With the advances in genome wide screening arrays and sequencing techniques scientists were enabled to examine genetic variations and their effects on behavioral phenotypes. While single nucleotide polymorphisms (SNPs) are the most widely studied form of genomic variations to date, another type of variants has become increasingly important in recent research, the copy number variants (CNVs). These large segments of DNA that can comprise up to several megabasepairs and differ in copy number with respect to a reference genome have been associated with several disorders and behavioral phenotypes before. This study investigated the influence of CNVs on anxiety related behavior. The detection of these variants turned out to be a major challenge since all methods available are biased by limitations of the design of the approach and the subsequent computational analyses. Therefore, three different techniques (next generation sequencing and two distinct whole genome genotyping arrays) were employed to identify CNVs in a CD 1 derived mouse model consisting of two mouse strains showing high (HAB) and low (LAB) anxiety related behavior, respectively. By comparing CNVs in HAB vs. LAB mice with expression data of four distinct brain regions of high relevance to the limbic system (central and basolateral amygdala, cingulate cortex and the hypothalamic paraventricular nucleus), it was shown that CNVs can influence the expression of protein coding genes by the alteration of the genes’ copy number per se. Therefore, the genes mapping into regions where CNVs were detected in HAB vs. LAB mice (by all three detection methods) were suggested to be possible effectors of anxiety related behavior. Amongst these candidate genes those were considered to be the most interesting ones that were additionally found to map into regions of CNVs associated with anxiety related behavior in CD 1 mice. CNVs in these mice were detected by means of a whole genome genotyping array and subsequent processing of the raw data with a novel computational approach that was adapted from existing analysis methods. Furthermore, to test the effect of a specific CNV on anxiety related behavior in vivo, a breeding approach was used to generate animals with a full genetic background of HAB mice except for one LAB derived locus harboring a CNV that included the Glo1 gene. No direct effect on the phenotype could be observed, however, the respective CNV might be involved in the manipulation of anxiety related behavior taken into account the interaction with other factors. Taken together, this study provides not only a comprehensive catalogue of CNVs in HAB/LAB mice but also the evidence that these variants can influence anxiety related behavior. Furthermore, it gives a first insight into the functionality of CNVs with respect to anxiety related behavior. Therefore, this thesis provides a profound basis for multiple advanced studies.

No description available.

Here, I studied the role of two candidate genes i.e. neuropeptide S receptor 1 (Npsr1) and transmembrane protein 132D (Tmem132d), in two psychopathological animal models of anxiety-related behavior because of recent studies showing importance of these candidates in limbic areas and the frontal cortex of panic disorder patients, respectively. The two animal models are rat (r) and mouse (m), high anxiety-related behavior (rHAB/mHAB) and low anxiety-related behavior(rLAB/mLAB). To understand the anxiolytic role of neuropeptide S (NPS), basal Npsr1 mRNA expression was studied in limbic brain regions of HAB vs. LAB rodents, i.e. the paraventricular nucleus of hypothalamus (PVN) and amygdala, because these regions have been implicated in anxiety and fear attenuating responses of NPS and also due to differences in long-term activity based on cytochrome c oxidase activity in mHAB vs. mLAB. There was significantly lower basal Npsr1 mRNA expression in the basolateral amygdala of mHAB and also in the PVN of rHAB compared to corresponding LABs. To study the genetic underpinnings underlying this differential expression, Npsr1 DNA sequencing was carried out, which revealed several polymorphisms including single-nucleotide polymorphisms (SNP), insertions and deletions. By using dual reporter (luciferase) assays, I could show that the SNPs in the whole HAB promoter construct cause a significant decrease in promoter activity, thus confirming our in vivo findings in both rats and mice. Interestingly, however, when the promoter constructs were shortened to 500 bp relative to translational (ATG) start site, there was a two-fold higher HAB promoter activity, which could be attributed to the introduction of a polymorphism with putative binding site for the glucocorticoid receptor (GR) transcription factor. The