Diese Dissertation beschreibt den Einfluss von HGF auf das ventrikuläre Remodeling des Rattenherzens in der 1. und 16. Woche nach Ischämie und Reperfusion. Die funktionalen Parameter wurden mit Hilfe des NMR gemessen. In der 16. Woche nach Ischämie und Reperfusion wurde die histologisch ermittelte Narbengröße mit dem Wert, der mittels NMR ermittelt wurde, verglichen. / This dissertation describes the influence of HGF on ventricular cardial remodeling of rats one week and sixteen weeks after ischemia and reperfusion. The functional parameters were calculated with NMR. Sixteen weeks after ischemia and reperfusion the scar formation was also analyzed by histologic methods. The outcomes of this method were compared with the results of the measurement with NMR.

Articular cartilage defects are still one of the major challenges in orthopedic and trauma surgery. Today, autologous chondrocyte transplantation (ACT), as a cell-based therapy, is an established procedure. However, one major limitation of this technique is the loss of the chondrogenic phenotype during expansion. Human mesenchymal stem cells (hMSCs) have an extensive proliferation potential and the capacity to differentiate into chondrocytes when maintained under specific conditions. They are therefore considered as candidate cells for tissue engineering approaches of functional cartilage tissue substitutes. First in this study, hMSCs were embedded in a collagen type I hydrogel to evaluate the cartilaginous construct in vitro. HMSC collagen hydrogels cultivated in different culture media showed always a marked contraction, most pronounced in chondrogenic differentiation medium supplemented with TGF-ß1. After stimulation with chondrogenic factors (dexamethasone and TGF-ß1) hMSCs were able to undergo chondrogenesis when embedded in the collagen type I hydrogel, as evaluated by the temporal induction of cartilage-specific gene expression. Furthermore, the cells showed a chondrocyte-like appearance and were homogeneously distributed within a proteoglycan- and collagen type II-rich extracellular matrix, except a small area in the center of the constructs. In this study, chondrogenic differentiation could not be realized with every hMSC preparation. With the improvement of the culture conditions, e.g. the use of a different FBS lot in the gel fabrication process, a higher amount of cartilage-specific matrix deposition could be achieved. Nevertheless, the large variations in the differentiation capacity display the high donor-to-donor variability influencing the development of a cartilaginous construct. Taken together, the results demonstrate that the collagen type I hydrogel is a suitable carrier matrix for hMSC-based cartilage regeneration therapies which present a promising future alternative to ACT. Second, to further improve the quality of tissue-engineered cartilaginous constructs, mechanical stimulation in specific bioreactor systems are often employed. In this study, the effects of mechanical loading on hMSC differentiation have been examined. HMSC collagen hydrogels were cultured in a defined chondrogenic differentiation medium without TGF-ß1 and subjected to a combined mechanical stimulation protocol, consisting of perfusion and cyclic uniaxial compression. Bioreactor cultivation neither affected overall cell viability nor the cell number in collagen hydrogels. Compared with non-loaded controls, mechanical loading promoted the gene expression of COMP and biglycan and induced an up-regulation of matrix metalloproteinase 3. These results circumstantiate that hMSCs are sensitive to mechanical forces, but their differentiation to chondrocytes could not be induced. Further studies are needed to identify the specific metabolic pathways which are altered by mechanical stimulation. Third, for the development of new cell-based therapies for articular cartilage repair, a reliable cell monitoring technique is required to track the cells in vivo non-invasively and repeatedly. This study aimed at analyzing systematically the performance and biological impact of a simple and efficient labeling protocol for hMSCs. Very small superparamagnetic iron oxide particles (VSOPs) were used as magnetic resonance (MR) contrast agent. Iron uptake was confirmed histologically with prussian blue staining and quantified by mass spectrometry. Compared with unlabeled cells, VSOP-labeling did neither influence significantly the viability nor the proliferation potential of hMSCs. Furthermore, iron incorporation did not affect the differentiation capacity of hMSCs. The efficiency of the labeling protocol was assessed with high resolution MR imaging at 11.7 Tesla. VSOP-labeled hMSCs were visualized in a collagen type I hydrogel indicated by distinct hypointense spots in the MR images, resulting from an iron specific loss of signal intensity. This was confirmed by prussian blue staining. In summary, this labeling technique has great potential to visualize hMSCs and track their migration after transplantation for articular cartilage repair with MR imaging. / Gelenkknorpeldefekte stellen immer noch eine der großen Herausforderungen in der Orthopädie und Unfallchirurgie dar. Als zellbasiertes Verfahren ist die Autologe Chondrozytentransplantation (ACT) heute in der klinischen Routine etabliert. Ein großer Nachteil dieser Methode ist jedoch der Verlust des chondrozytären Phänotyps während der Expansion der Zellen. