Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-22Bitstream added on 2015-03-03T12:07:10Z : No. of bitstreams: 1 000807109.pdf: 457835 bytes, checksum: c8b102f16b86a5f3ecea8c8ee3c9df40 (MD5) / A pesquisa objetivou analisar a suscetibilidade de duas populações distintas de Helicoverpa armigera a produtos comerciais à base de Bacillus thuringiensis (Bt) e isolados de Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Metarhizium rileyi. As populações foram coletadas em lavouras de soja nos municípios de Rio Verde (GO) e Luís Eduardo Magalhães (BA) e criadas em laboratório até a décima geração antes do início dos bioensaios. Os formulados utilizados foram Dipel® PM (B. thuringiensis var kurstaki), Xentari® WG (B. thuringiensis var. aizawai) e Agree® WG (B. thuringiensis var. aizawai GC91 transconjugado com B. thuringiensis var. kurstaki), com a aplicação de 50 ?L da suspensão do produto biológico, na concentração de 107 esporos viáveis/mL, sobre a superfície da dieta acondicionada em recipientes esféricos de plástico (2 cm de diâmetro x 3 cm de altura). Em cada recipiente foi inserida uma lagarta, de cada instar larval, em um total de 100 lagartas por tratamento distribuídas em 10 repetições. As avaliações referentes à mortalidade foram efetuadas a cada 24 horas, até o sétimo dia após a aplicação dos tratamentos. Os fungos B. bassiana e M. anisopliae foram obtidos a partir dos produtos comerciais biológicos Boveril® PM e Metarril® PM, respectivamente, enquanto que M. rileyi foi isolado de cadáveres de H. armigera, sendo padronizados na concentração de 108 conídios viáveis/mL. Como unidade experimental foram utilizados recipientes de plástico (2 cm de diâmetro x 3 cm de altura), com dieta artificial na qual uma alíquota de 50 ?L do fungo foi misturada ou aplicada na superfície. Em cada recipiente foi inserida uma lagarta de primeiro instar, com menos de 24 h de vida, totalizando 100 lagartas por tratamento distribuídas em 10 repetições. A mortalidade foi avaliada a cada 24 h, até o décimo dia após a aplicação dos tratamentos. Lagartas de primeiro instar de H. armigera, de ambas ... / The research aimed to assess the suscetibility of two distinct Brazilian populations of Helicoverpa armigera to commercial Bacillus thuringiensis insecticides and isolates of Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Metarhizium rileyi.The pest populations were collected in soybean fields located in Rio Verde (GO) and Luís Eduardo Magalhães (BA), taken to laboratory and reared until the tenth generation on artificial diet, to be used in the experiment.The bioassays were performed using spherical plastic receptacles (2-cm diameter x 3- cm height) containing artificial diet until complete the half volume. The formulated products used were Dipel® WP (B. thuringiensis var kurstaki), Xentari® WG (B. thuringiensis var. aizawai) and Agree® WG (B. thuringiensis var. aizawai GC91 with B. thuringiensis var. kurstaki), spraying 50 ?L of biological product solution at 107 viable spores/mL, on the surface of the diet. One caterpillar was inserted in each receptacle, related with larval instar, totaling 100 caterpillars per treatment and each group containing 10 caterpillars were considered a replication. Mortality were assessed each 24h, until the seventh day after the beginning of the bioassay. To perform the bioassays with entomopathogenic fungi, B. bassiana and M. anisopliae were obtained from the bio-insecticides Boveril® WP and Metarril® WP, respectively and M. rileyi was isolated from H. armigera cadavers at concentration of 108 viable conidia/mL. The bioassays were performed using spherical plastic receptacles (2-cmdiameter x 3-cm height) containing artificial diet until complete the half volume. After this step, a solution of 50 ?L containing the entomopathogenic fungi was sprayed on the diet surface. One caterpillar was inserted in each receptacle, with less than 24 h after hatch, totaling 100 caterpillars per treatment. Each group containing 10 caterpillars were considered a replication. Mortality were assessed each 24h, until ...

