As infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) são um grave problema de saúde pública cujo prognóstico tem sido desfavorecido pela emergência e endemicidade de bactérias multirresistentes (MRs). Neste cenário, seguindo uma tendência mundial, no Brasil, infecções por cepas de Acinetobacter baumannii MRs produtoras de carbapenemases do tipo OXA são atualmente consideradas uma emergência clínica e epidemiológica. Na falta de alternativas terapêuticas efetivas para infecções relacionadas, este trabalho objetivou avaliar efeitos sinérgicos (utilizando checkerboard e time-kill) decorrentes da combinação de 10 antimicrobianos de diferentes classes, contra 8 cepas MRs de A. baumannii, clonalmente não relacionadas, produtoras de carbapenemases do tipo OXA-23, OXA-72, OXA-58 e OXA-143, representativas de diferentes centros hospitalares do Brasil. Como resultado, a combinação amicacina/tigeciclina apresentou atividade sinérgica (S= ΣCIF ≤ 0,5) e parcialmente sinérgica (PS= &#931CIF ;0,5-0,75) contra 4 (50%) cepas produtoras de OXA-143 ou OXA-72, e 2 cepas (25%) produtoras de OXA-23, respectivamente. Por outro lado, a combinação polimixina B/imipenem apresentou atividade S e PS contra 3 (37,5%) isolados OXA-143, OXA-23 ou OXA-72 positivos, e 1 (12,5%) isolado produtor de OXA-58, respectivamente. Já, a combinação amicacina/ampicilina-sulbactam foi S contra 2 (25%) A. baumannii OXA-143 ou OXA-23 positivos, sendo PS contra dois (25%) A. baumannii OXA-58 ou OXA-143/23 positivos. De interesse, foi o efeito S da combinação polimixina B/vancomicina, contra 2 cepas (25%) produtoras de OXA-72 ou OXA-23. Por outro lado, a combinação ampicilina-sulbactam/rifampicina apresentou atividade PS contra 6 (75%) cepas produtoras das variantes OXA-23, OXA-143, OXA-72 ou OXA-58. Da mesma forma, rifampicina combinada com polimixina B foi sinérgica para uma cepa OXA-23 (12,5%) e PS para 5/8 (62,5%) cepas produtoras de OXA-72, OXA-58, OXA-23/-OXA143 ou OXA-143. O efeito sinérgico da combinação polimixina B/imipenem foi confirmado, in vivo, no modelo murino de infecção, tanto por avaliação histopatológica como por redução das UFC/g pulmão ou baço (p ≤ 0,05). Finalmente, foi avaliada a atividade, in vitro, do lípide catiônico brometo de dioctadecildimetilamônio (DDA), individualmente e em combinação com tigeciclina. DDA possui efeito bactericida, e potencializou sinergicamente a tigeciclina contra 2 (25%) cepas OXA-143 ou OXA-23 positivas. A atividade do DDA, assim como a atividade da sua combinação com tigeciclina foram efetivas já na segunda hora de interação, como avaliado pelas curvas de morte. Em resumo, o efeito sinérgico decorrente do uso combinado de amicacina, tigeciclina, polimixina B, imipenem, rifampicina ou ampicilina/sulbactam, pode constituir uma alternativa terapêutica para o tratamento de infecções produzidas por cepas de A. baumannii MRs produtoras de oxacilinases, sendo que nanofragmentos catiônicos de bicamada do lipídeo sintético de DDA tem potencial para consolidar um produto de aplicação clínica. / Healthcare-associated infections (HAIs) are a serious public health issue, which have been related with an unfavorable prognosis due to the emergence and endemicity of multidrug-resistant (MDR) bacteria. In this scenario, following a worldwide trend, in Brazil, infections produced by MDR OXA-type carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii are currently considered a clinical and epidemiological urgency. In the absence of effective therapeutic alternatives for related infections, this study aimed to evaluate synergistic effects (by using time-kill and checkerboard assays) achieved by the combination of 10 different classes of antimicrobial against 8 strains of MDR, clonally unrelated, A. baumannii strains producing OXA-23, OXA-72, OXA-58 and OXA-143 carbapenemases, being representatives of different medical centers in Brazil. As a result, the combination of amikacin / tigecycline showed synergistic (S = ΣFIC ≤ 0.5) and partially synergistic (PS = 0.5 to 0.75 ΣFIC) activity against 4 (50%) OXA-72 or OXA-143 producing A. baumannii strains, and two strains (25%) producing OXA-23, respectively. Moreover, the combination of polymyxin B / imipenem showed S and PS activity against 3 (37.5%) OXA-143, OXA-23 and OXA-72 positive isolates, and 1 (12.5%) OXA-58 producer, respectively. On the other hand, the combination amikacin / ampicillin-sulbactam was S against 2 (25%) OXA-143 and OXA-23 positive strains, being PS against two (25%) OXA-58- and OXA-143/23-producing A. baumannii. Of interest was the synergistic effect achieved by polymyxin B plus vancomycin against two strains (25%) producing OXA-72 and OXA-23, respectively. Furthermore, the ampicilina-sulbactam / rifampicin combination displayed a PS activity against six (75%) strains producing OXA-23, OXA-143, OXA-72 or OXA-58-type enzymes. Likewise, rifampicin combined with polymyxin B was S against 1 (25%) OXA-23-positive A. baumannii being PS to 5/8 (62.5%) strains producing OXA-72, OXA-58, OXA-23/-OXA143 or OXA-143. The synergistic effect of the combination polymyxin B / imipenem was confirmed, in vivo, in the murine model of infection, by using both histopathological studies and bacterial clearance from the lungs and spleen (CFU/g, p≤ 0.05). Finally, we evaluated the in vitro activity of the cationic lipid dioctadecyldimethylammonium bromide (DDA), alone and in combination with tigecycline. DDA display a bactericidal effect, enhancing synergistically the activity of tigecycline against 2 (25%) OXA-143 and OXA-23 positive strains, respectively. DDA activity alone and in combination with tigecycline was effective on the second hour of interaction, as evaluated by time-kill assays. In summary, the synergistic effect resulting from the combined use of amikacin, tigecycline, polymyxin B, imipenem, rifampicin or ampicillin / sulbactam, could be an alternative therapy for the treatment of infections caused by MDR A. baumannii strains producing oxacilinases. On the other hand, cationic bilayer nanofragments of DDA has potential for consolidating a product for medical application.

