Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 742482 bytes, checksum: 16c68ac95e43019b42c1b1b057afd7e3 (MD5) Previous issue date: 2014-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Because of the diversity of its indigenous microbiota, goat milk is considered a good source of new strains of lactic acid bacteria (LAB) with potential for exploitation as alternatives to food biopreservation. The increasing consumer demand for these alternatives justifies studies to investigate the antimicrobial potential of these microorganisms. The present study aimed to evaluate the genetic diversity and the antimicrobial action range of autochthonous strains of BAL isolated from goat milk that can be potentially used as biopreservatives in food. The bacteriocinogenic activity against Listeria monocytogenes and stability in different environmental conditions were also the target of this study. Fifty-seven isolates of BAL (33 isolates of Enterococcus spp., and 24 isolates of Lactococcus spp.), previously characterized as bacteriocinogenic by genotypic and phenotypic methods, were subjected to macrorestriction with SmaI and PFGE and their profiles were compared with the results of bacteriocinogenic genes previously searched. High genetic diversity was observed for both genders. Although PFGE showed sufficient discriminatory power, isolates with different results for bacteriocinogenic genes were grouped as identical in both genders. Twelve isolates from Lactococcus spp. and eighteen isolates of Enterococcus spp., representing different pulsotypes, were selected for evaluation of the antimicrobial activity range against 46 target microorganisms (including BAL, pathogens and spoilage microorganisms). Lactococcus strains showed a wide spectrum against the targets, especially against L. monocytogenes and Clostridium spp.. Enterococcus spp., similarly, was able to inhibit various targets, acting mainly against Listeria spp. Gram- negative microorganisms also showed sensitivity to isolates of both genders. Six isolates (four Enterococcus spp., and two Lactococcus spp.) were evaluated for bacteriocinogenic potential against L. monocytogenes strains from different serotypes and all of them were inhibited by bacteriocins produced by these LAB. Additionally, bacteriocins produced by these isolates showed a wide range of stability at different pH values and temperatures. The data showed that goat milk can contain a diverse microbiota able to inhibit microorganisms of interest to the food industry and can be potentially employed in biopreservation of foods produced at different processing conditions. / O leite de cabra, devido a diversidade de sua microbiota autóctone, é considerado uma boa fonte de novas cepas de Bactérias Ácido Láticas (BAL) com potencial para exploração como alternativas à biopreservação de alimentos. A crescente demanda dos consumidores por essas alternativas justifica estudos que investiguem o potencial antimicrobiano desses micro-organismos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a diversidade genética e o espectro de ação de cepas de BAL antagonistas autóctones de leite de cabra que podem ser potencialmente utilizadas como biopreservantes em alimentos. A atividade bacteriocinogênica contra Listeria monocytogenes e estabilidade das bacteriocinas em diferentes condições ambientais também foram alvo deste trabalho. Cinquenta e sete isolados de BAL (33 isolados de Enterococcus spp. e 24 isolados de Lactococcus spp.), previamente caracterizados como bacteriocinogênicos por metodologias genotípicas e fenotípicas, foram submetidos à macrorrestrição com a enzima SmaI e PFGE e seus perfis foram comparados aos resultados de genes bacteriocinogênicos previamente pesquisados. Alta variabilidade genética foi observada para ambos os gêneros. Embora o PFGE tenha apresentado poder discriminatório suficiente, isolados com diferentes resultados para genes de bacteriocinas foram agrupados como idênticos em ambos os gêneros. Doze isolados de Lactococcus spp. e dezoito isolados de Enterococcus spp., representativos de diferentes pulsotipos, foram selecionados para avaliação do espectro de ação antimicrobiana contra 46 micro- organismos indicadores (incluindo BAL, micro-organismos deteriorantes e patógenos). Os isolados de Lactococcus spp. demonstraram amplo espectro de ação sobre os micro-organismos alvo, com destaque para a atividade contra os patógenos L. monocytogenes e Clostridium spp.. Enterococcus spp., de modo similar, foi capaz de inibir diversos micro-organismos alvo, apresentando atividade principalmente contra Listeria spp. Cepas Gram-negativas também apresentaram sensibilidade aos isolados de ambos os gêneros. Seis isolados (quatro Enterococcus spp. e dois Lactococcus spp.) foram avaliados quanto ao potencial bacteriocinogênico contra cepas de L. monocytogenes de diferentes sorotipos e todos os sorotipos foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas pelas BAL. Adicionalmente, as bacteriocinas produzidas por estes isolados apresentaram ampla faixa de estabilidade em diferentes valores de pH e temperaturas. Os dados obtidos demonstraram que o leite de cabra pode conter uma microbiota bacteriocinogênica diversificada, capaz de inibir micro-organismos de interesse à indústria de alimentos, podendo ser potencialmente empregadas na bioconservação de alimentos produzidos em diferentes condições de processamento.