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-10-10Bitstream added on 2015-03-03T12:07:10Z : No. of bitstreams: 1 000807201.pdf: 483466 bytes, checksum: 9ce1194dfbf09ca15305e2a818f8d540 (MD5) / O objetivo dessa pesquisa foi analisar a compatibilidade entre produtos químicos e biológicos, a patogenicidade de Bacillus thuringiensis que cresceu em meio contendo inseticidas químicos e o efeito dos diferentes ingredientes ativos azadiractina, flubendiamida, bifentrina, espinosade e beta-ciflutrina e de três produtos biológicos comerciais à base de B. thuringiensis sobre lagartas de primeiro ínstar de T. absoluta. Os produtos químicos utilizados foram: azadiractina (Azamax®), flubendiamida (Belt®), bifentrina (Talstar® 100EC), espinosade (Tracer®) e beta-ciflutrina (Turbo®) e os bioenseticidas Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Dipel®), B. thuringiensis aizawai (Xentari®) e B. thuringiensis var. aizawai GC-91 (Agree®) . Para avaliar a compatibilidade foram mensuradas a área de crescimento das colônias (cm2) e efetuada a contagem dos esporos. Já para os testes de mortalidade das lagartas foram utilizados 5 folíolos de plantas de tomate de aproximadamente 8 cm imersos nas suspensões por 10 segundos. Sobre cada folíolo foram colocadas 20 lagartas de primeiro ínstar de T. absoluta. Para a testemunha foi utilizada água destilada autoclavada e 0,05% de Tween 20®. Nenhum produto químico impediu o crescimento de B. thuringiesis (Agree®, Dipel® e Xentari®), independente da dose utilizada (mínima, média recomendada ou máxima). Tracer® e Azamax® proporcionaram maior tamanho de colônias em relação à testemunha. As três suspensões dos produtos biológicos (Agree®, Dipel® e Xentari®) que cresceram em Nutriente Agar + inseticidas químicos foram patogênicas à lagartas de primeiro ínstar de T. absoluta. No sétimo dia de avaliação da mortalidade foi observado que o produto biológico Xentari® X Belt®, dose mínima, apresentou 100% de mortalidade. Na avaliação de mortalidade dos produtos no sétimo dia de avaliação o produto Turbo® apresentou menor porcentagem de mortalidade em relação aos ... / The aim of this study was to evaluate the compatibility between chemicals and biological insecticides, pathogenicity of Bacillus thuringiensis grown in medium containing chemical insecticides and the effect of the active ingredients Azadirachtin, Flubendiamide, Bifenthrin, Spinosad and Beta-cyfluthrin and those of three commercial Bt-based insecticides to control first instar caterpillars of T. absoluta. The chemicals used were: Azadirachtin (Azamax®), Flubendiamide (Belt®), Bifenthrin (Talstar®100 EC), Beta-cyfluthrin (Turbo®) and Spinosad (Tracer®) and bioinsecticides Dipel® (Bacillus thuringiensis kurstaki) Xentari® (Bacillus thuringiensis aizawai) and Agree® (Bacillus thuringiensis kurstaki + aizawai). To assess the compatibility we measured the colony growth area (cm2) and spores were counted. To evaluate the larval mortality, 5 leaflets with 8 cm were immersed in suspensions for 10 seconds were used. On each leaflet we placed 20 first instar larvae of T. absoluta. For the control, autoclaved distilled water and 0.05% Tween® 20 were used to immerse the leaflets. None of chemical insecticides prevented the growth of B. thuringiesis (Dipel®, Agree® and Xentari®), independent of dosage [minimum, half (recommended) or maximum]. Tracer® and Azamax® provided greater colony size compared to control. The three suspensions of Bt-based insecticides (Agree®, Dipel® and Xentari®) grown on Nutrient Agar + chemical insecticides were pathogenic to first instar larvae of T. absoluta. At the seventh day assessment of mortality, we observed that the biological insecticide Xentari® X Belt® at the lowest dose showed 100% of mortality. For the chemical insecticides at the seventh day, Turbo® showed the lowest mortality rate compared to the other products. The chemicals tested were compatible with Bt-based insecticides under laboratory conditions, showing possibilities to be adopted jointly to control T. absoluta after the ...

Orientador: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Arlindo Leal Boiça Junior / Banca: Roberto Marchi Goulart / Resumo: Spodoptera albula é uma praga polifaga e cosmopolita sendo que no Brasil não existem produtos registrados para o seu controle embora recentemente alguns agricultores tenham relatados surtos desta espécie em lavouras de soja no estado do Mato Grosso. Desta forma, é de extrema importância o desenvolvimento de táticas de controle eficientes para esta praga e que ao mesmo tempo sejam pouco agressivas ao meio ambiente e à sociedade. Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica altamente eficiente no controle de lepidópteros praga e apresenta toxicidade para várias espécies do gênero Spodoptera. A atividade tóxica de isolados e bioinseticidas à base de Bt foi avaliada utilizando lagartas de segundo instar de S. albula em bioensaios de mortalidade e virulência, bem com os efeitos subletais do Bt nas lagartas sobreviventes aos tratamentos. Os bioinseticidas Agree, Xentari e Dipel SC foram selecionados para os bioensaios de virulência, sendo que o primeiro foi o mais virulento e, portanto o mais promissor para o manejo desta praga. Também foi observada diferença na toxicidade entre as formulações do Dipel. Entre os isolados nenhum se destacou no controle desta praga e o isolado Bt05 afetou o desenvolvimento das lagartas resultando em menor peso de pré-pupa e pupa em relação a testemunha / Abstract: Spodoptera albula is a polyphagous and cosmopolitan pest and in Brazil there are no products registered for their control although some farmers have recently been reported outbreaks of this specie in soybean in the Mato Grosso state. Thus, it is extremely important to developing effective tactics to control this pest that are less harmful to the environment and society. Bacillus thuringiensis (Bt) is a highly efficient entomopathogenic bacterium in lepidopterous pest control and it is toxic to several species of Spodoptera genus. The toxic activity of Bt isolates and Bt biopesticides was evaluated using S. albula second instar larvae in mortality and virulence bioassays, and evaluating the sublethal Bt effects on larvae surviving to treatment. The biopesticides Agree, Xentari and Dipel SC were selected for bioassay virulence. Agree was the most virulent and therefore the most promising for the S. albula management. It was also observed differences in toxicity between Dipel formulations. All Bt isolates tested were not good for the control of this pest and the isolate BT05 affected the development of larvae resulting in lower weight of pre-pupa and pupa compared to control / Mestre

Orientadora: Janete Apparecida Desidério / Banca: Agda Paula Facincani / Banca: Irlan Leite de Abreu / Resumo: Como uma alternativa para diminuir as agressões constantes que o ecossistema vem sofrendo, devido à grande quantidade de produtos químicos utilizados no controle de pragas, pesquisas envolvendo microrganismos capazes de promover o controle biológico tem se intensificado. Dentre estes microrganismos a bactéria Bacillus thuringiensis tem se destacado. Essa bactéria caracteriza-se pela produção de proteínas tóxicas a representantes de diversas ordens de insetos. Em particular, as proteínas Vip3A, estão em amplo estudo devido a sua especificidade, alto potencial ativo e como alternativa para o controle da resistência de insetos às proteínas Cry. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi selecionar, a partir de 1080 isolados de diferentes regiões brasileiras, aqueles portadores de genes vip3A e obter a sequência de nucleotídeos completa dos mesmos. As linhagens padrão B. thuringiensis var. kurstaki HD1, B. thuringiensis var. tolworthi HD125 e o isolado I187 tiveram seus DNAs amplificados com oligonucleotídeos baseados na sequência de genes vip3A, descritos no banco de dados de B. thuringiensis e, a partir dos amplicons obtidos, a sequência completa de nucleotídeos dos mesmos foi determinada, utilizando-se da estratégia de "primer walking". A proteína Vip3Aa43 (GenBank: [HQ594534]) da linhagem HD1 demonstrou ser 100% idêntica às proteínas Vip3Aa já descritas. Já as proteínas Vip3Aa42 (GenBank: [HQ587048]) da linhagem HD125 e Vip3Ag5 (GenBank: [HQ542193]) do isolado I187 demonstraram similaridade de 99% com as proteínas descritas Vip3Aa35 e Vip3Ag2, respectivamente, demonstrando serem duas novas proteínas Vip3A, devido às substituições de aminoácidos ocorridas. Os três genes vip3A obtidos poderão ser utilizados na produção de plantas Bt, piramidadas ou não, visando ao manejo da resistência dos insetos praga / Abstract: As an alternative to decrease the constant aggressions that the ecosystem has suffered due to the large amount of chemical products used in pest control, researches involving microorganisms able to promoting biological control have been intensified. Among these microorganisms the bacterium Bacillus thuringiensis has been stood out. This bacterium is characterized by the production of toxic proteins to representatives of several insect orders. In particular, the Vip3A proteins are in large study due to its specificity, and high active potential as an alternative to control of insect's resistance to Cry proteins. According to this, the aim of this work was to select from 1080 isolates in different Brazilian regions, those carrying vip3A genes and obtain the complete nucleotide sequence of the same. The standard strains B. thuringiensis var. kurstaki HD1, B. thuringiensis var. tolworthi HD125 and the isolate I187 had their DNA amplified with primers based on vip3A gene sequence described in database of B. thuringiensis, and from the amplicons obtained, the full sequence of nucleotides was determined, by the use of the strategy of "primer walking". The protein Vip3Aa43 (GenBank: [HQ594534]) of HD1 strain showed to be 100% identical to Vip3Aa proteins already described. However, the proteins Vip3Aa42 (GenBank: [HQ587048]) of HD125 strain and Vip3Ag5 (GenBank: [HQ542193]) of the isolate I187 showed 99% similarity with the Vip3Aa35 and Vip3Ag2 proteins described, respectively, showing been two new Vip3A proteins due to amino acid substitutions occurred. The three vip3A genes obtained can be used in the production of Bt crops, pyramidal or not, aiming to resistance management of pest insects / Mestre

