Orientador: Maria Inês de Moura Campos Pardini / Resumo: Este trabalho visou a comparação de 5 diferentes métodos de extração de DNA, a partir de amostras de materiais de arquivo (tecido incluído em parafina, lâmina de hemograma corada e não corada com Leishman, lâmina de mielograma, gotas de sangue em Guthrie card) e fontes escassas (células bucais, 1 e 3 bulbos capilares, 2 mL de urina), para avaliar a facilidade de aplicação dos mesmos e possibilidade de amplificação desse DNA pela técnica de PCR. Os métodos incluíram digestão por proteinase K, seguida e não seguida por purificação com fenol/clorofórmio, utilização de Chelex 100 Ò, utilização de InstaGeneÒ e fervura em água estéril. O DNA obtido, foi testado por PCR, para a amplificação de três fragmentos gênicos: de Brainderived neutrophic factor (764 pb), de Fator V Leiden (220 pb) e de Abelson (106 pb), sendo que, a amplificação para o primeiro, eliminava a necessidade dos demais. Conforme o tamanho do fragmento gênico estudado, a fonte potencial de DNA e o método de extração utilizado, os resultados caracterizaram o melhor caminho para padronização dos procedimentos técnicos a serem incluídos e apresentados no manual de Procedimentos Operacionais Padrão do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro - HC - UNESP - Botucatu. / Abstract: The present work aimed to compare five different methods of DNA extraction of archieved materials samples (paraffin-embedded tissues, periferic blood smear - stained or non-stained with Leshman, aspired bone marrow smears and blood guts in Guthrie card) and rare sources (oral cells, 1 and 3 capilar bulbs, 2 mL urine), to avaliate the aplication facility and the amplification possibility one for PCR. The methods included proteinase K digestion - followed or non by phenol/chloroform purification, Chelex 100Ò (BioRad), InstaGeneÒ (BioRad) and boilling in sterile water. The DNA obteined, was tested for amplification of 3 genic fragments: from Brainderived neutrophic factor gene (764 bp), Factor V Leiden gene (220 bp) and Abelson gene (106 bp). According to the genic fragment lenght studed, the DNA potential source and the extraction method used, the results characterized better guidelines for padronization of the techniques procedures for to Good Manufacturing Practices from Molecular Biology Laboratory from Blood Center - Medicine School - UNESP - Botucatu . / Mestre

Orientador: Jose Geraldo Nery / Banca: Regina Célia Galvão Frem / Banca: Elso Drigo Filho / Resumo: Zeólitas são materiais policristalinos constituídos de aluminosilicatos que possuem sistemas de poros e cavidades, alta área superficial e carga negativa. Devido a essas propriedades físico-químicas, esses materiais podem ser utilizados como trocadores iônicos, peneiras moleculares, catalisadores heterogêneos e agentes hemostáticos coagulantes. No que diz respeito a aplicação desses materiais como agentes hemostáticos coagulantes, as propriedades físico-químicas descritas acima oferecem um ambiente favorável para que o processo de coagulação ocorra mais rapidamente, uma vez que as cargas negativas presentes na estrutura das zeólitas induzem o início da via intrínseca da cascata de coagulação, este fenômeno é conhecido como "glass effect". Além disso, a alta área superficial facilita a adsorção de moléculas de água e como consequência, as proteínas e fatores coagulantes ficam concentrados facilitando o processo de formação do coágulo. O uso de nanozeólitas das famílias FAU e LTA como agente coagulante já foi reportado na literatura, no entanto não existem relatos de aplicação da nanozeólita MOR para tal finalidade. Sendo assim, um dos objetivos desta pesquisa foi avaliar o potencial coagulante desta zeolita. Para tanto, a síntese da nanozeólita é um processo fundamental e o desafio desta pesquisa foi reduzir o tempo de síntese e a escala do material utilizando a radiação de micro-ondas sem perder a cristalinidade e a pureza de fase. Para este estudo, a síntese da zeólita foi... / Abstract: Zeolites are alluminosilicate polycristalline materials with properties such as nanosized pores, channels and large surface area. Due to these physicochemical properties, zeolitic materials can be used as ion exchangers, molecular sieves, heterogenous catalysts and hemostatic coagulation agent. Concerning the application of zeolites as hemostatic agentes, mordenite zeolite has physicochemical properties that offer a favorable environment that makes coagulation more efficient, such as negative charges, that induce the initialization of intrinsic via of clot cascade, this phenomenon is known as glass effect. Furthermore, the high surface area makes the adsorption of water molecules more efficient which concentrates proteins and coagulant factors, thus accelerating the formation of clot. The application of nanozeolite FAU as hemostatic coagulation agent has been reported in the literature, nevertheless as far as it's concerned, nanozeolite MOR hasn't been reported for this application. Therefore one of this research objectives was evaluate the hemostatic coagulation potential of nanozeolite MOR and to reach this objective, the synthesis of the material was fundamental. However the challenge of this research was decrease the synthesis time and decrease the size of material using microwave radiation without lose the cristalinity and phase purity. For this study, mordenite zeolite was synthetized with the following gel composition: 1Al2O3: 30SiO2: 6Na2O: 780H2O. The method used ... / Mestre

