Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-24Bitstream added on 2014-06-13T18:49:56Z : No. of bitstreams: 1 costa_lc_me_sjrp_parcial.pdf: 205173 bytes, checksum: bf8330ba8ebec2e33d2e94ec3f85ca8c (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-25T13:01:07Z: costa_lc_me_sjrp_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-25T13:03:25Z : No. of bitstreams: 1 000624262_20151231.pdf: 180856 bytes, checksum: 0c0db07749af7e17dd04bbdebcc70b88 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-04T10:26:22Z: 000624262_20151231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-04T10:28:15Z : No. of bitstreams: 1 000624262.pdf: 814952 bytes, checksum: c2e88a5f2759a15bbe1e835ebd0266af (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Mastoparanos são uma família de peptídeos líticos, extraídos do saco de veneno de vespas sociais, que apresentam moderada a intensa atividade antimicrobiana e alguns são hemolíticos e citotóxicos. Embora o mecanismo de ação destes peptídeos não seja bem compreendido ainda, aceita-se que envolva desestabilização da fase lipídica da membrana celular. Acredita-se que a carga líquida do peptídeo e sua hidrofobicidade média contribuam na modulação da atividade lítica e na seletividade. Nesta dissertação apresentamos um estudo de quatro peptídeos mastoparanos que possuem resíduos ácidos e básicos resultando em uma carga elétrica líquida variando de +1 a +4. Este estudo envolve a análise conformacional destes peptídeos em vesículas zwitteriônicas e aniônicas por dicroísmo circular. Suas atividades líticas foram avaliadas usando espectroscopia de fluorescência monitorando a recuperação da intensidade de fluorescência devido à liberação de marcador fluorescente encapsulado em vesículas. As constantes de partição destes peptídeos em vesículas zwitteriônicas foram também determinadas por espectroscopia de fluorescência usando um método de análise que é independente de modelo. Com o objetivo de entender a influência de resíduos ácidos e a carga líquida dos peptídeos e sua hidrofobicidade na interação peptídeo-lipídio, foram estimadas as contribuições energéticas eletrostáticas e não eletrostática. Para alcançar este objetivo, os resultados obtidos nas isotermas de ligação por fluorescência foram associados com medidas de potencial zeta. Foi observado que a afinidade destes peptídeos em vesículas zwitteriônicas decresce com a carga líquida do peptídeo e as curvas de dose-resposta são mais cooperativas para os dois peptídeos com as cargas mais baixas. Os peptídeos com maior carga apresentaram uma maior afinidade... / Mastoparans are a family of lytic peptides extracted from the venom sac of wasps which present moderate to intense antimicrobial activity and some of them are hemolytic and cytotoxic. Although the mechanism of action of these peptides are still not completely understood, it is accepted that it involves the destabilization of the lipidic phase of the cell membrane. It is believed that both the peptide net electrical charge and its mean hydrophobicity contribute to modulate their lytic activity and selectivity. In this dissertation we present a study of four mastoparan peptides which have acidic and basic residues resulting in net electrical charges ranging from +1 to +4. This study involves the conformational analysis of these peptides in zwitterionic and anionic lipid vesicles by circular dichroism. Their lytic activities were evaluated using fluorescence spectroscopy by the release of fluorescent dye entrapped in these two types of vesicles. The partition constants of these peptides to zwitterionic vesicles were also determined by fluorescence spectroscopy using a method of analysis which is model independent. Aiming to understand the influence of acidic residues and of the peptides net charge and hydrophobocity on the peptide-lipid interaction, the electrostatic and non electrostatic energetic contributions were estimated. To achieve this goal it was used the association of the results of fluorescence binding isotherms and zeta potential measurements. It was observed that the affinity and lytic activity of these peptides in zwitterionic vesicles decrease with the peptides net electrical charges and the dose-response curves are more cooperative for the two peptides with lower net charges. The more charged peptides exhibit higher affinity and lytic activity in anionic vesicles. The most charged peptide displayed the higher selectivity for the vesicles studied. The present work... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-17Bitstream added on 2014-06-13T18:08:49Z : No. of bitstreams: 1 paulino_kh_me_sjrp.pdf: 434360 bytes, checksum: a8e2b302456d5e127779718e98e3d011 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Neste trabalho foram resolvidos, através de Equação de Schrödinger independente do tempo, os potenciais biestáveis do Poço Duplo Quadrado Unidimensional Simétrico (PDQUS) e do Poço Duplo Assimétrico (PDQUA), concentrando neste último grande parte do estudo. Como todo PDQUS é ressonante por definição, é possível então estimar o tempo de tunelamento através da Fórmula de Rabi. O mesmo não acontece com PDQUA, pois nem todo poço duplo assimétrico é ressonante. Foi necessário então, encontrar barreiras de potencial e distância entre os poços que permitiram a ressonância, pois a probabilidade de tunelamento é muito maior que aquelas dos casos onde não há ressonância. Além do tempo de tunelamento, o tempo de transição eletrônica também é estimado, com o objetivo de propor um modelo de transferência eletrônica (TE). Uma possível aplicação para tal modelo está relacionada a sistemas biológicos ocorrendo por tunelamento e por transição, utilizando o PDQUA. Com base na TE em bactérias fotossintéticas, pôde-se obter informações estruturais, como: as distâncias e energias envolvidas no processo, que foram essenciais para os exemplos numéricos tratados nesse trabalho. / In this work were resolved, by