés està relacionat, en part almenys, amb l'activació de la ruta TORC1 i, a més, requereix la inhibició parcial de la ruta GAAC. En canvi, aquest efecte positiu és independent de la repressió del reguló de Aft1. Arran de l'observació que els aminoàcids reprimeixen el reguló de ferro, es va aprofundir en l'estudi de la relació entre l'homeòstasi d'aminoàcids i la de ferro en S. cerevisiae arribant a un model de regulació segons el qual l'activació de la ruta GAAC induiria la localització nuclear de Aft1 i la consegüent expressió dels seus gens diana, mentre que la inhibició d'aquesta ruta per la presència d'aminoàcids tindria l'efecte contrari. L'activitat de Aft1 seria controlada a través de l'estat de fosforilació d' eIF2a i, hipotèticament, implicaria la regulació de la formació de complexos Fe/S. El Fulvat potàssic millora la tolerància a estrés osmòtic, oxidatiu i tèrmic. Les anàlisis d'expressió mitjançant micromatrius i qRT-PCR indiquen que el tractament amb Fulvat potàssic reprimeix el reguló de Aft1. Aquesta repressió es pot explicar per un augment en el contingut intracel·lular de ferro, l'entrada del qual depén de la oxidorreductasa codificada pel gen FET3. La tolerància a estrés abiòtic que proporciona el Fulvat potàssic també depén de FET3, per la qual cosa es conclou que el mecanisme d'acció d'aquest bioestimulant es basa en un increment de la disponibilitat de ferro, el qual s'acumula en les cèl·lules sense produir dany oxidatiu extra. / Caballero Molada, M. (2016). Estudio de efectos protectores y mecanismos de acción frente a estrés abiótico de bioestimulantes de fertilizantes en Saccharomyces cerevisiae [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/67390 / TESIS
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ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DIFERENCIAL ENTRE AISLADOS DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS (CTV) Y SUS HUÉSPEDES

Gómez Muñoz, Neus 15 January 2018 (has links)
La tristeza es la enfermedad viral más grave del cultivo de los cítricos y su agente causal es el virus de la tristeza de los cí­tricos (CTV). CTV induce uno o más de los siguientes sí­ndromes: I) decaimiento y muerte de los naranjos dulces (ND), pomelos y mandarinos injertados sobre el patrón naranjo amargo (NA), sí­ndrome conocido como "tristeza", II) enanismo, acanaladuras en la madera y fruta de pequeño calibre (stem pitting, SP), y III) enanismo y amarillamiento de plantas de semilla de limonero, pomelo y NA (seedling yellows, SY). La gama de huéspedes de CTV es muy restringida y hasta hace poco no se conocí­a ningún huésped herbáceo experimental. Actualmente, se sabe que la agroinfiltración de Nicotiana benthamiana, con clones de DNA complemantario (cDNA) del aislado T36 de CTV produce la infección sistémica de la planta, acompañada de sí­ntomas similares a los inducidos en cí­tricos, si bien la infección no queda limitada al floema. El aislado T36 induce SY y SP de lima Mejicana (LM), pero no en otros huéspedes como pomelo o ND. El estudio de los determinantes genéticos responsables de la inducción del sí­ndrome de SP requerí­a desarrollar un sistema genético basado en clones agroinfecciosos de un aislado inductor de estos sí­ntomas, como el aislado español T318A. Para ello, se partió de clones de cDNA de longitud completa de T318A previamente desarrollados en el laboratorio, capaces de replicarse en hojas de N. benthamiana pero incapaces de inducir infección sistémica y que presentaban varias mutaciones en su proteína de cápsida minoritaria p27. La corrección de dichas mutaciones y la construcción de nuevos clones de longitud completa de T318A marcados con el gen gfp, mostraron una correcta replicación en hojas agroinfiltradas de N. benthamiana, pero resultaron incapaces de inducir infección sistémica en este huésped experimental. La respuesta diferencial de N. benthamiana frente a distintas cepas de CTV permite estudiar los factores implicados en la interacción virus-huésped. Se analizó la interacción de las proteí­nas virales p20 y p25 de los aislados T36 y T318A con proteí­nas de N. benthamiana utilizando un abordaje consistente en: i) la expresión transitoria de p20/p25 marcadas con una etiqueta Strep-Tag en hojas de N. benthamiana, ii) purificación de los complejos proteí­na CTV-proteína huésped y análisis interactómico de los datos, y iii) estudio de la interacción directa entre p20/p25 y proteínas seleccionadas del huésped mediante análisis del doble hibrido en levadura y complementación bimolecular de fluorescencia (BIFC). Este abordaje proteómico mostró claras diferencias entre aislados que pueden explicar, en parte, el comportamiento diferencial de los aislados T36 y T318A en dicho huésped experimental. La inducción el síndrome de decaimiento por parte de CTV ha obligado a utilizar patrones tolerantes al decaimiento. Dichos patrones son menos adecuados. Las plantas de cí­tricos propagadas sobre NA e infectadas por CTV muestran necrosis en los tubos cribosos y disminución del floema funcional. Éstos desórdenes podrí­an ser consecuencia de la activación de los mecanismos de defensa como la reacción de hipersensibilidad desencadenada por la ruta del ácido salicí­lico o el silenciamiento génico mediado por RNA (post-transcriptional gene silencing, PTGS). Con el objetivo de avanzar en el mecanismo molecular de la resistencia del NA a la infección por CTV, se estudió el papel de diferentes genes de la planta implicados en las rutas mediante el uso de un vector viral basado en el genoma del virus del manchado foliar de los cítricos (citrus leaf blotch virus, CLBV). El silenciamiento génico de las rutas del AS o del PTGS en plantas NA y la inoculación de tres aislados de CTV patogénicamente diferentes mostró