O fungo patogênico Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococcose, uma doença fatal que envolve a formação de criptococomas nos pulmões e cérebro em hospedeiros imunocompetentes. O monitoramento da patogênese de C. gattii e sua colonização nos diferentes órgãos em modelos animais geralmente são analisados pelo método laborioso e impreciso de contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). Neste trabalho foi desenvolvido um modelo prático de monitoramento da infecção e da eficácia de tratamentos antifúngicos, através da construção de uma linhagem de C. gattii expressando constitutivamente o gene repórter mCherry e da avaliação por imagem baseada em fluorescência. Após a infecção intranasal de camundongos e do tratamento com anfotericina B (AMB) ou fluconazol (FLC) durante 4 a 7 dias, pulmões, rins, baço e o cérebro foram removidos e examinados em IVIS Lumina, e a infecção foi monitorada pelo método tradicional de contagem de UFC. As análises por imagem demonstraram a predileção de C. gattii pelo trato respiratório, com presença reduzida no sistema nervoso central. Estas observações foram consistentes com as obtidas pela determinação de UFC. As análises por imagem e a determinação por UFC corroboraram os resultados relativos aos efeitos do tratamento com FLC. Entretanto, os dados foram significativamente diferentes quando AMB foi utilizada. Os resultados obtidos sugerem esta técnica como um potencial método para a investigação da dinâmica da infecção e da sua resposta a tratamentos terapêuticos. / The pathogenic fungus Cryptococcus gattii is one of the etiological agents of human cryptococcosis, which may evolve to the formation of cryptococcomas in the lungs and brain of immunocompetent hosts. Monitoring the progression of pathogenesis and organ colonization in animal models is important in the study of infectious microorganisms. However, this monitoring usually involves laborious and imprecise methods, such as colony forming unit (CFU) determination. Here, we propose the use of a practical model to monitor C. gattii infections in mice and to evaluate antifungal treatment. Our approach involved the infection of mice with a C. gattii strain that constitutively expresses the mCherry reporter gene, followed by fluorescence-based imaging analysis of the colonized organs. Mice were infected intranasally with the fluorescent C. gattii strain and treated with amphotericin B (AMB) or fluconazole (FLC) for 4 or 7 days. The lungs, kidney, spleen, and brain were excised and examined in an IVIS Lumina instrument to determine fluorescence intensity and for CFU determination. Imaging analyses showed that C. gattii primarily colonizes the respiratory tract, with reduced dissemination to the central nervous system. This observation was consistent with the results of CFU determination. The evaluation of the effects of fluconazole treatment in infected mice revealed that both imaging and CFU methods produced similar results. However, the results of the two methods were considerably different when the effects of AMB were evaluated. Our results support the use of imaging-based techniques to monitor infections caused by C. gattii in mice, as well as the response of animal hosts to treatment with antifungals.

O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença rara, mas possui uma taxa de incidência muito próxima à taxa de letalidade. Parte da alta mortalidade do ADP se deve ao diagnóstico difícil (muitas vezes somente possível com análise de tecido pancreático) e tardio da doença, que geralmente acontece com o tumor já em estágio avançado. Assim, a descoberta de biomarcadores não-invasivos surge como uma possibilidade de diagnóstico mais seguro e, de preferência, precoce. Recentemente descobriuse que os microRNAS (miRNAs - pequenos RNAs não-codificantes, envolvidos na iniciação e na manutenção de tumores, incluindo o ADP) são estáveis em amostras circulantes, e a diferença em seus níveis de expressão pode discriminar com acurácia a presença ou ausência de determinadas doenças. Neste estudo, nós avaliamos a expressão de seis miRNAs (miR-21, -34a, -155, -196a, -200b e -376a) escolhidos de acordo com dados prévios da literatura, em amostras