Schrödinger equation independent of time, the bistable potential of the One Dimensional Symmetric Double Square Well (PDQUS) and Asymmetric Double Well (PDQUA), concentrating largely in the latter study. As all PDQUS is resonant by definition, it is possible then estimate the time of tunneling through the Rabi formula. This not happens with PDQUA, because not all asymmetric double well is resonant. It was necessary then, to find potential barriers and distance between wells that allowed the resonance because the tunneling probability is much higher than those cases where there is no resonance. Besides the time of tunneling, the electronic transition time is also estimated, with the objective of proposing a model of electron transfer (TE). One possible application for such a model is related to biological systems occuring by tunneling and transition, using the PDQUA. Based on the TE in photosynthetic bacteria, could be obtained structural information, such as distances and energies involved in the process, which were essential for the numerical examples treated in this work.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-12Bitstream added on 2014-06-13T19:28:26Z : No. of bitstreams: 1 souza_ar_me_sjrp.pdf: 3817333 bytes, checksum: 20cb2aff6d1bb018de51a42cb94ec963 (MD5) / Esta dissertação aborda o estudo de duas proteínas, uma β-1,3-1,4-glicanase (EC 3.2.1.73) de Bacillus subtilis 168 (liquenase) e outra α-L-arabinofuranosidase (E.C. 3.2.1.55) da família GH51 de Thermotoga petrophila RKU-1, ambas com potenciais aplicações biotecnológicas. A liquenase é responsável pela catálise da clivagem de β-D-glicanas unidas por ligações tipo 1,3 e 1,4, por outro lado a arabinofuranosidase de estudo é responsável pela hidrólise de resíduos α-1,2, α-1,3 e α-1,5-L-arabinofuranosil e age em combinação com outras enzimas para despolimerização de arabinose em polissacarídeos. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo realizar estudos estruturais e biofísicos dessas duas proteínas com o intuito de obter informações moleculares importantes que pudessem contribuir para utilização das mesmas em processos biotecnológicos, como o pré-tratamento da biomassa lignocelulósica por exemplo. Desta forma, foi verificado que a liquenase apresenta massa molecular de 28 kDa, mostra um enovelamento típico de membros da família GH16 com estrutura β-jelly e mostrou uma termotolerância reduzida, abaixo de 50°C. Por outro lado, a arabinofuranosidase é uma enzima termofílica com massa molecular de 57 kDa e com a presença de dois domínios: um domínio catalítico com enovelamento barril (α/β) e um domínio C-terminal β-sanduíche, que possui um motivo β-hairpin único para arabinofuranosidases encontradas no gênero Thermotoga. Desta forma, foi possível concluir que a liquenase de estudo é uma enzima monomérica e que sua reduzida termotolerância limita sua aplicação em processos industriais acima de 50°C. Desta forma, esta é uma candidata a estudos de engenharia de proteínas. E com relação a arabinofuranosidase, possui uma estrutura hexamérica, quando em solução, e sua elevada estabilidade térmica sugere que esta é uma forte candidata a futuras aplicações industriais / This paper describes two proteins, β-1,3-1,4-glucanase (EC 3.2.1.73) from Bacillus subtilis 168 (lichenase) and α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) family GH51 from Thermotoga petrophila RKU-1, both with potential biotechnological applications. The lichenase is responsible for cleavage of β-D-glucans joined by linkages type 1.3 and 1.4, on the other hand arabinofuranosidase is responsible for the hydrolysis of α-1.2, α-1.3 and α-1.5-L-arabinofuranosyl radicals and acts synergistically with others enzymes for arabinose depolymerization of polysaccharides. Therefore, this study aimed to perform structural and biophysical studies of these two proteins in order to obtain important molecular information that could help biotechnological processes by application of these enzymes, such as the pretreatment of lignocellulosic biomass. Thus, it was found that the lichenase molecular mass was 28 kDa and showed a typical folding members of the family GH16 with structure β-jelly and showed a reduced thermotolerance, below 50°C. Moreover, arabinofuranosidase, a thermophilic enzyme, showed molecular mass of 57 kDa and displayed two domains: a folding barrel with the catalytic domain (α/β) and a C-terminal domain β-sandwich, which had a motif β-hairpin unique for arabinofuranosidases found in the genus Thermotoga. Therefore, it was concluded that the lichenase is a monomeric enzyme and that its reduced thermotolerance feature limits its application in industrial processes, above 50°C. So, this is a candidate for future studies of protein engineering. Regarding the arabinofuranosidase, revealed a hexameric structure, when in solution, and its high thermal stability suggests that this is a strong candidate for future industrial applications

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-01Bitstream added on 2014-06-13T20:29:36Z : No. of bitstreams: 1 vechettijunior_ij_me_botib.pdf: 1594421 bytes, checksum: 1167a8c201efe109070dc8bcf75dadb1 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O músculo esquelético é constituído por tipos de fibras que diferem de acordo com suas propriedades contráteis e metabólicas. Estas fibras possuem uma elevada plasticidade sendo capazes de alterar seu fenótipo em resposta a vários estímulos, como o treinamento físico. Tem sido demonstrado que o treinamento aeróbico frequentemente induz a pequenas alterações na massa muscular, promovendo mudanças no perfil do músculo em direção a um padrão mais eficiente. Vários estudos têm sido realizados para tentar identificar as vias moleculares envolvidas com a adaptação muscular. A maioria destes estudos tem procurado entender os fatores que controlam as alterações no fenótipo muscular, incluindo o fator de crescimento semelhante à