A produção de bacteriocina por Bactérias Ácido Lácticas tem atraído grande atenção por causa do seu status GRAS (Generally Recognized as Safe), e seu uso potencial como aditivo seguro para a conservação de alimentos. Em função de suas características antimicrobianas, as bacteriocinas têm sido testadas como bioconservadores em diversos produtos, mostrando atividade contra microrganismos patogênicos. Porém, o elevado custo de produção ainda tem sido um fator relevante para ampla utilização deste tipo de conservante. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade da produção de enterocinas, utilizando soro de leite parcialmente desmineralizado e água de maceração de milho (milhocina) como substrato. Foram avaliados 5 isolados de enterococos (Efm20, Efm22, Efm24, Efm25 e Efs27) produtores de enterocina em meio MRS frente a bactéria Listeria innocua CLIP 12612 e Listeria monocytogenes 2032. O meio de cutura MRS foi substituido na concentração de 25% por soro de leite ou milhocina. O ensaio da ação da enterocina foi realizado pelo método de difusão em poços. O caráter proteico da bacteriocina foi confirmado após incubação com enzimas proteolíticas α-quimiotripsina, protease e proteinase-K. A produção de peróxido de hidrogênio e ácido lático foram descartadas pela utilização de catalase e neutralização com NaOH. O sobrenadante livre de células (CFS) obtido em ambos substratos foram tratados a 80 °C e 100 °C, apresentando termoestabilidade. Os CFS obtidos em MRS com milhocina pelo isolado Efm22 (24 horas) atingiu 6400 UA/mL frente às duas bactérias indicadoras. Já os isolados Efm24 (24 horas) e Efm20 (18 horas) chegaram a 6400 UA/mL frente a Listeria innocua CLIP 12612. Em soro de leite, os maiores valores de UA/mL ocorreram pelos isolados Efm20, Efm25 e Efs27 (24 horas). Em conclusão, constatou-se que os substratos testados apresentam potencial para serem aplicados na fabricação de bioconservantes de produtos alimentícios. / The production of bacteriocin by Lactic Acid Bacteria has attracted great attention because of its GRAS (Generally Recognized as Safe) status, and its potential use as a safe additive for food preservation. Due to their antimicrobial characteristics, bacteriocins have been tested as bioconservatives in several products, showing activity against pathogenic microorganisms. However, the high cost of production has still been a relevant factor for the wide use of this type of preservative. Therefore, the objective of this work was to evaluate the viability of enterocin production using partially demineralized whey and corn steep liquor as substrate. Five Enterococcus isolates (Efm20, Efm22, Efm24, Efm25 and Efs27) were tested on MRS medium against Listeria innocua CLIP 12612 bacterium and Listeria monocytogenes 2032. The MRS culture medium was replaced at 25% concentration by whey or corn steep liquor.The assay of the action of enterocin was performed by the well diffusion method. The proteinic character of bacteriocina was confirmed after incubation with proteolytic enzymes α-chymotrypsin, protease and proteinase-K. The production of hydrogen peroxide and lactic acid were discarded by the use of catalase and neutralization with NaOH. The cell free supernatant (CFS) obtained on both substrates were treated at 80 ° C and 100 ° C, exhibiting thermostability. The CFS obtained in MRS with corn steep liquor by the Efm22 isolate (24 hours) reached 6400 AU / mL against the two indicator bacteria. On the other hand, the isolates Efm24 (24 hours) and Efm20 (18 hours) reached 6400 AU / mL compared to Listeria innocua CLIP 12612. In whey, the highest values of UA / mL occurred with the isolates Efm20, Efm25 and Efs27 (24 hours). In conclusion, it was verified that the substrates tested have potential to be applied in the manufacture of food product bioconservants.

O presunto cozido é um dos embutidos cárneos mais consumidos no Brasil, sendo também um dos mais sensíveis à deterioração por bactérias ácido láticas (BAL) e a contaminação por Listeria monocytogenes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana da nisina (Nisaplin®) aplicada em presunto cozido, a fim de controlar L. monocytogenes e BAL. Para tanto, presuntos cozidos foram preparados e fatiados individualmente pelas empresas DuPont e Marsul. No ensaio 1, o presunto foi injetado com salmoura contendo 12,5 mg de nisina por kg (dosagem aprovada no Brasil para queijos fundidos). O potencial bioconservante da nisina foi avaliado contaminando artificialmente as fatias do presunto com um pool composto por 5 cepas de L. monocytogenes. Os resultados do ensaio 1 demonstraram que o tratamento com nisina não teve efeito significativo sobre a população de L. monocytogenes. Já as BAL foram inibidas por 2 dias. No ensaio 2, a adição da nisina na mesma dosagem foi feita no tambleamento, inibindo a população de L. monocytogenes por 6 dias e BAL por 10 dias Em vista dos resultados obtidos nos 2 primeiros ensaios foi determinada a concentração mínima bactericida (CMB) do pool e dos isolados de L. monocytogenes, a fim de verificar a sensibilidade das cepas individualmente e em conjunto e o efeito da nisina sem a matriz cárnea. Além disso, também foi avaliado o efeito sinérgico ou antagônico da salmoura sobre a ação bactericida da nisina. Pôde-se constatar que as diferentes cepas de L. monocytogenes demonstraram perfis de sensibilidade diferentes e que o pool de cepas foi menos sensível ao efeito da nisina. Os resultados obtidos conduziram a avaliação de dosagem maior de nisina no presunto cozido. No ensaio 3, 32 mg/kg de nisina foram adicionadas a salmoura do presunto cozido e testados contra o pool de L. monocytogenes e a cepa ATCC 7644, separadamente. Os resultados demonstraram que a nova dosagem de nisina inibiu significativamente a multiplicação do pool de L. monocytogenes e da cepa ATCC 7644, durante 10 dias, sugerindo ser uma barreira efetiva no controle de L. monocytogenes em presunto cozido. / Precooked