higher HAB promoter activity was suppressed by dexamethasone (a GR activator), thus suggesting the presence of a polymorphism that favors GR binding. These findings are analogous to the higher HAB specific allele expression in cross-mated F1 offspring, which allows us to study the HAB vs. LAB alleles in the same cellular environment, irrespective of any epigenetic or other environmentally mediated factors that might modulate or interact with cis-acting factors. In addition, there was no difference in Npsr1 mRNA expression in the basolateral amygdala of mHAB and mLAB subjected to environmental enrichment (EE) and unpredictable chronic mild stress (UCMS), respectively. Thus it is a non-plastic gene as it does not respond to environmental challenges faced by the susceptible animal models. Similarly, for Tmem132d, using dual luciferase assays, two SNPs in the mHAB promoter region were shown to cause an increase in its corresponding promoter activity, and there was no difference in DNA methylation in the mHAB vs. mLAB Tmem132d promoter region, which explains the observed higher Tmem132d mRNA expression in the anterior cingulate cortex of mHAB. However, mHABs subjected to EE had higher Tmem132d mRNA expression, while mLAB undergoing UCMS had corresponding lower gene expression. To study the cis-trans interaction, we also subjected cross-mated F1 offspring to EE or UCMS and found that both groups have higher mLAB allelic expression, which could be attributed to differences in DNA methylation. Finally, I could show that there was no difference in DNA methylation in the basal mHAB vs. mLAB Tmem132d promoter and that two SNPs in the mHAB promoter were sufficient to cause a higher corresponding promoter activity, which explains the in vivo findings observed in the anterior cingulate cortex. Furthermore, F1 offspring subjected to EE or UCMS had a significantly lower mHAB-specific allele expression which was negatively correlated with DNA methylation, in the Tmem132d promoter region, thus this suggests cross-talk between genetic and environmentally mediated epigenetic factors. In summary, the data suggests a strong evolutionary conserved role of the NPS system considering the similar findings in rats and mice. However, Npsr1 is a nonplastic gene as it is not amenable to the different environmental manipulations applied to the animals. On the other hand, the plastic gene Tmem132d, is differentially expressed, thus making the animals more susceptible to environmental influences. Here, it could be revealed, that SNPs in the mHAB Tmem132d promoter cause higher promoter activity and that environmental manipulation can modulate the gene’s corresponding expression through DNA methylation.

Le développement du cerveau nécessite une organisation finement régulée du système nerveux. Celle-ci dépend de mécanismes tels que la neurogenèse, la neuromigration et l'élaboration de contacts des neurones avec les cellules voisines et la matrice extracellulaire. Pour ce faire, plusieurs molécules sont mises à contribution, dont des facteurs de croissance, des protéases, des molécules d'adhésion cellulaire et de guidage ainsi que les composantes de la matrice extracellulaire. La céruloplasmine (CP) est une glycoprotéine à cuivre bleu de 132 kDa. Principalement sécrétée par les hépatocytes dans la circulation systémique, la CP est également exprimée à la surface d'astrocytes dans le cerveau. Elle agit à titre de principal transporteur plasmatique du cuivre, présente des propriétés antioxydantes et possède des activités oxydasique et ferroxydasique. Cette dernière activité fait de la CP un important régulateur du métabolisme du fer dans l'organisme. Nous avons montré dernièrement que la CP peut induire, in vitro, l'agrégation de neurones nouvellement différenciés de cellules souches embryonnaires P19. Cette action soulève la possibilité d'un rôle de la CP dans l'organisation du système nerveux en développement. Nous testons l'hypothèse que les mécanismes de cette neuroagrégation pourraient dépendre (1) de l'existence de récepteurs neuronaux de la CP, lesquels pourraient être purifiés par chromatographie d'affinité sur de la CP immobilisée en vue de leur caractérisation, et/ou (2) d'une action de protéases compte tenu que des protéases sont impliquées dans l'organisation du système nerveux en développement. Les résultats montrent que la CP peut être couplée à des billes de CNBr-Sepharose avec une efficacité de 100% pour un rapport de 7 mg de protéine par ml de gel. La CP couplée conserve 57% de son activité oxydasique initiale alors que la protéine libre incubée dans des conditions similaires a perdu 82% de son activité. Ainsi, l'immobilisation a un effet protecteur sur l'activité et donc la conformation de la CP. La colonne