insulina-I (IGF-I), a miostatina (MSTN) e a calcineurina (CaN). O objetivo deste estudo foi testar a hipótese de que as alterações que ocorrem em músculos fenotipicamente distintos durante o treinamento aeróbio de longo prazo são regulados por fatores de crescimento miogênicos, como o IGF-I, MSTN e CaN A e B. Ratos Wistar machos (80 dias de idade, 250-300 g) foram divididos em dois grupos: treinado (T; n = 8) e controle (C, n = 8). Os animais do grupo T foram submetidos a um programa de treinamento aeróbio de natação de longo prazo (8 semanas, 5 dias / semana). O volume e intensidade do treino foram progressivos: 10 min, sem sobrecarga (1ª semana), 20 min, com sobrecarga de 1% (2ª semana), 25, 30, 35 e 40 min, 3% de sobrecarga (3ª semana), 45, 50, 55, e 60 min, 5% de sobrecarga (4ª semana) e 60 min, 5% de sobrecarga (5ª a 8 semanas). No final do experimento os animais foram pesados e sacrificados. Os músculos sóleo (SOL) e Plantar (PL) foram retirados e processados para as análises histoquímica, morfométrica, bioquímica e molecular... / The skeletal muscle is constituted by fiber types which differ according to their contractile and metabolic properties. Muscle fibers have a high plasticity and are dynamic structures liable to modify their phenotype in response to several stimuli, such as physical training. It has been shown that aerobic training frequently leads to minor changes in muscle mass, promoting changes in muscle profile toward a more efficient pattern. Several studies have been performed to try to identify the molecular pathways involved in the muscle adaptation. Most of them converge to understand the factors that control the muscle phenotype changes including the insulin-like growth factor-I (IGF-I), Myostatin (MSTN) and Calcineurin (CaN). The purpose of this study was to test the hypothesis that muscle phenotypically distinct changes that occur during long-term aerobic training are regulated by myogenic growth factors including IGF-I, MSTN and CaN A and B. Male Wistar rats (80 days old, 250-300 g) were divided into two groups: trained (T; n=8) and control (C; n=8). T group underwent a swimming aerobic training program for 8 weeks (5 days/week). Training volume and intensity were progressive: 10 min without overloading (1st week), 20 min, 1% overload (2nd week), 25, 30, 35, and 40 min, 3% overload (3rd week), 45, 50, 55, and 60 min, 5% overload (4th week and 60 min, 5% overload (5th to 8th weeks). At the end of the experiment animals were weighed and sacrificed. Soleus (SOL) and Plantaris (PL) muscles were removed and processed for histochemical, morphometrical, biochemical and molecular analyses. No significant difference was observed in the initial body weight among the groups (p >0.05). After aerobic training, a reduction of the final body weight was observed in the trained (p < 0.05) compared with the control groups... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-15Bitstream added on 2014-06-13T18:09:16Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_ceb_me_araiq.pdf: 1957153 bytes, checksum: b0ae4e0d1fb8956ef357b8e5d40d4f21 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A metilação de ilhas CpG em regiões regulatórias de vários genes tem sido descrita como um processo importante no silenciamento de genes supressores de tumor e diretamente envolvida no processo de carcinogênese de uma série de tumores. O estudo desses genes afetados pela metilação em tumores visa identificar possíveis marcadores moleculares para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de tumores, além de possibilitar a descoberta de fatores importantes no processo biológico do câncer. Neste sentido, ao estudar o perfil diferencial de metilação de genes em carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, o gene MX1 foi identificado como diferencialmente expresso. Correlação também foi encontrada entre o silenciamento de ADAM23 e estágios tardios da progressão tumoral neste tipo de câncer. Dessa forma, o presente estudo envolveu a identificação de ligantes celulares das proteínas ADAM23 e MX1 por meio de rastreamentos de duplo- híbrido, usando bibliotecas de cDNA de cérebro fetal humano. Inicialmente, foi realizado rastreamento com os domínios desintegrina e rico em cisteína (DIS-ACR) de ADAM23, com um total de 5,1x105 transformantes obtidos, dos quais somente 1 foi confirmado pelo ensaio de “plasmid linkage”. O candidato confirmado pelo “plasmid linkage”, identificado como SPRY1, foi considerado como falso positivo por ser uma proteína estritamente citoplasmática, não podendo, portanto, interagir fisicamente com os domínios DIS-ACR de ADAM23, que são extracelulares. Ainda, foi realizado rastreamento com a proteína MX1, que resultou em aproximadamente 1,0x106 transformantes, dos quais 74 foram confirmados pelo ensaio de duplo- híbrido e codificam para 9 ligantes já conhecidos e 21 ligantes prováveis de MX1. Entre esses ligantes prováveis estão proteínas que já haviam sido descritas como ligantes de MX1, incluindo a própria proteína MX1,... / The methylation of CpG islands at regulatory regions of various genes has been described as an important process for the silencing of tumor suppressor genes and is directly involved in the carcinogenesis of a series of tumors. The study of these methylation-affected genes in tumors aims at identifying possible molecular markers for diagnostic, prognostic and treatment of such tumors, besides making possible the discovery of factors important for cancer biology. On this purpose, the study of differential pattern of gene methylation in head and neck squamous cell carcinoma identified the gene MX1 as differentially methylated. Together with this result, it was found a correlation between ADAM23 silencing and late stages of tumor progression in this type of cancer. In order to identify cellular ligands of ADAM23 and MX1, we performed two-hybrid screenings using fetal brain cDNA libraries. Initially, a