Acinetobacter baumanii fait aujourd’hui partie des bactéries les plus problématiques dans le monde. Responsable de nombreux pics épidémiques d’infections nosocomiales auxquelles sont associés de forts taux de mortalité, cette bactérie puise sa pathogénie dans de multiples caractéristiques qui lui permettent ainsi d’échapper au système immunitaire de l’hôte et à la plupart des traitements actuels. Capable d’adhérer à de multiples surfaces, A. baumanii persiste dans l’environnement hospitalier à travers un mode de vie communautaire au sein duquel ses capacités de survie sont exacerbées. Chez les espèces du genre Acinetobacter, le mode de vie communautaire peut prendre deux formes distinctes : le biofilm et la pellicule. Dans la première partie de cette thèse, nous avons cherché à discriminer ces deux modes de vie, chez la souche ATCC 17978, par une analyse protéomique à large échelle. Nous avons confirmé la présence de nombreux marqueurs communs aux deux communautés (transporteurs, systèmes de sécrétion, d’acquisition d’ions, adhésines et pili) et mis en exergue des systèmes spécifiquement reliés à la formation du biofilm (pilus Fim, T2SS, T1SS/pompe A1S_0535-38, LPS/LOS, motif capsulaire) et à celle de la pellicule (Gac). Grâce à l’étude de la souche A. baumannii SDF en mode biofilm, qui présente un génome plus compact, nous montrons que très peu de mécanismes moléculaires sont partagés par les deux souches étudiées. Ce résultat témoigne de la difficulté quant au développement d’un traitement dirigé contre les biofilms A. baumannii. Dans une deuxième partie, nous avons testé deux approches pour prévenir et éradiquer les biofilms à A. baumannii. La première a ciblé le Quorum Sensing (QS), système de communication essentielle à la coordination des cellules. Nous avons pu montrer que les acides gras mono-insaturés (acide palmitoléique et acide myristoléique), au même titre que la virstatine, limitait la formation de communautés à A. baumannii en inhibant l’expression du régulateur abaR nécessaire au QS. Dans une seconde stratégie, nous avons finalement évalué l’action antibactérienne et antibiofilm d’un nouveau composé d’origine naturelle : la squalamine. Dans cette étude, nous montrons pour la première fois qu’A. baumannii est capable d’entrer dans un état de dormance (persistant/VBNC) pour survivre à de fortes doses de ciprofloxacine, mais que la squalamine est capable d’éradiquer ces cellules persistantes grâce à des concentrations inférieures à la concentration hémolytique. / Today, Acinetobacter baumannii is one of the most problematic pathogens in the world. This bacterium is responsible for worldwide epidemic outbreaks associated with dramatic mortality rates. It possesses high capacities to evade the immune host system and to resist to numerous available antibacterial agents. A. baumannii is also able to persist into hospital environment due to high adhesion abilities which induce community development. This process is also associated to an enhanced survival rate. In Acinetobacter genus, community modes of lif can take two forms : biofilm and pellicle. In this study on the strain ATCC 17978, we tried to discriminate these two lifestyles by a large scale proteomic analysis. We have confirmed the presence of many common community markers (transporters, ion acquisition secretion systems, adhesins and pili) and highlighted systems specifically related to biofilm (pilus Fim, T2SS, T1SS / pump A1S_0535-38, LPS / LOS, capsular pattern) and pellicle communities. Furthermore the proteomic analysis of an avirulent A. baumannii strain, SDF, in biofilm allowed to highlight peculiar metabolic pathways, specific adhesion determinants but very few markers shared by ATCC 17978. This demonstrated the difficulty in developing a treatment directed against A. baumannii biofilm. Then, we tested different approaches to prevent and eradicate biofilms. The first one targeted the Quorum Sensing system (QS), an essential communication system for cell coordination. We have showed that monounsaturated fatty acids (palmitoleic acid and myristoleic acid), like virstatin prevent the community formation of A. baumannii by inhibiting the expression of the abaR regulator required for QS. In a second strategy, we have evaluated the antibacterial and antibiofilm activity of a new natural compound : the squalamine. We showed for the first time that if ciprofloxacin treatment was able to induce a dormancy population (persistent/VBNCs) in A. baumannii, squalamine was able to eradicate this population of dormant cells.

Acinetobacter baumannii is an important nosocomial pathogen characterized by the ability to acquire and develop complex resistance to antimicrobial agents. This capability is caused by eflux systems removing molecules of antibiotics from bacterial intracellular space. AdeABC is an RND-type chromosomal eflux system specific for A. baumannii which has a broad substrate spectrum. In this work, we focused on functional analysis of AdeABC to define its role in the resistance development to aminoglycosides in genetically different strains. We studied a set of 15 epidemiologically and genotypically well characterized strains of A. baumannii which were fully susceptible to aminoglycosides and other antibiotics primarily effective against this species. We determined genotyp of AdeABC for these strains and performed a selection for resistant variants in the presence of netilmicin. Using real-time qRT-PCR we compared the expression of the transporter gene adeB in originally sensitive strains and selected variants. The obtained results confirmed that the increased expression of AdeABC significantly reduces susceptibility to aminoglycosides and other antibiotics. The results also suggest that the efflux system provides a significant selective advantage for nosocomial strains of A. baumannii.