la implicación de ambas rutas en la defensa del NA frente a CTV. / Tristeza is the most important viral disease affecting citrus plants and Citrus tristeza virus (CTV) is the causal agent of this disease. CTV induces at least one of this syndromes: I) decline and death of sweet orange (SwO), grapefruits and mandarin trees grafted on sour orange (SO) rootstock, this syndromes is known as "tristeza", II) stunting, stem pitting (SP) and small fruits, and III) stunting and leaf chlorosis of lemon, grapefruit and SO seedlings (seedling yellows, SY). The host range of CTV is restricted and until recently no experimental herbaceous host was known. The agroinoculation Nicotiana benthamiana with clones of complementary DNA (cDNA) from the CTV isolate T36 cause the systemic infection of the plant and similar symptoms to those observed in citrus, although the infection is not limited to the phloem. T36 isolate induces SY and SP of Mexican lime (ML), but not in other hosts such as grapefruit and SwO. Therefore, to study the genetic determinants responsible of the SP syndrome induction was necessary to develop a genetic system based on agroinoculated clones from an isolate able to induce these symptoms, such as the Spanish isolate T318A. To do this, full length cDNA clones from T318A were obtained. They are able to replicate in N. benthamiana leaves but unable to induce systemic infection and showed several mutations in their protein of the minor coat, p27. The correction of these mutations and the construction of new clones of complete length from T318A labeled with the gfp gene, showed a proper replication in agroinoculated leaves of N. benthamiana, but they were still unable to induce systemic infection in this experimental host. The differential response of N. benthamiana to different CTV strains allows the study of the potential factors involved in the virus-host interaction. The aim of this work was study the interaction between the viral proteins p20 and p25 from the isolates T36 and T318A with N. benthamiana proteins with an analysis consisted in: I) the transitory expression of p20/p25 fused to Strep-Tag in N. benthamiana leaves, II) purification of the CTV protein-host protein complex and interatomic analysis of the data, and III) the study of the direct interaction between p20/p25 and selected plant proteins by the analysis of the double hybrid in yeast and bimolecular complementation of fluorescence (BIFC). The proteomic analysis showed strong differences between isolates that may partially explain the differential behavior of the T36 and T318A isolates in this experimental host. The induction of decline syndrome by CTV in citrus has leaded the use of tolerant rootstocks to decline. However, the use of such rootstocks is less suitable. Citrus plants propagated on SO rootstock and infected by CTV show phloem necrosis below the bud union that reduces the flow of carbohydrates to the roots. These symptoms may be a consequence of the activation of defense pathways in the plant, such as the hypersensitive reaction, hormone salicylic acid (SA) pathways or the RNA mediated post-transcriptional gene silencing (PTGS). Their relation is essential to know their implication in the decline. Therefore, the role of different genes involved in SA and PTGS has been studied by the silencing of plant genes using a viral vector (VIGS) based in the genome of the citrus leaf blotch virus (CLBV). The gene silencing of the SA and PTGS in SO and the inoculation of three different pathogenicity CTV isolates showed that both pathways are involved in the SO defense against CTV. The analysis of the proteins p20, p23 and p25 as possible suppressors of the AS indicating that the more virulent CTV isolates possess the more powerful suppressors. / La Tristesa és la malaltia viral més greu del cultiu dels cítrics. CTV induïx un o més de les sí­ndromes següents: I) decaïment i mort de taronger dolç§ (ND), pomelo i mandariner empeltats sobre el patró taronger amarg (NA), sí­ndrome conegut com "Tristesa", II) nanisme, estries en la fusta i fruita de xicotet calibre (SP) i III) nanisme i tonalitat groguenta de plantes de llavor de llimera, pomelo i taronger amarg (SY). El rang d'hostes de CTV és molt restringit i fins fa poc no es coneixia cap hoste herbaci experimental. Actualment es sap que la infecciò sistèmica en Nicotiana benthamiana amb clons de DNA complementari (cDNA) de l`aïllat de T36 provoca la infecció sistemàtica de la planta, acompanyada de síntomes similars als induïts en cí­trics, si be la infecció no queda llimitada al floema. L' aïllat T36 induïx SY i estries en la fusta de Llima Mexicana (LM), però no en altres hostes com a pomelo, ND o NA, l'estudi dels determinants genètics responsables de la inducció de la síndrome de SP requeria desenvolupar un sistema genètic basat en clons agroinfecciosos d'un aïllat inductor d'estos sí­mptomes, com l'aïllat espanyol T318A. Per a això, es va partir de clons de cDNA longitud completa de T318A prèviament desenvolupats al laboratori, capaços de replicar-se en fulls de N. benthamiana però incapaços d'induir infecció sistèmica i que presentaven varies mutacions en la seua proteïna de càpsida minoritatia p27. La correcció d`aquestes mutacions i la construcció de nous clons T318A de longitud completa marcats amb el gen gfp, van mostrar una correcta replicació en fulls agroinfiltradas de N. benthamiana però van resultar incapaços d'induir infecció sistèmica en aquest hoste experimental. La resposta diferencial dependent d'aïllat en N. benthamiana front CTV permet estudiar els possibles factors de la interacció virus- hoste. Es va dur a terme l'estudi de la funció de les proteínes virals p20 i p25 dels aïllats T36 i T318A amb proteïnes de