de soro e saliva de pacientes com e sem ADP, e também em tecido tumoral e não-tumoral de pacientes com ADP. Esta avaliação comparativa teve como objetivo verificar a presença de biomarcadores de diagnóstico, e possivelmente de prognóstico, neste perfil. Os níveis de expressão foram mensurados através de quantificação relativa, por PCR quantitativo em tempo real. Embora os níveis de expressão tenham se mostrado elevados em todas as amostras de tecido tumoral em relação ao tecido não-tumoral, esta diferença não foi significativa. Isso pode ser explicado pelo pequeno tamanho amostral, pela heterogeneidade tumoral e tecidual e pela ampla variabilidade de expressão dos miRNAs. Em amostras de soro, miR-21 e miR-34a foram significativamente mais expressos em pacientes com ADP e ambos foram capazes de discriminar pacientes com e sem doença com sensibilidade e especificidades clinicamente aceitáveis. Nosso estudo mostrou ainda que existe uma correlação forte e positiva entre os níveis de expressão destes dois miRNAs em amostras de soro e tecido, embora o mecanismo responsável por esta correlação seja desconhecido. A ausência de correlação de miR-21 e de miR-34a, quando analisados individualmente em amostras de soro e tecido pareadas, sugere que diferentes mecanismos regulam a expressão destes miRNAs em diferentes tecidos. Nas amostras de saliva, de modo geral, os níveis de miRNA foram muito baixos, e mesmo os miRNA detectáveis não apresentaram valores de expressão significativamente diferentes entre casos e controles. Tais achados sugerem que os miRNAs escolhidos neste estudo não são biomarcadores salivares adequados para diagnóstico, embora seja necessário uma confirmação destes dados em uma série maior de casos. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a rare disease, whose incidence rates are very close to mortality rates. Part of the high mortality of PDAC is due to its difficult (often only possible with pancreatic tissue analysis) and late diagnosis, when disease is at an advanced stage. Thus, the discovery of noninvasive diagnostic biomarkers emerges as a possibility to perform a safe diagnosis, preferably early in the disease course. Recently, microRNAs (miRNAs - small non-coding RNAs involved in tumors initiation and maintenance, including PDAC) were discovered as stable molecules in circulating samples. Several studies have shown that the difference in their expression levels between cases and controls can accurately discriminate the presence or absence of certain diseases. In this study, we evaluated the expression levels of six miRNAs (miR-21, -34a, -155, -196a, -200b and -376a), chosen according to previous literature data, in serum and saliva samples from patients with and without PDAC, and also in non-tumoral and tumoral tissue. The aim of our study was to investigate the presence of diagnostic and/or prognostic biomarkers. Expression levels were measured by relative quantification using real-time quantitative PCR. Although expression levels were increased in tumor tissues, this difference did not reach significance. This can be explained by the small sample size and the heterogeneity of tumor and tissue, beyond the already described wide variability in miRNAs expression levels. In serum, miR-21 and miR-34a were significantly more expressed in samples from patients with ADP and both were able to distinguish patients with and without disease with clinically acceptable sensitivity and specificity. Our study also showed that there is a strong positive correlation between the expression levels of these two miRNAs in serum and tissue. However, the mechanism related to this correlation remains unknown. The absence of correlation between each miR-21 and miR-34a individually, when matched serum and tissue samples were compared, indicates that different mechanisms regulate the expression of these miRNAs in different body compartments. In saliva samples, generally, miRNA levels were very low, and no difference in miRNA expression levels was seen between cases and controls. These findings suggest that the chosen miRNAs are not adequate as diagnostic biomarkers in saliva, although these findings require confirmation in a larger series of cases.