Orientador: Ricardo Antônio Polanczyk / Banca: Arlindo Leal Boiça Junior / Banca: Sergio Antonio de Bortoli / Banca: Luís Garrigós Leite / Banca: josé Roberto Scarpellini / Resumo: Objetivou-se avaliar a ação do Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Berliner) no epitélio do intestino médio de lagartas de Brassolis sophorae L. (Linnaeus). O trabalho foi realizado no período de janeiro a novembro de 2015 no Laboratório de Entomologia Agrícola Aplicada da Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), Belém-PA. As lagartas foram coletadas na plantação de palma de óleo da empresa Companhia Reais Agroindustriais, pertencente ao Grupo AGROPALMA, localizada no km 70 da Rodovia PA-150, Município de Tailândia, Pará (Latitude: 2⁰ 38' S. Longitude: 48⁰ 13' W. Gr.). Aplicou-se formulação comercial Dipel® de B. thuringiensis var. kurstaki por meio de imersão de folhas de palma de óleo, previamente lavadas em água destilada e secas em temperatura ambiente, as quais foram incorporadas à dieta fornecida às lagartas de terceiro instar de B. sophorae mantidas em recipientes plásticos. A aplicação do bioinseticida por meio da imersão das folhas de palma de óleo mostrou-se eficiente no controle de lagartas, atingindo níveis de 100% de mortalidade em todas as concentrações utilizadas (0,25; 0,5; 0,75 e 1,00 L/ha) variando para menos o tempo de efetividade de acordo com o aumento da concentração. Sintomas de infecção pelo B. thuringiensis foram identificados nas lagartas e confirmadas através da observação microscópica de alterações morfológicas e formação de vacúolos no citoplasma das células epiteliais do intestino médio das lagartas. A utilização do Dipel® nessas concentr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed to evaluate the action of Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Berliner) in the midgut epithelium crawler Brassolis sophorae L. (Linnaeus). The work was carried out from January to November 2015 in Applied Agricultural Entomology Laboratory of the Federal Rural University of Amazonia (UFRA), Belém-PA. Larvae were collected in the oil palm plantation company Royal Agroindustrial company belonging to AGROPALMA Group, located at kilometer 70 of Highway PA-150, City of Thailand, Pará (Latitude: 2⁰ 38 'S. Longitude: 48⁰ 13' W. Gr.). applied Dipel® commercial formulation of B. thuringiensis var. kurstaki by dipping palm leaf oil, previously washed with distilled water and dried in room temperature water, which were incorporated into the diet fed to third instar larvae of B. sophorae kept in plastic containers. The application of the biopesticide by immersing the oil palm leaves was efficient in the control of caterpillars, reaching levels of 100% mortality in all used concentrations (0.25, 0.5, 0.75 and 1, 00 L / ha) for less time varying effectiveness according to the concentration. Symptoms of infection with B. thuringiensis were identified in the caterpillars and confirmed by microscopic observation of morphological changes and vacuole formation in the cytoplasm of epithelial midgut cells of caterpillars. The use of these concentrations resulted Dipel® location cytotoxic effect, producing histolysis in the midgut of track B. sophorae leading probably abnormal o... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

FARIAS, D. F. Biossegurança alimentar de proteínas Cry: dos métodos clássicos à era ômica. 2013. 242 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2014-11-26T21:13:54Z No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2014-12-22T18:43:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-22T18:43:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tes_dffarias.pdf: 7077086 bytes, checksum: 0f15c85068dcdf054a10234ce13093a8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Currently at least 12 varieties of cotton expressing Cry proteins from Bacillus thruringiensis (Bt) are released for sale in Brazil to confer resistance to insect attack. However, these proteins are active against lepidopteran, whereas the major pest of Brazilian cotton is a beetle, the cotton boll weevil (Anthonomus grandis). In this context, great efforts have been dedicated in the search for new Cry molecules active against coleopteran. Using techniques of in vitro directed molecular evolution, the Cry8Ka5 mutant protein was developed, which is several times more toxic against the boll weevil than the original protein, Cry8Ka1, initially discovered. Given its promising activity against coleopteran, Cry8Ka5 is being used for the development of a new Bt cotton, as well as of other Bt crops of economic importance. However, as part of legal requirements for the commercial release of a transgenic plant, the recombinant products should be tested for their food safety (FS) in order to detect potential allergenic, toxic and antimetabolic effects. This study aimed to perform a comprehensive FS assessment of the Cry8Ka5 mutant protein and of the Cry1Ac protein, already incorporated in several commercialized Bt crops. The latter was used as a protein control or test depending on the originality of the approach used in each section of this work. The FS evaluation performed covered not only the legal requirements but also the implementation of methodologies hitherto never proposed to assess the safety of consumption of Bt. For that, this study was structured in four chapters. Chapter 1 aimed to conduct a literature review on the state of the art of Bt plants and Cry proteins, as well as provide a general understanding of the concepts and current legislation in GM plants FS. Chapter 2 aimed to evaluate the FS of Cry8Ka5 mutant entomotoxin through the two-step method based on weights of evidence that, in turn, meets the recommendations of CTNBio. In this section, the Cry1Ac protein was