Orientador: Nilce Maria Martinez Rossi / Resumo: A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri é um fitopatógeno causador do cancro cítrico que compromete parte da produção de laranjas do Estado de São Paulo, com reflexos negativos para a economia do Estado e do País. Para que haja um controle futuro do cancro cítrico, vários pesquisadores se empenharam no Projeto Genoma-Xanthomonas visando desvendar o conjunto gênico desta bactéria e fornecer subsídios para a identificação dos genes envolvidos com a sua patogenicidade. Neste sentido, o atual trabalho visa o monitoramento da expressão gênica do patógeno quando submetido a diferentes condições ambientais, tais como variações no pH extracelular e antibacterianos utilizando o Differential Display RT - PCR. Deste modo, obtivemos a expressão de genes importantes quando o microrganismo foi submetido ao pH 8.0 tais como: um gene relacionado a um transportador MFS, valina - piruvato aminotransferase, glucano 1,4--glucosidase e uma proteína hipotética conservada. Quando submetida à agentes inibidores como a ampicilina, a Xanthomonas expressou proteínas como a integrase, proteína de virulência e uma fosforibosilformilglicinamida ciclo ligase. Quando em meio de cultura contendo penicilina, a bactéria expressou o gene da tirosil t-RNA sintetase. Há um grande interesse em desvendar os mecanismos de ataque da Xanthomonas axonopodis pv. citri, na sua interação com o vegetal e também suas estratégias para inibir o sistema de defesa do hospedeiro, promovendo o surgimento da doença. Neste sentido, espera-se que estes resultados, adicionados a outros projetos funcionais, possam fornecer informações quanto ao mecanismo de defesa da Xanthomonas, bem como da interação planta-bactéria e conseqüentemente auxiliar no controle do cancro cítrico. / Abstract: The bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri is a pathogen causing citric canker that compromises part of the orange production in the State of São Paulo, with negative consequences for the economy of the State and the Country. For the future control of citric canker, several investigators participated in the Xanthomonas Genome Project in order to determine the gene set of this bacterium and to contribute to the identification of the genes involved in its pathogenicity. In this respect, the objective of the current study was to monitor the gene expression of the pathogen when submitted to different environmental conditions such as variation in extracellular pH, and to different antibacterial agents using Differential Display RT-PCR. Using this method we obtained the expression of important genes when the bacteria were submitted to pH 8.0, such as a gene related to an MFS transporter, valine-pyruvate aminotransferase, glucan 1,4--glucosidase and a conserved hypothetical protein. When submitted to the action of inhibitory agents such as ampicillin, Xanthomonas expressed various proteins, i.e., integrase, virulence protein and a phosphoribosylformylglycinamide cycloligase. In a culture containing penicillin, the bacteria expressed the gene of tyrosyl t-RNA synthetase. There is great interest in determining the mechanisms of attack of Xanthomonas axonopodis pv. citri, its interaction with plants and also the strategies it uses to inhibit the defense system of the host, promoting the onset of the disease. In this respect, the present results, added to those obtained in other functional projects, are expected to provide information about the defense mechanism of Xanthomonas and about the plant-bacterium interaction in order to contribute to the control of citric canker / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação de Biologia Molecular, 2008. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2009-09-24T18:24:57Z No. of bitstreams: 1 2008_SharonLisauskasFerrazCampos.pdf: 614751 bytes, checksum: 207837a556ea269b616b4e6a0ac825c9 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T13:55:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_SharonLisauskasFerrazCampos.pdf: 614751 bytes, checksum: 207837a556ea269b616b4e6a0ac825c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T13:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_SharonLisauskasFerrazCampos.pdf: 614751 bytes, checksum: 207837a556ea269b616b4e6a0ac825c9 (MD5) Previous issue date: 2008 / A crescente demanda por biomoléculas de interesse farmacológico tem levado ao desenvolvimento de sistemas adicionais para a sua produção em larga escala e sob custos mais reduzidos. Sistemas de expressão utilizando células de eucariotos superiores vêm sendo apontados como possíveis alternativas para a produção de proteínas de interesse farmacológico (Leite, 2000). A secreção desses polipeptídeos no leite de animais transgênicos possibilita não apenas altos rendimentos de produção de fármacos heterólogos como também a ocorrência de seu processamento e modificações pós-traducionais de modo correto (Kerr et al., 1996). De maneira complementar, a produção desse tipo de biomolécula em sistemas eucariotos tem apresentado características interessantes tanto com relação à manutenção de seu processo de síntese, enovelamento e processamento, quanto à significativa redução de custos, aumento de estabilidade, manutenção de atividade biológica e ausência de contaminantes e patógenos comuns aos humanos (Kusnadi et al., 1997). O fator IX de coagulação sangüínea é uma glicoproteína da classe das serino-proteases que apresenta massa molecular de aproximadamente 55kDa. O polipeptídeo é sintetizado no fígado e secretado posteriormente no sangue, em que participa de uma cascata complexa de reações envolvendo mais três fatores de coagulação e duas proteínas: a pró-trombina e o fibrinogênio, culminando à coagulação sangüínea (Thompson et al., 1986). Alterações genéticas que ocasionam a disfunção ou a ausência de síntese do FIX resultam na hemofilia B, doença recessiva ligada ao cromossomo X que afeta cerca de 1 em cada 10.000 homens no Brasil. No presente trabalho foram desenvolvidas linhagens de camundongos (Mus muscullus) transgênicos, microinjetados com o gene do fator IX de coagulação humana. As camundongas fundadoras, bem como suas progênies secretaram no leite o FIX recombinante (3% proteínas solúveis totais). A integração estável do transgene - sob controle do promotor da ?-caseína do leite - foi verificada por southern blot, e a presença do FIX no leite de fêmeas transgênicas verificada por western blot. Testes de atividade da proteína recombinante em amostras de sangue de hemofílicos do tipo B foram realizados com auxílio de coagulômetro, comprovando a bioatividade da proteína. A expressão do fator IX de coagulação humana biologicamente ativa em camundongos transgênicos (Eyestone, 1994; Damak et al., 1996; Lisauskas et al., 2008) justifica a aplicabilidade dos sistemas em bovinos transgênicos utilizados como biofábricas (Lisauskas et al., 2007; Iguma et al, 2005). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The increasing demand for production of pharmaceutical interest recombinant proteins has been the goal for the development of additional systems to its production on a large scale and reduced costs. Eukaryotes expression systems are possible alternatives to the production of recombinant protein (Leite, 2000). The secretion of these polypeptides in the milk of transgenic animals promised high level of heterologous pharmaceutical products as well as the correct process and post-translation modifications (Kerr et al., 1996). The production on eukaryotic systems has presented characteristic interesting in such a way with regard to the maintenance of its process of synthesis, envelopment and processing, and to the significant reduction of costs, increase of stability, maintenance of biological activity, absence of contaminants and pathogens to the humans (Kusnadi et al., 1997). Blood coagulation factor IX is a serine-protease glycoprotein and it presents molecular mass of 55kDa. The polypeptide is synthesized in the liver and secreted in the blood, where it participates of reactions group involving coagulation factors and proteins that permit the blood coagulation (Thompson et al., 1986). Genetic alterations that cause the dysfunction or the absence of synthesis of the FIX lead to the hemofilia B, a recessive illness linked to chromosome X which affects about 1 in each 10,000 men in Brazil. In this work two lineages of mice (Mus muscullus) were microinjected with the human coagulation factor IX gene. The founding females and its progenies secreted the recombinant FIX in their milk (3% Total Soluble Protein). The stable integration of transgene - under control of the milk -casein pBC1 promoter - was confirmed by southern blot analysis. The presence of the FIX recombinant protein in the milk of transgenic females was verified by western blot. Tests of its activity in B hemophilic blood samples were confirmed by coagulometer pattern, validating this heterologous system.