N. benthamiana utilitzant un abordatge consistent en: i) l' expressió transitòria de les dues proteïnes p20/p25 marcades amb una etiqueta Strep-Tag en fulls de N. benthamiana, ii) purificació dels complexos proteïna CTV-proteïna hoste i anàlisi interactómic de les dades, i iii) estudi de la interacció directa per mitjà  de doble híbrid en llevat i complementació bimolecular de fluorescència (BIFC) de les proteïnes virals i determinades proteïnes de N. benthamiana. Aquest abordatge proteòmic va mostrar clares diferències entre aïllats que poden explicar el comportament diferencial dels aïllats T36 i T318A en aquest hoste experimental. La inducció de la sí­ndrome de decaïment per part de CTV en cí­trics ha obligat la utilització de patrons tolerants al decaïment. No obstant, aquestos patrons són agronòmicament menys adequats. Les plantes de cítrics propagades sobre NA i infectades por CTV mostren necrosi als tubs cribosos i disminució del floema funcional. Aquestos sí­mptomes poden ser conseqüència de l'activació de les rutes de defensa de la planta com la reacció d'hipersensibilitat, desencadenada per la ruta de l'àcid salicí­lic o el silenciamient gènic mediat per RNA (PTGS). Amb l'objectiu d'analitzar la implicació d¿aquestes rutes en la defensa, es va estudiar el paper de diferents gens implicats en la ruta de l'AS i del PTGS per mitjà  del silenciamient gènic induït per virus basat en el genoma del tacat foliar dels cítrics (CLBV). El silenciamient gènic de les rutes AS o PTGS en plantes NA i la inoculació de tres aïllats de CTV patogènicament diferents va mostrar la implicació de les dues rutes en la defensa del NA front CTV. L'analisis de les proteïnes p20, p23 i p25 com a possibles supressors de la ruta de l'AS va indicar que els aïllats més virulents de CTV posseïxen supressors més potents. / Gómez Muñoz, N. (2017). ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN DIFERENCIAL ENTRE AISLADOS DEL VIRUS DE LA TRISTEZA DE LOS CÍTRICOS (CTV) Y SUS HUÉSPEDES [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/94624 / TESIS
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Regulation of ABA signaling through degradation of clade A PP2Cs by the RGLG1 and CRL3 BPM E3 ligases

Julián Valenzuela, Jose 24 February 2020 (has links)
[ES] La ubiquitinación inducida por hormonas desempeña un papel crucial en la vida media de los reguladores negativos clave de la propia señalización hormonal. En la señalización por ABA, los reguladores negativos clave son las PP2Cs del clado A, como PP2CA o ABI1, y su degradación es un mecanismo complementario a la inhibición de su actividad mediada por PYR/PYL/RCAR. El ABA promueve la degradación de ABI1 a través de las E3 ligasas PUB12/13, y PP2CA a través de las E3 ligasas RGLG1/5. Sin embargo, se predice que otras E3 ligasas no identificadas también regularán la vida media de las PP2Cs del clado A. En pasos posteriores de la señalización por ABA, el ABA también induce la regulación positiva de los niveles de transcrito y proteína de las PP2Cs como un mecanismo de retroalimentación negativa. Por lo tanto, restablecer la señalización de ABA también requiere la degradación de las PP2Cs para evitar su acumulación excesiva inducida por el propio ABA. En este trabajo identificamos las proteínas BTB/POZ AND MATH DOMAIN (BPM), adaptadores del sustrato de las E3 ligasas multiméricas CULLIN3-RING E3 (CRL3), como proteínas que interactúan con las PP2Cs. BPM3 y BPM5 interactúan en el núcleo con PP2CA, así como con ABI1, ABI2 y HAB1. Además, BPM3 y BPM5 aceleran la degradación de las PP2Cs de una manera dependiente del ABA y su sobreexpresión conduce a una mayor sensibilidad al ABA. Además, las plantas mutantes bpm3 bpm5 mostraron una mayor acumulación de PP2CA, ABI1 y HAB1, lo que conduce a una sensibilidad global disminuida al ABA. Finalmente, utilizando ensayos bioquímicos y genéticos, demostramos que las BPM aumentaban la ubiquitinación de PP2CA. Dado que la formación de los complejos ternarios receptor-ABA-fosfatasa se ve notablemente afectada por la abundancia de sus componentes proteicos y la concentración de ABA, revelamos que las BPM y las E3 ligasas multiméricas CRL3 son moduladores importantes de los niveles del correceptor PP2C para regular la señalización temprana de ABA, así como durante los consiguientes pasos de restablecimiento. Al contrario que con PUB12/13, no se sabe cómo el ABA aumenta la degradación de PP2CA a través de RGLG1/5. En el caso de RGLG1, esta proteína se encuentra predominantemente en la membrana plasmática, mientras que PP2CA se encuentra predominantemente en el núcleo. Nosotros demostramos que el ABA modifica la localización subcelular de RGLG1, promoviendo la interacción nuclear con PP2CA. En primer lugar, encontramos que RGLG1 está miristoilado in vivo, lo que facilita su unión a la membrana plasmática, sin embargo, el ABA inhibe esta miristoilación. El ABA también regula negativamente a N-myristoyltransferase 1, la enzima activa y central en la miristoilación de proteínas, esto puede ayudar a promover la translocación de RGLG1 al núcleo. Allí, RGLG1 puede interactuar con ciertos receptores monoméricos del ABA, como PYL8. El reclutamiento nuclear de la E3 ligasa también fue promovido por el aumento de los niveles de proteína PP2CA y por la formación de complejos RGLG1-PYL8-PP2CA en presencia de ABA. Además, nosotros encontramos que RGLG1Gly2Ala, mutada en el sitio de miristoilación N-terminal, muestra localización nuclear constitutiva y provoca una respuesta más sensible al ABA y al estrés salino y osmótico. En resumen, proporcionamos evidencia de que una ligasa E3 puede reubicarse dinámicamente en respuesta al ABA, el estrés salino y osmótico, y el aumento de los niveles de su sustrato, lo