ham is one of the most consumed meats in Brazil. It is also one of the most sensitive to spoilage by lactic acid bacteria (LAB) and contamination by Listeria monocytogenes. The objective of this study is to evaluate the antimicrobial activity of Nisin (Nisaplin®) when applied to precooked ham, in order to control the growth of L. monocytogenes and LAB. For the purposes of this study, the precooked ham prepared and sliced individually by the DuPont and Marsul company was used. For trial 1, brine containing 12.5 mg of nisin was injected per kg of ham (dosage approved in Brazil for processed cheese). The biopreservative potential of nisin was evaluated by artificially contaminating slices of control and test ham with a pool of 5 different strains of L. monocytogenes. The results of this first trial showed that treatment with this amount of nisin had no significant effect on the growth of the L. monocytogenes population. However, the LAB population was indeed inhibited by 2 days. In trial number 2, the addition of nisin to the same amount of precooked ham by tumbling inhibited the growth of the L. monocytogenes population by 6 days and of the LAB population by 10 days. In light of the results obtained in these first 2 trials, the minimum bactericidal concentration (MBC) pool and L. monocytogenes isolates were determined in order to verify the sensitivity of the strains individually and together as well as the effects of nisin without the meat matrix Additionally, the synergistic or antagonistic effects of brine on the antimicrobial properties of nisin were also evaluated. Results suggest that different strains of L. monocytogenes have different sensitivity profiles and that the pool of strains was less sensitive to the effects of the nisin. These results prompted an increase in the dosage of nisin added to the precooked ham in trial number 3. In this trial, 32mg/kg of nisin was added to the brine of the precooked ham and tested against the L. monocytogenes pool and ATCC 7644 strain, separately. Results demonstrated that this increase in amount of nisin significantly reduced the growth of the L. monocytogenes pool and of the ATCC strain for 10 days. This suggests that nisin can be an effective barrier against the growth of L. monocytogenes in precooked ham.

Peptídeos antimicrobianos são vistos como alternativas promissoras a serem empregadas pela iindústria farmacêutica no controle de infecções causadas por microrganismos, como também na indústria alimentícia, onde podem desempenhar papéis como conservantes naturais de alimentos. Plantaricina149 é um membro deste grupo, sendo composto por 22 resíduos de aminoácidos, com natureza catiônica e atividade inibitória sobre algumas bactérias patogênicas. Neste trabalho, foram sintetizados diferentes peptídeos análogos à Plantaricina149 para investigar suas ações sobre microrganismos (bactérias e fungos), a fim de correlacionar estes estudos com a ação lítica do peptídeo em modelos de membrana diversos (monocamadas e vesículas fosfolipídicas). A interação de Plantaricina149 com estes sistemas foi monitorada pelas espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência, ensaios de tensão superficial, calorimetria e ressonância plasmônica de superfície, e mostrou ser altamente específica para superfícies fosfolipídicas que apresentam densidade de cargas negativas, tais como a membrana celular de bactérias. A interação eletrostática inicial que se estabelece entre o peptídeo e os fosfolipídios é de extrema importância, sendo capaz de induzir uma estruturação helicoidal na região C-terminal do peptídeo, enquanto a região Nterminal contribui com as interações hidrofóbicas necessárias para a penetração do peptídeo nas camadas fosfolipídicas levando a ruptura das mesmas. De forma semelhante, a atividade antimicrobiana de Plantaricina149a (e alguns de seus análogos) também mostrou ser resultado das interações das duas regiões da molécula, e foi afetada com a retirada ou modificação da região N-terminal do peptídeo. Com a deleção desta região, o peptídeo passou a ter somente ação bacteriostática sobre Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, perdendo a capacidade bactericida. / Antimicrobial peptides are seen as promising alternatives to be employed in pharmaceutical industry for controlling infections caused by microorganisms, and also in food industry, where they can play roles as natural food preservatives. Plantaricina149 is a member of this group, constituted of 22 amino acid residues, cationic in nature and presenting inhibitory activity against some pathogenic bacteria. In this work, different Plantaricina149 analog peptides were synthesized to investigate their action against microorganisms (bacteria and fungi), with the aim of correlating these studies with the lytic action of the peptide on several membrane models (phospholipid monolayers and vesicles). The Plantaricina149 interaction with these systems was monitored by circular dichroism and fluorescence spectroscopies, surface tension assays, calorimetry and surface plasmon resonance, and showed to be highly specific to phospholipid surfaces that present negative charge density, such as the bacteria cell membrane. The initial peptide-phospholipids electrostatic interaction is extremely important, and it is capable of inducing a helical structure in the peptide C-terminal region, while the Nterminal region contributes with the hydrophobic interactions needed to the peptide penetration in the phospholipid layers and to the disruption of them. Similarly, the Plantaricina149 antimicrobial activity has also proved to be a result of the interactions from the two regions of the molecule, and it was strongly affected by the removal or modification of the peptide N-terminal region. Promoting the deletion of this region has left the peptide only with a bacteriostatic action against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, removing its bactericide ability.

Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Izildinha Moreno / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T11:59:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_MaristeladaSilvado_D.pdf: 987996 bytes, checksum: b40b83ce1cfdfd6fe5e6d3a67301de6d (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A biopreservação é uma técnica utilizada para estender a vida útil e aumentar a segurança dos alimentos por meio do emprego de microbiota protetora e/ou seus peptídeos antimicrobianos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana de culturas produtoras de bacteriocinas sobre alguns patógenos Gram-positivos de ocorrência comum em produtos lácteos. As culturas bacteriocinogênicas Lactococcus lactis subsp. Lactis ATCC 11454, Lactobacillus plantarum ALC 01 e Enterococcus faecium FAIR-E 198 apresentaram comportamento distinto em relação à produção de bacteriocinas quando inoculadas em caldo MRS e em leite desnatado reconstituído (LDR) a 10%. Na avaliação do espectro de ação antimicrobiano pelo método de difusão em ágar por inoculação em poços, as bacteriocinas produzidas por Lb. plantarum ALC 01 e E. faecium FAIR-E 198 apresentaram atividade inibitória apenas sobre as linhagens de Listeria monocytogenes, já a nisina produzida por Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 demonstrou espectro de ação mais amplo, porém com menor atividade que as demais culturas bacteriocinogênicas. Na avaliação da compatibilidade de desenvolvimento associativo com fermentos lácticos comerciais, somente Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 apresentou atividade (halo de 6mm) sobre as linhagens constituintes de ambos os fermentos lácticos avaliados. A determinação da atividade acidificante foi realizada em LDR 10% após 8 e 24h de incubação a 35ºC; a adição de 0,1% e de 0,5% das culturas bacteriocinogênicas não afetou significativamente a capacidade de acidificação dos fermentos lácticos. Além disso, observou-se que o desenvolvimento associativo dos fermentos lácticos com Lb. Plantarum ALC 01 e E. faecium FAIR-E 198, em ambas as concentrações, proporcionou significativo aumento da atividade das bacteriocinas destas culturas, enquanto que a atividade da nisina de Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 foi suprimida. A atividade de aminopeptidases foi determinada após desenvolvimento das culturas lácticas em caldo MRS, Lb. Plantarum ALC 01 apresentou as maiores atividades. Também foi analisado o comportamento de patógenos Gram-positivos durante desenvolvimento associativo com as culturas produtoras de bacteriocinas e fermento láctico em LDR 10% a 35ºC por 48h. Lb. plantarum ALC 01 e E. faecium FAIR-E 198 não influenciaram significativamente o desenvolvimento de Bacillus cereus K1-B041 e de Staphylococcus aureus ATCC 27154 durante as primeiras 24h de incubação a 35ºC, contudo apresentaram forte ação inibitória sobre L monocytogenes Scott A. Já Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 afetou o desenvolvimento de todos os patógenos apenas durante as primeiras 12h de incubação. O fermento láctico demonstrou significativa ação inibitória sobre B. cereus K1-B041 (>7,37 log UFC/ml) e L monocytogenes Scott A (>6,26 log UFC/ml). Em queijo Minas Frescal, não foi observada diferença significativa entre a ação das culturas bacteriocinogênicas e o fermento láctico sobre L. monocytogenes Scott A e S. aureus ATCC 27154. B. cereus K1-B041 demonstrou susceptibilidade a Lb. plantarum ALC 01 e E. faecium FAIR-E 198 após 7 dias. Pelo método de diluição crítica não foi detectada atividade de bacteriocina nos queijos durante os 21 dias de estocagem a 8 ± 1ºC. A adição das culturas produtoras de bacteriocinas como adjuntas ao queijo Minas Frescal não promoveu alteração no pH e na acidez, contudo Lb. plantarum ALC 01 e E. faecium FAIR-E 198 promoveram aumento da proteólise primária e secundária. Embora os resultados obtidos demonstrem que as culturas bacteriocinogênicas avaliadas não possam ser empregadas como único método de conservação, estas podem atuar em sinergia com outros fatores para aumentar a eficiência no controle de patógenos Gram-positivos, especialmente L. monocytogenes, em produtos lácteos fermentados / Abstract: The biopreservation system, such as bacteriocinogenic lactic bacteria cultures and/or their bacteriocins, have received increasing attention and new approaches to control pathogenic and spoilage microorganisms have been developed. The purpose of this study was to evaluate the action of bacteriocin-producing cultures (Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454, Lactobacillus plantarum ALC 01 and Enterococcus faecium FAIR-E 198) on some Gram-positive pathogens in different culture media and dairy products. The bacteriocin production was influenced by the media. The antimicrobial activity of these cultures was evaluated by agar-well diffusion assay. The bacteriocins produced by Lb. plantarum ALC 01 and E. faecium FAIR-E 198 presented inhibitory activity on Listeria monocytogenes alone, on the other hand, the nisin produced by Lc. lactis subsp. Lactis ATCC 11454 demonstrated wide action spectrum, albeit with lower activity. In compatibility of associative development evaluation with the commercial starter culture, only Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 presented activity on the starter culture. The acidifier activity determination was carried out in skimmed milk after 8h and 24h of incubation at 35ºC. The addition of 0.1% and 0.5% of the bacteriocinogenic cultures did not affect the production of lactic acid by the starter culture. The associative development of the starter culture with Lb. plantarum ALC 01 and E. faecium FAIR-E 198 provided significant increase in bacteriocin activity of these cultures, while the activity of Lc. Lactis subsp. lactis ATCC 11454 nisin was suppressed. The aminopeptidase activity was determined after cellular lise of the lactic cultures previously grown in MRS broth. Lb plantarum ALC 01 presented the largest activity. Moreover, the behavior of Gram-positive pathogens was analyzed during co-culture with the bacteriocin-producing bacteria and with the starter culture in skimmed milk. Lb. plantarum ALC 01 and E. faecium FAIR-E 198 did not influence the development of Bacillus cereus K1-B041 and of Staphylococcus aureus ATCC 27154 during the first 24h of incubation at 35ºC. They presented strong inhibition on L. monocytogenes Scott A. Lc. lactis subsp. lactis ATCC 11454 affected the development of the pathogens studied during the first 12h of incubation. The starter culture demonstrated good inhibition of B. cereus