As ataxias espinocerebelares (SCAs) constituem um grupo de doenças neurodegenerativas fatais que apresentam uma grande heterogeneidade clínica. A doença de Machado-Joseph (DMJ), ou ataxia espinocerebelar tipo 3 (SCA3), é causada por uma expansão de uma seqüência repetitiva CAG em um gene, denominado MJD1, localizado no braço longo do cromossomo 14, expansão codificadora de uma seqüência poliglutamínica constituinte da proteína ataxina 3. Indivíduos normais apresentam entre 12 a 41 repetições, enquanto indivíduos afetados apresentam 61 a 84 repetições CAGs neste gene. Este trabalho teve como objetivos principais a padronização de metodologias moleculares para o identificação e a quantificação do número de repetições CAG no gene responsável pela da DMJ. Um grupo de 112 pacientes, pertencentes a 77 famílias, com suspeita clínica de algum tipo de ataxia espinocerebelar foi avaliado no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Após a extração de DNA destes pacientes, este material foi amplificado por PCR utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos para a região de interesse e posterior transferência destes fragmentos (1) para uma membrana de nylon pelo método de Southern blot, visando ao estabelecimento de um protocolo não-radioativo para detectar a presença do alelo normal e/ou mutante; e (2) análise em gel de poliacrilamida para quantificação do número de repetições presentes no alelo mutante. As análises laboratoriais identificaram um total de 77 pacientes com uma expansão CAG no gene da MJD1. Considerando-se apenas indivíduos não relacionados, a freqüência encontrada foi de 61% (47 indivíduos). Os protocolos estabelecidos demonstraram-se bastante eficazes e sensíveis para o diagnóstico da DMJ e quantificação do alelo expandido da respectiva doença.

As fosfodiesterases do tipo 2A (PDE2A) hidrolisam os nucleotídeos cíclicos cAMP e cGMP e por isso desempenham papel importante na sinalização intracelular. PDE2A é composta por uma região N-terminal, que ao contrário de outras famílias de PDEs, não possui função conhecida, dois domínios regulatórios, GAF A e GAF B, e um domínio catalítico localizado na porção C-terminal. Sabe-se que a hidrólise dos nucleotídeos cíclicos, pela PDE2A, é ativada pela ligação de cGMP ao domínio regulatório GAF B. Em uma triagem dois híbridos, identificamos XAP2 como a principal proteína interatora de PDE2A. XAP2 é um componente crucial do complexo multiprotéico do receptor Aril hidrocarboneto (Ahr), o principal fator de transcrição que controla a expressão de múltiplos genes envolvidos em detoxificação. Neste trabalho, foi determinado que XAP2 liga o domínio GAF B da enzima PDE2A. Ensaios de atividade fosfodiesterásica, utilizando proteínas purificadas, mostram que a ligação de XAP2 não interfere na atividade enzimática de PDE2A. Para analisar se PDE2A afeta a função de XAP2, foi investigado o deslocamento de Ahr para o núcleo. Sabe-se que a regulação da expressão dos genes alvos de Ah é iniciada pela ligação de tetraclorodibenzodioxina (TCDD) e por uma via, ainda pouco entendida, dependente de cAMP. Verificamos que a ligação de PDE2A à XAP2 inibe o deslocamento de Ahr para o núcleo, induzido por TCDD e por cAMP em células hepáticas Hepa1c1c7 em cultura. Em conclusão, mostramos neste trabalho que XAP2 recruta PDE2A para o complexo Ahr, causando a inibição da mobilidade de Ahr, possivelmente pela redução local da concentração de cAMP. Esses dados suportam o papel de cAMP no controle da função de Ahr. / Phosphodiesterase type 2A (PDE2A) hydrolyzes cyclic nucleotides cAMP and cGMP thus efficiently controlling cNMP-dependent signaling pathways. PDE2A is composed of an N-terminal region, two regulatory GAF domains and a catalytic domain. Cyclic nucleotide hydrolysis is known to be activated by cGMP binding to GAF-B, however, other mechanisms may operate to fine-tune local cyclic nucleotide levels. In a yeast-two-hybrid screening we identified XAP2, a crucial component of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) complex, as a major PDE2A-interacting protein. We mapped the XAP2 binding site to the GAF-B domain of PDE2A. PDE assays with purified proteins showed that XAP2 binding does not change the enzymatic activity of PDE2A. To analyze if PDE2A could affect the function of XAP2 we studied nuclear translocation of AhR, i.e. the master transcription factor controlling the expression of multiple detoxification genes. Notably, regulation of AhR target gene expression is initiated by tetrachlorodibenzodioxin (TCDD) binding to AhR and by a poorly understood cAMP-dependent pathway, followed by the translocation of AhR from the cytosol into the nucleus. Binding of PDE2A to XAP2 inhibited TCDD- and cAMP-induced nuclear translocation of AhR in Hepa1c1c7 hepatocytes. We conclude that XAP2 targets PDE2A to the AhR complex thereby restricting AhR mobility, possibly by a local reduction of cAMP levels. Our results provide first insights into the elusive cAMP-dependent regulation of AhR.