que revela un mecanismo para explicar cómo el ABA mejora la interacción RGLG1-PP2CA y, por lo tanto, la degradación de PP2CA. / [CAT] L' ubiquitinació induïda per hormones té un paper crucial en la vida mitjana dels reguladors negatius clau de la pròpia senyalització hormonal. En la senyalització per ABA, els reguladors negatius clau són les PP2Cs del clado A, com PP2CA o ABI1, i la seva degradació és un mecanisme complementari a la inhibició de la seva activitat mediada per PYR/PYL/RCAR. El ABA promou la degradació de ABI1 a través de les E3 lligases PUB12/13, i PP2CA per mitja de les E3 lligases RGLG1/5. No obstant això, es prediu que altres E3 lligases no identificades també regularan la vida mitjana de les PP2Cs del clado A. En passos posteriors de la senyalització per ABA, l'ABA també indueix la regulació positiva de nivells de transcrit i proteïna de les PP2Cs com un mecanisme de retroalimentació negativa. Per tant, restablir la senyalització d'ABA també requereix la degradació de les PP2Cs per evitar la seva acumulació excessiva induïda pel propi ABA. En aquest treball identifiquem les proteïnes BTB/POZ AND MATH DOMAIN (BPM), adaptadors del substrat de les E3 lligases multimèriques CULLIN3-RING E3 (CRL3), com proteïnes que interactuen amb les PP2Cs. BPM3 i BPM5 interactuen en el nucli amb PP2CA, així com amb ABI1, ABI2 i HAB1. A més, BPM3 i BPM5 acceleren la degradació de les PP2Cs d'una manera dependent del ABA i la seva sobreexpressió porta a una major sensibilitat al ABA. A més, les plantes mutants bpm3 bpm5 van mostrar una major acumulació de PP2CA, ABI1 i HAB1, el que porta a una sensibilitat global disminuïda a ABA. Finalment, utilitzant assajos bioquímics i genètics, aconseguint que les BPM augmentaven l' ubiquitinació de PP2CA. Atès que la formació dels complexos ternaris receptor-ABA-fosfatasa es veu notablement afectada per l'abundància dels seus components proteics i la concentració d'ABA, revelem que les BPM i les E3 lligases multimèriques CRL3 són moduladors importants dels nivells del coreceptor PP2C per regular la senyalització primerenca de ABA, així com durant els consegüents passos de restabliment. Al contrari que amb PUB12/13, no se sap com el ABA augmenta la degradació de PP2CA a través d'RGLG1/5. En el cas de RGLG1, aquesta proteïna es troba predominantment en la membrana plasmàtica, mentre que PP2CA es troba predominantment en el nucli. Nosaltres vam demostrar que l'ABA modifica la localització subcelular de RGLG1, promovent la interacció nuclear amb PP2CA. En primer lloc, trobem que RGLG1 està miristoilado in vivo, el que facilita la seva unió a la membrana plasmàtica, però, el ABA inhibeix aquesta miristoilación. El ABA també regula negativament N-myristoyltransferase 1, l' enzim actiu i central en la miristoilación de proteïnes, això pot ajudar a promoure la translocació de RGLG1 al nucli. Allà, RGLG1 pot interactuar amb certs receptors monomèrics de l'ABA, com PYL8. El reclutament nuclear de l'E3 lligasa també va ser promogut per l'augment dels nivells de proteïna PP2CA i per la formació de complexos RGLG1-PYL8-PP2CA en presència d'ABA. A més, nosaltres trobem que RGLG1Gly2Ala, mutada en el lloc de miristoilació N-terminal, mostra localització nuclear constitutiva i provoca una resposta més sensible al ABA i l'estrès salí i osmòtic. En resum, proporcionem evidència que una ligasa E3 pot reubicar dinàmicament en resposta al ABA, l'estrès salí i osmòtic, i l'augment dels nivells de la seva substrat, el que revela un mecanisme per explicar com el ABA millora la interacció RGLG1-PP2CA i, per tant, la degradació de PP2CA. / [EN] Hormone-induced ubiquitination plays a crucial role to determine the half-life of key negative regulators of hormone signaling. In case of ABA signaling, the key negative regulators are the clade-A PP2Cs, such as PP2CA or ABI1, and their degradation is a complementary mechanism to PYR/PYL/RCAR-mediated inhibition of their activity. ABA promotes the degradation of ABI1 through the PUB12/13 E3 ligases, and PP2CA through the RGLG1/5 E3 ligases. However, other unidentified E3 ligases are predicted to regulate clade A PP2Cs half-life as well. At later steps of ABA signaling, ABA also induces upregulation of PP2C transcripts and protein levels as a negative feedback mechanism. Therefore, resetting of ABA signaling also requires PP2C degradation to avoid excessive ABA-induced accumulation of PP2Cs. In this work we identified BTB/POZ AND MATH DOMAIN proteins (BPMs), substrate adaptors of the multimeric CULLIN3-RING E3 ligases (CRL3s), as PP2C-interacting proteins. BPM3 and BPM5 interact in the nucleus with PP2CA as well as with ABI1, ABI2 and HAB1. Additionally, BPM3 and BPM5 accelerate the turnover of PP2Cs in an ABA-dependent manner and their overexpression leads to enhanced ABA sensitivity. Moreover, bpm3 bpm5 mutant plants showed increased accumulation of PP2CA, ABI1 and HAB1, which leads to global diminished ABA sensitivity. Finally, using biochemical and genetic assays we demonstrated that BPMs enhance the ubiquitination of PP2CA. Given the formation of receptor-ABA-phosphatase ternary complexes is markedly affected by the abundance of protein components and ABA concentration, we reveal that BPMs and multimeric CRL3 E3 ligases are important modulators of PP2C co-receptor levels to regulate early ABA signaling as well as the subsequent resetting steps. In contrast to PUB12/13, it was not known how ABA enhances the degradation of PP2CA by RGLG1/5. RGLG1 is predominantly found in the plasma membrane whereas PP2CA is predominant in the nucleus. We demonstrate that ABA modifies the subcellular localization of RGLG1, promoting nuclear interaction with PP2CA. Firstly, we found that RGLG1 is myristoylated in