screening with the disintegrin and cystein rich (DIS-ACR) domains of ADAM23 was accomplished, with an amount of 5,1x105 transformants obtained, out of which just one was confirmed by plasmid linkage assay and identified as SPRY1. However, it was considered a false positive since this protein is restricted to the cytoplasmatic compartment and, therefore, it may not physically bind the DIS-ACR domains of ADAM23, known to be extracellular. Additionally, a screening with the MX1 protein was performed, resulting in approximately 1.0x106 transformants, out of which 74 were confirmed by two-hybrid assay and revealed 9 already known and 21 putative ligands of MX1. Among the putative ligands there are proteins previously described as MX1 ligands, including MX1 itself, corroborating the results obtained in our screening. Moreover, most of the identified ligands are factors involved in protein SUMOylation, PML-NB assembly and proteins that are related to transcriptional control and apoptosis. The results ... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-26Bitstream added on 2014-06-13T20:50:01Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_rd_me_araiq.pdf: 458621 bytes, checksum: b64d723b7092c74fd22ab470646c2f98 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Este trabalho teve como objetivo identificar fatores de transcrição envolvidos na via metabólica do glicogênio no fungo Neurospora crassa durante o crescimento vegetativo e na condição de choque térmico. Para isso foi utilizado uma coleção de 139 linhagens mutantes do fungo, as quais possuem genes codificadores de fatores de transcrição individualmente nocauteados. O conteúdo de glicogênio de todas as linhagens foi determinado tanto a 30ºC, temperatura fisiológica de crescimento, quanto a 45ºC, situação de choque térmico. Do total das linhagens analisadas, 10 apresentaram um perfil distinto daquele observado na selvagem. Com o objetivo de verificar o envolvimento dos fatores de transcrição identificados na expressão do gene que codifica a enzima glicogênio sintase (gsn), experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram que do total de linhagens analisadas, 3 apresentaram diferenças na transcrição de gsn, sugerindo que os fatores de transcrição nocauteados nestas linhagens atuam diretamente na regulação da transcrição do gene. As linhagens mutantes selecionadas foram avaliadas quanto ao crescimento e comparadas à linhagem selvagem. Todas as linhagens selecionadas apresentaram uma taxa de crescimento bastante semelhante à linhagem selvagem, exceto a linhagem FGSC011062 (ORF NCU09739), a qual apresentou uma taxa de crescimento muito reduzida. Ferramentas de bioinformática disponíveis na internet foram utilizadas para a dedução teórica das características bioquímicas, moleculares e estruturais dos fatores de transcrição selecionados, tais como ponto isoelétrico, massa molecular, sinais de localização nuclear clássicos e a presença de domínios conhecidos. A análise por Blastp revelou que apenas 2 das 10 ORFs selecionadas codificam fatores de transcrição com função conhecida e as demais codificam proteínas hipotéticas... / The objective of this work was to identify transcription factors involved in the glycogen metabolic pathway of the fungus Neurospora crassa. We used a collection of 139 mutant strains, in which each strain has a gene codifying for transcription factor individually knockedout. The glycogen content was quantified during the vegetative growth (30ºC), and after a stress condition such as heat shock (transfer for 30ºC to 45ºC). Of all analyzed strains, 10 showed a pattern of glycogen accumulation distinct of the one observed for the wild type strain. To verify the involvement of the transcription factors identified in the expression of the gene encoding glycogen synthase (gsn), Northern blot experiments were performed and revealed that 3 strains showed differences in gene transcription, either before or after heat shock. The results suggested that the transcription factors knocked-out in the strains might act directly in the regulation of the gsn gene transcription. The growth of the selected mutant strains was evaluated and compared to the wild type strain. Most of the selected mutant had a growth rate similar to the wild type strain, except the strain FGSC01162 (ORF NCU09739), which showed a reduced growth rate. Online bioinformatics tools were used to predict the biochemical parameters, such as isoeletric point and molecular weight, as well protein domain, such as classic nuclear localization signal (cNLS). Analysis by Blastp revealed that 2 from 10 selected ORFs codify transcription factors having functional roles in public databases: the ORF NCU08000 codifies the cutinase transcription factor 1α that is involved in the induction of the expression of cutinases genes by fatty acids in ascomycetes, and the ORF NCU06971 codifies the protein XlnR a transcription factor responsible for the transcription activation of genes involved in the xylan degradation. The results described... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador : Dr. Stenio Perdigão Fragoso / Co-orientadora : Drª. Gisele Fernanda Assine Picci / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 10/06/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia Celular e Molecular / Resumo: O protozoário Trypanosoma cruzí, agente causador da Doença de Chagas, possui características incomuns em relação à organização e expressão gênicas, tais como genes arranjados em polícístrons, transcritos processados por uma reação de trans splícíng, ausência promotores clássicos da RNA Polimerase 11 e poucos fatores de transcrição codificados em seu genoma. Essas características sugerem que a regulação diferencial da expressão gênica, que permitem um ciclo de vida complexo, é controlada por mecanismos pós-transcricionais, principalmente através de elementos em eis presentes, em geral, nas regiões não traduzidas (UTRs) dos mRNAs e de proteínas ligadoras de RNA (fatores em trans). As proteínas CCCH zínc fínger, caracterizadas por possuírem três resíduos de cisteína e um de histidina que coordenam um íon zinco na sequência C-X7;8-C-X5-C-X3-H, estão entre as proteínas ligadoras de RNA que promovem o controle do processamento, estabilidade, distribuição e tradução dos mRNAs. O objetivo do presente trabalho foi estudar o papel que proteína TcZC3H31 (a qual possui três domínios CCCH zínc fínger) desempenha durante o ciclo de vida do T. cruzí, usando técnicas como nocaute gênico, superexpressão e ribonômica. Essa proteína é expressa quase que exclusivamente nas formas epimastigota e tripomastigota metacíclico. Durante a divisão celular (G2, mitose e citocinese) de epimastigotas foram observadas estruturas com alta concentração dessa proteína, as quais não são observadas nos parasitas em na fase G1 do ciclo celular. Foram obtidos parasitas nocautes para esse gene, os quais foram incapazes de se diferenciar de epimastigota para a forma tripomastigota metacíclico, enquanto parasitas superexpressando TcZC3H31 se diferenciam com maior eficiência do que os parasitas selvagens, sugerindo que essa proteína é essencial para a diferenciação do T. cruzí. Ensaios de imunoprecipitação de RNA seguida de sequenciamento (experimentos de ribonômica) permitiram a identificação de mRNAs alvos dessa proteína. A maioria dos genes identificados nessa análise codificam proteíno-quinases. O padrão de expressão de alguns RNAs alvos foi avaliado por PCR quantitativa ao longo do ciclo de vida e nos parasitas mutantes obtidos. Através dessas análises foi possível identificar um grupo de 5 genes para os quais padrão de expressão acompanha ao da proteína TcZC3H31, ou seja, seus mRNAs estão aumentados quando a proteína está superexpressa e diminuídos quando a proteína está ausente (nocaute gênico). Palavras-chave: Trypanosoma cruzí. CCCH zínc fíngers. Regulação da expressão gênica. Regulação pós-transcricional. Metaciclogênese. / Abstract: The protozoan parasite Trypanosoma cruzí is the causative agent of chagas disease and presents unusual gene expression and organization features. For example, genes are arranged in polícístrons, transcripts are processed through a trans splícíng reaction, and their genome lacks the classic RNA Polymerase li promoters and encodes only a few transcription factors. Those features suggest that the differential regulation of gene expression, required for the complexity of their life cycle, is controled at the posttranscriptional level, mainly through eis contrai elements, which are generally present in the untranslated regions (UTRs) of mRNAs and trans-acting factors, such as RNAbinding proteins (RBPs). The CCCH zínc fínger proteins are characterized by the presence of three cystein and one histidine residues that coordinate the zinc ion in the motif C-X718-C-X5-C-X3-H. They are RNA binding proteins that contrai mRNA processing, stability, distribution and translation. The aim of the present work was to to examine the role that the TcZC3H31 (a three CCCH zínc fínger motifs-containing protein) plays during the life cycle of T. cruzí. TcZC3H31 is almost exclusively expressed in the epimastigote and metacyclic trypomastigote forms. During cell division (G2, mytose and cytokinesis phases) TcZC3H31 was concentrated in structures, which were not observed in the G1 phase. T. cruzí null mutant for TcZC3H31 gene is not able to undergo differentiation to metacyclic trypomastigote forms, whereas TcZC3H31- superexpressing parasites differentiate more efficiently than wild type counterpart. These data suggest that TcZC3H31 protein is essential for T. cruzí differentiation. RNA immunoprecipitation followed by sequencing (ribonomic assays) identified the TcZC3H31 mRNA targets. Most of them encode for protein kinases. The expression pattern of some targets through the life cycle and in the mutant parasites was measured by quantitative PCR. This analysis enabled the identification of a 5 genes group wich showed an expression pattern similar to the expression of TcZC3H31 protein, with an increase of these mRNAs in response to the protein overexpression and a decrease in the protein absence (gene knockout). Key words: Trypanosoma cruzí. CCCH zínc fíngers. Gene expression regulation. Postranscriptional regulation. Metacyclogenesis.

Made available in DSpace on 2015-05-22T12:36:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000468555-Texto+Completo-0.pdf: 8199104 bytes, checksum: 8319f77be38697b0864185d6a700fdf3 (MD5) Previous issue date: 2015 / Glioblastoma (grade IV) is among the most prevalent primary intracranial tumors and is considered a challenge in oncology and neurosurgery due to the highly aggressive nature, and the elevated mortality rates. The location of the tumor and its invasive nature avoid the standard-of-care therapy, which includes surgical resection followed by radiotherapy and chemotherapy. Nevertheless, the current gold standard treatment has not been effective to prevent tumor evolution, as indicated by the poor survival rates. In this context, we analyzed the GPCRs for kinin and the high-voltagegated calcium channels (VGCC) as feasible new therapeutic approaches in malignant gliomas. Thereby, the signaling triggered by bradykinin or the disruption of calcium signaling might contribute with pivotal mechanisms underlying glioma progression, such as cell proliferation. Therefore, the aim of this study was to further evaluate the relevance of B1 (B1R) and B2 (B2R) kinin receptors as well as the P/Q- and N-type VGCC in glioma development, by using in vitro and in vivo glioma model. Cell culture assay showed that the treatment with the selective B1R des-Arg9-BK (1-100 nM) and B2R BK (1-100 nM) agonists induced a marked enhancement of cell proliferation and viability through ERK1/2 and PI3K/Akt signaling, according to evaluation of U-138MG and U-251MG cell