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2008-11-12T17:50:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_AlexandreRosa.pdf: 9082399 bytes, checksum: 9fe59d69d2f47fa7ddf981b510013376 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2008-12-08T18:26:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_AlexandreRosa.pdf: 9082399 bytes, checksum: 9fe59d69d2f47fa7ddf981b510013376 (MD5) / Made available in DSpace on 2008-12-08T18:26:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_AlexandreRosa.pdf: 9082399 bytes, checksum: 9fe59d69d2f47fa7ddf981b510013376 (MD5) / Biomedical research commonly starts by raising a hypothesis to solve a problem. In this context, scientists select the most appropriate method(s) to answer the question and solve a common dilemma. Over the past decade, we have witnessed a revolution of new technologies in molecular biology – the Omics Science. Highscale technologies such as metabolomics, cytomics, genomics and proteomics are changing the way we study complex biological systems. Current approaches to understanding the functional diversity of an organism preferentially strive for a systems biology approach whereby first the phenotypic classification of a specific cytome is achieved prior to an attempt to perform proteomic analysis. In this context, to better understand the features that involve neutrophil activation and programmed cell death in the pathological and healthy states, this study proposes the integration of cell biology approaches such as flow cytometry with a very robust proteomics platform in an attempt to integrate data at the molecular level with phenotypic data of neutrophils. The application of subcellular fractionation method using digitonin detergent extraction to enrich cytosolic proteins from neutrophils was found reproducible, simple to perform, and inexpensive. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pesquisas biomédica comumente começa com a elaboração de uma hipotese para resolver um problema. Nesse contexto, cientistas selecionam o(s) metodo(s) mais apropriado(s) para responder a questão e solucionar um dilema. Nos últimas anos, nós temos testemunhado uma revolução de novas tecnologias em biologia molecular – a ciência -Omica. Tecnologias de alta-escala tais como metabolômica, citômica, genômica e proteômica estão mudando o modo que estudamos sistemas biológicos complexos. Métodos contemporâneos para o entendimento da diversidade funcional em um dado organismo preferencialmente abordam uma visão de biologia de sistemas onde primeiro a classificação fenótipa de um citoma é alcançado antes de uma tentativa de caracterizar o proteoma de tal célula. Dentro desse contexto, e para proporcionar um melhor entendimento dos componentes envolvidos na ativação e morte celular programada dos neutrófilos nos estados patológicos e sano, esse estudo propõe a integração de métodos em biologia celular tal como citometria de fluxo com uma robusta plataforma proteômica em uma tentativa de integrar dados a nível molecular com dados fenótipicos de neutrófilos. Fracionamento subcelular usando um método de extração e enriquecimento de proteínas citosólicas com o detergente digitonina foi otimizado nesse trabalho, e encontrado ser altamente reprodutível, fácil de realizar, e de baixo custo.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-09-15T19:37:58Z No. of bitstreams: 1 2008_NadiaSilvaCastro.pdf: 1694398 bytes, checksum: 0128cdccb93616f46069ecd716dbb71a (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-09-21T12:39:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_NadiaSilvaCastro.pdf: 1694398 bytes, checksum: 0128cdccb93616f46069ecd716dbb71a (MD5) / Made available in DSpace on 2009-09-21T12:39:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_NadiaSilvaCastro.pdf: 1694398 bytes, checksum: 0128cdccb93616f46069ecd716dbb71a (MD5) Previous issue date: 2008-05 / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente etiológico da paracoccidioidomicose. Em humanos, a infecção inicia-se pela inalação de propágulos fúngicos que alcançam os pulmões. A parede dos microrganismos constitui um importante reservatório de macromoléculas imunoreativas