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSZ) verfügen über ein ausgeprägtes Proliferationspotential und besitzen die Fähigkeit, unter spezifischen Bedingungen zu Knorpelzellen zu differenzieren. Sie werden daher als alternative Zellen für das Tissue Engineering von funktionellem Knorpelersatzgewebe in Betracht gezogen. In der vorliegenden Arbeit wurden erstens hMSZ in ein Kollagen Typ I Hydrogel eingebracht und zunächst der Grad der chondrogenen Zelldifferenzierung im Konstrukt evaluiert. HMSZ-Kollagenhydrogele zeigten in allen Kultivierungsmedien eine deutliche Kontraktion, welche am stärksten im chondrogenen Differenzierungsmedium unter Zugabe von TGF-ß1 ausgeprägt war. Nach Stimulation mit chondrogenen Faktoren (Dexamethason und TGF-ß1) differenzierten hMSZ zu Knorpelzellen, nachgewiesen durch die Induktion von knorpelspezifischer Genexpression. Die Zellen wiesen eine Chondrozyten-ähnliche Morphologie auf und waren bis auf einen kleinen Bereich in der Mitte des Konstrukts homogen in einer Proteoglykan- und Kollagen Typ II-haltigen extrazellulären Matrix verteilt. Eine chondrogene Differenzierung konnte in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht mit jeder hMSZ-Präparation realisiert werden. Durch die Verbesserung der Kulturbedingungen, z.B. durch die Verwendung einer anderen Serumcharge im Gelherstellungsprozess, konnte eine Steigerung der knorpelspezifischen Matrixsynthese erzielt werden. Nichtsdestotrotz spiegeln die großen Schwankungen in der Differenzierungskapazität die hohe Variabilität zwischen verschiedenen Spendern wider, welche die Entwicklung eines knorpelartigen Gewebes beeinflussen. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass das Kollagen Typ I Hydrogel eine geeignete Trägermatrix für hMSZ darstellt, um in Stammzell-basierten Knorpelregenerationstherapien zukünftig als vielversprechende Alternative zur ACT eingesetzt zu werden. Um die Qualität eines in vitro generierten knorpelartigen Gewebes weiter zu verbessern, wird häufig eine mechanische Stimulation in spezifischen Bioreaktorsystemen durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurden daher zweitens die Effekte von mechanischer Belastung auf die Differenzierung von hMSZ untersucht. HMSZ-Kollagenhydrogele wurden im chondrogenen Differenzierungsmedium ohne TGF-ß1 kultiviert und einem kombinierten mechanischen Stimulationsprotokoll, bestehend aus Perfusion und zyklischer uniaxialer Kompression, ausgesetzt. Die Kultivierung im Bioreaktor hatte weder einen Einfluss auf die Zellvitalität noch auf die Anzahl der Zellen im Kollagen Typ I Hydrogel. Die mechanische Beeinflussung steigerte im Vergleich mit den unbelasteten Kontrollgelen die Genexpression von COMP und Biglykan und führte zu einer Hochregulation von Matrix Metalloproteinase 3. Diese Ergebnisse belegen, dass hMSZ mechanosensitiv sind, jedoch konnte keine Differenzierung zu Knorpelzellen induziert werden. Hierfür sind weitere Studien notwendig, um spezifische Stoffwechselwege zu identifizieren, welche durch die mechanische Stimulation beeinflusst werden. Drittens, für die Entwicklung von neuen zellbasierten Therapien für die Gelenkknorpelrekonstruktion ist eine zuverlässige Bildgebung auf zellulärer Ebene erforderlich, um die Zellen in vivo wiederholt nicht invasiv zu detektieren. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, systematisch die Effizienz und die biologischen Auswirkungen einer einfachen und dauerhaften Markierung für hMSZ zu untersuchen. Superparamagnetische Eisenoxidnanopartikel (VSOPs), ein Magnetresonanz (MR)-Kontrastmittel, wurden für die Markierung eingesetzt. Die Aufnahme der Eisenoxidnanopartikel wurde histologisch mittels eisenspezifischer Berliner-Blau-Färbung nachgewiesen und durch Massenspektroskopie quantifiziert. Im Vergleich zu unmarkierten Zellen beeinträchtigte die VSOP-Markierung weder die Vitalität noch das Proliferationspotential der hMSZ. Weiterhin war durch die Aufnahme der Eisenoxidnanopartikel keine Beeinflussung der Differenzierungskapazität der hMSZ zu verzeichnen. Die Effizienz der Zellmarkierung wurde mittels hochauflösender MR-Bildgebung bei 11,7 Tesla beurteilt. VSOP-markierte hMSZ im Kollagen Typ I Hydrogel erschienen als hypointense Punkte in den MR-Bildern, hervorgerufen durch die typische, VSOP-bedingte Signalauslöschung. Histologische Untersuchungen dieser Konstrukte bestätigten die MR-Ergebnisse. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass diese Zellmarkierungsmethode in Verbindung mit der MR-Bildgebung über das Potential verfügt, nach einer Gelenkknorpelrekonstruktion Aufschluss über die Lokalisation und Migration der transplantierten hMSZ zu liefern.

