Diss. (sammanfattning) Uppsala : universitet, 2006. / Härtill 6 uppsatser.

While bacterioplankton indisputably control vital biogeochemical paths in the cycling of carbon and nutrients in the world’s oceans, our knowledge about the functional and genetic diversity of bacterioplankton communities is negligible. In this thesis, molecular and more traditional microbiological methods were used to study the specific function of N2-fixation and in a general sense diversity of marine bacterioplankton species. Most oceans are nitrogen limited and, therefore, adaptive to bacterioplankton capable of N2-fixation. Recent studies have found nifH genes (coding for the nitrogenase enzyme) related to diverse heterotrophic bacteria in oceanic seawater samples indicating that, along with cyanobacteria, also heterotrophic bacteria benefit from N2-fixation. Here, molecular and cultivation methods were used to examine diazotrophic bacterioplankton in the Baltic Sea. We successfully isolated heterotrophic N2-fixing bacteria belonging to the γ-proteobacterial class by means of low-nitrogen plates and semi-solid diazotrophic medium tubes. The isolates required low-O2 conditions for N2-fixation. Using Real-time PCR it was found that heterotrophic bacterioplankton carrying the nifH gene was abundant (3 x 104 nifH gene copies L seawater-1) at locations in the Southwest Baltic proper. With the aim to identify the main N2-fixing organisms in Baltic Proper surface waters, a clone library of nifH gene transcripts (RNA) was generated. Clone inserts were exclusively related to Aphanizomenon sp. and Nodularia sp. Using quantitative real-time PCR it was found that the nifH gene expression from Nodularia sp. was highly variable between stations in the Baltic Proper but was 10-fold higher during mid summer relative to early summer and fall. A diel study showed a 4-fold increase in Nodularia transcript concentrations at early to mid day relative to rest of the day. Real-time PCR was found to be a powerful and highly sensitive method for measuring gene expression. Since nucleic acids are a prerequisite for molecular analyses of bacterioplankton dynamics a protocol to extract DNA from seawater samples was developed with the aim to maximize the yield of high-quality DNA. Each step in the protocol was important for the efficiency of extraction. The obtained extraction efficiencies were up to 92% for seawater samples and up to 96% for isolates. The protocol provides a guideline for DNA extraction from seawater samples for other studies. In a global sampling campaign (9 locations from polar, tropical and temperate regions) we sampled DNA from surface water and constructed 16S rRNA gene libraries to investigate diversity and biogeography of bacterioplankton. Approx. 80% of the sequences found were similar to sequences already deposited in GenBank, indicating that a large fraction of the marine bacterioplankton already has been sampled, which in turn suggests a limited global bacterioplankton diversity. This thesis have improved our knowledge about the composition and nifH gene expression of the diazotrophic bacterioplankton community in the Baltic Sea and contribute significantly to the discussion on global marine bacterioplankton diversity and biogeography. / Östersjön är ett av världens största brackvattensystem. Den ekologiska balansen i detta hav är hotad på grund av övergödning. Mycket arbete har därför fokuserats på att reducera utsläppen av näringsämnen, speciellt kväve. Dessa ansträngningar kan dock motverkas av bakterier som har förmåga att omvandla luftens kväve till metaboliskt användbart ammonium (kvävefixering). På sommaren är Östersjöns primärproduktion begränsad av kväve, med följden att det årligen uppstår massiva blomningar av kvävefixerande bakterier, framför allt cyanobakterier. Dessa är främst Aphanizomenon och Nodularia, men inte endast de fototrofa cyanobakterierna har förutsättningar att fixera N2. NifH gener (genen som kodar för nitrogenas) bärs också av heterotrofa bakterioplankton, vilket har visats i studier i främst Atlanten och Stilla havet. Med hjälp av två olika odlingsmetoder lyckades vi isolera heterotrofa kvävefixerande bakterier tillhörande klassen γ-proteobakteria från Östersjön. Svårigheten med att finna dessa bakterier ligger i att de kräver en miljö med mycket låg syrehalt för att kunna fixera kväve. Resultaten från denna studie ledde oss vidare till att undersöka vilka organismer som uttrycker nifH genen (och då troligen även fixerar kväve) i Östersjön. En av de bakterier som isolerats kunde påvisas med Realtids PCR i ett relativt stort antal (3 x 104 nifH genkopior per liter) vid en av de