e um potencial alvo para a procura de candidatos a vacinas. Em muitos patógenos, as proteínas com âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) mostraram-se imunogênicas e importantes fatores de virulência. Assim, com o objetivo de estudar as proteínas de superfície foram efetuadas análises no banco de dados do transcriptoma de P. brasiliensis, onde pesquisou-se por proteínas GPI-ancoradas localizadas na membrana plasmática ou parede celular, bem como por proteínas que estivessem envolvidas na síntese, ligação e clivagem da âncora de GPI. Estas proteínas foram identificadas em várias categorias funcionais, tais como: (i) enzimas: glicanosiltransferases (1-3), (ii) prováveis antígenos de superfície, (iii) proteínas com papel estrutural e envolvidas na biossíntese da parede celular. Foram identificados transcritos codificantes para proteínas da via de biossíntese e hidrolise da âncora de GPI. Visando o conhecimento de mecanismos moleculares que participem da montagem e morfogênese da parede celular de P. brasiliensis, foi realizado o estudo de ?-1,3-glicanosiltransferas e 3 (PbGel3). PbGel3 mostrou-se em cópia única no genoma deste fungo com maiores níveis do transcrito e de proteína na fase miceliana. A proteína foi imunolocalizada na superfície de células leveduriformes e de micélio de P. brasiliensis. O potencial papel de PbGel3p na biossíntese e remodelamento foi evidenciado pela habilidade em recuperar o fenótipo do mutante gas1? de Saccharomyces cerevisiae. O homólogo da proteína DFG5 (deficiente para o crescimento filamentoso 5) de P. brasiliensis, uma proteína glicosilada provavelmente ligada à parede celular pela rede de ?-glicana foi estudado. Estudos de interação demonstraram que a proteína PbDfg5p recombinante se liga aos componentes da matriz extracelular, sugerindo um papel importante nos passos iniciais de colonização e aderência de P. brasiliensis aos tecidos do hospedeiro. Em função de seu papel biológico, bioquímica única, organização estrutural e a ausência da maioria de seus constituintes em células de mamíferos, a parede celular é um alvo atraente para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos e essencial para o entendimento da patogênese fúngica. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a temperature dependent dimorphic fungus, the etiological agent of paracoccidioidomycosis. In human, infection starts by inhalation of fungal propagules reaching the pulmonary epithelium, where the morphogenetic conversion is correlated with changes in the cell wall composition, organization and structure. The cell wall constitute an important reservoir of immunoreactive molecules and potential target for the search of vaccine candidates. In many pathogens, the proteins with glicosilfosfatidilinositol (GPI)-anchors are immunogenic and important virulence factors. Thus, P. brasiliensis transcriptome data were analyzed for potential GPI-anchored proteins localized in plasma membrane or cell wall, as well as for proteins involved in synthesis, attachment and cleavage of the GPI anchor. The proteins were identified in several functional categories: (i) enzymes: glucanosyltransferases(1- 3), (ii) probable surface antigens, (iii) proteins involved in cell wall biosynthesis and structural role. It was identificated transcript encoding to proteins involved in GPI anchor biosynthesis and hydrolysis. In an effort to elucidate the molecular mechanisms involved in the fungus cell wall-assembling and morphogenesis it was performed the study of the B-1,3-glucanosyltransferase 3 (PbGel3). PbGel3 showed one copy in genome of this fungus with the highest level of transcript and protein in the mycelium phase. The protein was immunolocalized at the surface in both mycelium and yeast phase. The potential role of PbGel3p in cell wall biosynthesis and remodeling was evidenced by its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae gas1 mutant. The DFG5 (defective in filamentous growth) homologue of P. brasiliensis, a probably glicosylated and B-glucan linked cell-wall protein was also studied. Studies demonstrated that the recombinant PbDfg5p binds to extracellular matrix components, indicating that it can be important for initial steps leading of P. brasiliensis attachment and colonization of host tissues. Because of its essential biological role, unique biochemistry, structural organization and the absence of the most of their constituents in mammalians cells, the cell wall is an attractive target for the development of new antifungal agents and essential for understanding the fungal pathogenesis.