Nuclear magnetic resonance (NMR) imaging is a well-established imaging technique. If the achieved spatial resolution is below 100 um, it is usually denoted as magnetic resonance microscopy (MRM). The spatial resolution limit is on the order of a few um. As a downside, high resolution imaging is usually time-consuming and technological requirements are very sumptuous. Furthermore, miniaturization of the radiofrequency (RF) coil leading to a so-called microcoil is necessary; it also brings along detrimental effects. Therefore, there is a high potential for optimizing present MRM methods. Hence it is the aim of this work to improve and further develop present methods in MRM with focus on the RF coil and to apply those methods on new biological applications. All experiments were conducted on a Bruker 17.6 T system with a maximum gradient strength of 1 T/m and four RF receiver channels. Minimizing the RF coil dimensions, leads to increased artefacts due to differences in magnetic susceptibility of the coil wire and surrounding air. Susceptibility matching by immersing the coil in FC-43 is the most common approach that fulfills the requirements of most applications. However, hardly any alternatives are known for cases where usage of FC-43 is not feasible due to its specific disadvantages. Two alternative substances (bromotricholoromethane and Fomblin Y25) were presented and their usability was checked by susceptibility determination and demonstration experiments after shimming under practical conditions. In a typical MRM microcoil experiment, the sample volume is significantly smaller than the maximum volume usable for imaging. This mismatch has been optimized in order to increase the experiment efficiency by increasing the number of probe coils and samples used. A four-channel probehead consisting of four individual solenoid coils suited for cellular imaging of Xenopus laevis oocytes was designed, allowing simultaneous acquisition from four samples. All coils were well isolated and allowed quantitative image acquisition with the same spatial resolution as in single coil operation. This method has also been applied in other studies for increased efficiency: using X. laevis oocytes as a single cell model, the effect of chemical fixation on intracellular NMR relaxation times T1 and T2 and on diffusion was studied for the first time. Significant reduction of relaxation times was found in all cell compartments; after reimmersion in buffer, values return close to the initial values, but there were small but statistically significant differences due to residual formaldehyde. Embryos of the same species have been studied morphologically in different developmental stages. Wild type embryos were compared to embryos that had experienced variations in protein levels of chromosomal proteins HMGN and H1A. Significant differences were found between wild type and HMGN-modified embryos, while no difference was observed between wild type and H1-modified embryos. These results were concordant with results obtained from light microscopy and histology. The technique of molecular imaging was also performed on X. laevis embryos. Commercially available antibodies coupled to ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) dextrane coated particles (MACS) served as a specific probe detectable by MRM, the aim being the detection of tissue specific contrast variations. Initially, the relaxivity of MACS was studied and compared to Resovist and VSOP particles. The iron concentration was determined quantitatively by using a general theoretical approach and results were compared to values obtained from mass spectroscopy. After incubation with MACS antibodies, intraembryonal relaxation times were determined in different regions of the embryo. These values allowed determination of local iron oxide particle concentrations, and specific binding could be distinguished from unspecific binding. Although applications in this work were focused on X. laevis oocytes and embryos, 3D-imaging on a beewolf head was also carried out in order to visualize the postpharyngeal gland. Additionally, an isolated beewolf antenna was imaged with a spatial resolution of (8 um)^3 for depiction of the antennal glands by using a microcoil that was specially designed for this sample. The experiments carried out in this work show that commercially available MRM systems can be significantly optimized by using small sample-adapted RF coils and by parallel operation of multiple coils, by which the sample throughput and thus time-efficiency is increased. With this optimized setup, practical use was demonstrated in a number of new biological applications. / Bildgebung mittels magnetischer Kernresonanz (NMR) ist eine etablierte Methode. Liegt die erreichte Ortsauflösung unter 100 um, wird sie allgemein als Magnetresonanz-Mikroskopie (MRM) bezeichnet. Die Untergrenze der Auflösung liegt in der Größenordnung weniger um. Da höchstaufgelöste Bildgebung meist sehr zeitintensiv ist, kostspielige Anforderungen an die zugrunde liegende Technologie setzt und zudem durch die notwendige Verkleinerung der Hochfrequenz (HF)-Spule auf sogenannte microcoils und Erhöhung der Bildauflösung auch nachteilige Effekte zunehmen, besteht viel Optimierungsbedarf bei bestehenden MRM-Methoden. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Verbesserung und Weiterentwicklung bestehender Methoden der MRM mit besonderem Augenmerk auf die HF-Spule und ihre Anwendung auf neue biologische Fragestellungen. Alle Experimente wurden an einem Bruker 17.6T System mit einer maximalen Gradientenstärke von 1T/m und vier HF-Empfangskanälen durchgeführt. Die Miniaturisierung der HF-Spule führt zu Bildverzerrungen aufgrund des Unterschieds in magnetischer Suszeptibilität zwischen Luft und Spulendraht. Der übliche Ansatz der Suszeptibilitätsanpassung mit FC-43 ist für die meisten Anwendungen ausreichend, jedoch gibt es kaum bekannte Alternativen für den Fall, dass die Nachteile von FC-43 eine Verwendung verhindern. Es wurden zwei neue Substanzen (Bromtrichlormethan sowie Fomblin Y25) vorgestellt und ihre Verwendbarkeit mittels Suszeptibilitätsmessung und experimentellen Shim-Ergebnissen im praktischen Einsatz geprüft. Bei üblichen MRM-Experimenten mit ’microcoils’ ist das Probenvolumen deutlich kleiner als das maximal für Bildgebung zur Verfügung stehende Volumen. Dieses Ungleichgewicht wurde ausgenutzt, um die Effizienz von Mikroskopie-Experimenten durch parallelen Einsatz mehrerer ’microcoils’ zu erhöhen. Ein Probenkopf mit vier entkoppelten Solenoidspulen wurde für zelluläre Bildgebung an Xenopus laevis (Krallenfrosch)-Oozyten konstruiert. Ohne Auflösungsverlust konnten damit vier Proben zeitgleich quantitativ untersucht werden. Diese Methode wurde auch in weiteren Studien zur Steigerung der Effizienz eingesetzt: Am Modell einzelner Zellen (X. laevis-Oozyten) wurde die Auswirkung chemischer Fixierung auf NMR-Relaxationszeiten (T1, T2) sowie Diffusion erstmals intrazellulär untersucht. Es konnten erhebliche Verkürzungen der Relaxationszeiten in allen Zellkompartimenten festgestellt werden, die nach Spülung mit Pufferlösung bis auf geringe, statistisch signifikante Abweichungen bedingt durch verbleibendes Formaldehyd auf die Ausgangswerte der nichtfixierten Zelle zurückkehrten. In einem weiteren Projekt wurden Embryonen derselben Spezies in verschiedenen Entwicklungsstadien morphologisch untersucht. Wildtyp-Embryonen wurden mit Embryonen verglichen, deren natürlicher Gehalt an chromosomalen Proteinen HMGN und H1A verändert wurden. Signifikante Unterschiede zwischen Wildtyp und HMGN-veränderten Embryonen konnten festgestellt werden, während sich kein Unterschied zu H1A-veränderten Embryonen zeigte. Lichtmikroskopie und Histologie lieferten damit übereinstimmende Ergebnisse. Ebenfalls an Xenopus-Embryonen wurde die Technik der molekularen Bildgebung eingesetzt. Ziel war es, mit kommerziell erhältlichen Antikörpern, die an superparamagnetische Eisenoxidpartikel mit einer Größe von wenigen nm (USPIO) mit Dextranhülle gekoppelt sind (MACS), gewebespezifische Kontraständerungen zu erhalten. Zunächst wurde die Relaxivität von MACS untersucht und mit Resovist- sowie VSOP-Partikeln verglichen. Anschließend wurde die Eisenkonzentration quantitativ unter Zuhilfenahme eines allgemeinen theoretischen Modells bestimmt und mit Ergebnissen verglichen, die massenspektroskopisch gewonnen wurden. Nach Inkubation mit MACS wurden Relaxationszeiten intraembryonal in verschiedenen Regionen gemessen. Daraus wurden Konzentrationen von Eisenoxid-Partikeln berechnet; zusätzlich konnte zwischen spezifischer und unspezifischer Bindung differenziert werden. Obwohl der Anwendungsschwerpunkt dieser Arbeit auf der Bildgebung an X. laevis- Oozyten und Embryonen lag, wurde auch Bildgebung am Kopf eines Bienenwolfs zur 3D-Darstellung der Postpharyngealdrüse durchgeführt. Zusätzlich wurde mit einer speziell auf das Untersuchungsobjekt angepassten ’microcoil’ eine isolierte Bienenwolfantenne mit einer Auflösung von (8 um)^3 untersucht; Ziel war die Darstellung der Antennaldrüsen. Die durchgeführten Projekte zeigen, dass bei kommerziell erhältlichen MRM-Systemen deutliches Optimierungspotential existiert: zum einen durch verkleinerte und probenangepasste HF-Spulen, zum anderen durch die Parallelisierung mehrerer Spulen, wodurch der Probendurchsatz und damit die Zeiteffizienz gesteigert werden kann. Mit diesem optimierten Aufbau konnte anschließend die Nutzbarkeit der MRM bei neuen biologischen Anwendungen gezeigt werden.

Das Dephasierungsverhalten und die daraus resultierende Relaxation der Magnetisierung sind Grundlage aller auf der Kernspinresonanz basierenden bildgebenden Verfahren. Das erhaltene Signalder präzedierenden Protonen wird wesentlich von den Eigenschaften des untersuchten Gewebes bestimmt. Insbesondere die durch magnetisierte Stoffe wie z. B. desoxygeniertes Blut (BOLD-Effekt) oder magnetische Nanopartikel erzeugten Suszeptibilitätssprünge gewinnen zunehmend Bedeutung in der biomedizinischen Bildgebung. In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse von Feldinhomogenitäten auf das NMR-Signal untersucht. / The properties of dephasing and the resulting relaxation of the magnetization are the basic principle on which all magnetic resonance imaging methods are based. The signal obtained from the gyrating spins is essentially determined by the properties of the considered tissue. Especially the susceptibility differences caused by magnetized materials (for example, deoxygenated blood, BOLD-effect) or magnetic nanoparticles are becoming more important for biomedical imaging. In the present work, the influence of such field inhomogeneities on the NMR-signal is analyzed.

