Stroke and traumatic brain injuries are common causes of disability, with loss of nerve tissue due to secondary degeneration, gliosis, and often the formation of cavities that inhibit neural cell growth. Recent attempts at neural cell regeneration have therefore focused on the use of engineering materials that mimic the adult neural stem cell (NSC) niche, in order to establish an adequate environment for neurogenesis and differentiation. However, because the adult mammalian NSC niche has limited regenerative capacities, effective regeneration of the central nervous system (CNS) requires the reconstitution of its embryonic counterpart. Radial glia are bipolar cells with 1-2 µm-thick shafts that form a palisade and span the entire CNS parenchyma serving as substrates for neuronal migration. They contain high levels of glycogen and release L-lactate. Cerebral energy metabolism is a highly compartmentalized and complex process. The adult brain normally uses glucose as its primary energy source. However, before and immediately after birth, lactate is also an important energy source because at this time the level of glucose is low. Over the past decade, a role for lactate in fuelling the energetic requirements of neurons has emerged, not only during the perinatal period but also in adulthood. Initial evidence suggests that the metabolisms of NSC, neurons and astrocytes differ and that energy-dependent processes may influence the balance between NSC self-renewal and differentiation. The main goal of this thesis was to design an implantable biomaterial scaffold that reproduces the organization and supportive function of embryonic radial glia. Here we tested two types of poly L/DL lactic acid (PLA95/5 and PLA70/30), a biodegradable material permissive for neural cell adhesion and growth, as materials for nerve regeneration. PLA95/5 films were highly crystalline, stiff (GPa), and did not degrade significantly in the period analyzed in culture. In contrast, PLA70/30 films were more amorphous, softer (MPa) and degraded faster, releasing significant amounts of lactate into the medium. PLA70/30 performed better than PLA95/5 for primary cortical neural cell adhesion, proliferation and differentiation, maintaining the pools of neuronal and glial progenitor cells in vitro. Finally, for in vivo studies, we designed 3D cell-free biomimetic scaffolds consisting of electrospun PLA70/30 nanofibers. Radially aligned scaffolds released L-lactate and reproduced the 3D organization and supportive function of radial glia. These scaffolds implanted into cavities made in mouse brain fostered complete implant vascularization, sustained neurogenesis, and allowed the long-term survival and integration of the newly generated neurons. Our results suggest that PLA70/30 scaffolds mimic some of the physical and biochemical characteristics of the NSC niche. Overall, our results show that the endogenous CNS is capable of regeneration through the in vivo dedifferentiation induced by biophysical and metabolic cues, with no need for exogenous cells, growth factors, or genetic manipulation. / Las lesiones cerebrales son causas comunes de discapacidad que conllevan pérdida de tejido nervioso debido a la degeneración secundaria, la gliosis, y con frecuencia la formación de cavidades que inhiben el crecimiento neuronal. Recientemente, las terapias neuroregenerativas se han centrado en el uso de la ingeniería de materiales. Durante el desarrollo del SNC, las células de glia radial son las principales CMN que generan neuronas y glía y son retenidas en el cerebro adulto de especies que regeneran. Durante la neurogénesis temprana, los vasos sanguíneos invaden el SNC e interactúan con las CMN, dando lugar al nicho neurovascular. En el cerebro adulto, la glia radial puede ser recuperada al menos en cierta medida después de una lesión, lo que indica un intento endógeno en la reconstitución del nicho embrionario. Las células de glía radial son bipolares con 1-2 micras de espesor que forman una empalizada que abarca todo el parénquima del SNC sirviendo como sustrato para la migración neuronal. Esta glía radial contiene altos niveles de glucógeno liberando al exterior L-lactato. El metabolismo energético cerebral es un proceso altamente compartimentado y complejo. El cerebro adulto normalmente usa glucosa como fuente de energía primaria. Sin embargo, antes e inmediatamente después del nacimiento, el lactato es también una fuente de energía importante, debido a que los niveles de glucosa son bajos. En la última década, se ha visto que el lactato juega un papel importante como factor energético para las neuronas, no sólo durante el período perinatal sino también en la edad adulta. Nuevas evidencias sugieren que el metabolismo de las CMN, neuronas y astrocitos son diferentes y que los procesos dependientes de energía pueden influir en el equilibrio entre la auto-renovación y diferenciación de las CMN. El objetivo principal de esta tesis ha sido diseñar un andamio implantable que reprodujera la organización y función de soporte de la glía radial embrionaria. Para ello, hemos probado dos tipos