lines. Meanwhile, the incubation of either B1R SSR240612 (1-30 μM) or B2R HOE-140 (1-100 μM) antagonists induced a marked cell death with mixed apoptosis/necrosis characteristics. The in vivo mouse model of GL261-induced glioma of C57/BL6 or B1R and B2R knockout mice showed an uncontrolled tumor growing in KOB1R mice. Conversely, there was no significant change of the tumor development in KOB2R mice. Notably, the genetic ablation or the pharmacological combined antagonism of B1R and B2R (SSR240612; 25 nmol/site + HOE-140; 50 pmol/site) diminished the tumor progression as well as the mitotic index of the GL261-induced glioma. To understand the potential anti-tumor effects of the blockade of P/Q- and Ntype VGCC, we used animal-derived inhibitors namely PhTx3-3 (P/Q-type blocker) and Phα1β (N-type blocker) from P. nigriventer, or MVIIC (P/Q-type blocker) and MVIIA (N-type blocker) from C. magus. The PhTx3-3 (0. 3 - 100 pM), Phα1β (0. 3 - 100 pM) and MVIIA (0. 3 - 100 pM) displayed a significant inhibitory effect on proliferation and viability of M059J, U-138MG and U-251MG glioma tested cell lines, and evoked cell death mainly with apoptosis characteristics. In the glioblastoma in vivo model, the Ntype VGCC blockade by either Phα1β (50 pmol/site; i. c. v. and i. t. ) or MVIIA (10 pmol/site; i. c. v. ) caused significant reductions of glioma growth and progression. Of note, the N-type inhibition by Phα1β and MVIIA led to a marked increase of GFAPactivated astrocytes and Iba-1-positive microglia in the peritumoral area, which might be related to the inhibitory effects of immune system in tumor development. Using molecular and pharmacological approaches, our data provide clear evidence on the beneficial effects of the simultaneous inhibition of both B1R and B2R as well as the P/Q- and N-type blockade on glioma development. Thus, we propose that the combined selective antagonism of B1R and B2R, such as the P/Q-, and especially N type high-VGCC inhibition could markedly modify the tumor progression, which might represent an attractive alternative for the treatment of malignant gliomas in the future. / O glioblastoma apresenta a maior incidência entre todos os gliomas e se caracteriza como o mais agressivo e fatal (grau IV) dos tumores primários do SNC. Atualmente o glioblastoma é considerado uns dos grandes desafios da oncologia e da neurocirurgia, devido ao seu caráter altamente agressivo. A sobrevida média dos pacientes é bastante baixa e o prognóstico é desfavorável, já que a grande maioria destes tumores apresenta um padrão difuso e infiltrativo de crescimento, o que dificulta as abordagens atuais para a terapia tumoral. Neste estudo foram analisados os efeitos dos receptores da família dos GPCRs de cininas e dos canais de cálcio voltagemdependentes (CCVD) como base para possíveis alvos no tratamento dos gliomas malignos, a fim de caracterizar novas abordagens terapêuticas. O efeito da sinalização desencadeada pela BK e da sinalização Ca2+-dependente pode estar envolvida na regulação do crescimento e progressão dos gliomas e na migração das células tumorais. Neste sentido, este trabalho visou explorar o papel dos receptores B1 (B1R) e B2 (B2R) de cininas e da sinalização de Ca2+ via CCVD tipo-P/Q e -N em modelo de glioma in vitro e in vivo. Ensaios em cultura celular utilizando as linhagens de glioma humano U-138MG e U-251MG demonstraram que a ativação dos B1R e B2R pelo uso dos agonistas desarg 9-BK (1-100 nM) e BK (1-100 nM) aumentou a proliferação das linhagens celulares testadas, através da ativação das vias ERK1/2 e PI3K/Akt. Enquanto que a exposição aos antagonistas seletivos para estes receptores, SSR240612 (1-30 μM) e HOE-140 (1- 100 μM), provocou intensa morte celular com características de necrose/apoptose. A parte in vivo compreendeu a técnica de implante das células GL261 de glioma (grau IV) em animais C57/BL6 e knockout para os B1R e B2R. A deleção apenas do B1R provocou um importante crescimento tumoral nos animais knockout para este receptor, enquanto que os animais com deleção de B2R não tiveram o desenvolvimento tumoral alterado. Notavelmente, tanto a deleção gênica como o antagonismo farmacológico combinado dos receptores B1 e B2 (SSR240612; 25 nmol/sítio + HOE-140; 50 pmol/sítio) diminuiu o crescimento tumoral e o índice mitótico dos gliomas implantados. Para compreender o envolvimento dos CCVD tipo-P/Q e -N na fisiopatologia dos gliomas foram utilizadas frações da toxina da aranha Phoneutria nigriventer (PhTx3-3 bloqueadora de canais do tipo-P/Q; Phα1β bloqueadora de canais do tipo-N) e ω-conotoxinas provenientes do Conus magus (MVIIC bloqueadora de canais do tipo- P/Q; MVIIA bloqueadora de canais do tipo-N). Os experimentos in vitro evidenciaram que o bloqueio dos canais de Ca2+ tipo-P/Q e -N pelas toxinas PhTx3-3 (0. 3 - 100 pM), Phα1β (0. 3 - 100 pM) e MVIIA (0. 3 - 100 pM) inibiram a proliferação e a viabilidade das linhagens celulares M059J, U-138MG e U-251MG de glioma humano, com intensa característica de morte celular por apoptose. Os resultados utilizando o modelo de glioblastoma in vivo, demonstraram que ambas as toxinas bloqueadoras dos canais do tipo-N, Phα1β (50 pmol/sítio) e MVIIA (10 pmol/sítio), foram efetivas em diminuir o crescimento e a progressão tumoral nos animais tratados, com intensa ativação de astrócitos e micróglia, destacando o possível envolvimento do sistema imune na inibição do crescimento tumoral. Através do uso de ferramentas moleculares e farmacológicas, nossos resultados demonstraram o envolvimento importante tanto dos B1R e B2R de cininas, como dos CCVD tipo-P/Q e -N no desenvolvimento dos gliomas malignos. Desta maneira, podemos propor que o bloqueio farmacológico combinado de antagonistas seletivos para os receptores B1 e B2, assim como a inibição dos CCVD tipo-P/Q e -N surgem como potenciais alvos terapêuticos no manejo dos tumores cerebrais e podem representar alternativas promissoras no tratamento dos gliomas.