vivo, which facilitates its attachment to the plasma membrane, nevertheless, ABA inhibits its myristoylation. ABA also downregulates N-myristoyltransferase 1, the central active enzyme of protein myristoylation, which may help to promote RGLG1 translocation to the nucleus. There, RGLG1 can interact with certain monomeric ABA receptors, as PYL8. Enhanced nuclear recruitment of the E3 ligase was also promoted by increasing PP2CA protein levels and the formation of RGLG1-PYL8-PP2CA complexes in the presence of ABA. Additionally, we found that RGLG1Gly2Ala protein, mutated at the N-terminal myristoylation site, shows constitutive nuclear localization and causes an enhanced response to ABA and salt and osmotic stresses. In summary, we provided evidence that an E3 ligase can dynamically relocalize in response to ABA, salt and osmotic stress, and increased levels of its target, which reveals a mechanism to explain how ABA enhances RGLG1-PP2CA interaction and hence PP2CA degradation. / Julián Valenzuela, J. (2020). Regulation of ABA signaling through degradation of clade A PP2Cs by the RGLG1 and CRL3 BPM E3 ligases [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137777 / TESIS
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Mesoporous silica and gold-based nanodevices: new controlled delivery platforms for biomedical applications

Vivo Llorca, Gema 26 July 2021 (has links)
[ES] La presente tesis doctoral titulada "Mesoporous silica and gold-based nanodevices: new controlled delivery platforms for biomedical applications" se centra en el diseño, síntesis, caracterización y evaluación de distintos nanodispositivos híbridos orgánico-inorgánicos. En concreto, se utilizan como soporte nanopartículas mesoporosas de sílice y nanopartículas de oro para su aplicación biomédica, en concreto en el campo del cáncer de mama. En el primer capítulo se introduce el marco general en el que se engloban los estudios realizados. Se presentan los conceptos relacionados con nanotecnología y nanomedicina, así como la interacción de las nanopartículas a nivel biológico con el organismo y las células. Finalmente, se introducen conceptos básicos del cáncer de mama y la aplicación de nanomateriales como terapia. A continuación, en el segundo capítulo, se exponen los objetivos de la presente tesis doctoral que son abordados en los siguientes capítulos experimentales. En el tercer capítulo se describe el primer nanomaterial para la liberación controlada de dos inhibidores (navitoclax y S63845) de las proteínas anti- apoptóticas de la familia Bcl-2. Este sistema se ha diseñado con el objetivo de superar la resistencia a navitoclax en un modelo celular de cáncer de mama triple negativo. En concreto, se han preparado nanopartículas mesoporosas de sílice cargadas con navitoclax y S63845, y funcionalizadas con un aptámero dirigido a la proteína de superficie MUC1, que actúa como puerta molecular. En este trabajo hemos demostrado que las nanopartículas diseñadas son internalizadas preferentemente por células tumorales de cáncer de mama. También hemos demostrado la capacidad de las nanopartículas de revertir la resistencia a navitoclax en un modelo celular de cáncer de mama triple negativo. Además, ponemos de manifiesto la disminución del principal efecto adverso (trombocitopenia) asociado a la administración del navitoclax en su formulación libre, gracias a la encapsulación en las nanopartículas. En el capítulo cuatro se presenta un sistema sensible a pH para la liberación controlada de un cargo fluorescente y la maquinaria de edición génica basada en el sistema CRISPR/Cas9, dirigido a la edición del gen codificante de la proteína fluorescente verde (GFP, del inglés gren fluorescent protein). El nanodispositivo está constituido por nanopartículas mesoporosas de sílice cargadas con rodamina B, funcionalizadas con polietilenimina y revestidas con el plásmido codificante del sistema CRISPR/Cas9. En este trabajo se ha demostrado el escape lisosomal de las nanopartículas, mediado por el efecto esponja de protones de la PEI. Asimismo, mostramos un nanodispositivo pionero en su campo, basado en nanopartículas mesoporosas de sílice, capaz de realizar la doble función de llevar a cabo la edición del gen codificante de GFP y la liberación exitosa del cargo fluorescente. En el quinto, y último, capítulo experimental se propone una nueva aproximación para realizar una terapia enzimática prodroga empleando nanopartículas de oro como transportadores enzimáticos. En este caso, se aborda la funcionalización de nanopartículas de oro con la enzima peroxidasa de rábano (HRP, del inglés horseradish peroxidase), capaz de transformar la prodroga inocua ácido indol-3-acético en especies radicales que resultan tóxicas para las células tumorales. En este capítulo se ha demostrado el efecto terapéutico del nanodispositivo en combinación con la prodroga en modelos celulares de cáncer de mama de los subtipos luminal A y triple negativo. Además, se ha confirmado la eficacia terapéutica del sistema en esferoides tumorales formados por células de cáncer de mama triple negativo. Por último, se presentan en el capítulo seis las conclusiones extraídas del desarrollo de esta tesis doctoral. Los resultados obtenidos en este trabajo contribuirán al desarrollo de nuevos nanomateriales inteligentes con aplicación en diversas áreas de la nanomedicina. / [CA] La present tesi doctoral titulada "Mesoporous silica and gold-based nanodevices: new controlled delivery platforms for biomedical applications" se centra en el disseny, síntesi, caracterització i avaluació de diferents nanodispositius híbrids orgànic-inorgànics. En concret, s'utilitzen com a suport nanopartícules mesoporoses de sílice i nanopartícules d'or per a la seua