de ácido poli L/DL láctico (PLA95/5 y PLA70/30), material biodegradable y permisivo para la adhesión y el crecimiento neuronal. Las películas de PLA95/5 eran cristalinas, rígidas (GPa), y no se degradaban significativamente en el período analizado durante el cultivo in vitro. Sin embargo, las películas de PLA70/30 eran más amorfas, menos rígidas (MPa) y se degradaban más rápido, liberando cantidades significativas de lactato en el medio. A diferencia del PLA95/5, en el 70/30 había una mejor adhesión neuronal, así como la proliferación y el mantenimiento de los progenitores neuronales y gliales in vitro. Finalmente, para los estudios in vivo, diseñamos andamios biomiméticos en 3D libres de células que consistían en nanofibras de PLA70/30. Los andamios radialmente alineados reproducían la organización 3D y la función de apoyo de la glía radial. Estos andamios implantados en la corteza cerebral del ratón ayudaron a la completa vascularización del implante, permitiendo la supervivencia y la integración a largo plazo de las neuronas recién generadas. Nuestros resultados sugieren que los andamios de PLA70/30 imitan algunas de las características físicas y bioquímicas del nicho neurovascular. En conclusión, nuestros resultados muestran que el SNC es capaz de regenerar de manera endógena a través de la des-diferenciación in vivo inducida por las señales biofísicas y metabólicas, sin necesidad de células exógenas, factores de crecimiento o manipulación genética

Estudi de l'avaluació de la possible contaminació de tipus genotòxic en l'abocador de Garraf (Barcelona), el qual recull els residus urbans de Barcelona i de les seves rodalies. Es va dur a terme el "Comet Test" (o SCGE: "Single Cell Gel Electrophoresis Assay") i el Test dels Micronuclis (MNT) en mostres de sang d'Apodemus sylvaticus (capturats a diferents àrees de l'abocador, i en una zona control lluny de la influència d'aquest i que pertany al Parc Natural del Garraf). Al mateix temps, es va aplicar la tècnica del Comet test en mostres de celomòcits d'exemplars d'Allolobophora caliginosa exposats a mostres de sòls procedents de l'abocador (5 zones situades a diferents distàncies d'aquest), i a mostres control. Per a les dues espècies utilitzades i els dos assaigs realitzats (SCGE i MNT en Apodemus, i SCGE en Allolobophora) es van obtenir valors majors de dany al DNA en les mostres de les zones d'influència de l'abocador respecte a les mostres control. No es va poder establir, pel cas dels lumbrícids, una relació del nivell de dany en relació a la distància a l'abocador (s'esperava una disminució dels valors, un apropament als valors control, quan les mostres fossin recollides més lluny de l'abocador). Mentre que en el cas dels ratolins, els valors corresponents a la zona més allunyada eren significativament menors que els obtinguts al voltant de la bassa de lixiviats. Les dues espècies, autòctones i abundants, poden servir com a bons sentinelles per a l'avaluació de la contaminació en l'abocador (tot i que en el cas dels lumbrícids utilitzats la interpretació pot ser més complicada).Un altre estudi es va centrar en l'avaluació de la contaminació de tipus genotòxic en mostres de sòl de Doñana, recollides l'any 2000 en diferents zones afectades pel vessament tòxic de l'accident de les mines d'Aznalcóllar de l'abril del 1998. Es van exposar varis exemplars d'Allolobophora caliginosa a les diverses mostres de sòl, i es va dur a terme el SCGE en celomòcits. Al mateix temps es van comparar els resultats obtinguts pel SCGE amb la concentració de metalls pesants mesurada en les mostres de sòl. Les mostres contaminades pel vessament tòxic i les mostres de referència de la mateixa zona (suposadament no afectades pel vessament) indiquen valors superiors amb el "Comet test" als de les mostres control. Una part molt important del treball realitzat es va basar en aspectes tècnics de l'assaig del cometa ("Comet test"), per poder conèixer una mica més el seu funcionament a nivell fisiològic i molecular. Així es van realitzar diversos estudis "in vitro" i "in vivo" per veure la possible interferència de la divisió cel·lular en els resultats del SCGE. Altres proves han estat dirigides a veure la relació que pot existir entre els resultats del SCGE i els estats d'apoptosi i necrosi de les cèl·lules, els quals podrien causar una interferència (de tipus citotòxic) en els resultats de l'assaig. Un altre estudi està centrat en el seguiment de la cinètica de reparació. A determinades dosis d'una substància genotòxica (òxid d'estirè) a les que es podia observar un nivell de dany al DNA (mesurat amb el "Comet test"), al cap d'un determinat temps es podia veure una disminució d'aquest dany, atribuïble a la reparació, tant en experiments "in vivo" com "in vitro". La incubació de les mostres amb l'enzim de reparació Endonucleasa III permetia augmentar la sensibilitat del test, detectant lesions de tipus oxidatiu, i d'altres, a més de les normalment detectades amb el "Comet test" sense l'ús d'aquests enzims. En aquests experiments es va poder detectar la dosi/dependència de l'efecte genotòxic de l'òxid d'estirè.