Orientadora : Profª Drª Fabiane Gomes de Moraes Rego / Coorientador : Prof. Dr. Geraldo Picheth / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 17/06/2015 / Inclui referências : f. 115-141 / Área de concentração: Análises clínicas / Resumo: O Diabetes mellitus (DM) é uma síndrome de etiologia múltipla e poligênica. A hiperglicemia crônica favorece a formação de produtos finais de glicação avançada, os AGEs (Advanced Glycation End-products). A interação AGE-RAGE (receptor for AGE), inicia uma cascata de processos pro-inflamatórios e pro-coagulantes que resultam em estresse oxidativo, base da disfunção endotelial envolvida nas complicações vasculares do DM. Isoformas solúveis de RAGE (sRAGE e esRAGE) têm sido apontadas como preditores de risco para estas complicações. Assim, a interação de fatores genéticos e ambientais na fisiopatologia do DM torna relevante a descoberta de biomarcadores e variantes genéticas que possam auxiliar no diagnóstico, monitoramento ou prognóstico da doença. O objetivo do trabalho foi investigar a presença e associação entre biomarcadores e variantes genéticas no DM tipo 1 (DM1), tipo 2 (DM2) e gestacional (DMG). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Setor de Ciências da Saúde da UFPR (CAAE: 01038112.0.0000.0102). Neste estudo, 967 participantes foram subdivididos em grupos caso-controle: 100 DM1 e 117 controles saudáveis; 200 DM2 e 298 controles saudáveis; e, 127 DMG e 125 gestantes saudáveis. Biomarcadores de controle glicêmico, perfil lipídico, de inflamação e da função renal foram quantificados. Os polimorfismos rs17576 do gene MMP9 e rs3134945 do gene RAGE foram genotipados nos grupos caso-controle DM1 e DM2, e os polimorfismos rs1421085 do gene FTO, rs780094 do gene GCKR, rs1137100 e rs1137101 do gene LEPR, rs1801282 do gene PPARg e rs7901695 do gene TCF7L2, no grupo caso-controle DMG. Um subgrupo de pacientes com DM2 e complicações vasculares (n=44) foi selecionado e pareado por gênero e idade com controles saudáveis (n=44). Neste subgrupo (n=88), foram quantificadas sRAGE e esRAGE através de ensaio imunoenzimático para verificar associação dessas isoformas com outros biomarcadores ou com as variantes rs17576 do MMP9 e rs3134945 do RAGE. Todas as variantes estudadas estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg. O polimorfismo rs17576 do gene MMP9 não foi associado ao DM1(P=0,469) ou DM2 (P=0,269); assim como o rs3134945 do gene RAGE não está associado ao DM1(P=0,162) ou DM2 (P=0,659) na população em estudo. Os polimorfismos rs1421085 do gene FTO, rs1137100 e rs1137101 do gene LEPR, rs1801282 do gene PPARg e rs7901695 do gene TCF7L2 não foram associados ao DMG no presente estudo (P=0,420, P=0,687, P=0,228, P=0,851 e P=0,413, respectivamente). O polimorfismo rs780094 do gene GCKR foi associado ao DMG na população estudada, nos modelos codominante e dominante (P=0,022 e P=0,010, respectivamente), sendo o alelo T protetor (Odds ratio 1,41; 95%IC 0,97- 2,03). Os polimorfismos em estudo não foram associados aos parâmetros antropométricos, clínicos e laboratoriais estudados. As concentrações séricas de sRAGE e esRAGE não diferem entre gêneros e não foram associadas ao DM2 ou com os polimorfismos rs17576 do MMP9 e rs3134945 do RAGE; mas apresentaram correlação positiva e significativa (P<0,05) com a glicemia (r=0,335 e r=0,320, respectivamente) e com o 1,5 anidroglucitol (r=0,446 e r=0,563, respectivamente). Em conclusão, o gene GCKR é candidato à associação com DMG, e a presença do alelo T do polimorfismo rs780094 foi associada ao risco reduzido para o desenvolvimento da doença. Palavras-chave: Diabetes mellitus, biomarcadores, polimorfismos, sRAGE, esRAGE. / Abstract: Diabetes mellitus (DM) is a multifactorial and polygenic syndrome. The chronic hyperglycemia common in DM promotes the formation of Advanced Glycation Endproducts, AGEs. The interaction of AGEs with cellular receptor RAGE (receptor for AGE), initiates a cascade of pro-inflammatory and pro-coagulant processes which result in oxidative stress and endothelial dysfunction, basis of vascular complications. Thus, the soluble isoform of RAGE (sRAGE and esRAGE) have been identified as predictors of risk for DM complications. Because of the interaction of genetic and environmental factors in the DM pathophysiology it is relevant to search for serum or genetic biomarkers as tools for diagnosis, monitoring or prognosis of DM. The aim of this study was to investigate the association between serum biomarkers and genetic variants in type 1 DM (T1D), type 2 DM (T2D) and gestational diabetes (GDM) The study was approved by the Research Ethics Committee of the UFPR Health Sciences