ursprungliga provtagningsstationerna. För att söka rätt på de olika organismtyper som uttrycker nifH skapades ett klonbibliotek baserat på mRNA extraherat från havsvatten. Det visade sig då att alla de närmare 100 kloner som sekvenserades tillhörde antingen Aphanizominon eller Nodularia. De heterotrofa bakteriernas nifH genuttryck var troligen i jämförelse med dessa cyanobakterier alltför lågt för att kunna detekteras. Realtids PCR mätningar av Nodularias nifH genuttryck visade på en stor variation mellan de olika provtagningsstationerna samt mellan de olika provtagningstillfällena. Vi fann dock en kraftig ökning under juli med en nedgång igen i augusti. En dygnscykelstudie visade att Nodularia nifH genuttrycket ökade under förmiddagen med en topp mitt på dagen för att sedan minska igen. Detta troligen med anledning av att den energikrävande kvävefixeringsprocessen sker under de ljusa timmarna då cellen får energi från fotosyntesen. I de molekylärbiologiska metoderna som används för att få information om identitet och aktivitet hos skilda organismer krävs att DNA och RNA kan extraheras från prover tagna i naturliga vattenmiljöer. Även om antalet bakterier tillsynes är högt, så är mängden DNA och RNA per liter havsvatten relativt låg, därför krävs ett väl fungerande protokoll för denna extraktion. I en inledande studie i denna avhandling optimerades en metod för att utvinna DNA. Ett antal sådana protokoll finns publicerade men dessa har ofta lågt utbyte. Det nya protokollet har hög effektivitet, vilket gör att små provvolymer kan användas (2 ml jämfört med tidigare flera liter) och därmed ökar hanterbarheten. Vi visar i denna studie att varje steg 7 i DNA-extraktionsprotokollet är viktigt för att ge en hög effektivitet. Detta protokoll kan med fördel användas som vägledning för många olika typer av studier. På grund av att många havsbakterier inte kan bilda kolonier och alltså inte växa på traditionella medier har det varit svårt att få en klar bild av artrikedomen. Molekylärbiologin har dock gjort det möjligt att identifiera bakterier med hjälp av 16S rRNA genen, en enorm mängd gensekvenser från världens alla hav har inkommit till den gemensamma databanken (GenBank). År 2002 gjordes en studie där man sammanställde informationen i denna databank, för att få en bild av artrikedomen i världshaven. Resultatet av denna studie var att det i världshaven fanns färre bakterietyper än vad många forskare har spekulerat i. I denna avhandlig har vi utfört en studie där vi gjorde en stor global provtagning för att se om denna undersökning överensstämde med den datainformativa. Provtagning från nio lokaliteter gjordes i de tempererade, tropiska och polarhaven. Ett genbibliotek från varje lokal gjordes och kloner sekvenserades. Resultatet visar i likhet med den datainformativa undersökningen på en begränsad artrikedom. 80% av gensekvenserna fanns redan i databanken, vilket tyder på att de flesta arter redan har blivit funna. Dessutom visade det sig att få av bakterierna återfanns på alla ställen och många återfanns endast på ett ställe. Utöver detta visade det sig att det fanns en ökad artrikedom ju närmare ekvatorn man kom, vilket tidigare har visats för större organismer. Studierna i denna avhandling har ökat förståelsen för hur sammansättningen av det kvävefixerande bakteriesamhället i Östersjön ser ut samt bidragit till diskussionen om den globala artrikedomen bland bakterioplakton och dess utbredning.

Ziel der Arbeit ist die Analyse des Phyto- und Bakterioplanktons in der Talsperre Saidenbach sowie die Identifizierung von Einflussfaktoren auf deren Zusammensetzung. Dazu wurde die mikrobielle Gemeinschaft im Freiwasser von 2013 bis 2015 monatlich in einer Vorsperre sowie an drei Probenahmestellen im Hauptbecken der Talsperre untersucht. Zur Quantifizierung und Differenzierung des Bakterioplanktons wurden Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie, CARD-FISH, denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese, Klonierung und 16S-Amplikonsequenzierung eingesetzt. Die Auswertung der Daten erfolgte durch Korrelations- und Clusteranalysen sowie NMDS unter Einbeziehung hydrophysikalischer und hydrochemischer Parameter, meteorologischer Daten sowie der Daten zur Phytoplanktongemeinschaft. Darüber hinaus wurden Verfahren zum Monitoring typischer Organismengruppen im Pelagial etabliert bzw. auf ihre Eignung hin untersucht: Die spektrofluorometrische Erfassung von Phytoplanktongruppen mit Hilfe einer Tauchsonde wurde anhand mikroskopischer Analysen des Phytoplanktons validiert. Für die Quantifizierung und Differenzierung des autotrophen Picoplanktons (APP) wurde eine durchflusszytometrische Methodik