La glia és el grup de cèl·lules del sistema nerviós més abundant en el cervell, durant molt de temps es va considerar només com un element de suport neuronal sense importància. D'aquí la necessitat d'investigar el comportament i caracterització de la mateixa en resposta a la pèrdua de memòria i l'activació tant de senyals intracel·lulars com de supervivència i deteriorament cognitiu. En cultiu mixt de còrtex de ratolí C57BL/6J, tractament al 9 dia de creixement després de la sembra, activació a una hora amb leptina i prolactina, després la incubació de citoquines (IFNγ, IL-1β i TNFα) durant 48 hores. En especial, es va centrar en la connexió de les molècules de senyalització activades per l'estrès oxidatiu com ho són p38-MAKP i iNOS. Els efectes neuroprotectors d´adipoquines com la Melatonina, la Leptina i la Prolactina i els seus efectes sobre la inhibició de la producció d'òxid nítric i l'expressió de iNOS a través de p38-MAKP després dels tractaments de citoquines, inhibint el dany cel·lular d'astròcits donant suport al potencial antiinflamatori i antioxidant d'aquests compostos, i la seva potencial aplicació en el tractament de trastorns neurològics específics, els quals suggereixen les rutes implicades en les primeres etapes de la malaltia d'Alzheimer. / La glía es el grupo de células del sistema nervioso más abundante en el cerebro, por mucho tiempo se le consideró sólo como un elemento de soporte neuronal sin importancia. De ahí la necesidad de investigar el comportamiento y caracterización de la misma en respuesta a la pérdida de memoria y la activación tanto de señales intracelulares, de supervivencia y deterioro cognitivo. En cultivo mixto de cortex de ratón C57Bl/6J, tratamiento al 9 día de crecimiento después de la siembra, activación a una hora con leptina y prolactina, luego la incubación de citoquinas (IFNγ, IL-1β y TNFα) durante 48 horas. en especial, se centró en la conexión de las moléculas de señalización activadas por el estrés oxidativo como lo son p38-MAKP e iNOS. los efectos neuroprotectores de adipoquinas como Melatonina, Leptina y Prolactina y sus efectos sobre la inhibición de la producción de óxido nítrico y la expresión de iNOS a través de p38-MAKP después de los tratamientos de citoquinas, inhibiendo el daño celular de astrocitos dando apoyo al potencial antinflamatorio y antioxidante de estos compuestos, y a su potencial aplicación en el tratamiento de trastornos neurológicos específicos, los cuales sugiere las rutas implicadas en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer. / Glia is the group most abundant cells in the brain nervous system, for a long time it was considered only as an element of support neuronal unimportant. Hence the need to investigate the behavior and characterization of it in response to the loss of memory and both intracellular signal activation, survival and cognitive impairment. In mixed culture of mouse cortex C57Bl / 6J, 9 day treatment growth after planting, one hour activation with leptin and prolactin after incubation of cytokines (IFNy, IL-1β and TNF) for 48 hours. Of particular note the connection of signaling molecules activated by oxidative stress as they are p38 and iNOS MAKP focused. Neuroprotective effect of adipokines as: Melatonin, prolactin and leptin and its effects on the inhibition of nitric oxide production and iNOS expression, through p38-MAKP after treatments cytokine inhibiting cell damage astrocyte supporting the anti-inflammatory and antioxidant potential of these compounds, and their potential application in the treatment of specific neurological disorders, suggesting pathways involved in the early stages of Alzheimer's disease.

TrkA es va descobrir com a un oncogén producte de la fusió del seu domini tirosinakinasa (TK) amb la tropomiosina. Posteriorment, va augmentar el seu interès endescobrir-se que la proteïna nativa constituïa el receptor del factor de creixementnerviós (NGF).Es coneixen bé els esdeveniments que tenen lloc a partir de la unió del lligand alreceptor i que donen lloc a l'activació de les vies de senyalització de les MAPK yPI 3-K/Akt. Se sap que, in vivo, la internalització del receptor i el seu transportretrògrad també juguen un paper important per a l'efecte a llarg termini del NGF ique és un tret distintiu en relació a d'altres receptors de factors de creixement.L'activació del receptor també comporta un augment transitori de Ca2+intracel· lular. Per això ens vam plantejar l'estudi de la relació entre l'activació deTrkA i calmodulina (CaM), com a sensor dels nivells de Ca2+ intracel· lulars.En primer lloc vam observar una interacció directa i dependent de Ca2+ entre CaM ila meitat c-terminal del domini intracel· lular de TrkA. La primera part del treball secentra en caracteritzar aquesta interacció.Per veure l'efecte de la unió sobre Trk, vam utilitzar inhibidors de CaM. Aquestsno impedeixen la fosforilació de TrkA induïda per NGF, però sí comporten laproteòlisi del receptor donant lloc a un fragment amb activitat tirosina kinasaconstitutiva. Donada la ubiqüitat de CaM, i la seva importància en processos vitalsper a la cél· lula, el segon objectiu ha consistit en buscar el lloc d'unió a CaM deTrkA per així poder obtenir una construcció de Trk on es perdés la unió a CaM.Basant-nos en diverses evidències, ens vam centrar en la caracterització d'una regióque conté una Tyr fosforilable (Y701) i que forma part d'un motiud'internalització. L'última part del treball se centra en descriure les característiquesd'aquesta Tyr i la seva funció, que més enllà de la relació amb CaM, pot constituiruna fosforilació inhibitòria per l'activitat de Trk i un lloc de regulació negativa dela internalització. / TrkA se descubrió como un oncogén producto de la fusión de su dominio tirosinakinasa (TK) con la tropomiosina. Posteriormente, aumentó su interés trasdescubrirse que la proteína nativa constituía el receptor del factor de crecimientonervioso (NGF).Se conocen bien