Orientador: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Resumo: A resistência microbiana causa grande número de mortes todos os anos. Sua emergência e disseminação são fenômenos complexos, que devem ser compreendidos no contexto de redes de assistência. Entre os microrganismos multidroga-resistentes (MDR), causam especial preocupação os bacilos Gram-negativos, especialmente Acinetobacter baumannii e Enterobactérias (Escherichia coli, Klebsiella spp e Enterobacter spp) resistentes aos carbapenêmicos (CRAB e CRE, respectivamente). Nós realizamos dois estudos com o objetivo de descrever o comportamento espaço-temporal de CRAB e CRE. O primeiro deles teve delineamento ecológico e se baseou em notificações de agentes de infecção da corrente sanguínea em Unidades de Terapia Intensiva do Estado de São Paulo. O segundo foi uma revisão sistemática de literatura científica e “literatura cinzenta” para identificar relatos de ocorrência de infecções por CRAB e CRE no Brasil. Nossos resultados no Estado de São Paulo demonstraram tendências temporais opostas para CRAB (redução) e CRE (crescimento). Em ambos os casos a incidência é maior nas Regiões Metropolitanas de São Paulo e Campinas, a partir de onde os microrganismos parecem espalhar-se para outras áreas. Infecções foram mais frequentes em hospitais públicos e naqueles com menor proporção de leitos de UTI. Fatores socio-econômicos e demográficos apresentaram associações variáveis, porém plausíveis, com a incidência dos microrganismos de interesse. Os resultados da revisão sistemática apontam para ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Antimicrobial resistance causes great numbers of deaths every year. Its emergence and dissemination are complex phenomena, which must be understood in the context of healthcare networks. Among multidrug-resistant microorganisms (MDR), carbapenem-resistant Gram-negative bacilli, especially Acinetobacter baumannii (CRAB) and Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella spp and Enterobacter spp; CRE) are of special concern. We performed two studies with the objective of describing the space-time behavior of CRAB and CRE. The first study had an ecological design and was based on reports of microorganisms causing bloodstream infections in Intensive Care Units in the São Paulo State, Brazil. The second was a systematic review of scientific literature and "gray literature" to identify reports of CRAB and CRE infections in Brazil. Our results in the State of São Paulo showed opposite temporal trends for CRAB (reduction) and CRE (growth). In both cases the incidence is higher in the Metropolitan Regions of São Paulo and Campinas, from where the microorganisms seem to spread to other areas. Infections were more frequent in public hospitals and in those with a lower proportion of ICU beds. Socio-economic and demographic factors presented variable but plausible associations with the incidence of microorganisms of interest. Results of the systematic review point to an initial concentration of CRAB and CRE reports in the Brazilian Southeast, followed by a dispersion in the country. The... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-07-04T17:46:23Z No. of bitstreams: 1 TES_STEPHANIE_WAGNER_GALLO_PARCIAL.pdf: 790698 bytes, checksum: 760c735fb69bbd136bd69c8c9ddfb82d (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-07-04T17:46:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TES_STEPHANIE_WAGNER_GALLO_PARCIAL.pdf: 790698 bytes, checksum: 760c735fb69bbd136bd69c8c9ddfb82d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-04T17:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES_STEPHANIE_WAGNER_GALLO_PARCIAL.pdf: 790698 bytes, checksum: 760c735fb69bbd136bd69c8c9ddfb82d (MD5) Previous issue date: 2017-03-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) / Acinetobacter calcoaceticus-baumannii (ACB) complex comprises opportunistic and emerging pathogens that are responsible for several diseases, mainly affecting immunocompromised patients and those hospitalized in intensive care units. Therapeutic options for ACB infections are restricted, since these microorganisms are often resistant to most antimicrobials. In addition, these bacteria may also form persister cells, which constitute a small population of susceptible cells able to survive lethal concentrations of bactericidal antimicrobials and other stressors. This phenotype is associated with failure in antimicrobial therapy, especially in chronic and recurrent infections. Therefore, the aim of this study was to evaluate the presence of persister cells from ACB complex isolates exposed to meropenem and/or polymyxin B, in biofilm and planktonic cells, as well as to analyze these cells regarding their morphology and identify expression patterns of proteins possibly involved in the formation and maintenance of persistence. For this, 20 clinical isolates were characterized for the ability to form biofilm on polystyrene surface, and for meropenem and polymyxin B susceptibility, by the assessment of Minimum Inhibitory Concentration (MIC). All isolates were exposed to meropenem at different concentrations above the MIC, while five isolates were exposed to polymyxin B for the assessment of the persisters presence. For all experiments, in order to estimate the fraction of remaining cells, aliquots were removed at determined time points, followed by serial decimal dilutions and drop plating technique on nutrient agar. All isolates presented persisters at different proportions, in both culture conditions when exposed to meropenem or polymyxin B after 48 h. The higher fractions were verified in biofilm for both antimicrobials in comparison with planktonic cultures. Meropenem concentrations did not influence persisters levels. However, after polymyxin B exposure, persister cells fractions were dependent on the concentration employed. After 24 h polymyxin B exposure, a growth resumption of surviving cells was observed. These cells were again evaluated for susceptibility to this antimicrobial, remaining susceptible with MIC of 1 ?g/ mL. Moreover, integrity of polymyxin B in the supernatant of the cultures was verified by chromatographic assay, demonstrating that polymyxin B is not significantly degraded after 48 h exposure. On the other hand, when meropenem and polymyxin B were associated at different concentrations, no resumption of cell growth was observed, as well as this combination was able to eradicate persister cells from A. baumannii (Acb-1) cultured in late exponential phase. Furthermore, Nano-Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry was employed for the identification and relative quantification of proteins possibly associated with persistence in A. baumannii, after exposure to meropenem. Different patterns of expression were identified between persister cells present in planktonic and biofilm cultures, suggesting that persistence may be regulated by different mechanisms. Proteins involved in the cell division