chromatographique CP-agarose a permis de retenir spécifiquement une protéine de 30 kDa à partir d'extraits de protéines membranaires d'érythrocytes bovins. Cette protéine pourrait correspondre à la forme monomérique du récepteur érythrocytaire rapporté dans la littérature. Des extraits de cerveaux de rat ont été déplétés de leur CP endogène puis chromatographiés sur un gel de CP-agarose. Une protéine de 45 kDa, éluée de ce gel, est reconnue par un anticorps anti-CP, indiquant une fragmentation de la CP immobilisée par une protéase de l'extrait. Ce fragment pourrait avoir une signification biologique puisqu'une forme immunoréactive de 45 kDa de la CP prédomine dans le cerveau de rats adultes et de nouveau-nés, contrairement à la forme native de 132 kDa qui prédomine dans la circulation. Le SBTI (inhibiteur de trypsine de la fève de soya) et l'aprotinine, des inhibiteurs de protéases à sérine, inhibent l'agrégation de neurones P19 induite par l'addition de CP native in vitro. Les neurones traités avec la CP en présence de ces inhibiteurs sont bien répartis sur le support de culture et étendent de nombreux neurites, contrairement aux neurones traités avec la CP seulement. En aucun cas la CP n'est dégradée dans le milieu neuroconditionné. La reeline, une protéase à sérine extracellulaire ayant un rôle établi dans la neuromigration développementale, existe sous des formes de 400, 300 et 180 kDa dans le cerveau, alors que les neurones P19 sécrètent la reeline sous formes de 400 et 180 kDa. Le traitement des neurones avec la CP induit la production de la forme de 300 kDa, production inhibée par le SBTI et l'aprotinine. Alors que l'existence de récepteurs neuronaux de la CP demeure pour le moment élusive, les résultats indiquent qu'une activité protéasique serait impliquée dans l'action neuroagrégative de la CP et que la reeline et non la CP serait une cible de cette activité. L'ensemble du travail supporte donc l'hypothèse que l'action neuroagrégative de la CP in vitro reflète l'implication de la protéine dans la neuromigration in vivo. Il soulève aussi la possibilité que des fragments physiologiques de la CP aient une action neuroagrégative comme celle de la CP native. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Céruloplasmine, neurones P19, migration neuronale, reeline, activité protéolytique

Hintergrund Zu den grundlegendsten Fragestellungen in der Biologie gehört die Frage nach der Natur und Entstehung biologischer Arten. Dieses Problem der Artdefinition (Engl. "Species Problem") war der Ursprung weitläufiger und kontroverser Diskussionen seit der Formulierung der Darwin'schen Evolutionstheorie. Bis heute wurden etwa 30 verschiedene und zum Teil gegensätzliche Konzepte zur Definition und wissenschaftlichen Abgrenzung der Art veröffentlicht. Eine Einigung ist nicht in Sicht. Gleichzeitig ist die Taxonomie mit der Herausforderung konfrontiert, dass ein immenser Teil der weltweiten Artenvielfalt wissenschaftlich noch nicht erfasst und beschrieben ist. Dies erfordert Methoden, die die Beschreibung neuer Arten beschleunigen und gleichzeitig deren Zuverlässigkeit und Nachvollziehbarkeit wahren. DNA-Barcoding, d.h. Artbestimmung an Hand eines kurzen standardisierten Fragments der DNA, soll die Erfassung der Artenvielfalt und das Erkennen unbekannter Arten beschleunigen. Die so genannte "Cybertaxonomie" erlaubt leichteren und schnelleren Zugriff auf vorhandene taxonomische Informationen, indem Daten online und kostenfrei zur Verfügung gestellt werden. Dies trägt zur Steigerung der Effizienz taxonomischer Prozesse bei. Integrative Taxonomie kombiniert verschiedene Beweislinien, wie zum Beispiel morphologische, molekulare und ökologische Daten, um die Zuverlässigkeit und Nachvollziehbarkeit bei der Abgrenzung und Beschreibung von Arten zu erhöhen. In dieser Dissertation untersuche ich zwei verschiedene Studiensysteme, um derzeit als gültig angesehene Modelle der Artbildung und Methoden der Artabgrenzung zu testen. Bei diesen Systemen handelt es sich um die Reptilien der Komoren, einer Gruppe ozeanischer Inseln im westlichen Indischen Ozean, und australische Wasserkäfer. Die Biogeographie dieser beiden Gruppen ist durch höchst unterschiedliche Faktoren geprägt: Die Komoren sind vergleichsweise junge vulkanische Inseln, deren einheimische, landbewohnende und flugunfähige Faunenelemente ausschließlich auf Besiedelung durch Drift über das offene Meer zurückgehen. Dagegen stellt Australien eine alte und isolierte Landmasse dar, deren Lebensgemeinschaften durch Klimaveränderungen in der Erdgeschichte geprägt sind. Ozeanische Inseln wurden schon von frühen Forschern als wichtige Systeme zum Studium der Biogeographie erkannt, und meine Untersuchung dieser beiden so unterschiedlichen Systeme stellt sowohl die