los acontecimientos que ocurren tras la unión del ligando alreceptor y que dan lugar a la activación de las vías de señalización de las MAPK yPI 3-K/Akt. Se sabe que, in vivo, la internalización del receptor y su transporteretrógrado también juegan un papel importante para el efecto a largo plazo delNGF y que es una característica distintiva de otros receptores de factores decrecimiento.La activación del receptor también conlleva un aumento transitorio de Ca2+intracelular. Por ello nos planteamos estudiar la relación entre la activación deTrkA y calmodulina (CaM), como sensor de los niveles de Ca2+ intracelulares.En primer lugar observamos una interacción directa y Ca2+ dependiente entre CaMy la mitad c-terminal del dominio intracelular de TrkA. La primera parte del trabajose centra en caracterizar esta interacción.Para ver el efecto de la unión sobre Trk, utilizamos inhibidores de CaM. Éstos noimpiden la fosforilación de TrkA inducida por NGF, pero sí conllevan la proteolisisdel receptor dando lugar a un fragmento con actividad tirosina kinasa constitutiva.Dada la ubicuidad de CaM y su importancia en procesos vitales para la célula, elsegundo objetivo consistió en buscar el sitio de unión a CaM de TrkA, para asípoder obtener una construcción de Trk en que se perdiera la unión a CaM.Basándonos en diversas evidencias, nos centramos en la caracterización de unaregión que contenía una Tyr fosforilable (Y701) y que además forma parte de unmotivo de internalización. La última parte del trabajo se centra en describir lascaracterísticas de dicha Tyr y su función,que más allá de la relación con CaM,puede constituir una fosforilación inhibitoria para la actividad de Trk y un lugar deregulación negativa de su internalización. / TrkA was discovered as an oncogen, product of the fusion of its Tyrosine kinasedomain with Tropomiosin. Later on, it was identified as the receptor for the Nervegrowth factor (NGF).The first steps in Trk signaling after ligand binding are well understood. And alsothe pathways leading to MAPKs and PI3K-Akt activation. But receptorinternalization and retrograde transport are also important for the long termsignaling of TrkA, giving raise to a differential regulation of Trk receptors amongother growth factor receptors.Receptor activation also induces an increase in intracellular calcium concentration.That's why we thought on studying the relationship between TrkA activation andcalmodulin (CaM), as a prototypical calcium sensor.First we described a direct and calcium-dependent interaction between CaM andthe c-terminal part of TrkA. The first part of this work consists on thecharacterization of this interaction.In order to check the effect of CaM binding on TrkA we used CaM inhibitors.NGF-induced TrkA fosforilation was not inhibited upon CaM inhibition, but Trkwas cleaved, leading to constitutively active fragments. CaM is ubiquous andnecessary for many cell processes, so the second objective has been to search forthe CaM binding domain on TrkA in order to generate a TrkA mutant defective inCaM binding.We mutated a region containing a phosphorylatable Tyrosine Y701 that constitutesa trafficking motif, as the putative binding site of CaM. The last part of this projectdeals with the characterization of the mutants, and their effect even regardless ofCaM binding. Its phosphorylation might inhibit Trk function, and the regionconstitutes a negative regulator of internalization.

Este trabajo estudia el ambiente de la matriz extracelular (ECM) y su implicación en la respuesta inmunitaria y espermatogénesis de la dorada. Especie muy útil como modelo experimental en el estudio de las interacciones entre los sistemas inmunitario y reproductor por sus características biológicas de reproducción estacional, involución testicular y reversión sexual. Los resultados demostraron que el colágeno y sus péptidos derivados pueden actuar como señales de daño (DAMPs), modulando de forma específica la respuesta inmunitaria innata y los procesos de inflamación inicial en fagocitos profesionales y fibroblastos de dorada. Asimismo, las fuertes correlaciones entre moléculas relacionadas con la ECM, en condiciones fisiológicas y durante el desarrollo, son moduladas en granulocitos acidófilos como parte de la respuesta inflamatoria ante DAMPs y moléculas derivadas de patógenos. Finalmente, se encontró que además de la integrina beta 1a que se expresa constitutivamente, en dorada existe la isoforma ITGB1b que se expresa principalmente en testículo y durante la espermatogénesis. Estos hallazgos aportan al conocimiento sobre el ambiente de la ECM como un entorno complejo, coordinado y multifuncional, con posibles aplicaciones prácticas a futuro en el campo de la regeneración y remodelación tisular. / This work studies the extracellular matrix (ECM) environment and their implications in the immune response and spermatogenesis in gilthead seabream. This is a useful model to study interactions between immune and reproductive systems, considering its biological characteristics, such as seasonal breeding, testicular involution and sexual reversion. The results showed collagen and its derived peptides as able to act as damage signals (DAMPs), modulating in a specific form the innate immune response and the early inflammation processes in seabream professional phagocytes and fibroblasts. In addition, the strong correlations between ECM related molecules, under physiological conditions and during development, are modulated as part of the response against DAMPs and pathogen derived molecules. Finally, we found that in addition to the integrin beta 1a (ITGB1a) which is constitutively expressed, in seabream there is an ITGB1b which is mainly expressed in testis and during spermatogenesis. These findings improve the knowledge about ECM compartment as a complex, coordinated and multifunctional environment, having possible future practical applications in the tissue regeneration and remodelling.

