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Together with the current antibiotic resistance crisis, bacterial persistence appears to play an increasingly important role in the frequent failure of antibiotic treatments. Persister cells are rare bacteria that transiently become drug tolerant, allowing them to survive lethal concentrations of bactericidal antibiotics. Upon antibiotic removal, persister cells are able to resume growth and give rise to a new bacterial population as sensitive to the antibiotic as the original population. Interest in persister cells seriously increased in the past few years as these phenotypic variants were shown to be involved in the recalcitrance of chronic infections, such as tuberculosis and pneumonia and in the well-known biofilm tolerance to antibiotics. Persistence has therefore been extensively studied throughout the last decade, which led to the discovery of large variety of different molecular mechanisms involved in persisters formation. However, the specific physiology of bacterial persisters remains elusive up to now, mainly because of the transient nature and the low frequencies of persister cells in growing bacterial cultures. This work aims to gain a better understanding of the physiology of Escherichia coli persisters by combining population analyses with single-cell observations.In the first part of this thesis, we developed an experimental method allowing for measuring persistence with increased reproducibility. The method was further refined, which allowed us to observe four distinct phases in the ofloxacin time-kill curve, suggesting the existence of a tolerance continuum at the population level at treatment time. Characterization of these four phases notably revealed that the growth rate and the intrinsic antibiotic susceptibility of the strain define the number of surviving cells at the onset of the persistence phase, while persister cells survival mainly relies on active stress responses (SOS and stringent responses in particular).We next investigated the molecular mechanisms underlying the well-known correlation between persistence and the growth rate. Interestingly, we showed that the growth rate determines the number of survival cells at the onset of the persistent phase, whereas it does not affect the death rate of persister cells during antibiotic treatment. Furthermore, slow growth was shown to influence survival to ofloxacin independently of the replication rate, thereby suggesting that target inactivation solely cannot explain this correlation. However, our preliminary data indicate that ppGpp induction upon ofloxacin exposure substantially increases in slow growing bacterial populations, supporting a model in which slow growth would allow bacteria to respond faster to the antibiotic treatment, thereby generating more persisters than fast growing bacterial populations.Finally, both population and single-cell analyses were performed to assess the influence of the SOS response on persistence to ofloxacin. Firstly, population analyses revealed that the SOS response is required for survival of both sensitive and persister cells, but only during recovery, after ofloxacin removal, presumably allowing cells to induce SOS-dependent DNA repair pathways, required to deal with the accumulated ofloxacin-induced DNA lesions. The SOS response therefore appears as a good target for anti-persisters strategies, as shown by the 100-fold decrease in persistence upon co-treatment of a bacterial population with an SOS-inhibitor and ofloxacin. Secondly, single-cell analyses revealed that persister cells sustain similar DNA damages than sensitive cells upon ofloxacin treatment and induce SulA- and SOS-independent filamentation upon antibiotic removal, probably reflecting the presence of remaining cleaved complexes, formed during ofloxacin exposure. Importantly, we showed filamentation to occur in persister cells upon ampicillin treatment as well, thereby suggesting these filaments to be part of a more general survival pathway, which molecular basis remains unknown. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The accurate maintenance of genomic integrity in stem cells (SCs) is essential for tissue homeostasis and its deregulation leads to developmental defects, cancer and ageing. We have shown that Brca1, key homologous recombination (HR) gene and critical regulator of the choice of the DNA double strand break (DSB) repair pathway, is specifically required for hair follicle formation and the establishment and maintenance of adult hair follicle SC pool in a conditional knock-out (CKO) mouse model. Brca1 loss leads to DNA damage-induced cell death in the hair follicle (HF), particularly in the matrix transient amplifying progenitors and moderately so in prospective quiescent adult HF SCs. This cell loss causes compensatory hyper-proliferation of the prospective HF SCs and their subsequent depletion. In striking contrast, the interfollicular epidermis (IFE) and its resident SCs remain unaffected by Brca1 deletion. I uncovered two mechanisms underlying the ability of the SCs and progenitors of the IFE to survive the deletion of Brca1. Collectively, this data reveals how distinct SCs and progenitors respond differently to Brca1 loss. Furthermore we show how the IFE can survive Brca1 loss through the use of two particular mechanisms as to sustain tissue homeostasis. The mechanisms uncovered here are likely to be relevant in other tissue-specific SCs and will have important implications in understanding cancer initiation and ageing. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La présente thèse s’intéresse à l’histoire de la forêt tropicale Africaine de la région Guinéo-Congolaise (GC), plus particulièrement à l’histoire de sa fragmentation au niveau de la trouée du Dahomey ou Dahomey Gap (DG). Le DG est un corridor de savanes situé au niveau du sud Bénin et Togo et qui sépare la forêt GC en deux blocs :le bloc d’Afrique de l’ouest (WA) ou Haut Guinéen (UG) et le bloc d’Afrique centrale (CA), phytogéographiquement constitué du Bas Guinéen (LG) à l’ouest et du Congolais (C) à l’est. En effet, Les études de reconstitution des paléo-végétations dans le DG ont révélé que la forêt GC formait un seul bloc durant certaines phases interglaciaires et aurait subi une fragmentation durant les phases glaciaires. De plus, les études botaniques et phytogéographiques de la végétation actuelle du Bénin et du Togo (DG) ont révélé la présence d’îlots de forêts denses semi-décidues, de galeries forestières et de forêts riveraines qui contiennent des espèces typiques des forêts denses humides GC. Ces données pointent le rôle de barrière intermittente joué par le DG, mais on connaît mal l’origine de ces espèces GC du Dahomey Gap ni les conséquences évolutives des changements démographiques passés sur la diversité génétique de leurs populations. L’objectif principal de cette thèse est donc de déterminer avec une approche pluridisciplinaire l’origine des populations d’espèces GC du Dahomey Gap en vue de mieux comprendre l’histoire de la fragmentation de la forêt GC au niveau du DG et l’impact des changements climatiques passés sur la diversité intraspécifique. Pour atteindre cet objectif, au niveau interspécifique, (1) les patrons de diversité et de distribution géographique des espèces GC du DG ont été analysés afin de déterminer l’affinité ou origine WA et/ou CA de ces espèces. Ensuite, au niveau intraspécifique des données de microsatellites nucléaires et de génome chloroplastique entier ont été acquises afin de réaliser des analyses de diversité génétique, de phylogéographie et de l’histoire démographique des populations chez trois espèces d’arbres GC présentes dans le DG :Anthonotha macrophylla, Distemonanthus benthamianus et Terminalia superba. Pour chaque espèce nous avons tenté de déterminer (2) si les populations du DG de ces espèces se distinguent génétiquement des populations forestières, (3) si il y a des signatures génétiques de changements démographiques au sein des populations (changement de taille, fragmentation, fusion), (4) quelle est l’origine et la période d’installation des populations actuelles du DG et (5) quelles sont les capacités de dispersion des gènes et leur potentiel de colonisation. L’étude des patrons de diversité et de distribution géographique de la flore GC du DG montre que cette flore est partagée à 67 % par les deux blocs forestiers, mais qu’une plus grande proportion de ces espèces a une origine ou affinité CA (19,7%) que WA (13,3%). Elle montre aussi un patron est-ouest attendu (proportion d’espèces WA croissante vers l’ouest du DG), mais aussi nord-sud au niveau du Bénin (plus d’espèces WA vers le nord) suggérant le rôle potentiel de la chaîne de l’Atacora dans la colonisation du nord du DG par des espèces du UG.Au niveau génétique, les données de microsatellites nucléaires et de plastome montrent une forte structure génétique et une discontinuité génétique au sein des trois espèces séparant la population du DG avec celles des zones forestières indiquant une barrière passée au flux de gènes (1 pool génétique dans le DG, 1 pool génétique dans le WA et 3 pools génétiques dans le CA ou LG ;avec les données microsatellites nucléaires). Les inférences démographiques sur base des mêmes données microsatellites soutiennent le scénario d’origine par mélange de la population du DG pour les espèces D. benthamianus et T. superba tandis que pour A. macrophylla, c’est plutôt une origine CA. Les données de plastome quant à elles, soutiennent que la population du DG provient de la lignée LG (notamment depuis la ligne volcanique du Cameroun) des deux espèces D. benthamianus et A. macrophylla. Ce résultat concorde avec celui obtenu avec les données microsatellites de A. macrophylla mais pas pour D. benthamianus, laissant ainsi penser que l’origine de mélange obtenu pour cette espèce pourrait être due à un flux de gènes intense depuis le UG. Les datations à partir des données microsatellites nucléaires montrent que l’installation des populations des espèces T. superba et A. macrophylla date d’avant le Dernier maximum glaciaire (DMG), suggérant que certaines espèces GC du