K1-B041 (>7.37 log UFC/ml) and L monocytogenes Scott A (>6.26 log UFC/ml). In Minas Frescal cheese, significant difference was not observed between the action of the bacteriocinogenic cultures and the starter culture on L. monocytogenes Scott A and S. aureus ATCC 27154. B. cereus K1- B041 demonstrated susceptibility to Lb. plantarum ALC 01 and E. faecium FAIR-E 198 after 7 days. Bacteriocin activity was not detected in the cheeses during 21 days at 8 ± 1ºC. The addition of the bacteriocin-producing bacteria as an adjunct culture to the Minas Frescal cheese did not promote alteration in the pH and in the acidity, however Lb. plantarum ALC 01 and E. faecium FAIR-E 198 promoted an increase of the cheese proteolysis. Although the obtained results demonstrated that bacteriocinogenic cultures cannot be used as only method of conservation, these can be used as an additional barrier to optimize the control of Gram-positive pathogens, especially L. monocytogenes, in dairy products / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Reginaldo Bruno Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-08T12:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kamiya_RegianneUmeko_D.pdf: 1901318 bytes, checksum: 6b54c1e6cbe9e4b6b6fb94ea27db2ec2 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Esta tese, apresentada na forma de 3 artigos, teve por objetivos: (1) analisar a freqüência dos genes de produção de mutacinas I, II, III e IV, em genótipos de S. mutans isolados de indivíduos cárie-ativos e livres de cárie, (2) analisar a freqüência dos genes de produção das mutacinas I, II, III, IV, N, B-Ny 266, 1140 e genes homólogos às bacteriocinas, identificadas em outras espécies bacterianas, em cepas de S. mutans isolados de crianças, bem como detectar a expressão diferencial dos genes identificados, em células de S. mutans crescidas na condição planctônica e séssil, (3) analisar a expressão dos genes de produção das mutacinas I, II e proteínas kinases CiaH, Dgk e ComD, em diferentes fases do crescimento planctônico e séssil. O rastreamento e a freqüência dos genes estruturais de diferentes mutacinas em isolados de S. mutans, foram realizados pela técnica de PCR e a análise da expressão gênica, pela técnica de RT-PCR semi-quantitativa. Os estudos, apresentados nesta tese, demonstraram o papel das mutacinas como um fator de virulência, altamente diversificado entre a espécie S. mutans, e relacionado com o risco de cárie. Este fator de virulência, pode ser regulado por mecanismos quorum-sensing, sendo assim, dependente da condição de crescimento planctônica ou séssil. A regulação da produção de mutacinas, por mecanismos quorum-sensing, pode representar uma vantagem seletiva à espécie produtora, principalmente em ambiente complexo, como o biofilme dental e lesões de cárie. Futuramente, mais estudos serão necessários para identificar novos determinantes genéticos, necessários para a síntese de substâncias semelhantes às mutacinas, bem como, identificar os mecanismos e componentes, que modulam a expressão deste importante fatorde virulência em S. mutans / Abstract: This thesis, comprised of 3 manuscripts was designed (1) to analyse the frequency of biosynthesis genes of the mutacins types I, II, III and IV, in S. mutans isolated from caries-affected and caries-free individuals, (2) to analyse the frequency of biosynthesis genes of the mutacins types I, II, III, IV, N, B-Ny 266, 1140 and genes homologues to bacteriocins identified in other bacterial species, in S. mutans isolated from children, in addition, to detect the differential expression of these genes, in S. mutans cells grown in planktonic and sessil conditions, (3) and to analyse the expression of the mutacins I and II production genes and kinase proteins genes (ciaH, dgk e comD), in different phases of the planktonic and sessile growth. The screening and frequency of the mutacins structural genes in S. mutans isolates were realized by PCR technique and the analysis of genetic expression, by RT-PCR semiquantitative method. The studies, presented in this thesis, demonstrate the role of mutacins as a virulence factor, highly diverse among S. mutans, and related to risk of dental caries. The mutacins production may be regulated by quorum-sensing mechanisms and is dependent on planktonic and sessile conditions. The modulation by quorum-sensing mechanisms may represent a selective advantage for producer S. mutans strain, mainly in complex environments as the dental biofilm and caries. Hereafter, more studies will be necessary to identify new genetic determinants for synthesis of mutacin-like substances and elucidate the mechanisms and components that modulate the genetic expression of this important virulence factor in S. mutans / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

O charque é um produto cárneo tipicamente brasileiro, salgado e seco ao sol, ainda produzido de maneira artesanal. Durante sua produção há uma etapa de fermentação, realizada pela microbiota naturalmente presente na matéria-prima, o que dificulta a padronização do produto, e pode influenciar negativamente em suas características sensoriais e qualidade microbiológica. O controle da etapa de fermentação do charque seria uma alternativa para minimizar este problema e, neste contexto, as bactérias láticas produtoras de bacteriocinas se enquadram de forma interessante. A microbiota autóctone de charque inclui principalmente bactérias láticas e micro-organismos halofílicos e halotolerantes, sendo assim, este produto apresenta potencial como fonte para o isolamento de novas bactérias láticas produtoras de bacteriocinas. Assim, este trabalho teve por objetivo isolar e identificar culturas de bactérias láticas produtoras de bacteriocinas naturalmente presentes no charque, caracterizar parcialmente as bacteriocinas produzidas por essas culturas, avaliar seu potencial de aplicação neste produto para a melhoria de sua qualidade microbiológica e avaliar seu efeito na ecologia microbiana do charque, nas diferentes etapas de sua fabricação. Através da técnica de tripla camada em ágar foi isolada uma cepa de Lactococcus lactis subsp. lactis apresentando o gene codificador para nisina Z e com capacidade de inibir, in vitro, micro-organismos medianamente e altamente halotolerantes isolados de charque, além de outros micro-organismos deteriorantes e patogênicos importantes em alimentos, como Lactobacillus spp., Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus. A bacteriocina produzida pela cepa isolada neste estudo também possui características interessantes para sua aplicação na bioconservação de alimentos, como