Bone injury is a major health problem nowadays. Bone tissue engineering is a promising strategy to solve it. In this field many reports pointed out the role of scaffolds containing a calcium phosphate glass, such as G5, in the promotion of bone regeneration. These kinds of biomaterials release Ca2+ during degradation. Moreover, extracellular calcium (Ca2+0) is able to activate a special extracellular receptor called Calcium Sensing Receptor (CaSR), which can modulate migration, chemotaxis and differentiation. In that sense, present work aims to evaluate the role of extracellular calcium and CaSR as key factor in the induction of bone regeneration. We isolated endothelial progenitor cells (EPCs) and Mesenchymal Stromal cells (MSCs) from young rat’s bone marrow and they were stimulated with 10 mM Ca2+0. Results provided strong evidences about the role of Ca2+0 and CaSR in the modulation of chemotaxis, and angiogenic differentiation on EPCs, whilst on MSCs calcium exerted osteoinduction and proliferation through the CaSR. Furthermore, using biodegradable releasing calcium composite (PLA/G5) was measured the ability of that kind of biomaterials in the induction of bone and blood vessels formation in vivo. Finally, using a shell-less chick embryo model was compared the effect of the Ca2+0 and the ionic compound released by PLA/G5, demonstrating that the released Ca2+0 is the key factor in the promotion of angiogenesis and bone formation in vivo. The knowledge developed during this project will be a valuable tool to enhance the efficiency of biomaterials used in bone tissue engineering

El mètode tradicional utilitzat en la producció de vins escumosos (com el cava i el champagne) es caracteritza per una segona fermentació que té lloc dins l’ampolla. Aquesta segona fermentació presenta unes característiques molt específiques com són un alt contingut d’etanol, una pressió de CO2 creixent, baixa disponibilitat de nutrients i baixa temperatura. En aquesta tesi, s’ha analitzat en primer lloc l’efecte de factors ambientals sobre la cinètica fermentativa de Saccharomyces cerevisiae durant la segona fermentació, mitjançant el seguiment de la segona fermentació amb afròmetres. En segon lloc hem analitzat quin efecte tenen pràctiques habituals com l’addició de nutrients al vi base sobre la composició final del vi escumós, mitjançant l’anàlisi per HPLC del contingut d’aminoàcids i polisacàrids del vi i la seva capacitat escumant (mosalux). Finalment ens vàrem proposar identificar les bases genètiques de la segona fermentació mitjançant la detecció i validació de Quantitative Trait Locus (QTL). Els resultats obtinguts ens han permès identificar la temperatura, el vi base utilitzat, la soca de llevat i la font de nitrogen utilitzada en l’aclimatació del llevat com els factors que tenen més impacte en la segona fermentació. En segon lloc respecte a la composició final del vi escumós, hem pogut detectar que l’adició de nitrogen al vi base afavoreix, l’alliberament d’aminoàcids. Mentre que, l’adició de llevats secs inactius, promou la alliberació de polisacàrids i afavoreix l’escumabilitat del vi escumós. Finalment, hem identificat quatre gens, la variació al·lèlica dels quals explica la variació fenotípica observada entre soques. / El método tradicional utilizado en la producción de vinos espumosos (como el cava y el champagne) se caracteriza por una segunda fermentación que tiene lugar dentro de la botella. Esta segunda fermentación presenta unas características muy específicas como son un alto contenido de etanol, una presión de CO2 creciente, baja disponibilidad de nutrientes y baja temperatura. En esta tesis, se han analizado en primer lugar el efecto de factores ambientales sobre el desarrollo de la segunda fermentación, mediante su seguimiento con afrómetros. En segundo lugar hemos analizado qué efecto tienen prácticas habituales como la adición de nutrientes al vino base sobre la composición final del vino espumoso, mediante el análisis por HPLC del contenido de aminoácidos y polisacáridos del vino y su capacidad espumante (mosalux). Finalmente nos propusimos identificar las bases genéticas de la segunda fermentación mediante la detección y validación de “Quantitative Trait Locus” (QTL). Los resultados obtenidos nos han permitido identificar la temperatura, el vino base utilizado, la cepa de levadura y la fuente de nitrógeno utilizada en la aclimatación de la levadura como los factores que tienen mayor impacto en la segunda fermentación. En segundo lugar respecto a la composición final del vino espumoso, hemos podido detectar que la adición de nitrógeno al vino base favorece, la liberación de aminoácidos. Mientras que, la adición de levaduras secas inactivas, promueve la liberación de polisacáridos y favorece la espumabilidad del vino espumoso. Por último, hemos identificado cuatro genes, la variación alélica de los que explica la variación fenotípica observada entre cepas. / The traditional method used to produce sparkling wines (such as cava and champagne) is characterized by a second fermentation that takes place inside the bottle. This second fermentation has very specific characteristics such as a high ethanol content, increasing CO2 pressure, low temperature and low nutrient availability. In this thesis, we have firstly analyzed the effect of environmental factors on fermentation kinetics of Saccharomyces cerevisiae during the second fermentation, by monitoring the second fermentation development using aphrometers. Secondly, we analyzed what effect have common practices such as adding nutrients to the base wine on the final composition of the sparkling wine by HPLC analysis of content of amino acids and polysaccharides and its foaming capacity (mosalux) of the sparkling wine. Finally we aimed to identify the genetic basis of the second fermentation using Quantitative Trait Locus (QTL) mapping and validation approach. The results obtained enabled us to identify the temperature, the base wine used, the yeast strain and source of nitrogen used in the acclimatization of yeast as the factors that have the highest impact in the second fermentation kinetics. Secondly, with respect to the final composition of sparkling wine, we have found that the addition of nitrogen to the wine base favors the release of amino acids. While the addition of inactive dry yeast, promotes the release of polysaccharides and favors the foaming propoerties of the sparkling wine. Finally, we have identified four genes whose allelic variation explains the phenotypic variation observed among strains.