Sector (CAAE: 01038112.0.0000.0102). Were involved in this study 967 participants and the case-control groups were composed of 100 T1D and 117 healthy controls; 200 T2D and 298 healthy controls; and GDM 127 and 125 healthy pregnant women. Glycemic control biomarkers, lipid profile and inflammatory and renal function biomarkers were measured. The polymorphisms rs17576 of MMP9 gene and rs3134945 of RAGE gene were genotyped in the case-control groups T1D and T2D, and we genotyped, in GDM case-control group, the polymorphisms rs1421085 of FTO gene, rs780094 of GCKR gene, rs1137100 and rs1137101 of LEPR gene, rs1801282 of PPARg gene and rs7901695 of TCF7L2 gene. A set of T2D patients with vascular complications was selected and paired by gender and age with healthy controls. In this subgroup (n=88) we measured sRAGE and esRAGE by enzyme immunoassay to verify association with biomarkers or with the rs17576 and rs3134945 polymorphisms. All the studied variants were within the Hardy-Weinberg equilibrium. The rs17576 MMP9 gene polymorphism was not associated with T1D (P=0.469) or T2D (P=0.269); as well as rs3134945 RAGE gene polymorphism was not associated with T1D (P=0.162) or T2D (P=0.659) in the study population. The polymorphisms rs1421085 of FTO gene, rs1137100 and rs1137101 of LEPR gene, rs1801282 of PPARg gene and rs7901695 of TCF7L2 gene were not associated with GDM in this study (P=0.420, P=0.687, P=0.228, P=0.851 and P=0.413, respectively). The rs780094 GCKR gene polymorphism was associated with the GDM in the studied population, in codominant and dominant models (P=0.022 and P=0.010, respectively). We also observed the protective effect of T allele (odds ratio 1.41, 95%CI 0,97-2.03) in these patients. None of the studied polymorphisms were associated with anthropometric, clinical and laboratory parameters. Serum concentrations of sRAGE and esRAGE do not differ between genders and are not associated with T2D or with rs17576 of MMP9 gene and rs3134945 of RAGE gene; but they showed a positive and significant correlation (P < 0.05) with glucose (r=0.335 and r=0.320, respectively) and with 1.5 anhydroglucitol (r=0.446 and r=0.563, respectively). In conclusion, the GCKR gene is a candidate for association with GDM, and the presence of the T allele of the rs780094 polymorphism was associated with reduced risk for the disease. Key-words: Diabetes mellitus, biomarkers, polymorphisms, sRAGE, esRAGE.

Existe um atraso no diagnóstico de endometriose de cerca de 8 anos, provavelmente devido ao fato de seu diagnóstico ser cirúrgico e seus sintomas inespecíficos e com vários graus de intensidade. Devido a isso a procura por marcadores de endometriose é de interesse de todos os ginecologistas. Já foi demonstrado que a prolactina está aumentada neste grupo de pacientes. O objetivo deste estudo é avaliar a prolactina e o CA 125 com marcadores no diagnóstico de endometriose. Conduzimos ao longo desta dissertação um estudo transversal com um total de 97 pacientes divididas em dois grupos: 1- Grupo de estudo: pacientes sintomáticas com endometriose (sintomas de infertilidade ou dor), 2- Grupo controle: grupo de pacientes assintomática sem endometriose (pacientes que realizaram laparoscopia para ligadura tubária). Foram coletados amostra de plasma em ciclos menstruais anteriores a cirurgia durante a fase secretora do ciclo menstrual sendo dosado a prolactina (poll de 3 amostras) e o CA 125. Encontramos que a prolactina está aumentada no grupo de pacientes com endometriose, seja em pacientes inférteis, pacientes com dor, estágios I e II ou estágios III e IV. Comparando os dois marcadores, a prolactina (sensibilidade de 21% e especificidade de 99%) e Ca 125 (sensibilidade de 27% e especificidade de 97%) apresentam sensibilidade e especificidade semelhantes (P=0.58). Quando utilizamos estes dois marcadores juntos a sensibilidade foi de 44% e especificidade de 99%. Quando utilizamos, com escolha através da curva ROC, os dois melhores pontos de corte para prolactina e Ca 125 com os seguintes critérios: melhor sensibilidade para uma especificidade maior que 90% endometriose (para prolactina de 14.8 ng/ml e para o CA 125 de 19.8 U/I), obtivemos uma sensibilidade de 77% e especificidade 88% com os dois marcadores juntos. A prolactina é um marcador sérico semelhante ao CA 125 para diagnóstico de endometriose, e estes dois marcadores usados isoladamente possuem baixa sensibilidade. Entretanto, o uso destes dois marcadores juntos especialmente usando pontos de corte mais adequados para endometriose (para prolactina de 14.8 ng/ml e para o CA 125 de 19.8 U/I) apresentam sensibilidade (77%) e especificidade (88%) aceitáveis.