resistencia ao calor, presença de agente químicos e altos teores de NaCl, além de não ser afetada pelo pH. A aplicação dessa cepa em charque modelo resultou na redução de até 2 ciclos log na população de micro-organismos halotolerantes, indicando apresentar um potencial de aplicação como agente de bioconservação do produto. Os ensaios de avaliação da ecologia microbiana, empregando DGGE, indicaram que a fermentação natural do charque ocorreu com a participação de bactérias láticas dos gêneros Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus e de micro-organismos halotolerantes do gênero Staphylococcus. Além disso, os estudos referentes à dinâmica populacional demonstraram que a adição da cepa bacteriocinogênica ao charque não influenciou, de forma qualitativa, as populações presentes no produto. / Charqui is a Brazilian traditional meat product, salted and sun-dried, still manufactured without control of the fermentation step, which is performed by the indigenous microbiota. This fact interferes on the standardization of the product and can negatively affect the sensorial properties and microbiological quality. The application of a known microbiota would be an alternative to minimize this problem and the bacteriocin-producing lactic acid bacteria can can fit in this purpose. The charqui indigenous microbiota mainly includes lactic acid bactéria and halophilic and halotolerant microorganisms, therefore, this product presents a potencial as a source for the isolation of new bacteriocin-producing lactic acid bacteria. The aim of the present work was to isolate and identify bacteriocin-producing lactic acid bacteria from charqui, characterize the bacteriocins produced by the isolated culture, evaluate its potential as biopreservative in charqui and its influence on the microbial populations during the manufacture of the product. A bacteriocinogenic Lactococcus lactis subsp. lactis strain was isolated from charqui through the triple-layer agar technique. This strain produces a nisin-like bacteriocin capable to inhibit in vitro medium and highly halotolerant bacteria isolated from charqui and other food-borne pathogenic and spoilage microorganisms. The application of this strain for charqui manufacturing caused a reduction of up to 2 log in the halotolerant bacteria population, evidencing its potential application for charqui biopreservation. Studies in the populational dynamics using DGGE indicated that the presence of the bacteriocinogenic strain did not affect the microbial populations in the product.

Mudanças nos hábitos alimentares dos consumidores têm aumentado a demanda por frutas frescas e polpas de frutas. Com isso, a busca por novos compostos com atividade antimicrobiana é de grande interesse, já que a aplicação de aditivos químicos convencionais em alimentos tem sido reavaliada devido à potencial toxicidade de alguns desses compostos. As bacteriocinas ou BLIS, produzidas por diferentes gêneros bacterianos, têm despertado grande interesse industrial para aplicação em alimentos em processos de bioconservação. No presente trabalho, foram obtidos 3 isolados bacterianos (A, B e C) a partir de polpa de abacaxi, produtores de substância antagonista frente a diferentes linhagens de Listeria monocytogenes e Bacillus sp. A natureza proteica das substâncias antagônicas produzidas pelos isolados foi confirmada pela sensibilidade à enzima ? - quimotripsina. As linhagens foram identificadas através de provas bioquímicas e moleculares como Bacillus cereus, com a colaboração da Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro, Brasil). Para estudos mais detalhados da BLIS foi selecionado o isolado C denominado Bacillus cereus LFB-FIOCRUZ 1640. A melhor condição de incubação para produção da BLIS foi a 30ºC/24 horas, em caldo MRS. A BLIS apresentou estabilidade térmica por até 30 minutos a 80ºC e em ampla faixa de pH frente a L. monocytogenes. A purificação da BLIS foi realizada com resina Amberlite XAD-16 e de troca catiônica SP-Sepharose \"Fast Flow\", tendo o extrato apresentado um fator de purificação de 4,1 vezes e rendimento de 30%. O extrato obtido foi liofilizado e uma alíquota foi analisada por SDS-PAGE, o que permitiu a estimativa da massa molecular da BLIS de 25 kDa. A Concentração Bactericida Mínima (CBM) de 2 mg/mL foi determinada frente ao indicador L. monocytogenes e esta concentração de extrato foi aplicada em sistema modelo contendo polpa de abacaxi. A BLIS teve ação bactericida inibindo completamente L. monocytogenes por 24h/ 37ºC. Neste sentido, a aplicação da BLIS na área de alimentos e outras áreas farmacêuticas poderá ser explorada em outros trabalhos. / Changes in habits of consumers, with preference for healthy foods, have increased the demand for fruits and fruit pulps. Thus, there is great interest in searching new compounds with antimicrobial activity, since the application of conventional additives in foods is of concern due to the toxicity of some of these compounds. The bacteriocins or BLIS, produced by different bacteria genera, have increased the interest for its industrial application in food technology in processes of biopreservation. In this study, three isolates were obtained (A, B and C) from pineapple pulp, which produce antagonistic substances with activity against Listeria monocytogenes and Bacillus sp. The proteinaceous nature of the antagonistic substance produced by the isolates was confirmed by susceptibility to the enzyme ? - chymotrypsin. The strains were identified by biochemical and molecular tests as Bacillus cereus, in collaboration with Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro, Brazil). Isolate C of Bacillus cereus was named LFB-FIOCRUZ 1640. The best condition of incubation for the BLIS production was 30°C for 24 hours in MRS broth. The BLIS was thermostable (up to 30 minutes at 80°C) and it was partially stable in the range of pH 2 to 9. The purification of the BLIS was performed with Amberllite XAD-16 and cation-exchange SP-Sepharose \"Fast Flow\" resins. The extract presented a purification factor of 4.1 times and 30% of yield. The extract was lyophilized and analyzed by SDS-PAGE. The molecular mass of the BLIS was estimated as 25 kDa. The Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of 2 mg/mL was determined with the indicator L. monocytogenes, and this concentration of extract was applied in a model system containing pineapple pulp. The BLIS had bactericidal action which completely inhibited L. monocytogenes for 24h/37°C. The BLIS of B. cereus 1640 presents potential for application as an antimicrobial in food and other pharmaceutical areas.