TESILes procianidines són flavonoides (flavan-3-ols), de tipus oligomèric, que exerceixen efectes beneficiosos en malalties com càncer, diabetis, i malalties cardiovasculars, entre altres. Aquests efectes de les procianidines s'atribueixen, clàssicament, al seu caràcter antioxidant, eliminador d'espècies reactives d'oxigen (ROS), atès que en l'etiologia d'aquestes malalties sovint es descriu un estat associat d'estrès oxidatiu, degut a l'excés de ROS. No obstant, cal aprofundir en l'estudi dels efectes i mecanismes d'acció de les procianidines, que depassen ja aquest rol tradicional d'antioxidants, en mostrar recentment noves propietats que permeten ampliar el seu ventall d'actuació i de possibles aplicacions terapèutiques. L'objectiu principal de la tesi és, doncs, contribuir a entendre com les procianidines modulen l'equilibri redox cel·lular, tant a nivell de DNA com a nivell de l'expressió gènica d'enzims que formen part del sistema de defensa antioxidant en models d'estudi (in vivo i in vitro) induïts a estrès oxidatiu. Donat que les procianidines són força abundants en el vi negre, s'ha utilitzat com a font d'aquests compostos un extracte de procianidines de pinyol de raïm (GSPE).L'anàlisi in vitro de la capacitat antigenotòxica del GSPE, comparant-la amb la de flavonoides monomèrics mitjançant la tècnica del Comet assay, demostra que els flavonoides protegeixen el DNA de l'estrès oxidatiu, i que l'eficiència de la protecció es correlaciona estretament amb l'estructura del flavonoide. Així, les procianidines, d'estructura oligomèrica i que, per tant, posseeixen més centres reactius antioxidants respecte els seus monòmers base (catequina i epicatequina), són més efectives en la protecció contra el dany oxidatiu genòmic. No obstant, la quercetina, un flavonol descrit com estructuralment òptim per a desenvolupar un rol antioxidant, és el més efectiu entre els flavonoides analitzats. Tanmateix, l'efecte preventiu és més rellevant si, prèviament a induir les cèl·lules a estrès oxidatiu, incubem els flavonoides en el medi de cultiu. Per tant, el mecanisme d'eliminació de les ROS no és la via exclusiva d'actuació de les procianidines i dels altres flavonoides en la prevenció dels danys al DNA sinó que s'estimulen mecanismes d'adaptació cel·lular, com la modulació de l'expressió gènica dels enzims del sistema de defensa antioxidant. En aquests darrers, l'anàlisi in vitro de l'efecte de les procinidines en l'expressió gènica mostra una activació transcripcional de la glutatió peroxidasa (GPx), la glutatió S-transferasa (GST), i una regulació post-traduccional de la Cu,Zn-superòxid dismutasa (Cu,Zn-SOD) força marcada a la dosi de 15 mg/L de GSPE. Les condicions d'estrès oxidatiu s'estableixen per una disminució dels nivells de glutatió (GSH) associat a un alt índex de peroxidació lipídica. En aquestes condicions no hi ha una resposta coordinada del patró d'expressió dels enzims antioxidants malgrat que s'activen els enzims del cicle del glutatió.La pre-incubació dels hepatòcits amb procianidines prevé la disminució de glutatió, mantenint l'estat redox estable tot i exposar-los a condicions oxidants, probablement en activar els enzims limitants en la síntesi del glutatió, ajudant a regenerar-lo de nou. Aquest manteniment de l'estabilitat redox fa pensar que l'augment observat de les activitats dels enzims del cicle del glutatió comporten un enfortiment del sistema de defensa antioxidant contra possibles alteracions redox.Les procianidines regulen post-traduccionalment la Cu,Zn-SOD en un model in vivo d'hepatòcits de rata. Regulació que es confirma in vitro emprant cèl·lules Fao i que és molt marcada de nou a 15 mg/L, suggerint que aquesta dosi exerceix efectes més notables i que mereix ser estudiada en més profunditat. D'altra banda, les procianidines no exerceixen cap efecte modulador significatiu sobre el patró d'expressió gènica de la Cu,Zn-SOD in vivo, quan s'empren rates induïdes a diabetis, com a model d'estrès oxidatiu in vivo. / Procyanidins are oligomeric flavonoids (flavan-3-ols), which exert a wide range of beneficial effects on many diseases such as cancer, diabetes and cardiovascular dysfunctions. The health-protective properties of procyanidins have mainly been attributed to their antioxidant activity, which involves mechanisms such as reactive oxygen species (ROS) scavenging. It is widely accepted that increased oxidative stress is involved in the development and progression of many diseases and their complications, because of excessive ROS generation. However, the effects of procyanidins and their mechanisms must be studied because it has been reported that, as flavonoid compounds, they can act as signaling molecules and these effects, in conjunction with their known antioxidant activity, will enable them to extend their roles and possible therapeutic applications.So the