used as experimental control, since similar approaches have already been performed with this molecule. Based on official methods, we conclude that it is not expected any risk associated with consumption of protein Cry8Ka5 due to the following results found: 1. Bt products were shown to have a long history of safe use, 2. The protein showed no significant similarity in its primary amino acid sequence with known allergenic, toxic and/or antinutritional proteins; 3. The mode of action and high specificity against insects of Cry proteins are well known; 4. Cry8Ka5 was highly susceptible to digestion in simulated gastric fluid; 5. The protein Cry8Ka5 caused no significant adverse effects in mice (5,000 mg protein/kg body weight, orally, single dose). Chapter 3 aimed to evaluate the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins as to their cyto- and genotoxicity in a serie of conventional and alternative tests as well as antimicrobial effects. The proteins did not cause cyto- or genotoxic effects in human lymphocytes (both with IC50 > 1,000 µg/mL in all tests), did not cause hemolysis in human (types A, B, AB and O), rabbit and rat (both with IC50 > 1,000 µg/mL for all species) rythrocytes, but only Cry8Ka5 caused changes in the topography of the cell membrane of human O type erythrocytes at a concentration of 1,000 µg/mL, detected by atomic force microscopy. Furthermore, the Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins showed no cytotoxicity against Artemia sp. nauplii (LC50 > 700 and >1000 µg/mL, respectively), and did not inhibit the growth of four strains of bacteria and four of yeasts (both with MIC > 1,000 µg/mL for all microrganisms tested). Finally, Chapter 4 aimed to evaluate the effects of Cry8Ka5 and Cry1Ac proteins and of a "pool" of peptides of each one (Cry8Ka5-pep and Cry1Ac-pep, respectively), obtained by in vitro sequential digestion, on the gene expression profile of MCF-7 breast carcinoma cells and Caco-2 colon carcinoma cells, both human. No sample caused changes in the gene expression profile of differentiated Caco-2 cells (used as a model for human intestinal epithelium), even when tested at high concentration (100 µg/mL). In the exposure tests with undifferentiated MCF-7 cells, only Cry1Ac (at 100 µg/mL) caused significant changes in the gene expression pattern. However, this effect was not detected after treatment of these cells with the sample digested of Cry1Ac Cry1Ac-pep), which, in turn, better mimic actual conditions of exposure to Cry molecules. The experimental approaches used in the last three chapters were quite useful and, after all the above, it was possible to confirm the harmless nature of the Cry1Ac protein and conclude that the Cry8Ka5 protein is a safe biotechnological tool for the development of Bt cotton plants to confer resistance against the cotton boll weevil attack. / Atualmente são liberadas para comercialização no mercado agrobiotecnológico brasileiro, pelo menos, 12 variedades de algodão expressando proteínas Cry de Bacillus thruringiensis (Bt) para conferir resistência ao ataque de insetos. Contudo, essas proteínas são ativas contra lepidópteros, enquanto que a principal praga da cotonicultura brasileira é um coleóptero, o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis). Neste contexto, têm-se feito um grande esforço na busca por novas moléculas Cry ativas contra coleópteros. Utilizando técnicas de evolução molecular dirigida in vitro, foi desenvolvida a proteína mutante Cry8Ka5, que é várias vezes mais tóxica contra o bicudo do que a proteína original, Cry8Ka1, inicialmente descoberta. Dada a sua atividade promissora contra coleópteros, Cry8Ka5 está sendo utilizada para o desenvolvimento de um novo algodão Bt, bem como de outras culturas Bt de importância econômica. No entanto, como parte das exigências legais para a liberação comercial de uma planta transgênica, essa proteína recombinante deve ser testada quanto a sua biossegurança alimentar (BA) a fim de detectar potenciais efeitos alergênicos, tóxicos e/ou antimetabólicos. Assim, este trabalho objetivou realizar uma ampla avaliação de BA da proteína mutante Cry8Ka5 e da proteína Cry1Ac, já incorporada em várias culturas Bt comercializadas. A última foi utilizada como proteína controle ou teste dependendo do ineditismo da abordagem empregada em cada seção do trabalho. Nesse âmbito, a avaliação de BA proposta cobriu desde as exigências legais até a execução de metodologias, até então, nunca propostas para avaliação de segurança de consumo de produtos de Bt. Para tanto, este trabalho estruturou-se em quatro capítulos. O Capítulo 1 objetivou realizar uma revisão da literatura acerca do estado da arte das plantas Bt e proteínas Cry, bem como fornecer um entendimento geral sobre os conceitos e a legislação vigente em BA de plantas GM. Já o Capítulo 2 objetivou avaliar a BA da entomotoxina mutante Cry8Ka5 através do método de duas etapas baseado em pesos de evidência que, por sua vez, atende a todas as recomendações da CTNBio. Neste caso, a proteína Cry1Ac foi utilizada como controle experimental, pois abordagens similares já foram realizadas com essa molécula. Baseando-se nos métodos oficiais, é possível concluir que não é esperado qualquer risco associado ao consumo da proteína Cry8Ka5 devido aos seguintes resultados encontrados: 1. Produtos Bt mostraram ter longo histórico de uso seguro; 