and DNA replication were overexpressed in planktonic persisters, in agreement with the electron scanning microscopy images that presented dividing cells in this culture condition. Overexpression of glucose dehydrogenase (GDH), NADH dehydrogenase 1 (NDH-1), succinate dehydrogenase and ATP synthase indicates the electron transfer from the GDH-catalyzed reaction to the electron transport chain as a possible energy source for persisters, supporting the presence of cell division observed in planktonic culture. Conversely, proteins involved in amino acid metabolism, as well as major elongation factors were underexpressed in Acb-1 persister cells, suggesting that protein synthesis is reduced, even though many proteins were overproduced. Increased expression of several membrane-related proteins has also been observed, indicating possible changes in its composition and function, although proteins related to lipid metabolism were underexpressed. Overall, proteomic analysis of the persister cells showed that these cells could be physiologically distinct when cultured under different conditions, as well as overtime in the same condition. Therefore, considering the different behaviors of Acb-1 when exposed alone to meropenem or polymyxin B, as well as when exposed to these drugs in combination, it was concluded that each antimicrobial might act as a different stressor, possibly leading and/or selecting distinct tolerance mechanisms among persisters, which enabled their eradication when the drugs were combined. / Os pat?genos pertencentes ao complexo Acinetobacter calcoaceticus-baumannii (ACB) s?o considerados oportunistas e emergentes, respons?veis por ocasionar diversas enfermidades, acometendo principalmente pacientes imunocomprometidos e internados em unidades de tratamento intensivo. As op??es terap?uticas para o tratamento de infec??es ocasionadas por estes pat?genos s?o restritas, uma vez que estes apresentam frequentemente resist?ncia ? maioria dos antimicrobianos. Al?m disso, essas bact?rias podem ainda formar c?lulas persisters, que constituem uma pequena popula??o de c?lulas suscet?veis capazes de tolerar concentra??es letais de antimicrobianos bactericidas e outros agentes estressores. Este fen?tipo est? associado a falhas na terapia antimicrobiana, especialmente nas infec??es cr?nicas e recorrentes. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a presen?a de c?lulas persisters formadas por isolados do complexo ACB frente ? exposi??o ao meropenem e/ou ? polimixina B, na condi??o de biofilme e em cultivo planct?nico, assim como analisar estas c?lulas morfologicamente e identificar padr?es de express?o de prote?nas que pudessem estar envolvidos na forma??o e manuten??o da persist?ncia. Para tanto, 20 isolados cl?nicos foram caracterizados quanto ? capacidade em formar biofilme em superf?cie de poliestireno, e ? suscetibilidade ao meropenem e ? polimixina B, que foi avaliada por meio da determina??o da Concentra??o Inibit?ria M?nima (CIM) a estes f?rmacos. Todos os isolados foram submetidos ? exposi??o ao meropenem em diferentes concentra??es acima da CIM, enquanto que cinco foram expostos ? polimixina B para a avalia??o da presen?a de c?lulas persisters. Para todos os experimentos, a fim de estimar a fra??o de c?lulas remanescentes, al?quotas foram removidas em tempos determinados, efetuando-se dilui??es decimais seriadas e semeadura pela t?cnica da gota em ?gar nutriente. C?lulas persisters, em diferentes fra??es, foram encontradas nos cultivos de todos os isolados, tanto em biofilmes como na condi??o planct?nica, ap?s a exposi??o por 48 h ao meropenem e ? polimixina B, sendo as fra??es mais elevadas encontradas na condi??o de biofilme para ambos os antimicrobianos. As diferentes concentra??es de meropenem avaliadas n?o influenciaram os n?veis de c?lulas persisters; entretanto, frente ? exposi??o ? polimixina B, a fra??o de c?lulas mostrou-se dependente da concentra??o empregada. Ap?s exposi??o ? polimixina B por 24 h, foi observada retomada de crescimento das c?lulas sobreviventes, que foram avaliadas novamente quanto ? suscetibilidade a este antimicrobiano, mantendo-se suscet?veis com CIM de 1 ?g/mL, bem como foi verificada a integridade do antimicrobiano no sobrenadante destes cultivos por ensaios cromatogr?ficos, demonstrando que o mesmo n?o sofre degrada??o ap?s 48 h de exposi??o. Entretanto, quando se associou meropenem ? polimixina B em diferentes concentra??es, al?m de n?o ter sido observada a retomada de crescimento das c?lulas remanescentes, ocorreu a erradica??o das c?lulas persisters de um isolado de A. baumannii (Acb-1) cultivado em fase exponencial tardia. Al?m disso, a t?cnica de Nano-Cromatografia L?quida acoplada ? Espectrometria de Massas em Tandem foi empregada para a identifica??o e quantifica??o relativa de prote?nas possivelmente associadas ? persist?ncia em A. baumannii, ap?s a exposi??o ao meropenem. Diferentes padr?es de express?o foram identificados entre as c?lulas persisters presentes em cultivo planct?nico e em biofilme, sugerindo que a regula??o da persist?ncia possa ser realizada por mecanismos diferentes. Observou-se express?o aumentada de prote?nas envolvidas nos processos de divis?o celular e replica??o de DNA, especialmente no cultivo planct?nico, em concord?ncia com a presen?a de divis?o celular observada nas imagens obtidas a partir da microscopia eletr?nica de varredura nesta condi??o de cultivo. O aumento de express?o da glicose desidrogenase (GDH), NADH desidrogenase (NDH-1), succinato desidrogenase e ATP sintase indicam a transfer?ncia de el?trons a partir da rea??o catalisada por GDH para a cadeia de transporte de el?trons como uma poss?vel fonte de energ?tica para as persisters, corroborando a observa??o da presen?a de divis?o celular observada no cultivo planct?nico. Em contraste, prote?nas envolvidas no metabolismo de amino?cidos, bem como os principais fatores de elonga??o apresentaram express?o diminu?da em c?lulas persisters de Acb-1, sugerindo que a s?ntese proteica esteja reduzida, mesmo que muitas prote?nas tenham sido identificadas com express?o aumentada. Muitas prote?nas relacionadas ? membrana apresentaram a sua express?o aumentada, indicando poss?veis altera??es em sua composi??o e fun??o, embora prote?nas relacionadas ao metabolismo de lip?deos tenham apresentado express?o diminu?da. A an?lise prote?mica das c?lulas persisters, sobretudo, mostrou que estas c?lulas podem ser fisiologicamente distintas quando cultivadas em condi??es diferentes, bem como ao longo do tempo em uma mesma condi??o. Desta forma, considerando os distintos comportamentos do Acb-1 quando exposto isoladamente ao meropenem ou ? polimixina B, bem como quando exposto a estes f?rmacos ao mesmo tempo, pode-se concluir que cada antimicrobiano pode ter atuado como um diferente estressor, possivelmente, levando a e/ou selecionando mecanismos de toler?ncia diferentes entre as persisters, o que possibilitou a sua erradica??o quando os f?rmacos foram combinados.