main aim of the thesis is to increase understanding of how procyanidins modulate the cellular redox equilibrium, both at the level of DNA and at the level of the gene expression of the antioxidant enzyme systems in oxidative stress-induced study models (in vivo and in vitro). Since procyanidins are mainly found in red wine, a grape seed procyanidin extract (GSPE) was used as a flavonoid source.The antigenotoxic GSPE capacity in vitro, compared with monomeric flavonoids by the Comet assay, demonstrates that flavonoids protect DNA against oxidative insult and that the efficiency is correlated with the flavonoid structure. In fact, procyanidins, which are made up of oligomeric units with more antioxidant reactive cores, and therefore have greater antioxidant capacity than their basic monomers (catechin and epicatechin), are more effective against oxidative genomic injury. On the other hand, quercetin, a flavonol whose structure has been reported to be optimum for an antioxidant role, is the most effective of all the flavonoids analyzed. However, the preventive effect of flavonoids is more significant if, before the cells are subjected to oxidative stress induction, we incubate the flavonoids in the culture medium. So ROS scavenging action is not the only means by which procyanidins and other flavonoids prevent oxidative insults to DNA but there is an enhancement of such cellular adaptation mechanisms as gene expression of the antioxidant defence system. In this sense, the in vitro analysis of the effect of procyanidins on gene expression shows a transcriptional activation of glutathione peroxidase (GPx) and glutathione S-transferase (GST) and a posttranslational regulation of Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD), which is particularly high at 15 mg/L of GSPE. The oxidative conditions are established by decreasing the glutathione (GSH) levels associated to high levels of lipid peroxidation. In these conditions there is no coordinated response of the gene expression profile although there is an enhancement of glutathione cycle-related enzyme activities.Pre-incubating the hepatocytes with procyanidins prevents the glutathione from decreasing, but keeps the redox status stable despite the oxidative conditions. This is probably due to of the fact that the rate-limiting enzyme for GSH synthesis is activated, which stimulates de novo synthesis of GSH. The fact that the redox stability is maintained suggests that the increase observed in the glutathione-related enzyme activities strengthens the antioxidant defence system against possible oxidative injuries.Procyanidins post-translationally regulate the Cu,Zn-SOD in an in vivo model of rat hepatocytes. This is also confirmed in an in vitro model using Fao cells and the regulation is again more enhanced at 15 mg/L, suggesting that this dose exerts greater effects and needs to be studied in more depth. On the other hand, procyanidins do not significantly modify the Cu,Zn-SOD gene expression profile in vivo, when t

El zinc és el metall de transició més abundant després del ferro a totes les cèl·lules, i un micronutrient essencial, presentant diverses funcions en sistemes biològics. D'altra banda, els polifenols de la dieta són micronutrients bioactius que mostren nombrosos beneficis per a la salut, com ara activitat antitumoral i neuroprotectora. Anteriors treballs del nostre grup d'investigació han demostrat que els polifenols interaccionen amb cations de zinc i tenen la capacitat de modular l'expressió de diferents gens implicats en l'homeòstasi d'aquest. En aquest treball van ser usats els flavonoides gal·lat d’Epigalocatequina i Quercetina com a models per polifenols hidrofílics i lipofílics respectivament, observant-se que, un cop combinats amb el zinc, presenten activitat ionófora per aquest metall en un sistema liposomal, similar a l'efecte del Clioquinol, fàrmac utilitzat en teràpies anti-càncer i anti-Alzheimer. A través d'aquest mecanisme, s'augmenten el pool de zinc làbil citoplasmàtic, intercanviable i de senyalització en el model de carcinoma hepatocel·lular Hepa 1-6. Per tant, els polifenols de la dieta es poden afegir a l'arsenal de fàrmacs que modulen l'homeòstasi del zinc i regulen les vies biològiques dependents d'aquest. Com a prova d'aquest principi, hem demostrat aquí, que en concentracions molt baixes, el gal·lat d’Epigalocatequina i la Quercetina quan es combinen amb el zinc, poden activar o inhibir la fosforilació d'Akt en cèl·lules Hepa 1-6. A més, vam demostrar que la Quercetina desencadena l’apoptosi en el carcinoma hepatocel·lular Hepa 1-6 de manera dependent de zinc. / El zinc es el metal de transición más abundante después del hierro en todas las células, y un micronutriente esencial, presentando diversas funciones en sistemas biológicos. Por otra parte, los polifenoles de la dieta son micronutrientes