2. A proteína Cry8Ka5 não mostrou similaridade significativa de sua sequência de aminoácidos primária com proteínas alergênicas, tóxicas e/ou antinutricionais; 3. As proteínas Cry mostraram possuir modo de ação bastante compreendido e elevada especificidade contra insetos; 4. Cry8Ka5 foi altamente susceptível à digestão em fluído gástrico simulado; 5. A proteína Cry8Ka5 não causou efeitos adversos relevantes em camundongos (5.000 mg de proteína/Kg de peso corpóreo, via oral, dose única). Por sua vez, o Capítulo 3 objetivou avaliar a proteína Cry8Ka5 e a Cry1Ac quanto aos seus efeitos cito- e genotóxicos em uma série de testes clássicos e alternativos, além de pesquisar seus efeitos antimicrobianos. As proteínas não causaram efeitos cito- ou genotóxicos em linfócitos humanos (ambas com CI50 > 1.000 µg/mL em todos os testes), não promoveram hemólise em suspensões de eritrócitos de humanos (tipos A, B, AB e O), de coelho e rato (ambas com CI50 > 1.000 µg/mL para todas as espécies), enquanto somente a Cry8Ka5 causou alterações na topografia de membrana celular de eritrócitos humanos do tipo O, na concentração de 1.000 µg/mL, detectadas via microscopia de força atômica. Além disso, as proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac não apresentaram citotoxicidade elevada contra naúplios de Artemia sp. (CL50 > 700 e > 1000 µg/mL, respectivamente) e não inibiram o crescimento de quatro cepas de bactérias e quatro de leveduras (ambas com CIM > 1.000 µg/mL para todos os microrganismos testados). Por fim, o Capítulo 4 objetivou avaliar os efeitos das proteínas Cry8Ka5 e Cry1Ac e de um “pool” de peptídeos de cada uma (Cry8Ka5-pep e Cry1Ac-pep, respectivamente), obtidos por digestão sequencial in vitro, sobre o perfil de expressão gênica de células de carcinoma de mama MCF-7 e de carcinoma de cólon Caco-2, ambas de origem humana. Nenhuma das amostras testadas causou alterações no perfil de expressão gênica das células Caco-2 diferenciadas (utilizadas como um modelo de epitélio intestinal humano), mesmo quando testadas em alta concentração (100 µg/mL). Nos testes de exposição com células MCF-7 indiferenciadas, apenas a proteína Cry1Ac causou alterações significativas no padrão de expressão gênica. Contudo, esse efeito não foi detectado após tratamento dessas células com a amostra digerida de Cry1Ac (Cry1Ac-pep), que, por sua vez, mimetiza melhor as condições reais de exposição às moléculas Cry. As abordagens experimentais utilizadas nos três últimos capítulos mostraram-se bastante úteis e, após tudo que foi exposto, foi possível confirmar o caráter inócuo da proteína Cry1Ac, bem como concluir que a proteína Cry8Ka5 é uma ferramenta biotecnológica segura para o desenvolvimento de plantas de algodão Bt para conferir resistência ao ataque do bicudo-do-algodoeiro.

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-13. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:57Z : No. of bitstreams: 1 000848691.pdf: 292702 bytes, checksum: c164b1940d843e7e3969defa025270fa (MD5) / Spodoptera albula é uma praga polifaga e cosmopolita sendo que no Brasil não existem produtos registrados para o seu controle embora recentemente alguns agricultores tenham relatados surtos desta espécie em lavouras de soja no estado do Mato Grosso. Desta forma, é de extrema importância o desenvolvimento de táticas de controle eficientes para esta praga e que ao mesmo tempo sejam pouco agressivas ao meio ambiente e à sociedade. Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica altamente eficiente no controle de lepidópteros praga e apresenta toxicidade para várias espécies do gênero Spodoptera. A atividade tóxica de isolados e bioinseticidas à base de Bt foi avaliada utilizando lagartas de segundo instar de S. albula em bioensaios de mortalidade e virulência, bem com os efeitos subletais do Bt nas lagartas sobreviventes aos tratamentos. Os bioinseticidas Agree, Xentari e Dipel SC foram selecionados para os bioensaios de virulência, sendo que o primeiro foi o mais virulento e, portanto o mais promissor para o manejo desta praga. Também foi observada diferença na toxicidade entre as formulações do Dipel. Entre os isolados nenhum se destacou no controle desta praga e o isolado Bt05 afetou o desenvolvimento das lagartas resultando em menor peso de pré-pupa e pupa em relação a testemunha / Spodoptera albula is a polyphagous and cosmopolitan pest and in Brazil there are no products registered for their control although some farmers have recently been reported outbreaks of this specie in soybean in the Mato Grosso state. Thus, it is extremely important to developing effective tactics to control this pest that are less harmful to the environment and society. Bacillus thuringiensis (Bt) is a highly efficient entomopathogenic bacterium in lepidopterous pest control and it is toxic to several species of Spodoptera genus. The toxic activity of Bt isolates and Bt biopesticides was evaluated using S. albula second instar larvae in mortality and virulence bioassays, and evaluating the sublethal Bt effects on larvae surviving to treatment. The biopesticides Agree, Xentari and Dipel SC were selected for bioassay virulence. Agree was the most virulent and therefore the most promising for the S. albula management. It was also observed differences in toxicity between Dipel formulations. All Bt isolates tested were not good for the control of this pest and the isolate BT05 affected the development of larvae resulting in lower weight of pre-pupa and pupa compared to control