Orientador: Pasqual Barretti / Resumo: Peritonite por bacilos Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) é complicação importante da diálise peritoneal (DP), com curso clínico grave e elevada taxa de falência do método. Fatores associados à virulência, resistência antimicrobiana, formação de biofilme, entre outros, têm sido relatados, mas o limitado conjunto de evidências não permite concluir sobre os fatores responsáveis pelo pior curso clínico dessas infecções. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das características microbiológicas, das condições clínicas do paciente e do tratamento na evolução de peritonites por BGNNF, ocorridas num único centro, em período de 18 anos. A sensibilidade in vitro aos antimicrobianos, produção de biofilme, além da análise do perfil clonal das bactérias pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado foram realizadas em todos os isolados bacterianos. Foram pesquisados genotipicamente, em isolados de Pseudomonas aeruginosa, a presença de marcadores de virulência (alginato, exoenzima S, fosfolipases C, exotoxina A, protesase alcalina, elastase e ramnolipídeos). Associações entre as características microbiológicas do paciente e tratamento com a taxa de resolução da peritonite foram estudadas. A espécie mais frequente foi Pseudomonas aeruginosa (45,59%), seguida por isolados do complexo Acinetobacter baumannii (17,65%). O estudo dos fatores de virulência da Pseudomonas aeruginosa revelou a presença de fatores de virulência em 100% dos casos, exceto exoenzima S (58,33%)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Peritonitis due to non-fermentative Gram-negative bacilli (NFGNB) is a serious complication of peritoneal dialysis (PD), with a severe clinical course and high technique failure rate. Factors as bacterial virulence, antimicrobial resistance, biofilm formation, among others, have been reported, but the limited amount of evidence does not allow to conclude on the factors responsible for the worst clinical course of these infections. The objective of this study was to evaluate the influence of the microbiological characteristics, patients conditions, and treatment on evolution of peritonitis episodes at a single center in an 18 - year period. In vitro susceptibility, biofilm production, and clonal profile analysis of bacteria by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) were performed in all isolates. The presence of virulence markers (alginate, exoenzyme S, phospholipases C, exotoxin A, alkaline protease, elastase, and ramnolipids) was genotyped in bacterial isolates of Pseudomonas aeruginosa. From the data referring to the patient and causal agent, associations between the microbiological, patient characteristics, and treatment on the resolution rate of peritonitis were analyzed. The most frequent species was Pseudomonas aeruginosa (45.59%), followed by Acinetobacter baumannii complex (17.65%). The study of the virulence factors of Pseudomonas aeruginosa revealed the presence of virulence factors in 100% of the cases, except for exonzyme S (58.33%) and hemolytic phospholipase C ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

This study focuses on the question of the epidemiology of resistance to antibiotics in Acinetobacter baumannii, which is nowadays one of the most problematic bacterial patho- gens associated with failing antimicrobial therapy. Its aim was to define population-genetic properties, epidemiology and the nature of multidrug resistance for a sample of the current population of A. baumannii from Czechia. A total of 55 isolates were collected in eight medi- cal facilities in central Bohemia from October 2016 to May 2018. The isolates were assessed for their identity at the species, clonal and strain levels as well as resistance phenotype and genotype; they were classified into five clonal groups, each of which encompassed isolates that were likely to be epidemiologically related. The 55 isolates studied belonged, nearly exclusively, to global clone ECII, with 53 % of them forming a genetically relatively homoge- neous group characterized by extensive resistance to antibiotics (susceptible only to col- istin), the presence of genes encoding ArmA a OXA-23 (resistance to all aminoglycosides and carbapenems) and spread in all locations. The in-depth epidemiological analysis of isolates from the city of Příbram and its vicinity indicated the regional spread of two strains, one of which belonged to the...