Resumo não disonível

A caracterização molecular e morfofisiológica de 28 isolados de Metarhizium ssp. foi avaliada por análises de seqüências do espaçador transcrito interno (ITS1 e ITS2), presença de elementos dsRNA e taxa de crescimento e esporulação em diferentes temperaturas e pH. A patogenicidade de 19 isolados do fungo entomopatogênico Metarhizium ssp. foi avaliada para fêmeas ingurgitadas do carrapato Boophilus microplus. As alterações cronológicas durante o processo de infecção Metarhizium anisopliae isolado E6 em B. microplus foi avaliada em detalhe por microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão. O seqüenciamento do espaçador transcrito interno confirmou a identidade taxonômica dos isolados avaliados como M. anisopliae var. anisopliae ou M. anisopliae var. majus e mostrou que dois isolados (CG291 e CG423), previamente classificados como Metarhizium flavoviride, são pertencentes a M. anisopliae var. anisopliae. Os testes sobre a influência da temperatura e pH no desenvolvimento e esporulação dos isolados evidenciaram que a melhor temperatura de crescimento para a maioria desses foi 28oC e que o crescimento foi ótimo na faixa de pH entre 4 a 9. Os bioensaios mostraram que três isolados (C14, CG47 e CG97) foram altamente patogênicos para fêmeas ingurgitadas de B. microplus sendo tão virulentos quanto o isolado E6, previamente analisado, causando cerca de 90-100% de mortalidade ao 4o dia de infecção. Outros isolados foram menos virulentos ou não mostraram virulência para o carrapato. A presença de dsRNA foi avaliada em 28 isolados e detectada em 21 isolados. Vários padrões de dsRNA foram observados baseados no tamanho molecular analisado por eletroforese em gel de agarose. Nenhuma correlação foi observada entre a presença de dsRNA e a virulência do fungo. As observações microscópicas evidenciaram que o fungo M. anisopliae isolado E6 invade seu hospedeiro por penetração direta da cutícula, sendo que este processo envolveu as etapas de adesão e germinação dos conídios, formação do apressório e penetração do fungo na cutícula do hospedeiro. A adesão e germinação dos conídios na superfície da cutícula se iniciou após 24 h de infecção. Neste mesmo tempo, ocorreu diferenciação do apressório, estrutura que exerce a pressão mecânica durante o processo de penetração, sendo que este processo é facilitado pela ação de enzimas hidrolíticas secretadas pelo fungo. A penetração de algumas hifas ocorreu até 24 h após a infecção do fungo, embora, neste mesmo tempo de infecção, a maioria dos conídios ainda estivesse em processo de germinação. A penetração em massa do fungo foi observada 72 h após a infecção e, após 96 h, as hifas emergiram na superfície da cutícula para originarem novos conídios e assegurarem a perpetuação do fungo. A intensa invasão das hifas nos tecidos adjacentes confirmou a eficácia do isolado E6 na infecção do carrapato B. microplus.