Die Dynamik der Kernspindephasierung in lebenden Systemen enhält relevante Informationen über biologisch wichtige Parameter, wie Sauerstoffversorgung, Mikrozirkulation, Diffusion etc.. Ursächlich für die Dephasierung sind Interaktionen des Spins mit fluktuierenden Magnetfeldern. Notwendig sind also Modelle, welche diese Interaktionen mit den biologisch relevanten Parametern in Beziehung setzen. Problematisch ist, daß fast alle analytische Ansätze nur in extremen Dynamikbereichen der Störfeldfluktuationen (motional narrowing - , static dephasing limit) gültig sind. In dieser Arbeit zeigen wir einen Ansatz, mit dem man die Dynamik der Störfeldfluktuationen erheblich vereinfachen und trotzdem noch deren wesentliche Eigenschaften beibehalten kann. Dieser Ansatz ist nicht auf einen speziellen Dynamikbereich festgelegt. Angewendet wird dieses Näherungsverfahren zur Beschreibung der Spin Dephasierung im Herzmuskel. Die Relaxationszeiten erhält man als Funktion der Kapillardichte und Blutoxygenierung. Vergleiche mit numerisch errechneten Daten anderer, eigenen Messungen am menschlichen Herzen und experimentellen Befunden in der Literatur, bestätigen die theoretischen Vorhersagen. / The dynamics of nuclear spin dephasing in living objects contains relevant information about important parameters as oxygen supply, microcirculation, and diffusion. Spin dephasing is induced by interaction of spins with fluctuating perturbation fields. Desirable are models which relate these interactions to the biological parameters. Unfortunately most analytical approaches are restricted to certain motion regimes, e.g. the motional narrowing or static dephasing limit. In this work we present an analytical approach, which simplifies the perturbation field dynamics but still conserves its relevant properties. This approach is not restricted to any motion regime. As an application we describe spin dephasing in the cardiac muscle. We obtain the relaxation time as a function of capillary density and blood oxygenation. Data are in excellent agreement with numerical simulations of others, own measurements in humans, and experimental data in the literature.

Dank der mit modernen NMR-Spektrometern (Kernspintomographen) routinemäßig realisierbaren isotropen räumlichen Auflösungen von wenigen Mikrometern, ergeben sich für die 1H NMR-Mikroskopie zahlreiche neue Anwendungsgebiete. Allerdings sind die Möglichkeiten und Grenzen der NMR-Mikroskopie bezüglich ihrer praktischen Anwendbarkeit bisher nur wenig untersucht worden. Die vorliegende Arbeit ist im Bereich der biophysikalischen Grundlagenforschung angesiedelt und soll die praktische Anwendbarkeit der NMR-Mikroskopie auf neuen medizinischen und biologischen Anwendungsgebieten anhand von ausgewählten Beispielen aus diesen Bereichen demonstrieren. Die einzelnen Projekte besitzen deswegen immer auch den Charakter von Machbarkeitsstudien, die aufzeigen sollen, welche Möglichkeiten und Vorteile die NMR-Mikroskopie im Vergleich zu etablierten Untersuchungsmethoden bietet. Im Detail wurden unterschiedliche lebende und fixierte biologische Proben mittels NMR-Mikroskopie zerstörungsfrei und räumlich hochaufgelöst dargestellt. Dabei variierte die spezielle Zielsetzung von der Visualisierung der Invasion eines Tumorsphäroiden in ein Zellaggregat anhand von T2-Parameterkarten (Zeitkonstante der Spin-Spin-Relaxation) über die dreidimensionale Darstellung des Gehirns der Honigbiene in der intakten Kopfkapsel bis hin zur nicht-invassiven Abbildung der Anatomie prenataler Delphine. Für alle durchgeführten Projekte war der nicht-invasive Charakter der NMR-Experimente von entscheidender Bedeutung. Die zu beobachtende Tumorinvasion durfte nicht durch die Messung beeinflusst werden, das Bienengehirn sollte möglichst naturgetreu abgebildet werden, und die untersuchten Delphine sind seltene Museumsstücke, die nicht zerstört werden durften. Die verschiedenen Proben wurden mit der jeweils bestmöglichen räumlichen Auflösung visualisiert, die sich entweder durch das minimal nötige Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) oder durch die zur Verfügung stehende Messzeit ergab. Um einzelne feine Strukturen in den Bildern auflösen zu können, mussten sowohl das SNR, als auch das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis optimiert werden. Die Messungen wurden an Hochfeld-NMR-Spektrometern bei 500 und 750 MHz durchgeführt, um das für die hohe Auflösung notwendige SNR zu gewährleisten. Mit den Experimenten konnten zahlreiche Fragen bezüglich mikroskopischer Details der verschiedenen untersuchten Proben nicht-invasiv beantworten werden. Gleichzeitig führten sie zu neuen interessanten Fragestellungen bezüglich der NMR-Mikroskopie an fixierten Proben. Darüber hinaus konnte die praktische Anwendbarkeit der NMR-Mikroskopie als Alternative bzw. Ergänzung zu herkömmlichen Untersuchungsmethoden wie der konfokalen Lasermikroskopie bei der Visualisierung des Bienengehirns und der konventionellen Histologie bei der Untersuchung der Anatomie der prenatalen Delphine demonstriert werden. Durch die Untersuchung der speziellen Vorteile und der Grenzen der Anwendung der