Orientador : Raul Osiecki / Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Educaçao Física. Defesa: Curitiba, 2006 / Inclui bibliografia e anexos

O fungo patogênico Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococcose, uma doença fatal que envolve a formação de criptococomas nos pulmões e cérebro em hospedeiros imunocompetentes. O monitoramento da patogênese de C. gattii e sua colonização nos diferentes órgãos em modelos animais geralmente são analisados pelo método laborioso e impreciso de contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). Neste trabalho foi desenvolvido um modelo prático de monitoramento da infecção e da eficácia de tratamentos antifúngicos, através da construção de uma linhagem de C. gattii expressando constitutivamente o gene repórter mCherry e da avaliação por imagem baseada em fluorescência. Após a infecção intranasal de camundongos e do tratamento com anfotericina B (AMB) ou fluconazol (FLC) durante 4 a 7 dias, pulmões, rins, baço e o cérebro foram removidos e examinados em IVIS Lumina, e a infecção foi monitorada pelo método tradicional de contagem de UFC. As análises por imagem demonstraram a predileção de C. gattii pelo trato respiratório, com presença reduzida no sistema nervoso central. Estas observações foram consistentes com as obtidas pela determinação de UFC. As análises por imagem e a determinação por UFC corroboraram os resultados relativos aos efeitos do tratamento com FLC. Entretanto, os dados foram significativamente diferentes quando AMB foi utilizada. Os resultados obtidos sugerem esta técnica como um potencial método para a investigação da dinâmica da infecção e da sua resposta a tratamentos terapêuticos. / The pathogenic fungus Cryptococcus gattii is one of the etiological agents of human cryptococcosis, which may evolve to the formation of cryptococcomas in the lungs and brain of immunocompetent hosts. Monitoring the progression of pathogenesis and organ colonization in animal models is important in the study of infectious microorganisms. However, this monitoring usually involves laborious and imprecise methods, such as colony forming unit (CFU) determination. Here, we propose the use of a practical model to monitor C. gattii infections in mice and to evaluate antifungal treatment. Our approach involved the infection of mice with a C. gattii strain that constitutively expresses the mCherry reporter gene, followed by fluorescence-based imaging analysis of the colonized organs. Mice were infected intranasally with the fluorescent C. gattii strain and treated with amphotericin B (AMB) or fluconazole (FLC) for 4 or 7 days. The lungs, kidney, spleen, and brain were excised and examined in an IVIS Lumina instrument to determine fluorescence intensity and for CFU determination. Imaging analyses showed that C. gattii primarily colonizes the respiratory tract, with reduced dissemination to the central nervous system. This observation was consistent with the results of CFU determination. The evaluation of the effects of fluconazole treatment in infected mice revealed that both imaging and CFU methods produced similar results. However, the results of the two methods were considerably different when the effects of AMB were evaluated. Our results support the use of imaging-based techniques to monitor infections caused by C. gattii in mice, as well as the response of animal hosts to treatment with antifungals.