bioactivos que muestran numerosos beneficios para la salud, tales como actividad antitumoral y neuroprotectora. Anteriores trabajos de nuestro grupo de investigación han demostrado que los polifenoles interaccionan con cationes de zinc y tienen la capacidad de modular la expresión de diferentes genes implicados en la homeostasis de éste. En este trabajo fueron usados los flavonoides galato de Epigalocatequina y Quercetina como modelos para polifenoles hidrofílicos y lipofílicos respectivamente, observándose que, una vez combinados con zinc, presentan actividad ionófora para este metal en un sistema liposomal, similar al efecto del Clioquinol, fármaco utilizado en terapias anti-cáncer y anti-Alzheimer. A través de este mecanismo, se aumentan el pool de zinc lábil citoplasmático, intercambiable y de señalización en el modelo de carcinoma hepatocelular Hepa 1-6. Por lo tanto, los polifenoles de la dieta se pueden añadir al arsenal de fármacos que modulan la homeostasis del zinc y regulan las vías biológicas dependientes de éste. Como prueba de este principio, hemos demostrado aquí, que en concentraciones muy bajas, el galato de Epigalocatequina y la Quercetina cuando se combinan con zinc, pueden activar o inhibir la fosforilación de Akt en células Hepa 1-6. Además, demostramos que la Quercetina desencadena apoptosis en el carcinoma hepatocelular Hepa 1-6 de manera dependiente de zinc. / Zinc is the most abundant transition metal after iron in all cells and an essential micronutrient, displaying many functions in biological systems. On the other hand, dietary polyphenols are bioactive micronutrients that display many health benefits, such as antitumor and neuroprotective activity. Previous work by our research group has shown that polyphenols interact with zinc cations and have the ability to modulate the expression of different genes involved in zinc homeostasis. In this work, using the flavonoids Epigallocatechin-gallate and Quercetin as a model for hydrophilic and lipophilic polyphenols respectively, we show that, once polyphenols are combined with zinc, they display a zinc ionophore activity in a liposomal system, similar to the anti-cancer and anti-Alzheimer drug Clioquinol. Through this mechanism, they increase the labile, interchangeable and signaling pool of cytoplasmic zinc in the hepatocellular carcinoma cells Hepa 1-6 model. Thus, natural dietary polyphenols can be added to the arsenal of drugs that may be used to modulate zinc homeostasis and regulate zinc-dependent biological pathways. As a probe of this principle, we have shown here that at remarkably low concentrations, Epigallocatechin-gallate and Quercetin when combined with zinc, may activate or inhibit Akt-phosphorylation in Hepa 1-6 cells. In addition, we demonstrate that Quercetin triggers apoptosis in the hepatocellular carcinoma Hepa 1-6 cell line in a zinc-dependent way.

En esta tesis se estudian los efectos farmacológicos de derivados lipídicos frente el glioma y el Alzheimer. Los beneficios de este tipo de fármacos, basados en la terapia lipídica de membrana, están asociados con la modulación de la composición y las propiedades fisicoquímicas de membrana. En concreto, el ácido 2-hidroxioleico (2OHOA) es un potente fármaco antitumoral que fue diseñado para regular la composición y la estructura de la membrana lipídica así como la función de importantes proteínas de membrana. Por otro lado, el ácido 2-hidroxiaraquidónico (2OHARA), el ácido 2-hidroxieicosapentaenóico (2OHEPA), y el ácido 2-hidroxidocosahexanóico (2OHDHA) son derivados lipídicos hidroxilados que fueron diseñados en nuestro grupo de investigación para el tratamiento del Alzheimer. Este trabajo se ha basado en el estudio del funcionamiento de estos derivados de ácidos grasos hidroxilados en la modulación de las vías de señalización de la UPR (respuesta a las proteínas mal plegadas) y de la autofagia en células de glioma y células neuronales. / In this thesis, the pharmacological effects of lipid derivatives against glioma and Alzheimer's Disease are studied. The benefits of this type of drugs, which are based on the lipid membrane therapy, are associated with the modulation of the composition and physicochemical properties of membranes. 2-Hydroxyoleic acid (2OHOA) is a potent antitumor drug designed to regulate membrane lipid composition and structure and the function of important membrane proteins. In addition, 2- hydroxyarachidonic acid (2OHARA; LP204A1), 2-hydroxyeicosapentaenoic acid (2OHEPA; LP205A1), and 2-hydroxydocosahexanoic acid (2OHDHA; LP226A1) are new hydroxy derivated lipids designed in our group for the treatment of Alzheimer’s Disease. The main goal of this work was to study how these synthetic hydroxy derivates modulate the unfolded protein response and the autophagy pathways in glioma cells and neuron-like cells for Alzheimer’s Disease.