DG auraient survécu au DMG. Pour D. benthamianus, la population du DG proviendrait plutôt d’une colonisation post glaciaire notamment lors de l’Holocène humide. Cette étude montre aussi que les populations du DG des différentes espèces présentent une faible diversité génétique comparativement aux zones forestières. Cette faible diversité génétique est congruente avec le déclin de la taille efficace suivi d’une dérive génétique pour A. macrophylla et T. superba, et avec l’effet de fondation ou un goulot d’étranglement suivi d’une dérive génétique pour D. benthamianus; obtenus à partir des analyses démographiques.En conclusion, cette étude doctorale révèle donc la particularité génétique de la population du DG des trois modèles étudiés et supportent une origine LG (probablement depuis la ligne volcanique du Cameroun) de la population du DG de ces espèces avec un flux de gènes intense depuis le UG. Elle pointe aussi que la réponse des espèces GC du DG aux changements climatiques passées pourrait n’avoir pas été synchrone, probablement en raison de l’écologie de chacune des espèces. Les fragments forestiers du DG devraient faire l’objet d’attention particulière de conservation car, il n’est pas exclu que malgré leur faible diversité, les populations du DG aient subit une sélection génétique et qu’elles soient plus adaptées aux conditions climatiques sèches du DG, dans quel cas elles représentent une ressource phytogénétique potentiellement importante. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Movement is a prerequisite for normal fetal development and growth. Intrauterine movement restrictions cause a broad spectrum of disorders in which the unifying feature is a reduction or lack of fetal movement, giving rise to the term fetal akinesia deformations sequence (FADS [OMIM 208150]). FADS corresponds to a clinically and genetically heterogeneous constellation of properties and is characterized by multiple joint contractures, facial abnormalities, and lung hypoplasia as a result of the decreased in utero movement of the fetuses. Affected babies are often prematurely and stillborn, and those born alive typically die within minutes or hours after birth. The genetic causes for this fatal disorder are ill-defined as a genetic diagnosis is rarely executed, but mutations in three genes, namely RAPSN, DOK7, and MUSK, as well as in the subunits of the muscular nicotinic acetylcholine receptor (AChR) have been described. These mutations are thought to affect neuromuscular junctions, although this has not been proven experimentally.The nucleoporin NUP88 is a constituent of the nuclear pore complex (NPC), the gate for all trafficking between the nucleus and the cytoplasm. NUP88 resides on both the cytoplasmic and the nuclear side of NPCs, and it is found in two distinct subcomplexes. It associates with NUP214 and NUP62 on the cytoplasmic face, while on the nuclear side NUP88 binds NUP98 and the intermediate filament protein lamin A. The NUP88-NUP214-NUP62 complex plays an essential role in the nuclear export of a subset of proteins and pre-ribosomes, which is mediated by the nuclear export receptor CRM1. NUP88 in particular somewhat participates in the nuclear export of NF-κB proteins in a CRM1-dependent manner. Moreover, NUP88 is frequently overexpressed in a variety of human cancers, and its role in cancer appears linked to the deregulation of the anaphase-promoting complex. Here, we report the first Mendelian disorders caused by mutations in NUP88 and with that the first lethal developmental human disease due to mutations in a nuclear pore component. We demonstrate that biallelic mutations in NUP88 are likely to cause fetal akinesia of the Pena-Shokeir subtype. We confirm in zebrafish that loss of NUP88 impairs movement and the mutations identified in the affected individuals resemble a loss-of-function phenotype. We show that loss of NUP88 affects expression and localization of rapsyn, the protein encoded by RAPSN, in human and mouse cell lines, and patient samples. Consistent with altered rapsyn, AChR clustering and neuromuscular junction formation in zebrafish are abnormal. We therefore propose that defective NUP88 function cause FADS by affecting neuromuscular junction formation.Keywords: Nuclear pore complex, NUP88, Fetal Akinesia Deformation Sequence, rapsyn, acetylcholine receptor clustering, synaptic transmission, fetal development, inherited developmental disorder. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les dinoflagellés sont un groupe très varié d’eucaryotes unicellulaires principalement retrouvés en milieu marin où ils ont un rôle écologique majeur dans la production primaire des océans et dans la formation des récifs coralliens. Ils sont aussi responsables de phénomènes néfastes comme les marées rouges et la production de toxines qui contaminent les crustacées et les poissons lorsque les conditions sont propices à leur multiplication rapide. Ces organismes possèdent des caractéristiques moléculaires uniques chez les eucaryotes, particulièrement en ce qui a trait au noyau. Le génome des dinoflagellés s’y retrouve condensé sous forme de cristal liquide stabilisé par des cations métalliques plutôt que sous forme de nucléosomes organisés par des histones. Cette forme condensée persiste tout au long du cycle cellulaire et limite la transcription des gènes à des boucles d’ADN qui se retrouvent à la périphérie des chromosomes. Ces caractéristiques inhabituelles, jumelées à une taille souvent imposante de leur génome, ont grandement limité l’étude des mécanismes moléculaires de base comme la régulation de la transcription. Afin de mieux caractériser ce processus chez ces organismes, le dinoflagellé Lingulodinium polyedrum, qui est étudié majoritairement pour ses multiples rythmes circadiens, a été utilisé. Tout d’abord, le séquençage à haut-débit a été utilisé afin de caractériser le transcriptome complet de l’organisme à quatre temps différents au cours d’une journée. De façon surprenante, ce séquençage a montré que très peu des transcrits varient entre les temps et que ces variations sont de faible amplitude, ce qui contraste fortement avec les résultats obtenus chez d’autres groupes d’organismes. Une inhibition pharmacologique de la transcription a aussi été effectuée et montre que les rythmes de photosynthèse et de bioluminescence continuent d’osciller de façon circadienne en absence de transcription. Ces résultats suggèrent que le modèle traditionnel de génération des rythmes circadiens par des boucles de rétroaction transcription/traduction est probablement absent chez Lingulodinium. La deuxième approche consiste en la caractérisation de deux protéines à domaine cold-shock (CSD), un domaine d’origine bactérienne qui est fortement surreprésenté chez les dinoflagellés et annoté comme potentiel facteur de transcription. Ces deux protéines ont une préférence pour la liaison de l’ADN simple brin versus l’ADN double brin tout en étant ii capable de lier de l’ARN. Par ailleurs, ces liaisons aux acides nucléiques ne sont pas spécifiques à une séquence particulière. L’analyse de leur abondance après un passage prolongé en condition froide n’a pas permis de déceler une augmentation importante de l’abondance des deux protéines et celles-ci sont également incapable de complémenter un quadruple mutant des protéines cold-shock chez E. coli. Ces données suggèrent que les CSDs des dinoflagellés ne sont probablement pas des facteurs de transcription séquence-spécifique et qu’ils ont également une fonction différente des protéines bactériennes. La troisième approche consiste en la réticulation in vivo des protéines interagissant avec la chromatine. Après réticulation, la chromatine a été purifiée et les protéines associées à ceux-ci ont été extraites et identifiées par spectrométrie de masse. Parmi les protéines identifiées, il y a un nombre réduit de protéines de liaison à l’ADN en comparaison avec des données similaires chez les animaux. Des peptides provenant d’une histone H4 ont aussi été identifiés, ce qui consiste en une des premières identifications de ce type de protéine chez les dinoflagellés. Plusieurs protéines de liaison à l’ARN ont été identifiées et pourraient permettre de réguler diverses étapes de la biologie des ARNm et ainsi moduler la traduction. Quelques protéines reliées au contrôle du cycle cellulaire et à la réparation de l’ADN ont aussi été identifiées. Mises ensemble, ces trois approches permettent de suggérer que la régulation de la transcription et de l’abondance des ARNm semblent avoir une importance moindre chez les dinoflagellés que chez les autres eucaryotes. / Dinoflagellates are a diverse group of unicellular eukaryotes found in marine habitat where they have a major role in the primary production of the ocean and in the formation of coral reefs. They are also responsible for some of the harmful algal blooms whose toxin production can contaminate crustacean and fish. Dinoflagellates possess unique molecular characteristics in eukaryotes, especially for their nucleus. For example, their genome is found in a permanently condensed liquid crystalline state stabilized by metallic cations instead of the nucleosome organized by histones. This condensed form persists throughout the cell cycle and limits transcription to DNA loops localized at the periphery of the chromosomes. These unusual characteristics, coupled with a generally large genome size, have greatly limited the study of basic molecular mechanisms such as transcription regulation. In order to better characterize this process for the dinoflagellates, I used Lingulodinium polyedrum, a dinoflagellate studied extensively for its circadian rhythms. As a first approach, high-throughput sequencing was used to characterize the complete transcriptome of the organism at four different times throughout the day. Surprisingly, this sequencing revealed that an extremely low number of transcripts vary in abundance between time points and that those variations are of low amplitude, a result in stark contrast with what has been observed in other organisms. A pharmacological inhibition of transcription was also done and shows that bioluminescence and