Gemeinsamkeiten als auch die Unterschiede der Biogeographie von Inseln und Kontinenten heraus. Methoden und wesentliche Ergebnisse Als Fallbeispiele zur Untersuchung im Rahmen dieser Dissertation wählte ich zwei Teilgruppen der komorischen Reptilien (Geckos der Gattung Paroedura und Schlangen der Gattung Lycodryas) sowie drei Teilgruppen der australischen Wasserkäfer (die Familie Hygrobiidae und die Gattungen Antiporus und Sternopriscus aus der Familie Dytiscidae) aus. In beiden Fällen wurde der Grundstein für weitere Untersuchungen durch DNA-Barcoding gelegt, wie für die Reptilien als Teil dieser Dissertation beschrieben. Als nächsten Schritt führte ich Untersuchungen an mehreren mitochondrialen und nukleären Genmarkern durch, um die Phylogenien der jeweiligen Gruppen zu rekonstruieren und, im Fall der Hygrobiidae, das Alter der Phylogenie durch eine molekulare Uhr abzuschätzen. Ich versuchte, die Phylogenien komorischer Reptilien mit geologischen Daten über die erdgeschichtliche Entstehung der Inseln sowie die Ausbreitungsmöglichkeiten zu und zwischen den Inseln in Verbindung zu bringen. Bei Phylogenien australischer Käfer der Gattungen Antiporus und Sternopriscus suchte ich nach Korrelationen zu Klimaveränderungen in der Erdgeschichte, der Entstehung der australischen Trockengebiete und den Eiszeiten im Pleistozän. Diese Hypothesen konnte ich durch Belege für die ökologische Diversifikation australischer Käfer aus meinen Ökologischen Nischenmodellierungen untermauern. Auf der Grundlage der Ergebnisse von DNA-Barcoding und molekularen Phylogenien unternahm ich taxonomische Revisionen der betreffenden Gruppen nach Methoden der integrativen Taxonomie. Als Beweislinien verwendete ich Daten aus morphologischen Untersuchungen, mitochondrialen und nukleären Genen, sowie kategorische und quantitative ökologische Daten. Dieser Ansatz führte zur Beschreibung einer neuen Art von Käfern (Antiporus occidentalis HAWLITSCHEK, HENDRICH, PORCH, & BALKE, 2011), zweier neuer Arten (Paroedura stellata HAWLITSCHEK & GLAW, 2012 and Lycodryas cococola HAWLITSCHEK, NAGY & GLAW, 2012) und einer Unterart von Reptilien (Lycodryas cococola innocens HAWLITSCHEK, NAGY & GLAW, 2012), sowie zur Bestätigung oder Wiederherstellung der Gültigkeit der zuvor beschriebene Taxa Lycodryas maculatus (GÜNTHER, 1858) und Lycodryas maculatus comorensis (PETERS, 1874). Alle taxonomischen Handlungen wurden gemäß dem Konzept der Cybertaxonomie ausgeführt: es wurden LSID-Nummern vergeben, Einträge in Online-Datenbanken vorgenommen, und nach Möglichkeit Publikationsmodi mit freiem Zugang für Leser gewählt. Zudem verwendete ich die im Rahmen meiner Dissertation gesammelten Daten zur Abschätzung des artenschutzfachlichen Status der Reptilien der Komoren. Außerdem dienten sie als Basis für die Entwicklung von SmartHerper Comoros, einem Naturführer zur Herpetofauna der Komoren als Applikation für Smartphone. Schlussfolgerungen Die Ergebnisse meiner Untersuchungen weisen auf komplexe biogeographische Muster sowohl im insulären als auch im kontinentalen Untersuchungsgebiet hin. Demzufolge haben die Stammformen der dort heimischen Reptilien die Komoren in einem sehr komplizierten Muster besiedelt, das z.B. im Fall der Gecko-Gattung Paroedura mehrere Aussterbe- und Wiederbesiedlungsereignisse beinhaltet und kaum mit der geographischen Lage und dem geologischen Alter der Inseln korreliert. Viele endemische Arten zeigen mögliche morphologische Anpassungen an den Insellebensraum. Molekulare Daten komorischer Reptilien legen nahe, dass Grand Comoro, zuvor als geologisch jüngste Insel angesehen, möglicherweise weit älter ist als bislang angenommen. Über australische Wasserkäfer erhobene Daten zeigten, dass Artbildungsereignisse innerhalb dieser Gruppe von höchst unterschiedlichem erdgeschichtlichem Alter sind und vom Mesozoikum (Hygrobiidae) über das Pleistozän (Antiporus) bis in die jüngste erdgeschichtliche Vergangenheit (Sternopriscus) reichen. Molekulare Unterschiede weisen darauf hin, dass die "Sternopriscus tarsalis radiation" einen der am schnellsten verlaufenen bislang beschriebenen Artbildungsprozesse innerhalb der Insekten darstellt. Der integrativ-taxonomische Ansatz erwies sich in meinen Augen bei der Abgrenzung aller neu beschriebenen Taxa wie auch bei der Bestätigung bestehender Taxa als höchst erfolgreich. Durch diesen Ansatz standen Belege für die Artabgrenzung auch bei unzureichender morphologischer oder genetischer Differenzierung in ausreichendem Maße zur Verfügung. Ökologische Daten, insbesondere solche, die bei Ökologischer Nischenmodellierung gewonnen wurden, haben sich in diesen Fällen als höchst aussagekräftig bei der Artabgrenzung erwiesen. Bei der Anwendung des integrativ-taxonomischen Ansatzes auf Schlangen der Gattung