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-18Bitstream added on 2014-06-13T20:52:57Z : No. of bitstreams: 1 laurentis_vl_me_jabo.pdf: 513772 bytes, checksum: 73a372dc0e5a8eefae0dce1ee2a31a2d (MD5) / O objetivo deste estudo foi verificar, por meio de métodos moleculares, possíveis diferenças entre populações de Plutella xylostella (PX, PA, PC e PJ) de três estados brasileiros produtores de brassicáceas e avaliar a suscetibilidade e os efeitos subletais nestas populações à bioinseticidas e isolados de Bacillus thuringiensis. Foram utilizados os métodos de sequenciamento do gene COI e ISSR-PCR para analisar a estrutura genética das populações. Para avaliar a suscetibilidade e os efeitos subletais foram pulverizados em discos foliares de couve de 8 cm de diâmetro os isolados 153.30A, 49.19A, T08.024, E7, E28, E47, 41.7L, 20.7L, HD-1 e Bt tenebrionis e os produtos Btt090®, Dipel®, Agree® e Xentari®. Após a secagem, os discos foliares foram oferecidos para alimentação de lagartas de segundo ínstar de P. xylostella de cada população, em placas de Petri. As pupas foram individualizadas em placas com poços tipo Elisa® até a emergência dos adultos. Os adultos foram separados em casais e transferidos para gaiolas para oviposição. Os insetos foram observados até a morte dos adultos, sendo avaliado: viabilidade e duração larval e pupal, consumo foliar, peso das pupas, razão sexual, longevidade, número de ovos/fêmea/dia, período de incubação e viabilidade dos ovos. Os produtos/isolados que causaram mortalidade superior a 80% foram utilizados para estimar os valores de CL50. As populações apresentaram diferenças nas estruturas genéticas, sendo PJ a mais diferente. Os produtos Agree®, Dipel® e Xentari® e os isolados 49.19A, E47 e HD1 causaram 100% de mortalidade para todas as populações. De modo geral, Dipel® e HD1 foram mais tóxicos dentre os produtos e isolados, respectivamente, devido às menores CL50. Os isolados T08.024 e E28 foram os que mais afetaram negativamente as características biológicas da... / The aim of this study was to detect possible differences among populations of Plutella xylostella (PX, PA, PC and PJ), from three Brazilian states that produce brassicaceas, and to evaluate the susceptibility and sublethal effects of these populations to Bacillus thuringiensis bioinsecticides and strains. We used the methods of COI gene sequencing and ISSR-PCR to analyze the genetic structure of the populations. To evaluate the susceptibility and sublethal effects, isolates 153.30A, 49.19A, T08.024, E7, E28, E47, 41.7L, 20.7L, HD-1 and Bt tenebrionis and products Btt090®, Dipel®, Agree® and Xentari® were sprayed on 8-cm-diameter kale leaf discs. After drying, the leaf disks were offered to fed second instar caterpillars of P. xylostella from each population, in Petri dishes. The pupae were placed in separated wells plates with Elisa ® until adult emergence. The adults were separated into couples and transferred to cages for oviposition. We observed the insects until the adults death, evaluating: larval and pupal viability and period, leaf consumption, pupal weight, sex ratio, longevity, number of eggs/female/day, incubation period and egg viability. Products/strains that caused mortality exceeding 80% were used to estimate the values of LC50. The populations showed differences in genetic structures, being PJ the most different one. Agree®, Dipel®, Xentari®, and the isolates 49.19A, E47 and HD1 caused 100% mortality for all populations. Generally, HD1 and Dipel® were the most toxic among products and strains, due to lower LC50. The isolates T08.024 and E28 were the ones that most affected negatively the biological characteristics of the pest, despite they didn’t cause 100% of mortality... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-22Bitstream added on 2014-06-13T20:32:41Z : No. of bitstreams: 1 viana_cltp_me_jabo.pdf: 681354 bytes, checksum: 292f317000f87f4932ed390de403036a (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Biologia e Criação de Insetos (LBCI) e no Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA) da FCAV-UNESP,Campus de Jaboticabal, SP. O objetivo geral foi selecionar novos isolados de Bacillus thuringiensis através da caracterização molecular, identificando as diferentes subclasses do gene cry1, determinar a patogenicidade contra lagartas de Plutella xylostella e avaliar a influência no ciclo biológico da praga. Foram utilizados 95 isolados de B. thuringiensis obtidos da coleção do LGBBA. O material genético foi extraído pela matriz de troca iônica Kit Instagene Matrix e submetido a PCR com iniciadores gerais para o gene cry1 e específicos para as subclasses. Realizaram-se bioensaios com 58 isolados, um controle positivo com a linhagem padrão HD-1 B. thuringiensis var. kurstaki, um controle negativo com B. thuringiensis var. tenebrionis e água com espalhante adesivo, como testemunha. O conteúdo das subclasses estudadas para o gene cry1 foi determinado para 58 isolados, o que representa 60% do total. Dentre os 95 isolados estudados, 27,4% demonstraram que o conjunto gênico cry1Aa, cry1Ca, cry1Da, cry1Fa e cry1Bd é a freqüência mais comum. Dos 58 isolados testados, 11 causaram mortalidade total das lagartas e os demais influenciaram negativamente o ciclo