photosynthesis rhythms persist in absence of transcription, suggesting that the classical transcription/translation feedback loop used to generate rhythmic timing in eukaryotes is probably absent in Lingulodinium. The second approach was the characterization of two proteins with a cold-shock domain (CSD), a type of domain strongly overrepresented in dinoflagellates and predicted to be a potential transcription factor. Those two proteins showed a preferential binding to single stranded DNA versus double stranded DNA while also being able to bind RNA, and were not specific to a particular sequence. Protein abundance analysis after a prolonged cold shock did not yield a massive increase in the abundance of those two proteins, as seen in E. coli. Furthermore, neither protein was able to complement a quadruple cold shock protein (CSP) mutant in E. coli. Data gathered here suggest that CSD proteins in dinoflagellates are probably iv not sequence-specific transcription factors and may also have a function different from bacterial CSP. The third approach consisted of the in vivo cross-linking of chromatin-interacting proteins. After cross-linking, the chromatin was purified and the proteins associated with it extracted and identified by mass spectrometry. Of the identified proteins, few DNA binding proteins were found, unlike similar studies done in animals. Peptides derived from a histone H4 were discovered, one of the first instances of histone identification in dinoflagellates. Multiple proteins able to bind RNA have been identified and could be used to regulate multiple steps of RNA biology and therefore modulate RNA translation. Some proteins related to cell cycle control and DNA repair were also identified. Taken together, these three approaches support the view that the transcriptional regulation and control over mRNAs abundance seem to have a lower importance in dinoflagellate than in other eukaryotes.

Les racines ont deux grands rôles. Le premier est le prélèvement de l’eau et des éléments nutritifs et le second est l’ancrage dans le sol. Identifier les gènes responsables de la mise en place des tissus et de l'architecture du système racinaire est donc essentiel pour pouvoir améliorer les variétés de riz soumises à des stress abiotiques de plus en plus fréquents et nombreux du fait du changement climatique. Au cours de cette thèse, j'ai réalisé une analyse fonctionnelle du gène DEFECTIVE IN OUTER CELL LAYER SPECIFICATION (DOCS1) qui appartient à la famille des récepteurs kinases à répétitions riches en leucine (LRR-RLK). Ces protéines sont composées de deux domaines principaux: un domaine extra-cytoplasmique composé de répétitions LRR et un domaine kinase intra-cytoplasmique. Un mutant de ce gène, nommé c68, possède une mutation non-sens dans le domaine kinase. Les plantes mutantes c68 présentent plusieurs phénotypes: une sensibilité accrue à l'aluminium, une réduction du nombre et de la taille des poils absorbants dans les racines, et des couches d’exoderme/épiderme d’identité mêlée. Le premier chapitre de la thèse porte sur l’étude conjointe de lignées knock-out CRISPRs du gène DOCS1 et de c68. Nos résultats ont montré que les mutants c68 et CRISPRs présentaient les mêmes phénotypes : sensibilité à l’aluminium, défauts des poils absorbants et tissus externes d’identité mixte. Ces résultats suggéraient que chez le mutant c68, soit la protéine DOCS1 n'était pas fonctionnelle, soit elle n'était pas traduite. Nos analyses phénotypiques ont aussi révélé que tous les mutants présentaient des défauts de réponse à la gravité à différents stades de développement. A 3 jours, un retard de réponse à la gravité était observé pendant la première heure après gravistimulation. Les plantules mutantes présentaient aussi des défauts de localisation d’un transporteur d’auxine. A 40 jours, nous avons observé que l'angle du cône racinaire des plantes mutantes était plus ouvert que celui des plantes sauvages. Deux gènes liés à l’auxine et plusieurs QTLs ont déjà été identifiés comme participant à ce phénotype chez le riz. Dans la suite de notre étude, nous avons donc cherché à identifier de nouveaux QTLs et gènes impliqués dans ce phénotype morphologique par étude d'association pan-génomique dans deux panels Indica et Japonica. Toutes les accessions de l'écotype bulu d'Indonésie et trois japonicas tempérés d'Asie du Sud présentaient un angle du cône racinaire très ouvert. En utilisant un modèle mixte associé à une technique de ré-échantillonnage, 55 QTLs ont été détectés. L'analyse des gènes sous-jacents ou voisin (+/- 50kb) a identifié 539 gènes, dont 6 LRR-RLK, 5 gènes liés à l’auxine et 5 gènes avec une fonction validée dans le développement ou l'architecture racinaire. Une approche complémentaire par cartographie génétique classique est proposée pour identifier les gènes en cause dans la ou les mutations à angle du cône racinaire très ouvert. Des perspectives de poursuite du travail effectué sont aussi présentées afin de déterminer si le phénotype affectant l'angle du cône racinaire induit par les mutations du gène DOCS1 ou