Made available in DSpace on 2015-05-22T12:36:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000468567-Texto+Completo-0.pdf: 3711593 bytes, checksum: 32dee061e07f3464cbf1a35564001f4c (MD5) Previous issue date: 2014 / Eucalyptus is an economically important woody species, especially as a raw material in many industrial sectors. Brazil ranks the second worldwide position in acreage, totalizing approximately three million hectares. Eucalyptus species are very susceptible to pathogens such as Botrytis cinerea (gray mold), which leads to mortality of cuttings in rooting phase. Biological control of plant diseases using soil microorganisms has been considered an alternative to reduce the use of pesticides and pathogen attack. Plant growth promoting rhizobacteria can act directly on plant development for production of phytohormones or indirectly as antagonists to pathogens, as well as promote changes in secondary metabolism, and hence inducing of systemic resistance. In this study, the direct roleof Streptomyces isolates in plant development was evaluated through the production of auxin and rhizogenic potential in Eucalyptus grandis and E. globulus plants, as well as indirectly, by modulation of the secondary metabolism, and induction of sistemic resistence in plantselicited with Streptomyces sp. and challenged with the pathogenic fungus B. cinerea. Metabolic responses were evaluated throughactivity of plant defense enzymes (PPO and POX) and induced secondary compounds (total phenolics and quercetinic-flavonoids fraction). The incidence and progression of gray mold disease on plants elicited Streptomyces sp. PM9, and coculture of these microorganisms (Streptomyces and B. cinerea) were also evaluated. Streptomyces sp. PM5 and PM9 isolates produced more auxin than the other isolates tested. Streptomyces sp. PM9 showed the highest rhizogenic potential on Eucalyptus sp. and modulated secondary metabolism of these plants. Antagonism of this isolated over B. cinerea was evidenced. Plants elicited with Streptomyces sp. PM9 and challenged with B. cinerea showed changes in PPO and POX enzymes and levels of phenolic compounds at different time points of analysis, which may be related to initial defense response. Phenolic compounds chlorogenic acid and gallic acid were, on average, the most abundant, while caffeic acid, benzoic acidand catechin were induced at specific time points. A delay in the onset of disease was significant in plants of E. grandis elicited with Streptomyces. The induction of resistance, disease delay and antagonism against B. cinereaindicate the capacity of Streptomyces sp. PM9 as an inducer of plant systemic resistance, and poses this microorganism as a potential candidate for biological control programs in nurseries of Eucalyptus. Interaction of rhizobacteria with eucalyptus plant, as well as the modulation of defense mechanisms may contribute to the establishment of new biocontrol strategies applied to forestry. / O eucalipto é uma espécie lenhosa economicamente importante, destacando-se como matériaprima em diversos setores industriais. O Brasil ocupa a segunda posição mundial em área plantada, totalizando aproximadamente três milhões de hectares. As espécies de eucalipto são muito suscetíveis a patógenos como Botrytis cinerea (mofo-cinzento), o qual leva à mortalidade de estacas em fase de enraizamento. O controle biológico de doenças em plantas utilizando microrganismos do solo tem sido considerado uma alternativa para reduzir o uso de agroquímicos e o ataque de patógenos. Rizobactérias promotoras de crescimento vegetal podem agir diretamente no desenvolvimento das plantaspela produção de fitormôniosou indiretamente, como antagonistas a fungos patogênicos, além de causar alterações no metabolismo secundário, com consequente indução de resistência sistêmica. Neste trabalho, avaliou-se a ação direta no desenvolvimento vegetal de isolados rizobacterianos do gênero Streptomyces através da produção de auxinas e potencial rizogênico de Eucalyptus grandis e E. globulus, bem como oefeito modulador no metabolismo secundárioe a indução de resistência sistêmica em plantas eliciadas com Streptomyces sp. e desafiadas com o fungo patogênico B. cinerea. As respostas metabólicas foram avaliadas através das atividades de enzimas realacionadas à defesa vegetal (PPO e POX) e dos compostos secundários induzidos (compostos fenólicos totais e fração flavonóides quercetínicos).A incidência e progressão da doença mofo cinzento em plantas eliciadas com Streptomyces sp. PM9, e cocultivo destes microrganismos (Streptomyces e B. cinerea) também foram avaliados. Os isolados de Streptomycessp. PM5 e PM9 apresentaram maior produção de auxina que os demais isolados testados. Streptomyces sp. PM9 apresentou o maior potencial rizogênico em plantas de Eucalyptus sp. emodulou o metabolismo secundário destas plantas. Oantagonismo deste isolado sobre B. cinerea foi evidenciado. As plantas eliciadas com Streptomyces sp. PM9 e desafiadas com B. cinereaapresentaram alterações nas enzimas PPO e POXe nos níveis de compostos fenólicos totais em diferentes tempos de análise, as quais foram relacionadas à resposta inicial de defesa. Os compostos fenólicos ácido gálico e clorogênico foram, em média, os mais abundantes, embora os ácidos cafeico e benzoico e a catequina tenham sido induzidos em momentos específicos. O retardo no estabelecimento da doença foi significativo em plantas de E. grandis eliciadas com Streptomyces. Os resultados de indução de resistência, retardo da doença eantagonismocontra B. cinerea, demonstram a capacidade de ação de Streptomycessp. PM9 como indutor de resistência sistêmica vegetal, colocando este microrganismo como potencial candidato aos programas de controle biológico em viveiros de mudas de Eucalyptus. A interação da planta de eucalipto com a rizobactéria, bem como a modulação dos mecanismos de defesa podem contribuir para o estabelecimento de novas estratégiasde biocontrole aplicado à silvicultura.