biológico da praga. Dentre as características avaliadas, a mortalidade larval e a pupal, bem como a duração larval foram as mais relevantes para se determinar quais isolados influenciaram a biologia da praga. Portanto, os isolados que causaram 100% de mortalidade larval têm grande potencial para formulação de produtos comerciais a serem utilizados em programas de manejo integrado de P. xylostella. / The research was developed in the Laboratório de Biologia e Criação de Insetos (LBCI) and in the Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA) at the FCAV-UNESP-Campus de Jaboticabal, SP. The general objective was to select new strains of Bacillus thuringiensis through the molecular characterization, identifying the different subclasses of the gene cry1, to determine the patogenicity against caterpillars of Plutella xylostella and to evaluate the influence in the pest biological parameters. It was used 95 isolated of B. thuringiensis obtained of the collection of LGBBA. The genetic material was extracted by the head office of change ionic Kit Instagene Matrix and submitted to PCR with general initiators for the gene cry1 and specific for the subclasses. Bioassays were made using 58 strains of B. thuringiensis, a positive control with var. tenebrionis and water was used with adhesive spreader Tween20®, as a standard the strains HD1 from B. thuringiensis var. kurstaki, a negative control with B. thuringiensis check. The content of the subclasses studied for the gene cry1 was determined for 58 isolated, what represents 60% of the total. Among the 95 isolated studied, 27,4% demonstrated that the genic group cry1Aa, cry1Ca, cry1Da, cry1Fa and cry1Bd is the most common frequency. Total mortality of caterpillars was observed in 11 of studied strains and the remainders affected negatively pest biological lifecycle. Larvae and pupae mortality, and larvae period were more relevants parameters to determine which isolates affect P. xylostella biology. In this way, the isolates caused 100 % larval mortality have higher potential for development a commercial bioinseticide to use in Plutella xylostella integrated pest management programs.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-25Bitstream added on 2014-06-13T18:29:31Z : No. of bitstreams: 1 figueiredo_cs_me_jabo_parcial.pdf: 433594 bytes, checksum: 5db23a3d4c3ab1bce497f29f193cd674 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-25T13:00:47Z: figueiredo_cs_me_jabo_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-25T13:03:13Z : No. of bitstreams: 1 000718405_20160225.pdf: 327253 bytes, checksum: 949c202d3f1b517f66218611f9a1bd5a (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-26T14:03:56Z: 000718405_20160225.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-26T14:04:50Z : No. of bitstreams: 1 000718405.pdf: 781931 bytes, checksum: cd606945171aa0e2251919afe0b3aec7 (MD5) / A bactéria Bacillus thuringiensis é vista como uma das melhores opções no controle biológico devido à ação entomopatogênica e a especificidade de suas proteínas. As proteínas Vip3, que são secretadas durante o crescimento vegetativo do B. thuringiensis, atuam no controle de importantes lepidópteros praga. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um gene vip3A de um isolado de B. thuringiensis, expressar a proteína e verificar sua toxicidade contra larvas de Anticarsia gemmatalis e. Spodoptera frugiperda Para tanto, o gene foi amplificado com iniciadores específicos por PCR, gerando um fragmento de 2370 pb. O fragmento foi clonado em vetor pGEM - T Easy para sequenciamento, subclonado em vetor de expressão pET-28a (+) e o conjunto inserido em células de Escherichia coli BL21 (DE3). A expressão da proteína foi induzida por IPTG, a proteína Vip3Aa50 foi visualizada em SDS-PAGE e detectada por “Western blotting”. Os ensaios de toxicidade revelaram alta virulência às larvas neonatas de A. gemmatalis e S. frugiperda, sendo as larvas da população de A. gemmatalis mais sensíveis. O isolado utilizado neste estudo é altamente promissor como fonte de gene vip3A para controle de ambas as pragas por meio da produção de plantas transgênicas como milho e soja. / The bacterium Bacillus thuringiensis is seen as one the best options for the biological control due to entomopathogenic action and protein specificity. The Vip3 proteins, which are secreted during the vegetative growth of B. thuringiensis, act to the control the most important lepidopteran pests. The aim of this study was to characterize a vip3A gene from an isolate of B. thuringiensis, to induce the protein and evalute its toxicity against Anticarsia gemmatalis and Spodoptera frugiperda larvae. Therefore, the gene was amplified by specific PCR’s primers, generating a 2370 pb fragment. The fragment was cloned into the pGEM-T Easy vector and subsequently, it was sequenced and subcloned into the pET-28a (+)’s expression vector and inserted in to the Escherichia coli BL21 (DE3) cells. The Vip3Aa50 protein expression was induced by IPTG, observed using SDS-PAGE and detected by Western blotting. The toxicity bioassay showed intense virulence for A. gemmatalis and S. frugiperda’s neonate larvae. The results showed that A. gemmatalis larval population was more sensitive. The isolate used in this study is highly promising as vip3A source gene to control both plagues through transgenic plant production, such as, corn and soybean.