Submitted by MIRIAN MARCOLAN DE MELLO null (marcolanmirian@yahoo.com.br) on 2016-02-16T08:13:42Z No. of bitstreams: 1 TESE Doutorado Mirian14_02_2016REPOSITÓRIO.pdf: 1649527 bytes, checksum: c26e5ed45e88f8a3889873caa917015a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-02-17T13:45:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mello_mm_dr_sjc.pdf: 1649527 bytes, checksum: c26e5ed45e88f8a3889873caa917015a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-17T13:45:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mello_mm_dr_sjc.pdf: 1649527 bytes, checksum: c26e5ed45e88f8a3889873caa917015a (MD5) Previous issue date: 2015-12-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Devido ao rápido aumento dos micro-organismos resistentes aos antibióticos e ao desenvolvimento limitado de novos agentes antimicrobianos, as infecções por bactérias Gram-negativas estão se tornando um desafio para os profissionais da saúde e uma ameaça para a saúde pública internacional. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito sinérgico dos antibióticos convencionais associados a terapia fotodinâmica antimicrobiana (PDT) no controle de Acinetobacter baumannii. Para realização desse trabalho, foram obtidos isolados clínicos de A. baumannii do Laboratório de Análises Clínicas Valeclin da cidade de São José dos Campos/SP, identificados pelo método de bioquimismo e submetidos ao teste de difusão em disco para verificar a sensibilidade antimicrobiana. Os isolados selecionados foram transferidos para o ICT/UNESP, onde foi realizado testes para determinação da Concentração Inibitória Mínima aos antibióticos Imipenem e Meropenem seguindo as normas da CLSI. Cepas sensíveis e resistentes aos antibióticos foram avaliadas quanto a sensibilidade in vitro à terapia fotodinâmica antimicrobiana. Além disso, foram testados os efeitos dos antibióticos convencionais, da PDT e da terapia combinada de antibióticos e PDT nas infecções experimentais induzidas em G. mellonella por isolados clínicos de A. baumannii resistentes aos antibióticos. Os resultados das terapias na infecção experimental foram avaliados por meio da curva de sobrevivência das lagartas de G. mellonella. Os dados dos testes in vitro foram submetidos à Análise de Variância e teste de Tukey. Os dados obtidos na curva de sobrevivência de G. mellonella foram analisados pelo método de Log-rank. Em todos os testes, foi considerado nível de significância de 5%. Nos resultados desse estudo, observou-se que o Laboratório Valeclin identificou 1,54% de amostras positivas para A. baumannii entre as 13.715 amostras clínicas analisadas em um período de 8 meses. Entre os isolados de A. baumannii, 58% demonstraram resistência aos antibióticos imipenem e meropenem por meio de teste de difusão em disco. A seguir 3 isolados clínicos sensíveis e 18 isolados resistentes a esses antibióticos foram selecionados para o presente estudo. O valor de CIM para os isolados sensíveis variou de ˂ 0,5 a 1µg/mL e para os isolados resistentes de 64 a >128µg/mL. A PDT in vitro reduziu o número de células de A. baumannii em todos os isolados testados, mas o percentual de redução foi dependente dos isolados analisados. Além disso, verificou-se nos testes in vivo, que o tratamento com PDT, antibióticos (Imipenem e Meropenem) e associação de PDT+Antibióticos resultaram na sobrevivência das lagartas de G. mellonella, porém sem efeito sinérgico. Conclui-se que a PDT teve ação antimicrobiana contra isolados clínicos de A. baumannii sensíveis e resistentes aos carbapenêmicos, mas não apresentou efeito sinérgico quando associada com antibióticos. / Due to the rapid growth of microorganisms resistant to antibiotics and the limited development of new antimicrobial agents, infections by Gram-negative bacteria are becoming a challenge for health professionals and a threat to international public health. The aim of this study was to evaluate the synergistic effect of conventional antibiotics associated with antimicrobial photodynamic therapy (PDT) in control of Acinetobacter baumannii. In order to conduct this project were obtained clinical isolates of A. baumannii at the Clinical Laboratory Valeclin situated in the city of São José dos Campos / SP, identified by bioquimismo method and submitted to disk diffusion test to verify the antimicrobial sensitivity. The selected isolates were transferred to the ICT / UNESP, which were conducted tests to determine the Minimum Inhibitory Concentration to Imipenem and Meropenem antibiotics following the rules of the CLSI. Sensitive and resistant strains to antibiotics were evaluated in vitro sensitivity to antimicrobial photodynamic therapy. Besides, the effects of conventional antibiotics, and combined PDT, and PDT of antibiotics in experimental infections induced in G. mellonella by clinical isolates of A. baumannii resistant to antibiotic therapy were tested. The results of therapies in experimental infection were evaluated by survival curve of worms G. mellonella. Data from in vitro tests were submitted to ANOVA and Tukey test. The data obtained in G. mellonella survival curve were analyzed by log-rank method. In all tests it was considered 5% significance level. The results of this study, it was observed that the Valeclin Laboratory identified 1.54% of positive samples for A. baumannii between the 13,715 clinical specimens analyzed in a period of 8 months. Among the isolates of A. baumannii, 58% were resistant to antibiotic imipenem and meropenem by disk diffusion test. Next, 3 isolates clinical sensitive and 18 isolates resistant to those antibiotics were selected for this study. The MIC value for sensitive isolates ranged from 0.5 to ˂ 1μg / mL and resistant isolates from 64 to> 128μg / mL. The PDT in vitro reduced the number of A. baumannii cells in all isolates tested, but the percentage of reduction was dependent on the analyzed isolates. Furthermore, it was found in in vivo tests, treatment with PDT, antibiotic (Imipenem and Meropenem) and PDT + Antibiotics association resulted in the survival of G. mellonella caterpillars, but no synergistic effect. It was concluded that PDT has antimicrobial activity against clinical isolates of A. baumannii sensitive and resistant to carbapenems, but it had no synergistic effect when combined with antibiotics.