O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença rara, mas possui uma taxa de incidência muito próxima à taxa de letalidade. Parte da alta mortalidade do ADP se deve ao diagnóstico difícil (muitas vezes somente possível com análise de tecido pancreático) e tardio da doença, que geralmente acontece com o tumor já em estágio avançado. Assim, a descoberta de biomarcadores não-invasivos surge como uma possibilidade de diagnóstico mais seguro e, de preferência, precoce. Recentemente descobriuse que os microRNAS (miRNAs - pequenos RNAs não-codificantes, envolvidos na iniciação e na manutenção de tumores, incluindo o ADP) são estáveis em amostras circulantes, e a diferença em seus níveis de expressão pode discriminar com acurácia a presença ou ausência de determinadas doenças. Neste estudo, nós avaliamos a expressão de seis miRNAs (miR-21, -34a, -155, -196a, -200b e -376a) escolhidos de acordo com dados prévios da literatura, em amostras de soro e saliva de pacientes com e sem ADP, e também em tecido tumoral e não-tumoral de pacientes com ADP. Esta avaliação comparativa teve como objetivo verificar a presença de biomarcadores de diagnóstico, e possivelmente de prognóstico, neste perfil. Os níveis de expressão foram mensurados através de quantificação relativa, por PCR quantitativo em tempo real. Embora os níveis de expressão tenham se mostrado elevados em todas as amostras de tecido tumoral em relação ao tecido não-tumoral, esta diferença não foi significativa. Isso pode ser explicado pelo pequeno tamanho amostral, pela heterogeneidade tumoral e tecidual e pela ampla variabilidade de expressão dos miRNAs. Em amostras de soro, miR-21 e miR-34a foram significativamente mais expressos em pacientes com ADP e ambos foram capazes de discriminar pacientes com e sem doença com sensibilidade e especificidades clinicamente aceitáveis. Nosso estudo mostrou ainda que existe uma correlação forte e positiva entre os níveis de expressão destes dois miRNAs em amostras de soro e tecido, embora o mecanismo responsável por esta correlação seja desconhecido. A ausência de correlação de miR-21 e de miR-34a, quando analisados individualmente em amostras de soro e tecido pareadas, sugere que diferentes mecanismos regulam a expressão destes miRNAs em diferentes tecidos. Nas amostras de saliva, de modo geral, os níveis de miRNA foram muito baixos, e mesmo os miRNA detectáveis não apresentaram valores de expressão significativamente diferentes entre casos e controles. Tais achados sugerem que os miRNAs escolhidos neste estudo não são biomarcadores salivares adequados para diagnóstico, embora seja necessário uma confirmação destes dados em uma série maior de casos. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a rare disease, whose incidence rates are very close to mortality rates. Part of the high mortality of PDAC is due to its difficult (often only possible with pancreatic tissue analysis) and late diagnosis, when disease is at an advanced stage. Thus, the discovery of noninvasive diagnostic biomarkers emerges as a possibility to perform a safe diagnosis, preferably early in the disease course. Recently, microRNAs (miRNAs - small non-coding RNAs involved in tumors initiation and maintenance, including PDAC) were discovered as stable molecules in circulating samples. Several studies have shown that the difference in their expression levels between cases and controls can accurately discriminate the presence or absence of certain diseases. In this study, we evaluated the expression levels of six miRNAs (miR-21, -34a, -155, -196a, -200b and -376a), chosen according to previous literature data, in serum and saliva samples from patients with and without PDAC, and also in non-tumoral and tumoral tissue. The aim of our study was to investigate the presence of diagnostic and/or prognostic biomarkers. Expression levels were measured by relative quantification using real-time quantitative PCR. Although expression levels were increased in tumor tissues, this difference did not reach significance. This can be explained by the small sample size and the heterogeneity of tumor and tissue, beyond the already described wide variability in miRNAs expression levels. In serum, miR-21 and miR-34a were significantly more expressed in samples from patients with ADP and both were able to distinguish patients with and without disease with clinically acceptable sensitivity and specificity. Our study also showed that there is a strong positive correlation between the expression levels of these two miRNAs in serum and tissue. However, the mechanism related to this correlation remains unknown. The absence of correlation between each miR-21 and miR-34a individually, when matched serum and tissue samples were compared, indicates that different mechanisms regulate the expression of these miRNAs in different body compartments. In saliva samples, generally, miRNA levels were very low, and no difference in miRNA expression levels was seen between cases and controls. These findings suggest that the chosen miRNAs are not adequate as diagnostic biomarkers in saliva, although these findings require confirmation in a larger series of cases.