Lycodryas argumentierte ich, den Rang der Unterart auf infraspezifische Einheiten mit einem gewissen Grad der Differenzierung anzuwenden. Schlussendlich liefern die Ergebnisse der Untersuchungen in meiner Dissertation nur einen kleinen, aber meiner Meinung nach dennoch nützlichen Beitrag zu unserem Verständnis darüber, wie biologische Arten entstehen und wie sie wissenschaftlich erfasst werden können. Meine Dissertation präsentiert diese Ergebnisse im Kontext der Debatte über die Artdefinition und stellt auch meine Meinung und Position darin dar. Meiner Ansicht nach ist diese äußerst fruchtbare Debatte von hoher Bedeutung für die zeitgenössische Entwicklung der Evolutionsbiologie und Biodiversitätsforschung. / Background The question of the nature and the origin of biological species is one of the most fundamental issues in biology. This so-called 'species problem' has been intensely debated since the formulation of the theory of evolution by Darwin. To date, about 30 concepts have been published that attempt to define, often conflictingly, what a species is and how it can be recognized by scientists, and a general agreement is not in sight. At the same time, taxonomy faces the challenge of a huge amount of global biodiversity that remains to be scientifically described. Therefore, taxonomic methods are required that make the description of new species faster and at the same time make them more reliable and reproducible. DNA barcoding, i.e., the use of a short standardized fragment of DNA for species identification, means to accelerate biodiversity inventories and the recognition of new species. Cybertaxonomy makes the access to taxonomic information easier and faster and helps increasing the efficiency of the taxonomic workflow by making data available online and free. Integrative taxonomy combines different lines of evidence, such as morphological, molecular, and ecological data, to make species delimitation and species descriptions more reliable and reproducible. In this dissertation I explore two different zoological study systems in order to test current models of speciation and methods of species delimitation. These study systems are the reptiles of the Comoros Archipelago, a group of oceanic islands in the Western Indian Ocean, and aquatic beetles of Australia. The biogeographical backgrounds of these two groups are very different: The Comoros are relatively young volcanic islands whose native terrestrial and non-flying fauna originates exclusively from overseas dispersal. In contrast, Australia is an old isolated landmass whose biota were shaped by past climate change. Oceanic islands have been recognized as prime study systems even by early biogeographers, and my study of these two different systems highlights the common grounds as well as the differences between insular and continental biogeography. Methods and principal findings I selected two groups out of the Comoran reptiles (Paroedura geckos and Lycodryas snakes) and three groups out of the Australian aquatic beetles (family Hygrobiidae and genera Antiporus and Sternopriscus, Dytiscidae) as study groups for this dissertation. In both cases, the data fundament for subsequent studies was laid by DNA barcoding, as included for reptiles in this dissertation. I then conducted analyses of several mitochondrial and nuclear genetic markers to reconstruct the phylogenies of the study groups and, in Hygrobiidae, estimate the divergence times within the phylogeny in a molecular clock approach. In Comoran reptiles, I attempted to correlate phylogenetic hypotheses with the geological history of island emergence and dispersal to and within the archipelago. In Australian Antiporus and Sternopriscus beetles, I attempted to correlate phylogenies with past climate change, the genesis of the Australian arid zone, and the Pleistocene climate oscillations. I used Ecological Niche Modeling to corroborate these hypotheses with evidence for ecological diversification in Australian beetles. Based on the results of DNA barcoding and molecular phylogenies, I used an integrative taxonomic approach to revise the taxonomy of the study groups accordingly. The lines of evidence I used were morphological data, mitochondrial molecular markers, nuclear molecular markers, and categorical and quantitative ecological data. This approach led to the description of one new species of beetle (Antiporus occidentalis HAWLITSCHEK, HENDRICH, PORCH, & BALKE, 2011) and two new species (Paroedura stellata HAWLITSCHEK & GLAW, 2012 and Lycodryas cococola HAWLITSCHEK, NAGY & GLAW, 2012), and one subspecies (Lycodryas cococola innocens HAWLITSCHEK, NAGY & GLAW, 2012), of reptiles, as well as to the confirmation or resurrection of the previously described taxa Lycodryas maculatus (GÜNTHER, 1858) and Lycodryas maculatus comorensis (PETERS, 1874). All taxonomic acts followed a cybertaxonomic concept by using LSID numbers, online databases, and, as far as possible, open access publication. Additionally, I used data collected in the course of this dissertation for estimating the conservation status of Comoran reptiles and for the development of SmartHerper Comoros, a field guide to the herpetofauna of the Comoros as a mobile application for smartphone. Conclusions The results of my studies show complex biogeographic patterns in both the insular and the continental study system. According to these results, the ancestors of native reptiles have colonized the Comoros Archipelago in a very complex pattern, including several events of extinction and re-colonization, e.g., in the case of the gecko genus Paroedura, with little correlation to the geographic positions or geological ages of the islands. Many endemic species show possible morphological adaptations to the island environment. Molecular data of reptiles suggest that Grand Comoro, the presumably geologically youngest island, may be considerably older than previously estimated. In Australian aquatic beetles, speciation events were shown to be of very different ages from Mesozoic (Hygrobiidae) to Pleistocene (Antiporus) and very recent (Sternopriscus). Molecular divergences indicate that speciation in the Sternopriscus tarsalis radiation was one of the fastest speciation events so far described among insects. I applied an integrative taxonomical approach in the delimitation of all newly described taxa and in the confirmation of previously described taxa. This approach provided sufficient evidence for species delimitation even in the absence of morphological differentiation (Antiporus), or when genetic data did not provide any clear evidence (Sternopriscus tarsalis radiation). In these cases, ecological data, particularly such data from Ecological Niche Modeling, was shown to be highly useful in integrative species delimitation. In the same approach applied to Lycodryas snakes, I argued for the usefulness of the subspecies rank for infraspecific entities with some degree of differentiation. I conclude that my research in the study systems I investigated in this dissertation are but small pieces that nevertheless advance our understanding of speciation and species delimitation by contributing to the ongoing debate on the species problem. My dissertation presents these results and represents my position in the debate. I see this debate as a very fruitful process that is highly important for the current development of evolutionary biology and biodiversity research.

Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist mit einer Reihe von lebensbedrohlichen Krankheiten assoziiert. Dazu zählen unter anderem Nasopharynxkarzinome, Hodgkin-Lymphome und lymphoproliferative Erkrankungen nach Organtransplantationen. Dennoch gibt es bisher keinen wirksamen Therapieansatz, der sich spezifisch mit der Rolle von EBV in diesen malignen Erkrankungen auseinandersetzt. Das latente Membranprotein 1 (LMP1) ist das primäre Onkogen von EBV und essenziell für die Transformation von B-Zellen durch das Virus. Für eine effiziente Transformation von Zellen ist die Aktivierung verschiedener zellulärer Signalwege durch LMP1 notwendig. LMP1 besitzt jedoch keine enzymatische Aktivität und die Induktion der Signalwege ist somit abhängig von der Rekrutierung verschiedener zellulärer Adapterproteine. Die Ausbildung der notwendigen Signalkomplexe wird über zwei C-terminale Aktivierungs-Regionen (CTAR1 und CTAR2) vermittelt. Verschiedene Mitglieder der Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor-assoziierten Faktoren (TRAF)-Protein-Familie spielen bei der Induktion der Signalwege durch diese beiden CTAR-Domänen eine zentrale Rolle. Nach grundlegenden Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen LMP1 und rekombinanten TRAF-Proteinen wurde hier die Interaktion zwischen TRAF2 und LMP1 als Zielstruktur für Inhibitoren vorgestellt. TRAF2 ist essenziell für die Aktivierung des NF-κB-Signalweges durch die CTAR1-Domäne und somit für das Überleben EBV-transformierter Zellen. Die Bindung von TRAF2 an LMP1 wurde biochemisch näher charakterisiert und die gewonnen Erkenntnisse verwendet, um ein System zu etablieren, mit dem Inhibitoren gegen den Komplex aus LMP1 und TRAF2 identifiziert werden können. Dieses ELISA-basierte System erfüllt die Anforderungen, die allgemein an hochdurchsatzfähige Systeme gestellt werden. In einem Pilotscreen einer Bibliothek mit Naturstoffen wurden Substanzen identifiziert, die die Bindung von TRAF2 an LMP1 in vitro inhibierten. Die potenteste Substanz inhibierte die Interaktion von TRAF2 und LMP1 mit einem IC50 von 8 