des nouveaux gènes identifiés est lié à des perturbations des flux d’auxine. / Roots have two major roles. The first one is to uptake water and nutrients and the second one is to anchor plants into the ground. Identifying the genes responsible for the establishment of tissues and architecture of the root system is essential to improve rice varieties subject to increasingly frequent and numerous abiotic stresses due to climate change. During my PhD, I undertook a functional analysis of the DEFECTIVE IN OUTER CELL LAYER SPECIFICATION (DOCS1) gene which belongs to the Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinase (LRR-RLK) family. These proteins are composed of two main domains: an extra-cytoplasmic domain containing LRR repeats and a cytoplasmic kinase domain. A mutant of this gene, named c68, carries a nonsense mutation in the kinase domain. The c68 mutant plants show several phenotypes: increased sensitivity to aluminum, reduced number and size of root hairs, and layers of external tissues with exodermis/epidermis mixed identity. The first chapter of the thesis focuses on the joint study of knockout CRISPRs lines of the DOCS1 gene and c68. Our results showed that the c68 and CRISPRs mutants displayed the same phenotypes: sensitivity to aluminum, defects in root hairs and mixed identity of external tissues. These results suggested that in the c68 mutant, either the DOCS1 protein was not functional, or the protein was not translated. Our phenotypic analyses also showed that all mutants exhibited impaired gravity responses at different development stages. At 3 days, a delay of response to gravity was observed during the first hour after gravistimulation. Mutant seedlings also had defects in an auxin transporter localization. At 40 days, we observed that the root cone angle of mutant plants was more open than that of wild-type plants. Two genes associated with auxin and several QTLs have been identified as contributing to this phenotype in rice. In the rest of our study, we therefore tried to identify new QTLs and genes involved in this morphological phenotype by a genome-wide association study in two Indica and Japonica panels. All accessions of the bulu ecotype from Indonesia and three South Asian temperate japonica had a very open root cone angle. Using a mixed model associated with a resampling technique, 55 QTLs were detected. The analysis of the underlying or neighbor (+/- 50kb) genes identified 539 genes, including 6 LRR-RLK, 5 genes related to auxin and 5 genes with a function validated in root development or architecture. A complementary approach by classical genetic mapping is proposed to identify genes involved in the mutation(s) involved in very open root cone angle. Prospective research lines are also presented to determine if the root cone angle phenotype , induced by DOCS1 or by newly identified genes, is linked with disruption of auxin fluxes.

La morphologie des cellules et leurs interactions avec l’environnement découlent de divers procédés mécaniques qui contribuent à la richesse et à la diversité de la vie qui nous entoure. À titre d’exemple, les cellules mammifères se conforment à différentes géométries en fonction de l’architecture de leur cytosquelette tandis que les bactéries et les levures adoptent une forme circulaire par turgescence. Je présente, dans cette thèse, la découverte d’un mécanisme de morphogénèse supplémentaire, soit la déformation de surface cellulaire via l’assemblage de protéines par démixtion de phases aqueuses non miscibles et l’adhésion entre les matériaux biologiques. J’expose de façon spécifique comment ce mécanisme régule le recrutement et le mouvement dynamique des protéines qui induisent l’invagination de la membrane plasmique lors de l’endocytose clathrine-dépendante (CME). Le phénomène de démixtion des protéines dans le cytoplasme est analogue à la séparation de phase de l’huile en solution aqueuse. Il constitue un mécanisme cellulaire important et conservé, où les protéines s’agglomèrent grâce aux interactions intermoléculaires qui supplantent la tendance du système à former un mélange homogène. Plusieurs exemples de compartiments cellulaires dépourvus de membrane se forment par démixtion de phase, tels que le nucléole et les granules de traitement de l’ARN [1-6]. Ces organes ou compartiments dénommés NMO, du terme anglais « non-membranous organelles », occupent des fonctions de stockage, de traitement et de modification chimique des molécules dans la cellule. J’explore ici les questions suivantes : est-ce que les NMO occupent d’autres fonctions à caractère morphologique ? Quels signaux cellulaires régulent la démixtion de phase des protéines dans la formation des NMO ? Fondée sur la physique mécanique du contact entre les matériaux, j’émets l’hypothèse que des compartiments cellulaires nanoscopiques, formés par démixtion de phase, génèrent des forces mécaniques par adhésion interfaciale. Le travail mécanique ainsi obtenu déforme le milieu cellulaire et les surfaces membranaires adjacents au NMO nouvellement créé. Le but de mon doctorat est de comprendre