aplicació biomèdica, en concret en el camp del càncer de mama. En el primer capítol s'introdueix el marc general en el qual s'engloben els estudis realitzats. Es presenten els conceptes relacionats amb la nanotecnologia i nanomedicina, així com la interacció de les nanopartícules a nivell biològic amb l'organisme i les cèl·lules. Finalment, s'introdueixen conceptes bàsics del càncer de mama i l'aplicació de nanomaterials com a teràpia. A continuació, en el segon capítol, s'exposen els objectius de la present tesi doctoral que són abordats en els següents capítols experimentals. En el tercer capítol es descriu el primer nanomaterial utilitzat per a l'alliberament controlat de dos inhibidors (navitoclax i S63845) de les proteïnes anti-apoptòtiques de la família Bcl-2. Aquest sistema s'ha dissenyat amb l'objectiu de superar la resistència a navitoclax en un model cel·lular de càncer de mama triple negatiu. En concret, s'han preparat nanopartícules mesoporoses de sílice carregades amb navitoclax i S63845, i funcionalitzades amb un aptàmer dirigit a la proteïna de superfície MUC1, que actua com a porta molecular. En aquest treball hem demostrat que les nanopartícules dissenyades són internalitzades preferentment per cèl·lules tumorals de càncer de mama. També hem demostrat la capacitat de les nanopartícules de revertir la resistència a navitoclax en un model cel·lular de càncer de mama triple negatiu. A més, posem de manifest la disminució del principal efecte advers (trombocitopènia) associat a l'administració del navitoclax en la seua formulació lliure, gràcies a l'encapsulació en les nanopartícules. En el capítol quatre es presenta un sistema sensible a pH per a l'alliberament controlat d'una càrrega fluorescent i la maquinària d'edició gènica basada en el sistema CRISPR/Cas9, dirigit a l'edició gènica del gen codificant de la proteïna fluorescent verda (GFP, del anglés gren fluorescent protein). El nanodispositiu està constituït per nanopartícules mesoporoses de sílice carregades amb rodamina B, funcionalitzades amb polietilenimina i revestides amb el plàsmid codificant del sistema CRISPR/Cas9. En aquest treball s'ha demostrat la fuga lisosomal de les nanopartícules, mediat per l'efecte esponja de protons de la PEI. Així mateix, vam mostrar un nanodispositiu pioner en el seu camp, basat en nanopartícules mesoporoses de sílice, capaç de realitzar la doble funció de dur a terme l'edició del gen codificant de la GFP i l'alliberament exitós de la càrrega fluorescent. En el cinqué i últim capítol experimental es proposa una nova aproximació per a realitzar una teràpia enzimàtica prodroga emprant nanopartícules d'or com a transportadors enzimàtics. En aquest cas, s'aborda la funcionalització de nanopartícules d'or amb l'enzim peroxidasa de rave (HRP, del anglés horseradish peroxidase), capaç de transformar la prodroga innòcua àcid indol-3-acètic en espècies radicals que resulten tòxiques per a les cèl·lules tumorals. En aquest capítol s'ha demostrat l'efecte terapèutic del nanodispositiu en combinació amb la prodroga en models cel·lulars de càncer de mama dels subtipus luminal A i triple negatiu. A més, s'ha confirmat l'eficàcia terapèutica del sistema en esferoides tumorals formats per cèl·lules de càncer de mama triple negatiu. Finalment, en el capítol sis es presenten les conclusions extretes del desenvolupament d'aquesta tesi doctoral. Els resultats obtinguts en aquesta tesi contriburan al desenvolupament de nous nanomaterials intel·ligents amb aplicació en diverses àrees de la nanomedicina. / [EN] This Ph.D. thesis entitled "Mesoporous silica and gold-based nanodevices: new controlled delivery platforms for biomedical applications" is focused on the design, synthesis, characterisation, and evaluation of several hybrid organic-inorganic nanomaterials. We have developed mesoporous silica nanoparticles and gold nanoparticles for biomedical applications, specifically in the breast cancer area. The first chapter includes an overview of the concepts related to the research performed. Introductory notions about nanotechnology and biomedicine are presented, as well as the basis of the interactions of nanoparticles with biological systems. Finally, breast cancer disease and the application of nanomaterials as therapy are described. Next, in the second chapter, the objectives addressed in the following experimental chapters are displayed. In the third chapter, we present the first nanomaterial for the controlled delivery of two inhibitors (navitoclax and S63845) of the Bcl-2 anti-apoptotic proteins. This nanosystem has been designed to overcome navitoclax resistance in a triple-negative breast cancer cellular model. We have prepared mesoporous silica nanoparticles loaded with navitoclax and S63845 and functionalised with an aptamer targeting MUC1 surface protein as a molecular gate. In this work, the specific targeting of the nanodevice to breast cancer cells has been demonstrated. The ability to overcome navitoclax resistance has been shown in navitoclax-resistant triple-negative breast cancer cells. Furthermore, navitoclax encapsulation in the nanoparticles has proved to reduce the main adverse effect (thrombocytopenia) associated with free formulated drug administration. In the fourth chapter, we describe a pH-responsive nanosystem for the controlled co-delivery of a fluorescent cargo and the genome-editing machinery based on CRISPR/Cas9, which targets the green fluorescent protein (GFP) coding gene. The nanodevice consists of mesoporous silica nanoparticles loaded with rhodamine B, functionalised with polyethyleneimine, and capped with the CRISPR/Cas9 plasmid. In the present work, we have shown the lysosomal scape capacity of the nanodevice enhanced by the proton