O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença rara, mas possui uma taxa de incidência muito próxima à taxa de letalidade. Parte da alta mortalidade do ADP se deve ao diagnóstico difícil (muitas vezes somente possível com análise de tecido pancreático) e tardio da doença, que geralmente acontece com o tumor já em estágio avançado. Assim, a descoberta de biomarcadores não-invasivos surge como uma possibilidade de diagnóstico mais seguro e, de preferência, precoce. Recentemente descobriuse que os microRNAS (miRNAs - pequenos RNAs não-codificantes, envolvidos na iniciação e na manutenção de tumores, incluindo o ADP) são estáveis em amostras circulantes, e a diferença em seus níveis de expressão pode discriminar com acurácia a presença ou ausência de determinadas doenças. Neste estudo, nós avaliamos a expressão de seis miRNAs (miR-21, -34a, -155, -196a, -200b e -376a) escolhidos de acordo com dados prévios da literatura, em amostras de soro e saliva de pacientes com e sem ADP, e também em tecido tumoral e não-tumoral de pacientes com ADP. Esta avaliação comparativa teve como objetivo verificar a presença de biomarcadores de diagnóstico, e possivelmente de prognóstico, neste perfil. Os níveis de expressão foram mensurados através de quantificação relativa, por PCR quantitativo em tempo real. Embora os níveis de expressão tenham se mostrado elevados em todas as amostras de tecido tumoral em relação ao tecido não-tumoral, esta diferença não foi significativa. Isso pode ser explicado pelo pequeno tamanho amostral, pela heterogeneidade tumoral e tecidual e pela ampla variabilidade de expressão dos miRNAs. Em amostras de soro, miR-21 e miR-34a foram significativamente mais expressos em pacientes com ADP e ambos foram capazes de discriminar pacientes com e sem doença com sensibilidade e especificidades clinicamente aceitáveis. Nosso estudo mostrou ainda que existe uma correlação forte e positiva entre os níveis de expressão destes dois miRNAs em amostras de soro e tecido, embora o mecanismo responsável por esta correlação seja desconhecido. A ausência de correlação de miR-21 e de miR-34a, quando analisados individualmente em amostras de soro e tecido pareadas, sugere que diferentes mecanismos regulam a expressão destes miRNAs em diferentes tecidos. Nas amostras de saliva, de modo geral, os níveis de miRNA foram muito baixos, e mesmo os miRNA detectáveis não apresentaram valores de expressão significativamente diferentes entre casos e controles. Tais achados sugerem que os miRNAs escolhidos neste estudo não são biomarcadores salivares adequados para diagnóstico, embora seja necessário uma confirmação destes dados em uma série maior de casos. / Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a rare disease, whose incidence rates are very close to mortality rates. Part of the high mortality of PDAC is due to its difficult (often only possible with pancreatic tissue analysis) and late diagnosis, when disease is at an advanced stage. Thus, the discovery of noninvasive diagnostic biomarkers emerges as a possibility to perform a safe diagnosis, preferably early in the disease course. Recently, microRNAs (miRNAs - small non-coding RNAs involved in tumors initiation and maintenance, including PDAC) were discovered as stable molecules in circulating samples. Several studies have shown that the difference in their expression levels between cases and controls can accurately discriminate the presence or absence of certain diseases. In this study, we evaluated the expression levels of six miRNAs (miR-21, -34a, -155, -196a, -200b and -376a), chosen according to previous literature data, in serum and saliva samples from patients with and without PDAC, and also in non-tumoral and tumoral tissue. The aim of our study was to investigate the presence of diagnostic and/or prognostic biomarkers. Expression levels were measured by relative quantification using real-time quantitative PCR. Although expression levels were increased in tumor tissues, this difference did not reach significance. This can be explained by the small sample size and the heterogeneity of tumor and tissue, beyond the already described wide variability in miRNAs expression levels. In serum, miR-21 and miR-34a were significantly more expressed in samples from patients with ADP and both were able to distinguish patients with and without disease with clinically acceptable sensitivity and specificity. Our study also showed that there is a strong positive correlation between the expression levels of these two miRNAs in serum and tissue. However, the mechanism related to this correlation remains unknown. The absence of correlation between each miR-21 and miR-34a individually, when matched serum and tissue samples were compared, indicates that different mechanisms regulate the expression of these miRNAs in different body compartments. In saliva samples, generally, miRNA levels were very low, and no difference in miRNA expression levels was seen between cases and controls. These findings suggest that the chosen miRNAs are not adequate as diagnostic biomarkers in saliva, although these findings require confirmation in a larger series of cases.