comment les cellules orchestrent, dans le temps et l’espace, la formation des NMO associés au CME et comment ceux-ci génèrent des forces mécaniques. Mes travaux se concentrent sur les mécanismes de démixtion de phase et d’adhésion de contact dans le processus d’endocytose chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Pour enquêter sur le rôle des modifications post-traductionnelles dans ces mécanismes, nous avons premièrement analysé la cinétique de phosphorylation des protéines en conditions de stress. Mes résultats démontrent que le recrutement et la fonction de certaines protéines impliquées dans le CME se régulent via des mécanismes de phosphorylation. Outre les processus de contrôle post-traductionnel, nous avons élucidé le rôle des domaines de faible complexité dans l’assemblage de plusieurs protéines associées avec le CME. De concert avec les modifications de phosphorylation, des domaines d’interaction protéine-protéine de type PrD (du terme « prion-like domains ») modulent directement le recrutement des protéines au sein des NMO associés au CME. La nature intrinsèquement désordonnée de ces PrD favorise un mécanisme d’assemblage des protéines par démixtion de phase tel que postulé. Finalement, mes travaux confirment que la formation de ces NMO spécifiques génère des forces mécaniques qui déforment la membrane plasmique et assurent le processus de CME. D’un point de vue fondamental, mes recherches permettent de mieux comprendre l’évolution d’une stratégie cellulaire pour assembler des compartiments cellulaires sans membrane et pour fixer les dimensions biologiques associées au CME. De manière plus appliquée, cette étude a le potentiel de générer des retombées importantes dans la compréhension et le traitement de maladies neurodégénératives souvent associées à une séparation de phase aberrante et à la formation d’agrégats protéiques liés à la pathologie. / Evolution has resulted in distinct mechanical processes that determine the shapes of living cells and their interactions with each other and with the environment. These molecular mechanisms have contributed to the wide variety of life we observe today. For example, mammalian cells rely on a complex cytoskeleton to adapt specific shapes whereas bacteria, yeast and plants use a combination of turgor pressure and cell walls to have their characteristic bloated form. In this dissertation, I describe my discovery of an unforeseen additional mechanism of morphogenesis: protein aqueous-aqueous phase separation and adhesive contact between biomaterials as a simple and efficient ways for cells to organize internal matter and accomplish work to shape internal structures and surfaces. I specifically describe how a fundamental process of phospholipid membrane and membrane-embedded protein recycling, clathrin-mediated endocytosis (CME), is driven by this mechanism. Analogous to water and oil emulsions, proteins, and biopolymers in general, can phase separate from single to a binary aqueous phase. For proteins that de-mix from the bulk environment, the intermolecular interactions (or cohesive energy) that favors protein condensation only needs to overcome the low mixing entropy of the system and represents a conserved and energy efficient cellular strategy [2, 3, 7, 8]. So far, various examples of phase separated cellular compartments, termed non-membranous organelles (NMOs), have been discovered. These include the nucleoli, germ line P granules and P bodies, to name a few [1-6]. NMOs are involved in many conserved biological processes and can function as storage, bioreactor or signaling bodies. Cells use phase separation as a scheme to organize internal matter, but do NMOs occupy other complex functions, such as morphogenesis? What specific signals trigger protein phase separation? Based on mechanical contact theory, I proposed that hundreds of nanometer- to micron-scale phase separated bodies can deform the cellular environment, both cytoplasm and membranes, through interfacial adhesion. I studied how mechanical contact between a phase-separated protein fluid droplet and CME nucleation sites on membranes drive endocytosis in the model organism budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. Specifically, this dissertation describes first, my investigations of post-translational modifications (phosphorylation) of several CME-mediating proteins and the implications of these modifications in regulating CME. I then describe how my efforts to understand what was distinct about the proteins that are phosphorylated led me to propose their phase separation into droplets capable of driving invagination and vesicle formation from plasma membrane. I used fluorescence microscopy, mass spectrometry and micro rheology techniques to respectively determine the spatiotemporal dynamics, phosphorylation modifications and material properties of coalesced CME-mediating proteins. I further investigated how phase separation of these proteins might generate mechanical force. I demonstrate that changes in the phosphorylation of some endocytic proteins regulates their