Among the wide range of products naturally fermented by lactic acid bacteria (LAB), there are the homemade cheeses. These bacteria are inherent to the raw milk and the fermentation process for producing compounds responsible for the flavor and texture of the products. Its use is one of the oldest food preservation techniques, since they are able to produce substances with antagonistic action against spoilage and pathogenic microorganisms, particularly Listeria monocytogenes, commonly found in refrigerated dairy products. In addition, many lactic acid bacteria have probiotic potential, thus becoming the most attractive one for its use. In North West Frontier region of Rio Grande do Sul a typical cheese is produced, popularly called colonial cheese, which its knowledge of fabrication techniques have been transferred verbally through generations. For being manufactured, in most cases, with raw milk without the addition of starter cultures and under poor conditions of hygiene, it has a diverse unwanted microbial population. This aspect is characterized as a danger to consumers, as well as spoilage organisms that can also serve as a carrier of pathogenic microorganisms. The objective of this study is to isolate and identify lactic acid bacteria with probiotic characteristics and bacteriocinogenic from milk and artisan cheeses produced in this region. Thus initially the BAL were isolated and tested for antagonist ability against pathogens, and then checked the ability to produce antimicrobial substances of proteinaceous nature (bacteriocins), as well as resistance to biological barriers, as a criteria for the selection of isolated with probiotic potential. Molecular identification was performed by obtaining and sequencing of 16S rDNA or the ITS region. Subsequently, the isolated were evaluated for antimicrobial resistance of clinical use and the production of the enzyme β-hemolysin as virulence factors. The selected isolated were used as inoculum in cheese produced at a pilot level, with monitoring of physical-chemical and microbiological, over twenty-eight days of maturation under refrigeration. Of total lactic acid bacteria isolated twentyone (34.43%) showed antagonistic potential against pathogenic microorganisms reference. Of these, seven (33.33%) were able to produce antimicrobial substances of nature protein, being classified as possibly bacteriocinogenic and five (23.81%) isolated were shown to possess probiotic potential. The molecular identification of these proved to treat Enterococcus durans, Enterococcus faecium and Lactobacillus plantarum. The isolated F9 and U5 were selected and added as bacteriocin and probiotic culture, respectively, as a pilot project in cheese artificially contaminated with Listeria monocytogenes. No isolated was able to remove this pathogenic organism in the cheese, and the cultivation of bacteriocinogenic shown to be capable of maintaining viable cells of the microorganism stable during the maturation period. The probiotic proved to be able to withstand during the ripening of the cheese, while maintaining a viable cell number in the order of 107 - 108UFC.g-1 cheese, which allows its use with probiotic purpose. / Dentre a variada gama de produtos fermentados naturalmente por bactérias ácido láticas (BAL) encontram-se os queijos artesanais. Estas bactérias são inerentes da matéria-prima leite e durante o processo fermentativo produzem compostos responsáveis pelo flavor e textura dos produtos. Sua utilização constituise em uma das técnicas mais antigas de conservação de alimentos, já que são capazes de produzir substâncias com caráter antagônico frente a micro-organismos deteriorantes e patogênicos, com destaque a Listeria monocytogenes, comumente encontrada em produtos lácteos refrigerados. Além disso, muitas bactérias ácido láticas possuem potencial probiótico, constituindo-se em um atrativo a mais para sua utilização. Na região Fronteira Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul é produzido um queijo típico, popularmente denominado queijo colonial, cujo conhecimento das técnicas de fabricação tem sido transferido verbalmente ao longo das gerações. Por ser fabricado, na grande maioria dos casos, com leite cru, sem a adição de culturas iniciadoras e sob condições deficientes de higiene, possui uma diversificada população microbiana indesejada. Este aspecto se caracteriza como um perigo aos consumidores, já que além de micro-organismos deteriorantes pode também servir como veículo de micro-organismos patogênicos. Assim, o objetivo do presente estudo foi isolar e identificar bactérias ácido láticas com características bacteriocinogênicas e probióticas, de leite e queijos artesanais desta região. Para isso, inicialmente, as BAL foram isoladas e testadas quanto a sua capacidade antagonista frente a micro-organismos patogênicos e então verificada a capacidade de produção de substâncias antimicrobianas de natureza protéica (bacteriocinas). A resistência a barreiras biológicas, como um dos critérios para seleção de isolados com potencial probiótico também foi avaliado. A identificação molecular dos isolados potencialmente bacteriocinogênicos e probióticos foi realizada por meio da obtenção e sequenciamento do rDNA 16S ou da região ITS. Posteriormente, os isolados foram avaliados quanto à resistência a antimicrobianos de uso clínico e à produção da enzima β-hemolisina, como fatores de virulência. Os isolados selecionados foram utilizados como inoculo em queijos produzidos a nível