Submitted by Ana Cláudia Moro Lima dos Santos (anna.moro@hotmail.com) on 2018-05-07T20:15:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertaçãofinal.pdf: 1989003 bytes, checksum: c02493762a88023038e4fc08eea12f1c (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-05-09T16:37:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_acml_me_bot.pdf: 1989003 bytes, checksum: c02493762a88023038e4fc08eea12f1c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-09T16:37:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_acml_me_bot.pdf: 1989003 bytes, checksum: c02493762a88023038e4fc08eea12f1c (MD5) Previous issue date: 2018-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Peritonite por bacilos Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) é complicação importante da diálise peritoneal (DP), com curso clínico grave e elevada taxa de falência do método. Fatores associados à virulência, resistência antimicrobiana, formação de biofilme, entre outros, têm sido relatados, mas o limitado conjunto de evidências não permite concluir sobre os fatores responsáveis pelo pior curso clínico dessas infecções. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das características microbiológicas, das condições clínicas do paciente e do tratamento na evolução de peritonites por BGNNF, ocorridas num único centro, em período de 18 anos. A sensibilidade in vitro aos antimicrobianos, produção de biofilme, além da análise do perfil clonal das bactérias pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado foram realizadas em todos os isolados bacterianos. Foram pesquisados genotipicamente, em isolados de Pseudomonas aeruginosa, a presença de marcadores de virulência (alginato, exoenzima S, fosfolipases C, exotoxina A, protesase alcalina, elastase e ramnolipídeos). Associações entre as características microbiológicas do paciente e tratamento com a taxa de resolução da peritonite foram estudadas. A espécie mais frequente foi Pseudomonas aeruginosa (45,59%), seguida por isolados do complexo Acinetobacter baumannii (17,65%). O estudo dos fatores de virulência da Pseudomonas aeruginosa revelou a presença de fatores de virulência em 100% dos casos, exceto exoenzima S (58,33%) e fosfolipase C não hemolítica (87,5%). Houve elevada proporção de BGNNF resistentes aos antimicrobianos testados, em particular à amicacina (36,73%) e à ciprofloxacina (44,9%), sendo que a sensibilidade aos betalactâmicos esteve acima de 70%. Observou-se elevada proporção de isolados produtores de biofilme (73,08%). Os resultados da tipagem por PFGE revelaram um perfil policlonal para a maioria dos isolados, entretanto para isolados do complexo Acinetobacter baumannii a análise revelou um cluster, entre 2000-2008, com perfil de multiresistência aos antimicrobianos, sugerindo fonte hospitalar. A evolução dos episódios mostrou reduzida taxa de cura (35,29%). A sensibilidade à amicacina e cefepime, se associaram de modo independente à maior chance de cura, enquanto a presença concomitante de infecção do óstio de saída do cateter de DP foi preditor independente de não resolução do episódio. Não se observaram associações entre fatores de virulência, produção de biofilme e características do paciente e tratamento com o desfecho dos episódios. Em conclusão, peritonites em DP, por BGNNF, são infecções com reduzida taxa de cura; a resistência bacteriana é fator associado à menor chance de resolução e peritonite por bactérias do gênero Acinetobacter spp. podem representar infecção grave, potencialmente de origem hospitalar, o que deve fazer redobrar os cuidados quanto ao seu manejo clínico. / Peritonitis due to non-fermentative Gram-negative bacilli (NFGNB) is a serious complication of peritoneal dialysis (PD), with a severe clinical course and high technique failure rate. Factors as bacterial virulence, antimicrobial resistance, biofilm formation, among others, have been reported, but the limited amount of evidence does not allow to conclude on the factors responsible for the worst clinical course of these infections. The objective of this study was to evaluate the influence of the microbiological characteristics, patients conditions, and treatment on evolution of peritonitis episodes at a single center in an 18 - year period. In vitro susceptibility, biofilm production, and clonal profile analysis of bacteria by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) were performed in all isolates. The presence of virulence markers (alginate, exoenzyme S, phospholipases C, exotoxin A, alkaline protease, elastase, and ramnolipids) was genotyped in bacterial isolates of Pseudomonas aeruginosa. From the data referring to the patient and causal agent, associations between the microbiological, patient characteristics, and treatment on the resolution rate of peritonitis were analyzed. The most frequent species was Pseudomonas aeruginosa (45.59%), followed by Acinetobacter baumannii complex (17.65%). The study of the virulence factors of Pseudomonas aeruginosa revealed the presence of virulence factors in 100% of the cases, except for exonzyme S (58.33%) and hemolytic phospholipase C (87.5%). There was a high proportion of antimicrobial resistant, in particular to amikacin (36.73%) and ciprofloxacin (44.9%), with sensitivity to betalactam above 70%. A high (73.08%) proportion of biofilm producing isolates was observed. The results of the PFGE typing revealed a polyclonal profile for most of the isolates; however, for the Acinetobacter baumannii complex species the analysis revealed a cluster at interval from 2000 to 2008, with antimicrobial multi resistance profile, suggest that peritonitis by this agent had a hospital source. The evolution of the episodes showed a reduced resolution rate (35.29%). The susceptibility to amikacin and to cefepime were independently associated with a higher odds of resolution, while the concomitant presence of PD catheter exit site infection was an independent predictor of non-resolution. In conclusion, peritonitis due to NFGNB in PD are infections with reduced resolution rate; bacterial resistance is an independent predictor of lower odds of resolution. Peritonitis by Acinetobacter spp. can represent serious / 64736017.2.0000.5411