entwickelt und die Resultate ebenfalls anhand mikroskopischer Zählungen überprüft. Die mit der FluoroProbe Sonde (bbe Moldaenke GmbH) ermittelten Chlorophyll-Konzentrationen für vier Algengruppen zeigten im Vergleich zu den mikroskopischen Analysen gute Übereinstimmung für die spektrale Gruppe der Diatomeen (incl. Haptophyceen, Dinophyceen, Chrysophyceen), während für die spektralen Gruppen der Grünalgen (incl. Desmidiaceen), Cyanobakterien und Cryptophyta z.T. deutliche Abweichungen auftraten. Die relative Zusammensetzung des Phytoplanktons wies ebenfalls deutliche Unterschiede zwischen FluoroProbe-Messungen und Mikroskopie auf, die vor allem in einer Überschätzung des Anteils von Grünalgen und einer generellen Unterschätzung von Cyanobakterien anhand der Sondenmessungen bestanden. Ein wesentlicher Vorteil der Sondenmessungen besteht jedoch in der Möglichkeit zur in-situ Aufnahme von Tiefenprofilen. Die Abschätzung der Zusammensetzung und Abundanz des Phytoplanktons in der Wassersäule vor Ort kann zur gezielten Probenahme genutzt werden und ergänzend Informationen zu nicht mikroskopisch analysierten Horizonten liefern. Die Sondenmessungen eignen sich jedoch nicht als Ersatz für mikroskopische Analysen und sollten nicht unabhängig von diesen betrachtet werden. Für die Quantifizierung des APP wurde eine durchflusszytometrische Methodik entwickelt, die im Vergleich zur Mikroskopie präzise Zellzahlen ergab und auch die Anteile phycocyanin- und phycoerythrinhaltiger Picoplankter zutreffend widerspiegelte. Der geringe Zeitaufwand für die durchflusszytometrischen Messungen ermöglicht es, das APP in einer höheren räumlichen und zeitlichen Auflösung zu untersuchen. Die statistische Auswertung in Hinblick auf die erhobenen Umweltparameter zeigte für die Abundanz der Picoplankter in den oberflächennahen Wasserschichten signifikante Zusammenhänge zur Wassertemperatur und dem pH-Wert. Unter den untersuchten Nährstoffen spielte nur die Nitratkonzentration in der Vorsperre und im Unterwasservorbecken eine Rolle. In der bakteriellen Gemeinschaft der Talsperre Saidenbach und der Vorsperre Forchheim wurden als dominante Taxa anhand von Klonierung und 16S-Amplikonsequenzierung typische Süßwasservertreter der jeweiligen Phyla nachgewiesen, z.B. hgcI-clade (Actinobacteria), Limnohabitans (Betaproteobacteria) und C. Pelagibacter (Alphaproteobacteria). Clusteranalysen für DGGE-Profile und 16S-Amplikonsequenzierungsdaten zeigten häufig Ähnlichkeiten der mikrobiellen Gemeinschaft in Vorsperre und Unterwasservorbecken sowie teilweise mit Proben späterer Zeitpunkte aus den weiter stromabwärtsgelegenen Probenahmestellen (S, E). Dies spiegelt möglicherweise einen Längstransport der Arten in der Talsperre wider und bedeutet für die Bewirtschaftung, dass in Vorsperren nicht nur Nährstoffelimination durch gezieltes Phytoplanktonwachstum und –sedimentation stattfindet, sondern sich auch Bakteriengruppen etablieren, die sich bei geeigneten ökologischen Bedingungen auf stromabwärts gelegene Kompartimente der Talsperre ausbreiten können. Die Zusammensetzung des Bakterioplanktons zeigte für einen Teil der Proben jahresübergreifend wiederkehrende saisonale Muster. Vor allem Proben des Jahres 2013 unterschieden sich jedoch deutlich von den entsprechenden Zeiträumen der anderen Jahre, worin sich meteorologische Besonderheiten (verkürzte Frühjahrszirkulation, sommerliches Starkregenereignis) widerspiegeln. Für die untersuchten Umweltparameter wurden in den aufeinanderfolgenden Jahren jeweils verschiedene Zusammenhänge zur Zusammensetzung des Bakterioplanktons festgestellt. Sowohl anhand der 16S-Amplikonsequenzierungsdaten als auch der DGGE-Profile konnten keine jahresübergreifend wirksamen Umweltfaktoren ermittelt werden, was auch auf den kurzen Untersuchungszeitraum von drei Jahren zurückzuführen ist. Vor allem ist aber davon auszugehen, dass im Gewässerökosystem stets mehrere Faktoren zusammenwirken und mehrstufige, z.T. zeitlich verzögerte Beziehungen zwischen den abiotischen und biotischen Komponenten bestehen. Für die Entwicklung der Ökosystemkomponenten spielen vor allem in den meso- und oligotrophen Standgewässern auch durch die Zirkulations- und Schichtungsverhältnisse eine entscheidende Rolle, die derzeit durch klimatische Veränderungen einem starken Wandel unterworfen sind. Die entsprechenden Veränderungen der mikrobiellen Gemeinschaft sind nicht absehbar und sollten in Anbetracht ihrer Stoffwechselleistungen im Gewässer ein wesentliches Element langfristiger Untersuchungen sein. Effiziente Verfahren zur Untersuchung verschiedener Komponenten des Phyto- und Bakterioplanktons können dazu einen wichtigen Beitrag leisten.