piloto, com monitoramento de parâmetros físico-químicos e microbiológicos, ao longo de vinte e oito dias de maturação, sob refrigeração. Do total de bactérias láticas isoladas, vinte e uma (34,43%) demonstraram potencial antagonista frente a micro-organismos patogênicos de referência. Destas, sete (33,33%) mostraram-se capazes de produzir substâncias antimicrobianas de natureza proteica, sendo classificadas como, possivelmente, bacteriocinogênicas e cinco (23,81%) dos isolados demonstraram possuir potencial probiótico. A identificação molecular destes revelou se tratarem de Enterococcus durans, Enterococcus faecium e Lactobacillus plantarum. Os isolados F9 e U5 foram selecionados e adicionados como cultura bacteriocinogênica e probiótica, respectivamente, em queijos a nível piloto, artificialmente contaminados com Listeria monocytogenes. Nenhum dos isolados foi capaz de eliminar este microorganismo patogênico nos queijos, porém o cultivo bacteriocinogênico se mostrou capaz de manter as contagens de células viáveis deste micro-organismo estáveis durante o período de maturação. A cultura probiótica se revelou capaz de resistir durante a maturação do queijo, mantendo um número de células viáveis na ordem de 107 - 108UFC.g-1 de queijo, o que permite sua utilização com propósito probiótico.

Xylella fastidiosa é o agente causal de uma série de doenças que ocorrem em plantas economicamente importantes como laranjeiras, videiras e cafeeiros, causando no Estado de São Paulo prejuízos relevantes à indústria citrícola. Esta bactéria Gram-negativa é restrita ao xilema das plantas e à porção anterior do trato digestório dos insetos vetores das famílias Cicadellidae e Cercopidae, conhecidos como cigarrinhas. Tentativas de elucidar os mecanismos de virulência e patogenicidade adotados por esta bactéria apontam a formação do biofilme como etapa fundamental para o estabelecimento da infecção e o consequente desenvolvimento da doença na planta, mas fatores adicionais parecem contribuir, tais como a produção de toxinas. As bacteriocinas são proteínas com atividade antibiótica contra cepas próximas à espécie produtora e que já foram associadas à virulência e patogenicidade de outras bactérias. Uma varredura in silico no genoma de X. fastidiosa 9a5c revelou 13 sequências codificadoras de microcinas putativas no cromossomo. Transcritos de todos esses genes foram detectados por RT-qPCR em culturas de X. fastidiosa 9a5c, e análises comparativas com genomas públicos (cepas Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 e GB514) e recém sequenciados por nosso grupo de pesquisa (cepas U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x e Fb7) revelaram que cada cepa possui seu próprio arsenal de bacteriocinas. Diferenças encontradas in silico entre os loci de bacteriocinas nas cepas foram demonstradas experimentalmente. Nossos resultados comprovam a variabilidade predita nos quatro clusters de bacteriocinas que identificamos, o que é esperado para genes relacionados à adaptação e patogenicidade. Destes loci, três foram detectados por RT-PCR como transcritos policistrônicos. Nossa tentativa de detectar essas proteínas em culturas de X. fastidiosa (através de sequenciamento de polipeptídeos por HPLC-MS/MS) foi capaz de identificar uma das bacteriocinas putativas e, portanto, o conjunto de nossas observações apóia a continuidade dos estudos para elucidar o papel das bacteriocinas na fisiopatologia de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of diseases that affect several economically important crops such as sweet orange trees, grapevines and coffee trees, causing in the State of São Paulo considerable losses mainly to the citrus industry. This Gram-negative bacterium is restricted to the plant xylem and to the upper gastrointestinal tract of its insect vectors, the sharpshooters from the Cicadellidae and Cercopidae families. Attempts to elucidate the virulence and pathogenicity pathways employed by this bacterium point the biofilm formation as a fundamental step for the establishment of the infection and the consequent development of the plant disease, but additional factors seem to contribute to these processes, such as the production of toxins. Bacteriocins are proteinaceous antibiotics that act against closely-related species and have been previously associated with virulence and pathogenicity in other bacteria. An in silico screening of the X. fastidiosa 9a5c genome revealed 13 coding sequences as putative microcins in the chromosome. Transcripts from all those genes were detected through RT-qPCR in X. fastidiosa 9a5c cultures, and comparative analyses on the public genomes (Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 and GB514) plus the ones recently sequenced by our group (U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x and Fb7) revealed that each strain possesses its own arsenal of bacteriocins. Differences found in silico among the loci in all strains were experimentally confirmed. Our results demonstrated the predicted variability in the four bacteriocins clusters as expected for adaptation and pathogenicity-related genes. Three out of the four bacteriocins loci were detected by RT-PCR as polycistronic transcripts. Our attempt to detect these proteins in X. fastidiosa cultures (using HPLC-MS/MS polypeptide sequencing) identified one of the putative bacteriocins, and therefore our observations warrant further efforts to elucidate the role of bacteriocins in the X. fastidiosa physiopathology.