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Infections caused by Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa multiresistant are responsible for high morbidity and mortality, failure of drug therapy, increased hospital stay and consequently the financial impact on the health system. However, while the occurrence of these bacteria to configure a public health problem, numerous studies reveal that it is scarce information about the resistance genes present in multi-drug resistant bacteria. This reality associated with the negative impact of these on society, justifies the importance of detecting the resistance genes of A. baumannii and P. aeruginosa multiresistant and clinically characterize patients from a public hospital in Sergipe. It is an analytical prospective cohort study and a quantitative approach. The collection of clinical data of patients was carried out through a specifically designed form. Strains of A. baumannii were subjected to PCR for identification of resistance genes (blaIMP, blaVIM, blaSIM, bla OXA-51, blaOXA-58, blaOXA-23 and blaOXA-24) and P. aeruginosa the blaSPM genes, blaVIM, blaIMP, blaKPC. Descriptive analyzes were performed, the Chi-square and Fisher exact tests, with 5% significance level. The software used was R version 3.1.2. The sample consisted of 119 patients. Of the 43 patients with P. aeruginosa isolates, 33 were male (76.7%) with mean age of 46.2 years. Twenty-eight were admitted to the ICU (65.1%) and 13 (30.2%) diagnosed with head trauma (TBI). Of the 76 patients with isolates of A. baumannii, 59 (77.6%) were male, mean age of 44.4 years. Fifty patients (65.8%) were from the ICU and 18 (23.7%) diagnosed with TBI. The median number of days of hospitalization was statistically significant between bacteria. Among the isolation sites, there is urine to P. aeruginosa, with 16 samples (37.2%) and tracheal aspirate for A. baumannii with 32 (42.1%) strains. A urinary catheter was the most used device in patients with isolates of A. baumannii (93.4% - 71) and the central venous catheter in patients with P. aeruginosa (93% - 40). All patients with P. aeruginosa isolates made use of carbapenems and 98.6% (75) of A. baumannii. It found statistically significant differences between bacteria in the use of aminoglycosides, 3rd generation cephalosporins and tigecycline. In P. aeruginosa was no significant difference in the use of oxacillin and cephalosporins of 1st and 3rd generations and polymyxin in the various sectors of the hospital. All the samples of A. baumannii and P. aeruginosa were susceptible to colistin, ranging between MIC <= 0.5 and 2. The majority (55.8% - 24) patients with P. aeruginosa and A. baumannii (52.6% - 40) died. Among the 76 strains of A. baumannii, 56 (73.6%) had concomitant both blaOXA-51 and blaOXA-23 genes. Among the 43 strains of P. aeruginosa, 28 (65.1%) had the blaSPM gene. It was concluded that the A.baumannii was more frequent than P. aeruginosa. There was a significant predominance of Pseudomonas and Acinetobacter in the urine in tracheal aspirates. Carbapenems was widely used throughout the hospital stay of patients with Acinetobacter and Pseudomonas isolates in different hospital departments. Most Pseudomonas strains showed blaSPM resistance gene and Acinetobacter blaOXA-23 genes and blaOXA-51 concurrently. The mortality of patients with Acinetobacter and Pseudomonas was greater than 50%. / As infecções causadas por Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa multirresistentes são responsáveis pela alta morbidade e mortalidade, falência da terapia medicamentosa, aumento do período de internação e consequentemente impacto financeiro no sistema de saúde. Todavia, embora a ocorrência destas bactérias se configure um problema de saúde pública, inúmeros estudos revelam que é escasso o conhecimento acerca dos genes de resistência presentes nas bactérias multirresistentes. Essa realidade associada ao impacto negativo destas na sociedade, justifica a importância de detectar os genes de resistência de A. baumannii e P. aeruginosa multirresistentes e caracterizar clinicamente os pacientes de um hospital público de Sergipe. Trata-se de um estudo analítico de coorte prospectiva e abordagem quantitativa. A coleta dos dados clínicos dos pacientes foi realizada através de um formulário especificamente elaborado. As cepas de A. baumannii foram submetidas à técnica PCR para identificação dos genes de resistência (blaIMP, blaVIM, blaSIM, bla OXA-51, blaOXA-58, blaOXA-23 e blaOXA-24) e em P. aeruginosa os genes blaSPM, blaVIM, blaIMP, blaKPC. Foram realizadas análises descritivas, os testes de Qui-Quadrado e Exato de Fisher, com nível de significância de 5%. O software utilizado foi o R versão 3.1.2. A amostra foi constituída de 119 pacientes. Dos 43 pacientes com isolados de P.aeruginosa, 33 eram do sexo masculino (76,7%), com idade média de 46,2 anos. Vinte e oito estavam internados na UTI (65,1%) e 13 (30,2%) com diagnóstico de trauma crânio encefálico (TCE). Dos 76 pacientes com isolados de A. baumannii, 59 (77,6%) era do sexo masculino, média de idade de 44,4 anos. Cinquenta pacientes (65,8%) eram procedentes da UTI e 18 (23,7%) com diagnóstico de TCE. A mediana de dias de internamento foi estatisticamente significante entre as bactérias. Dentre os sítios de isolamento, destaca-se a urina para P. aeruginosa, com 16 amostras (37,2%) e o aspirado traqueal para A. baumannii com 32 (42,1%) cepas. A sonda vesical foi o dispositivo mais usado nos pacientes com isolados de A. baumannii (93,4% - 71) e o cateter venoso central nos pacientes com P. aeruginosa (93% - 40). Todos os pacientes com isolados de P.aeruginosa fizeram uso dos carbapenêmicos e 98,6% (75) dos A. baumannii. Foi encontrado diferença estatisticamente significante entre as bactérias quanto ao uso dos aminoglicosídeos, cefalosporinas de 3ª geração e tigeciclina. Em P. aeruginosa houve diferença significativa no uso da oxacilina e cefalosporinas de 1ª e 3ª gerações e polimixina nos diversos setores do hospital. Todos as amostras de A. baumannii e P. aeruginosa apresentaram sensibilidade à colistina, com variação da MIC entre < = 0,5 e 2. A maioria (55,8% - 24) dos pacientes com P. aeruginosa e A. baumannii (52,6% - 40) foram a óbito. Dentre as 76 cepas de A. baumannii, 56 (73,6%) apresentaram concomitantemente os dois genes blaOXA-51 e blaOXA-23. Dentre as 43 cepas de P. aeruginosa, 28 (65,1%) apresentaram o gene blaSPM. Concluiu-se que o A.baumannii foi mais frequente do que a P.aeruginosa. Houve predomínio significante da Pseudomonas na urina e do Acinetobacter na secreção traqueal. Os carbapenêmicos foi amplamente utilizado ao longo da internação dos pacientes com isolados de Acinetobacter e Pseudomonas nos diversos setores do hospital. A maioria das cepas de Pseudomonas apresentaram gene de resistência blaSPM e Acinetobacter os genes blaOXA-23 e blaOXA-51 concomitantemente. A mortalidade dos pacientes com Acinetobacter e Pseudomonas foi superior a 50%.