sponge effect of PEI. We have also demonstrated a pioneering mesoporous silica-based nanodevice efficient in the simultaneous genome editing of the GFP gene (as a model gene) and the successful release of a fluorescent cargo (as a model drug). In the fifth and last experimental chapter, we propose a new approximation to develop enzyme prodrug therapy using gold nanoparticles as enzyme carriers. In this case, we use gold nanoparticles functionalised with the enzyme horseradish peroxidase (HRP), which transforms the non-toxic prodrug indol-3-acetic acid into radical species toxic to tumour cells. In this chapter, the therapeutic effect of the nanodevice in combination with the prodrug has been demonstrated in two breast cancer cell subtypes (luminal A and triple-negative breast cancers). Also, the therapeutic effect of the material has been corroborated in multicellular tumour spheroid-like cultures formed by triple-negative breast cancer cells. Finally, in the sixth chapter, the conclusions derived from the presented studies and the general conclusions of this Ph.D. thesis are released. The obtained results will promote the development of new smart nanomaterials with diverse biomedical applications. / Gema Vivo-Llorca thanks the Generalitat Valenciana for her fellowship ACIF/2017/072. Vicente Candela-Noguera thanks the Spanish Government for his fellowship FPU15/02753. We would like to thank Servier for the workart used in the figures of this manuscript (Servier Medical Art https://smart.servier.com/). We thank the Spanish Government (project RTI2018-100910-B-C41 (MCUI/AEI/FEDER, UE); SAF2017-84689-R-B (MCUI/AEI/FEDER, UE)) and the Generalitat Valenciana (project PROMETEO/2018/024 and PROMETEO/2019/065) for support. / Vivo Llorca, G. (2021). Mesoporous silica and gold-based nanodevices: new controlled delivery platforms for biomedical applications [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172713 / TESIS
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Development and characterization of two new tools for plant genetic engineering: A CRISPR/Cas12a-based mutagenesis system and a PhiC31-based gene switch

Bernabé Orts, Juan Miguel 16 December 2019 (has links)
[ES] La mejora genética vegetal tiene como objetivo la obtención de plantas con rasgos mejorados o características novedosas que podrían ayudar a superar los objetivos de sostenibilidad. Para este fin, la biotecnología vegetal necesita incorporar nuevas herramientas de ingeniería genética que combinen una mayor precisión con una mayor capacidad de mejora. Las herramientas de edición genética recientemente descubiertas basadas en la tecnología CRISPR/Cas9 han abierto el camino para modificar los genomas de las plantas con una precisión sin precedentes. Por otro lado, los nuevos enfoques de biología sintética basados en la modularidad y la estandarización de los elementos genéticos han permitido la construcción de dispositivos genéticos cada vez más complejos y refinados aplicados a la mejora genética vegetal. Con el objetivo final de expandir la caja de herramientas biotecnológicas para la mejora vegetal, esta tesis describe el desarrollo y la adaptación de dos nuevas herramientas: una nueva endonucleasa específica de sitio (SSN) y un interruptor genético modular para la regulación de la expresión transgénica. En una primera parte, esta tesis describe la adaptación de CRISPR/Cas12a para la expresión en plantas y compara la eficiencia de las variantes de Acidaminococcus (As) y Lachnospiraceae (Lb) Cas12a con Streptococcus pyogens Cas9 (SpCas9) descritos anteriormente en ocho loci de Nicotiana benthamiana usando expresión transitoria. LbCas12a mostró la actividad de mutagénesis promedio más alta en los loci analizados. Esta actividad también se confirmó en experimentos de transformación estable realizados en tres plantas modelo diferentes, a saber, N. benthamiana, Solanum lycopersicum y Arabidopsis thaliana. Para este último, los efectos mutagénicos colaterales fueron analizados en líneas segregantes sin la endonucleasa Cas12a, mediante secuenciación del genoma descartándose efectos indiscriminados. En conjunto, los resultados muestran que LbCas12a es una alternativa viable a SpCas9 para la edición genética en plantas. En una segunda parte, este trabajo describe un interruptor genético reversible destinado a controlar la expresión génica en plantas con mayor precisión que los sistemas inducibles tradicionales. Este interruptor, basado en el sistema de recombinación del fago PhiC31, fue construido como un dispositivo modular hecho de partes de ADN estándar y diseñado para controlar el estado transcripcional (encendido o apagado) de dos genes de interés mediante la inversión alternativa de un elemento regulador central de ADN. El estado del interruptor puede ser operado externa y reversiblemente por la acción de los actuadores de recombinación y su cinética, memoria y reversibilidad fueron ampliamente caracterizados en experimentos de transformación transitoria y estable en N. benthamiana. En conjunto, esta tesis muestra el diseño y la caracterización funcional de herramientas para la ingeniería del genómica y biología sintética de plantas que ahora ha sido completada con el sistema de edición genética CRISPR/Cas12a y un interruptor genético reversible y biestable basado en el sistema de recombinación del fago PhiC31. / [CAT] La millora genètica vegetal té com a objectiu l'obtenció de plantes amb trets millorats o característiques noves que podrien ajudar a superar els objectius de sostenibilitat. Amb aquesta finalitat, la biotecnologia vegetal necessita incorporar noves eines d'enginyeria genètica que combinen una major precisió amb una major capacitat de millora. Les eines d'edició genètica