recruitment to CME nucleation sites. We achieved reliable predictions of functional phosphosites by combining information on the conservation of the post-translational modifications with analysis of the proportion of a protein that is dynamically phosphorylated with time. The same dynamically phosphorylated proteins were enriched for low amino acid compositional complexity “prion-like domains”, which we demonstrated were essential to these proteins undergoing aqueous-aqueous phase separation on CME nucleation sites. I then demonstrate how phase separated droplet can produce mechanical work to invaginate membranes and drive CME to completion. In summary, I have discovered a fundamental molecular mechanism by which phase separated biopolymers and membranes could apply work to shape each other. This mechanism determines the natural selection of spatial scale and material properties of CME. Finally, I discuss broader implications of this dissertation to mechanistic understandings of the origins of neurodegenerative diseases, which likely involve pathological forms of protein phase separation and/or aggregation.

Malgré de nombreux progrès réalisés dans les traitements des cancers gynécologiques, ceux-ci demeurent la principale cause de mortalité due au cancer chez la femme. Les instabilités chromosomiques et génomiques au niveau du locus 3p21.3 sont des événements fréquents liés à des cancers épithéliaux, notamment les cancers du sein et de l'ovaire. C’est dans cette région que se trouvent les gènes hyaluronidases HYAL-1, HYAL-2 et HYAL-3. HYAL-1 est particulièrement surexprimé dans plusieurs cancers, notamment, le cancer de la prostate, la vessie, le cou, la tête et le sein où il est impliqué dans la progression tumorale et les métastases. Nous avons démontré que dans le locus 3p21.3, HYAL-1 est un gène cible sélectivement réprimé par ERα et l’estrogène. L’analyse de la cohorte METABRIC a révélé une corrélation inverse significative entre l’expression du gène HYAL-1 et ERα. Nous avons identifié des sites de liaison pour ERα au niveau du locus 3p21.3, parmi eux, un ERE proximal était responsable de la répression de HYAL-1 par ERα en plus d’un site Sp-1 requis pour atteindre une répression optimale. Cette répression de HYAL-1 est accompagnée par un enrichissement de la marque répressive H3K27me3 au niveau des deux sites ERE et Sp-1. En plus de réguler l’expression de nombreux gènes, l’activité transcriptionnelle des ERs est aussi régulée par les corégulateurs qui sont recrutés sur les ERs. Nous avons identifié un nouveau partenaire d’interaction inattendu pour les ERs, soit le facteur de transcription hématopoïétique TAL1. Malgré sa réputation d’oncogène dans les leucémies lymphoblastiques aiguës des cellules T, ce facteur de transcription est un corépresseur d’ERα, dû à son effet répresseur direct sur l’activité transcriptionnelle du récepteur en réponse à l’estrogène et donc sur l’expression de ces gènes cible dans le cancer du sein. De plus, TAL1 réprime aussi l’activation d’ERα en réponse à la phosphorylation induite par la voie des MAPK/Erk. Cette répression d’ERα par TAL1 résulte en une diminution de la prolifération et la migration des cellules cancéreuses mammaires. / Despite many advances in treatment of gynecological cancers, they remain the leading cause of cancer death in women. Chromosomal and genome instabilities at the 3p21.3 locus are frequent events related to epithelial cancers, including breast and ovarian cancers. It is in this region that the hyaluronidase HYAL-1, HYAL-2 and HYAL-3 genes are found. HYAL-1 is particularly overexpressed in several cancers, including prostate, bladder, neck, head and breast cancers where it promotes tumor progression and metastasis. We demonstrate here, that in the 3p21.3 locus, HYAL-1 is a target gene selectively repressed by ERα and estrogen. Integrative data mining using METABRIC dataset revealed a significant inverse correlation between ERα and HYAL-1 gene expression in human breast tumors. We identified binding sites for ERα at the 3p21.3 locus, among which a proximal ERE responsible for repression of HYAL-1 by ERα, in addition to an Sp-1 site required to achieve optimal repression. This repression of HYAL-1 is accompanied by an enrichment of the repressive mark H3K27me3 at the two sites ERE and Sp-1. In addition to regulate the expression of many target genes, the transcriptional activity of estrogen receptors is also regulated by coregulators who are recruited on ERs. We identified a new unexpected interaction partner for ERs, the hematopoietic transcription factor TAL1. Despite its reputation as an oncogene in T-cell acute lymphoblastic leukemia, this transcription factor is an ERα-corepressor due to its direct repressive effect on the transcriptional activity of the receptor in response to estrogen and thus to expression of its target genes in breast cancer. Moreover, TAL1 also inhibits ERs activation in response to phosphorylation induced by the MAPK/Erk pathway. This repression of ERα by TAL1 results in decreased growth and migration of mammary cancer cells.