µM in diesen in vitro Studien. Weiterhin zeigte diese Substanz eine spezifische biologische Wirkung auf die Vitalität von EBV-transformierten B-Zellen. Zusätzlich konnte in den Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen den verschiedenen TRAF-Proteinen und LMP1 erstmals eine direkte Bindung von TRAF6 an LMP1 gezeigt werden. Entgegen der bisherigen Modellvorstellung, nach der TRAF6 indirekt über Adapterproteine an LMP1 gebunden wird, konnte hier gezeigt werden, dass TRAF6 direkt an die LMP1-Sequenz P379VQLSY innerhalb der CTAR2-Domäne bindet. Diese Sequenz ist essenziell für die Aktivierung verschiedener TRAF6-abhängiger Signalwege durch die CTAR2-Domäne. Auf der Oberfläche von TRAF6 wird die Bindung an LMP1 durch dieselbe Bindetasche vermittelt, über die auch die Interaktion mit zellulären Rezeptoren stattfindet. Diese direkte Interaktion zwischen LMP1 und TRAF6 ist wichtig für die Aktivierung des NF κB-Signalweges durch die CTAR2-Domäne. TRAF6-Mutanten, die nicht mehr in der Lage waren, mit LMP1 zu interagieren, waren ebenfalls nicht mehr dazu fähig, die Induktion von NF κB-Signalen durch die CTAR2-Domäne von LMP1 in embryonalen TRAF6-/- Mausfibroblasten wiederherzustellen. Ebenfalls konnte neben der direkten Bindung von TRAF6 an LMP1 hier eine weitere neue Protein-Protein-Interaktion für TRAF6 beschrieben werden. TRAF6 bindet direkt an das TNF-Rezeptor-assoziierte Todesdomänenprotein (TRADD). Die Interaktion zwischen TRAF6 und TRADD unterscheidet sich jedoch von der Bindung anderer TRAF-Proteine an TRADD. Die in vitro Studien zeigten, dass TRAF6 in der Lage ist, sowohl mit Teilen des N-Terminus, als auch mit Teilen des C-Terminus von TRADD zu interagieren. Diese bisher nicht beschriebene Art der direkten Interaktion von TRAF6 mit TRADD eröffnet neue Einblicke in den Aufbau des LMP1-Signalkomplexes.

In the visual system of Drosophila, photoreceptor (R) neurons elaborate a precise retinotopic map of visual space in the brain. The retina consists of 750 ommatidia, each containing eight photoreceptor subtypes (R1-R8). R1-6 axons terminate in the first optic ganglion, the lamina. R7 and R8 axons extend through the lamina to innervate the second optic ganglion, the medulla. To maintain retinotopy in the lamina, R1-R6 photoreceptor axons have to undergo a complex axonal sorting during development, a process called neural superposition. The mechanisms responsible for the establishment of the highly organized connection pattern needed for retinotopy remain incompletely understood. The transmembrane receptor Golden goal (Gogo) is a known regulator of the developing Drosophila visual system. During R8 pathfinding, Gogo acts in two distinct steps. In larvae Gogo mediates repulsive axon-axon interactions between R8 axons in the medulla to maintain proper spacing. During pupal development, Gogo is required in R8 axons for afferent-target interactions to promote layer recognition. The aim of this thesis is to study how Gogo regulates target selection of R1-R6 axons in the lamina to increase our knowledge on how target specificity is controlled in vivo. The present work shows that Gogo is required for R1-R6 axon lamina targeting and target cartridge selection in distinct developmental steps. To analyze the consequences of loss of gogo function specifically in photoreceptor cells, I generated genetic mosaic eyes using targeted mitotic recombination. During larval and early pupal development loss of gogo function in large clones of R axons results in a disruption of R1-R6 fascicle pattern formation across the lamina plexus. Using single photoreceptor type rescue, I provide evidence that the first outgrowing axon R8 uses Gogo to identify its intermediate target in the lamina and to function as a pioneer axon for all follower R1-R6 axons for their correct patterning along the lamina plexus. Interestingly, small clones of gogo deficient R axons perfectly integrate into a proper retinotopic map suggesting that surrounding R axons of the same or neighboring fascicles provide complementary spatial guidance. Thus, Gogo acts in a partially redundant fashion with local guidance cues provided by neighboring axons. Additionally, during pupal stages at the onset of photoreceptor sorting, I further show that R1-R6 axons fail to choose correct target cartridges in the lamina when Gogo is absent in a large fraction of R cells. I show that gogo mutant R1-R6 axons target correctly to wild-type areas, whereas wild-type R1-R6 axons fail to project correctly to areas innervated by mutant R axons. Interestingly, rescue of Gogo in R8 axons was not only sufficient for fascicle patterning earlier in development but also for R1-R6 axons to select their proper target cartridges in the lamina during neural superposition. Finally, in