NMR-Mikroskopie gegenüber den herkömmlichen Untersuchungsmethoden konnte konkret der praktische Nutzen ihres Einsatzes aufgezeigt und Ergebnisse erzielt werden, die sonst nicht erzielbar wären. Gerade der Einsatz der NMR-Mikroskopie in Form der NMR-Histologie stellt einen vielversprechenden Weg zur Etablierung der NMR-Mikroskopie als Routineuntersuchungsmethode dar. Als ebenso erfolgreich hat sich die Anwendung der NMR-Mikroskopie als Untersuchungsmethode bei der Beobachtung der Tumorinvasion erwiesen, so dass sie auch in der medizinischen in-vitro Forschung und Therapiesimulation als sinnvolle Alternative zu den vorhandenen Methoden angesehen werden kann. Anhand der ausgewählten Anwendungsbeispiele ist es in dieser Arbeit somit gelungen, neue, konkrete Einsatzmöglichkeiten für die NMR-Mikroskopie zu eröffnen und ihre praktische Anwendbarkeit als Untersuchungsmethode für Fragestellungen im Bereich der medizinischen in-vitro Forschung und verschiedener neuro- und entwicklungsbiologischer Bereiche zu demonstrieren. / With modern MR-spectrometers it is possible to achieve isotropic spatial resolutions in the range of only a few microns. Thus, several new fields of application for 1H-MR-Microscopy are being developed. Still, the practical possibilities and limitations of this technique have only been determined rarely. This work has a biophysical background and uses different examples to demonstrate the practical applicability of NMR-Microscopy in the medical and biological sector. Therefore, the different projects are feasibility studies which are used to compare the possibilities and advantages of NMR-Microscopy with other, established examination techniques. In detail, using MR-Microscopy, different living and fixed biological samples have been visualized non-invasively with high spatial resolution. The specific purpose of the studies ranged from the visualization of the invasion of tumor-spheroids into cell aggregates using T2 parameter maps (time constant of the spin-spin relaxation) to the three-dimensional display of the honey bee brain in the intact head capsule and the non-invasive visualization of the anatomy of prenatal dolphins. For all these projects, the non-invasive character of MR-experiments was of utmost importance. The tumor invasion was not to be disturbed by the measurements, the bee brain should be visualized as close to its true natural shape as possible and the examined dolphins represent rare museum specimens which should not be destroyed. The different samples were all imaged with the best possible spatial resolution which was either limited by the necessary signal-to-noise ratio (SNR) or the available scan time. In order to resolve single details and fine structures in the images, it was necessary to optimize the SNR as well as the contrast-to-noise ratio. To guarantee the necessary SNR, the measurements were performed on high field MR-spectrometers with resonance frequencies of 500 and 750 MHz. Numerous questions about microscopic details of the examined samples could be answered non-invasively with the experiments performed. At the same time, the experiments led to new interesting questions about MR-Microscopy on fixed samples. Furthermore, the practical applicability of MR-Microscopy as an alternative or a supplement to conventional examination methods could be demonstrated. Here, these methods were confocal laser microscopy in the case of the honey bee brain and conventional histology in the case of the prenatal dolphins. By investigating the specific advantages and limitations of MR-Microscopy in these cases, it was possible to demonstrate the practical value of its application and to obtain results which would otherwise have been impossible. Especially the use of MR-Microscopy as MR-Histology is a promising application which will help to establish MR-Microscopy as a routine examination method. Since the tumor invasion process could also be observed very successfully using MR-Microscopy, this technique can as well be considered as a valuable tool for medical in-vitro research and therapy simulation and thus an alternative to existing methods. In summary, with the examples chosen in this work, it was possible to find new applications for MR-Microscopy and to demonstrate the practical applicability of this method in the fields of medical in-vitro research as well as neurological and developmental biology.