Made available in DSpace on 2015-05-22T12:36:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000468517-Texto+Completo-0.pdf: 6892081 bytes, checksum: c5aa659f71c5093d831d4810c3ab482c (MD5) Previous issue date: 2014 / The understanding of gene function in the externally visible characteristcs (EVC) expression has several uses in human population evolution studies or in forensic investigations. To this last, some effort has been done to discover an efficient and easy model for prediction of skin and eye color in humans. The obvious advantage of the prediction of such EVCs through the use of DNA is to be incorporated as routine in forensic labs and to be applied to police investigations. In our study we combined the genotyping of eight SNPs in pigment-related genes (rs4778138 - OCA2; rs12913832 - HERC2; rs16891982 - SLC45A2; rs8045560 - MC1R; rs1426654 - SLC24A5; rs2733832 - TYRP1; rs1042602 - TYR; rs916977 - HERC2) with different analytical approaches. Considering this SNP panel we evaluated allele frequencies from HAPMAP and ALFRED data obtained from subjects with High Melanin Content (HMC; from African populations), and Low Melanin Content (LMC; from European populations) and defined the alleles H (to predict HMC subjects) and alleles L (to predict LMC subjects). The cumulative distribution of alleles H and alleles L in two phenotypically different color groups of 134 South Brazilian subjects showed that 82% of HMC subjects (N = 61) had eight or more allele H and 100% of LMC subjects (N = 73) had less than eight allele H, with accuracy value of 96. 3%.We performed other analyses using AUC (Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve), PGL (Calculation of Pathway Genetic Load), and GP (Genetic Probability) approaches. The AUC was 0. 99 in predicting both HMC and LMC phenotypes; PGL showed the eight SNPs panel had 93% of concordance between genotype and HMC or LMC phenotypes; and GP approach showed 91% of concordance between prediction and HMC or LMC phenotypes. Our high-throughput genotyping technology combined with different analytical approaches reached very high accuracy to predict the extreme phenotypes of human pigmentation. We believe this forensic DNA phenotyping (FDP) technique would be particularly useful in cases in which the genetic profiles of crime scenes were not found in the DNA data banks or to help classify degraded cadavers skeletons, or biological clues of dismissed people. / A compreensão da função e expressão dos genes envolvidos nos traços externamente visíveis (EVC; do inglês externally visible characteristics) têm sido amplamente utilizada em vários estudos de evolução humana e investigações forenses. Para este último propósito, vários esforços têm sido feitos para descobrir um modelo eficiente e fácil para a predição da cor da pele e dos olhos em seres humanos. A vantagem óbvia da predição de tais EVCs, através da utilização do DNA, é sua incorporação na rotina em laboratórios forenses, sendo assim aplicada em investigações policiais. Em nosso estudo, relacionamos o genótipo de oito SNPs em genes relacionados com a pigmentação (rs4778138 - OCA2; rs12913832 - HERC2; rs16891982 - SLC45A2; rs8045560 - MC1R; rs1426654 - SLC24A5; rs2733832 - TYRP1; rs1042602 - TYR; rs916977 - HERC2) com diferentes abordagens analíticas. Este painel de SNPs considerou as frequências alélicas obtidas de dados do HapMap e Alfred a partir de indivíduos com Alto Conteúdo de Melanina (HMC; do inglês High Melanin Content; a partir de populações africanas), e Baixo Conteúdo de Melanina (LMC; do inglês Low Melanin Content; a partir de populações europeias) e definiu os alelos H (para predizer os HMC) e alelos L (para predizer os LMC). A distribuição cumulativa dos alelos H e L nos dois grupos com características de pigmentação fenotipicamente distintas, dos 134 indivíduos da nossa população, mostrou que 82% dos indivíduos HMC (N = 61) tinham oito ou mais alelos H e 100% dos indivíduos de LMC (N = 73) tinham menos de oito alelo H, com o valor de precisão de 96,3%.Outras abordagens como AUC (do inglês; Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve), cálculo de PGL (do inglês; Pathway Genetic Load) e GP (do inglês; Genetic Probability) foram realizadas. A análise AUC foi de 0,99 tanto para a predição fenotípica dos HMC quanto LMC; as análises PGL, para o painel com 8 SNPs, teve 93% de concordância genótipo-fenótipo nos HMC ou LMC; e a abordagem GP mostrou 91% de concordância para predição dos fenótipos HMC e LMC. Nossa tecnologia de genotipagem de alto rendimento, combinada com diferentes abordagens analíticas, chegou a uma precisão muito alta para predizer os fenótipos extremos de pigmentação humana. Acreditamos que esta técnica de fenotipagem forense pelo DNA (FDP; do inglês forensic DNA phenotyping), seria particularmente útil nos casos em que os perfis genéticos de locais de crime não fossem encontrados no bancos de dados de DNA ou para ajudar a classificar cadáveres degradados, esqueletos, ou vestígios biológicos de pessoas desaparecidas.