a third developmental step, Gogo is required for the elongation of R1-R6 axons along lamina cartridges within the neuropile. In the absence of Gogo axons fail to elongate in parallel fashion and intermingle with mutant axons of neighboring cartridges. This suggests that Gogo, similar to its role in medulla targeting, permits photoreceptor axons to stay separated from each other. Based on the results of this thesis, I propose that Gogo contributes to retinotopic map formation in the Drosophila lamina during three steps: initial target recognition of R1-R6 fascicles, target cartridge selection and cartridge elongation. / Im visuellen System von Drosophila stellen Photorezeptorneurone eine präzise retinotopische Karte des visuellen Raumes im Gehirn dar. Die Retina besteht aus 750 Ommatidia, die sich jeweils aus acht verschiedenen Photorezeptorneuronen (R1-R8) zusammensetzen. Die R1-R6 Axone projizieren ins erste optische Ganglion, die Lamina. Die R7 und R8 Axone erstrecken sich durch die Lamina hindurch und innervieren das zweite optische Ganglion, die Medulla. In der Lamina erfordert der Aufbau einer korrekten retinotopischen Karte eine komplexe Umsortierung der R1-R6 Photorezeptoraxone während der Entwicklung. Die genauen Mechanismen dieser präzisen axonalen Sortierung sind bislang nicht vollständig aufgeklärt. Das Transmembranprotein Golden goal (Gogo) ist notwendig für die Entwicklung des visuellen Systems in Drosophila. Bisher konnte eine genauere Funktion von Gogo in R8 Axonen in verschiedenen Entwicklungsschritten der Medulla gezeigt werden. Im späten Larvenstadium reguliert Gogo repulsive Axon-Axon Interaktionen zwischen R8 Axonen und sorgt damit für deren richtige Abstände zueinander. Im Verlauf der pupalen Entwicklung ist Gogo notwendig in R8 Axonen für die Erkennung der richtigen Schichten in der Medulla. Gogo vermittelt hier Interaktionen zwischen R8 Axonen und postsynaptischen Zellen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Funktion von Gogo bei der Zielerkennung von R1-R6 Axonen während der Entwicklung der Lamina zu untersuchen. Ich zeige, dass Gogo in verschiedenen Schritten der R1-R6 Zielfindung während der Laminaentwicklung notwendig ist. Um den Funktionsverlust von Gogo zu analysieren, habe ich durch gezielte mitotische Rekombination genetische Mosaikaugen generiert. Wenn eine große Gruppe benachbarter Photorezeptoren gogo mutant ist, werden R1-R6 Faszikel im frühen Puppenstadium nicht mehr regelmäßig in der Lamina verteilt. Durch eine gezielte Rettung des Phänotyps zeige ich, dass Gogo in R8 Axonen gebraucht wird, damit R1-R6 Faszikel ihre intermediären Positionen in der Lamina finden und R8 als Pionieraxon für nachfolgende R1-R6 Axone fungiert. Interessanterweise, zeigt der Funktionsverlust von Gogo in kleinen Zellgruppen benachbarter Photorezeptoren keine Phänotypen. Das deutet darauf hin, dass wild-typische R1-R8 Faszikel die Wegfindung benachbarter mutanter R1-R8 Faszikel räumlich komplementieren. Gogo ist daher teilweise redundant zu anderen lokalen Wegfindungsmechanismen. Zu einem späteren Zeitpunkt der pupalen Entwicklung, wenn R1-R6 Axone zu verschiedenen Zielzellen sortiert werden, hat der Funktionsverlust von Gogo in einer größeren Zellgruppe eine inkorrekte Zielzellfindung von R1-R6 Axonen zur Folge. Weiter zeige ich, dass gogo mutante R1-R6 Axone ihre Zielzellen korrekt finden, wenn die Photorezeptoren im Zielbereich wild-typisch sind. Umgekehrt innervieren wild-typische Axone falsche Zielzellen, wenn die Photorezeptoren im Zielbereich gogo mutant sind. Interessanterweise war die spezifische Expression von Gogo in R8 Axonen nicht nur ausreichend um den frühen Entwicklungsphänotyp zu retten, sondern auch ausreichend für die korrekte Wegfindung einzelner R1-R6 Axone während der neuralen Superposition zu retten. Im letzten Schritt der Laminainnervierung hat Gogo eine andere Funktion. Hier wird Gogo gebraucht, um die richtigen Abstände von R1-R6 Axonen während der Elongation der Termini zu regulieren. Ein Funktionsverlust von Gogo führt dazu, dass R1-R6 Axone nicht mehr parallel projizieren und sich untereinander überkreuzen. Das deutet darauf hin, dass Gogo eine ähnliche Funktion hat wie während der Medullainnervierung um Axone voneinander zu separieren. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse in dieser Arbeit, ziehe ich den Schluβ, dass Gogo an drei Schritten der Laminaentwicklung beteiligt ist: 1. während der Innervierung der R1-R6 Faszikel, 2. während der Auswahl finaler Zielzellen von R1-R6 Axonen und 3. während der Verlängerung von R1-R6 Termini.

No description available.

Texte remanié de: D. Phil. th.--Oxford. / Bibliogr. p. 354-376. Index.

Diss.--Zoologie--Göteborg--Göteborg university, 2002. / Bibliogr. en fin de chap.