Although age is one of the most salient and fundamental aspects of human faces, its processing in the brain has not yet been studied by any neuroimaging experiment. Automatic assessment of temporal changes across faces is a prerequisite to identifying persons over their life-span, and age per se is of biological and social relevance. Using a combination of evocative face morphs controlled for global optical flow and functional magnetic resonance imaging (fMRI), we segregate two areas that process changes of facial age in both hemispheres. These areas extend beyond the previously established face-sensitive network and are centered on the posterior inferior temporal sulcus (pITS) and the posterior angular gyrus (pANG), an evolutionarily new formation of the human brain. Using probabilistic tractography and by calculating spatial cross-correlations as well as creating minimum intersection maps between activation and connectivity patterns we demonstrate a hitherto unrecognized link between structure and function in the human brain on the basis of cognitive age processing. According to our results, implicit age processing involves the inferior temporal sulci and is, at the same time, closely tied to quantity decoding by the presumed neural systems devoted to magnitudes in the human parietal lobes. The ventral portion of Wernicke’s largely forgotten perpendicular association fasciculus is shown not only to interconnect these two areas but to relate to their activations, i.e. to transmit age-relevant information. In particular, post-hoc age-rating competence is shown to be associated with high response levels in the left angular gyrus. Cortical activation patterns related to changes of facial age differ from those previously elicited by other fixed as well as changeable face aspects such as gender (used for comparison), ethnicity and identity as well as eye gaze or facial expressions. We argue that this may be due to the fact that individual changes of facial age occur ontogenetically, unlike the instant changes of gaze direction or expressive content in faces that can be “mirrored” and require constant cognitive monitoring to follow. Discussing the ample evidence for distinct representations of quantitative age as opposed to categorical gender varied over continuous androgyny levels, we suggest that particular face-sensitive regions interact with additional object-unselective quantification modules to obtain individual estimates of facial age. / Obwohl das Alter eines der markantesten und grundlegendsten Aspekte menschlicher Gesichter darstellt, hat man die Verarbeitung im Gehirn noch nicht durch ein funktionell bildgebendes Verfahren untersucht und mit strukturellen Leitungsbahnen in Verbindung gebracht. Die automatische Bewertung der altersbedingten Veränderungen in Gesichtern ist eine Voraussetzung für die Identifizierung von Personen über ihre gesamte Lebenszeit, und das Lebensalter an sich ist von biologischer und sozialer Relevanz. In dieser Dissertation wird die funktionelle Kernspintomographie (fMRI) mit eindrucksvollen Gesichtsmorphs kombiniert, welche auf sichtbare Bewegung im gesamten Bild kontrolliert wurden. Hierdurch werden zwei Bereiche auf beiden Hemisphären isoliert, welche die Veränderungen des Alters von Gesichtern gemeinsam und automatisch verarbeiten. Diese Areale reichen über das zuvor etablierte gesichtssensible Netzwerk hinaus und zentrieren sich auf den hinteren inferio-temporalen Sulcus (pITS) und den hinteren angulären Gyrus (pANG), eine evolutionäre Neubildung des menschlichen Gehirns. Mit Hilfe der probabilistischen Traktographie diffusiongewichteter MRT-Daten und der Berechnung räumlicher Kreuzkorrelationen sowie der Erstellung von Minimum Intersection Maps zwischen Aktivierungs- und Konnektivitätsmustern wird ein bisher unerkannter Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion des menschlichen Gehirns anhand der kognitiven Altersverarbeitung aufgezeigt. Unseren Ergebnissen zufolge wird der inferiore temporale Sulcus in die implizite Altersverarbeitung einbezogen und gleichzeitig eng mit der Mengendekodierung verknüpft, welche in den vermutlich Größenabschätzungen gewidmeten neuronalen Systemen im Scheitellappen des menschlichen Gehirns erfolgt. Es wird dargelegt, dass der ventrale Teil von Wernickes weitgehend vergessenem senkrecht verlaufendem Assoziationsbündels nicht nur diese beiden Bereiche miteinander verbindet, sondern auch mit ihren Aktivierungen in Beziehung steht, was die These stützt, dass altersrelevante Informationen tatsächlich über ihn übertragen werden. Bei der nachträglichen Alterseinschätzung der Gesichter zeigt sich, dass gutes Abschneiden der Versuchspersonen mit stärkeren Aktivierungen im linken angulären Gyrus einhergeht. Die kortikalen Aktivierungsmuster auf Änderungen des Gesichtsalters unterscheiden sich von jenen, die mit anderen wechselnden Gesichtsmerkmalen in Zusammenhang gebracht wurden, welche das Geschlecht (das zum Vergleich und zur Kontrolle herangezogen wurde), die Ethnizität und die personelle Identität sowie Blickrichtungen und Mimik betreffen. Es wird argumentiert, dass dies möglicherweise auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass individuelle Änderungen des Gesichtsalters ontogenetisch auftreten, anders als beispielsweise die flüchtigen Wechsel von Blickrichtungen oder im Ausdruck in Gesichtern, welche vom Betrachter "gespiegelt" werden können und ständige Beobachtung erfordern, um kognitiv nachvollzogen werden zu können. Damit wird erstmals die eigene Art der Wahrnehmung und Verarbeitung des quantitativen Alters im direkten Gegensatz zu kategorischem Geschlecht belegt, welches über kontinuierliche Androgyniegrade variiert: Bestimmte gesichtssensible Regionen interagieren offenbar mit zusätzlichen nicht objekt-selektiven Quantifizierungsmodulen, um das Alter eines Gesichts individuell abzuschätzen.