recentment descobertes basades en la tecnologia CRISPR/Cas9 han obert el camí per modificar els genomes de les plantes amb una precisió sense precedents. D'altra banda, els nous enfocaments de biologia sintètica basats en la modularitat i l'estandardització dels elements genètics han permès la construcció de dispositius genètics cada vegada més complexos i sofisticats aplicats a la millora genètica vegetal. Amb l'objectiu final d'expandir la caixa d'eines biotecnològiques per a la millora vegetal, aquesta tesi descriu el desenvolupament i l'adaptació de dues noves eines: una nova endonucleasa específica de lloc (SSN) i un interruptor genètic modular per a la regulació de l'expressió transgènica . En una primera part, aquesta tesi descriu l'adaptació de CRISPR/Cas12a per a l'expressió en plantes i compara l'eficiència de les variants de Acidaminococcus (As) i Lachnospiraceae (Lb) Cas12a amb la ben establida Streptococcus pyogens Cas9 (SpCas9), en vuit loci de Nicotiana benthamiana usant expressió transitòria. LbCas12a va mostrar l'activitat de mutagènesi mitjana més alta en els loci analitzats. Aquesta activitat també es va confirmar en experiments de transformació estable realitzats en tres plantes model diferents, a saber, N. benthamiana, Solanum lycopersicum i Arabidopsis thaliana. Per a aquest últim, els efectes mutagènics col·laterals van ser analitzats en línies segregants sense l'endonucleasa Cas12a, mitjançant seqüenciació completa del genoma i descartant efectes indiscriminats. En conjunt, els resultats mostren que LbCas12a és una alternativa viable a SpCas9 per a l'edició genètica en plantes. En una segona part, aquest treball descriu un interruptor genètic reversible destinat a controlar l'expressió gènica en plantes amb major precisió que els sistemes induïbles tradicionals. Aquest interruptor, basat en el sistema de recombinació del bacteriòfag PhiC31, va ser construït com un dispositiu modular fet de parts d'ADN estàndard i dissenyat per controlar l'estat transcripcional (encès o apagat) de dos gens d'interès mitjançant la inversió alternativa d'un element regulador central d'ADN. L'estat de l'interruptor pot ser operat externa i reversiblement per acció dels actuadors de recombinació i la seva cinètica, memòria i reversibilitat van ser àmpliament caracteritzats en experiments de transformació transitòria i estable en N. benthamiana. En conjunt, aquesta tesi mostra el disseny i la caracterització funcional d'eines per a l'enginyeria del genòmica i biologia sintètica de plantes que ara ha sigut completat amb el sistema d'edició genètica CRISPR/Cas12a i un interruptor genètic biestable i reversible basat en el sistema de recombinació del bacteriòfag PhiC31. / [EN] Plant breeding aims to provide plants with improved traits or novel features that could help to overcome sustainability goals. To this end, plant biotechnology needs to incorporate new genetic engineering tools that combine increased precision with higher breeding power. The recently discovered genome editing tools based on CRISPR/Cas9 technology have opened the way to modify plant¿s genomes with unprecedented precision. On the other hand, new synthetic biology approaches based on modularity and standardization of genetic elements have enabled the construction of increasingly complex and refined genetic devices applied to plant breeding. With the ultimate goal of expanding the toolbox of plant breeding techniques, this thesis describes the development and adaptation to plant systems of two new breeding tools: a site-specific nuclease (SSNs), and a modular gene switch for the regulation of transgene expression. In a first part, this thesis describes the adoption of the SSN CRISPR/Cas12a for plant expression and compares the efficiency of Acidaminococcus (As) and Lachnospiraceae (Lb) Cas12a variants with the previously described Streptococcus pyogens Cas9 (SpCas9) in eight Nicotiana benthamiana loci using transient expression experiments. LbCas12a showed highest average mutagenesis activity in the loci assayed. This activity was also confirmed in stable genome editing experiments performed in three different model plants, namely N. benthamiana, Solanum lycopersicum and Arabidopsis thaliana. For the latter, off-target effects in Cas12a-free segregating lines were discarded at genomic level by deep sequencing. Collectively, the results show that LbCas12a is a viable alternative to SpCas9 for plant genome engineering. In a second part, this work describes the engineering of a new reversible genetic switch aimed at controlling gene expression in plants with higher precision than traditional inducible systems. This switch, based on the bacteriophage PhiC31 recombination system, was built as a modular device made of standard DNA parts and designed to control the transcriptional state (on or off) of two genes of interest by alternative inversion of a central DNA regulatory element. The state of the switch can be externally and reversibly operated by the action of the recombination actuators and its kinetics, memory, and reversibility were extensively characterized in N. benthamiana using both transient expression and stable transgenics. Altogether, this thesis shows the design and functional characterization of refined tools for genome engineering and synthetic biology in plants that now has been expanded with the CRISPR/Cas12a gene editing system and the phage PhiC31-based toggle switch. / Bernabé Orts, JM. (2019). Development and characterization of two new tools for plant genetic engineering: A CRISPR/Cas12a-based mutagenesis system and a PhiC31-based gene switch [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/133055 / TESIS

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