Introduction The 80kD glycoprotein transferrin (TF) and its related receptor (TFR1) play a major role in the recruitment by cancer cells of factors for their multiplication, adhesion, invasion and metastatic potential. Though primarily designed to bind iron and then be internalised into cells with its receptor, TF can also bind most transition metals such as Co, Cr, Mn, Zr, Ni, Cu, V, In & Ga. Under certain conditions TF binds Ti (IV) even more tightly than it does Fe and that this occurs at the N-lobe (as distinct from C) of apoTF. Further, under physiological conditions the species Fe(C)Ti(N)-TF may provide the route for Ti entry into cells via TFR1 (1). Thus, the radiometal PET reporter isotope 45Ti with an ‘intermediate’ (~hrs) half-life suited to tracking cell-focused biological mechanisms is an attractive option for elucidating cellular mechanisms involving TF binding and internalisation, at least in (preclinical) animal models. 45Ti (T½ = 3.08 hr; + branching ratio = 85 %; mean β+ energy = 439keV, no significant dose-conferring non-511keV γ-emissions) was produced using the reaction 45Sc(p,n)45Ti by irradiating (monoisotopic) scandium discs with an energy-degraded proton beam produced by an 18MeV isochronous medical cyclotron. Separation and purification was achieved with an hydroxylamine hydrochloride functionalised resin. Comparative microPET imaging was performed in an immunodeficient mouse model, measuring biodistributions of the radiolabels 45Ti-oxalate and 45Ti-human-TF (45Ti-h-TF), out to 6hr post-injection. Materials and Methods High purity 15mm diameter scandium disc foils (99.5%, Goodfellow, UK) each thickness 0.100 ± 0.005 mm (55 mg) were loaded into an in-house constructed solid-targetry system mounted on a 300mm external beam line utilising helium-gas and chilled water to cool the target body (2). The proton beam was degraded to 11.7 MeV using a graphite disc integrated into the graphite collimator. This energy abolishes the competing ‘contaminant’ reactions 45Sc(p,n+p)44Sc and 45Sc(p,2n)44Ti. Beam current was measured using the well documented 65Cu(p,n)65Zn reaction. Calculations showed that the chosen energy is close to the optimal primary energy (~12 MeV) for maximising the (thin-target) yield from a 0.100 mm thick target. For separation of Ti from the Sc target two methods were examined; (i) ion exchange column separation using 2000 mg AG 50W-X8 resin conditioned with 10mL 9M HCl. Disc is dissolved in 1 mL of 9M HCl, which at completion of reaction is pipetted into column. Successive 1 mL volumes of 9M HCl are added, and subsequent elutions collected. (ii) Following Gagnon et al., (3) a method employing hydroxylamine hydro-chloride functionalised resin (’hydroxamate method’) was applied, similar to its use in our hands for purification and separation of 89Zr (2) following its original description for 89Zr by Holland et al., (4). Disc dissolved in 2mL 6M HCl, then diluted to 2M. Elute through column to waste fraction 1 (w1 – see FIG. 1). Then elute 6 mL of 2M HCl through column to w2, followed by 6 mL of traceSELECT H2O to w3. Finally, elute Ti into successive 1 mL product fractions (p1, 2 etc.) using 5 mL of 1M oxalic acid. This procedure takes approximate 1 hr. 45Ti in elution vials was measured using γ-spectroscopy. Sc in the same vials was determined later using ICP-MS. Results A typical production run using a beam current of 40 μA for 60min on a 0.100mm-thick disc produced an activity of 1.83 GBq. Radionuclidic analysis of an irradiated disc using calibrated cryo-HPGe γ-spectroscopy revealed T½ = 2.97–3.19 hr (95% CI) for 45Ti, and with contaminant 44Sc < 0.19 %, with no other isotopes detected. Despite systematic adjustments to column conditions satisfactory chemical separation was not achieved using the ion exchange column method (i), despite previous reports of its success (5). Typical results of separation using the successful hydroxamate method (ii) are shown on the FIGURE 1. It is seen that significant portion of 45Ti is lost in the initial washing steps leading to waste collection. N = 4 replicate experiments showed a variation (SD) of 10 % of the mean in each elu-tion fraction. Subsequent ICP-MS of the same elutions for (cold) Sc showed approximately 80 % by mass appeared in w1 and 20 % in w2, with negligible total mass (total fraction ~1/6000) of Sc in product (p1–4) vials. However, the FIG. 1 shows that a total of only 30% of the original activity of 45Ti (corrected to EOB) is available in the product vials, with the vial of highest specific activity (p1) containing 14 %. However, using a stack of 2×0.100mm thick Sc discs as a target yields isotope of adequate specific activity with-out need for concentration, for subsequent labelling and small-animal imaging purposes. In a ‘proof-of-principle’ experiment, two groups of healthy Balb/c-nu/nu female adult mice were administered with 45Ti radiotracers. The first group (N = 3) received approximately 20 MBq IP of 45Ti-oxalate buffered to pH = 7.0, and under-went microPET/CT imaging (Super Argus PET, Sedecal, Spain) out to 6hr post-injection, plus biodistribution analysis of radioactivity by dis-section at sacrifice (6hr). The second group (N = 3) received approximately 20 MBq IP of 45Ti-h-TF and were also studied to 6hr post-injection, followed by radioactive analysis after dissection at sacrifice. Organ and tissue biodistributions of the two groups at 6hr were similar but with 45Ti-oxalate showing slightly greater affinity for bone. Biodistribution by dissection results broadly confirmed the findings from PET images. However, TLC results suggested that similarity of radiolabel biodistributions of the two groups may be due to contamination of the TF radiolabel with non-conjugated Ti at time of injection. An alternative explanation is dechelation in vivo of 45Ti from 45Ti-h-TF. Conclusion Despite significant loss of 45Ti to the waste fractions of the separation process (total 53 %, corrected to EOB), 45Ti of acceptable specific activity and high radionuclidic purity has been produced from the reaction 45Sc(p,n)45Ti, with separation and purification of the product by hydroxamate column chemistry, confirming an earlier report. Though microPET in vivo imaging using 45Ti-based radiolabels was shown to be feasible, the similarity in the results for the label 45Ti-h-TF compared with ‘raw’ 45Ti-oxalate suggests further investigations. These may include a direct comparison of in vivo 45Ti-h-TF small-animal imaging plus post-dissection biodistribution with the same procedures using 89Zr labelled h-apotransferrin (6).

Freiburg i. Br., Univ., Diss., 2007.

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005