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-18T18:16:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE FINAL - BIBLIOTECA- luciana.pdf: 2116020 bytes, checksum: 80cd9b81843b4b25db9ab797a238c9a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T18:16:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE FINAL - BIBLIOTECA- luciana.pdf: 2116020 bytes, checksum: 80cd9b81843b4b25db9ab797a238c9a9 (MD5) Previous issue date: 2014-02-10 / Introdução: A obesidade tem sido associada ao desenvolvimento e progressão de diferentes tipos de câncer. Vários mecanismos tentam explicar essa associação, mas há uma necessidade de melhor compreensão dos processos biológicos relacionando câncer e obesidade. A análise proteômica poderá fornecer o conhecimento a nível molecular de fatores envolvidos nesta associação, inferindo-a na prática clínica a partir de novas alternativas de prevenção e tratamento. Objetivos: Analisar o perfil de proteínas significativamente expressas no plasma de pacientes obesos no pré-operatório e seis meses após a cirurgia, avaliando, de maneira prospectiva, os efeitos da perda de peso na regulação da expressão de proteínas relacionadas ao aparecimento de tumores, através do IMC e percentual de perda de peso, bem como avaliar a influência da insulina na expressão das proteínas potencialmente carcinogênicas antes e após a cirurgia bariátrica. Métodos: Foram estudados 40 pacientes, selecionados em dois grupos: controle (n=10) e obesos (n=30), o último foi estratificado, para afastar variáveis de confusão, de acordo com a técnica cirúrgica (Derivação gástrica em Y de Roux, DGYR, n=11 e Gastrectomia vertical, GV, n=19), o IMC (≤ 40 kg/m2 e >40 Kg/m2) e concentração sérica de insulina (≤21 mU/L e >21 mU/L). Foram coletadas amostras de sangue para análise proteômica, através do plasma, utilizando a eletroforese bidimensional. As proteínas foram identificadas pelo TagIdent tool Expert protein Analysis System (Expasy), através do ponto isoelétrico (pI) e peso molecular da proteína; espécie Homo sapiens. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco. Resultados: Foram identificadas seis proteínas relacionadas à carcinogênese, hiperexpressas nos pacientes obesos, que não estavam presentes no grupo controle e tornaram-se ausentes após a cirurgia. Tais proteínas foram o Receptor da apolipoproteína B, o Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas, a Trombospondina- 2, o receptor da Lipoproteína de baixa densidade, a Transtirretina e a Podoplanina. Ainda, foram identificadas duas proteínas carcinogênicas hiperexpressas em todos os subgrupos, mais nos pacientes com obesidade grave (IMC>40 Kg/m2) e hiperinsulinemia (>21 mU/L), a saber: a tetraspanina-13 e a proteína de ligação de ácido graxo hepática (FABPL). Essas não foram mais expressas após o procedimento cirúrgico. A apoliporpoteína A1 estava hiperexpressa em todos os subgrupos no pré-operatório, permanecendo após a cirurgia, independente do percentual de perda de peso, porém desapareceu nos pacientes com hiperinsulinemia. Finalmente, a Calicreína 11, foi detectada em todos os grupos de obesos, pré-operatório, permanecendo presente após a cirurgia, exceto no grupo com obesidade grave e hiperinsulinemia e no grupo que apresentou menor percentual de perda de peso. Conclusão: Na amostra estudada, foram identificadas proteínas potencialmente carcinogênicas nos pacientes portadores de obesidade: Receptor da apolipoproteína B, o Receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas, a Trombospondina- 2, o receptor da Lipoproteína de baixa densidade, a Transtirretina e a Podoplanina. A perda de peso induzida pela cirurgia promoveu o desaparecimento dessas proteínas. A mudança nos níveis séricos de insulina influenciou na expressão da ApoA1 após a cirurgia; A calicreína 11 não foi influenciada pela perda de peso nem pela mudança nos níveis de insulina. / Introduction: Obesity has been associated with the development and progression of different types of cancer. Various mechanisms have been tried in an attempt to explain this association, but a greater understanding of the biological processes relating cancer and obesity is required. Proteomic analysis can provide molecular level knowledge of the factors involved in this association, improving clinical practice through new methods of prevention and treatment. Aim: Analysis of proteins significantly expressed in the plasma of obese pre-operative patients and patients six months after surgery, evaluating, in a prospective manner, the effects of weight loss in the regulation of the expression of proteins related to the appearance of tumors, through BMI and weight loss percentage, as well as analyzing the influence of insulin in the expression of potentially carcinogenic proteins before and after bariatric surgery. Methods: A total of 40 patients were divided into two groups: control (n=10) and obese (n=30). The latter group was stratified to remove confounding variables, in accordance with surgical technique used (Roux-En-Y gastric bypass, RYGB, n=11 and Sleeve Gastrectomy, SG, n=19), BMI (≤ 40 kg/m2 and >40 Kg/m2) and serum insulin concentration (≤21 mU/L and >21 mU/L). Blood samples were collected for proteomic analysis from plasma using two-dimensional electrophoresis. Proteins were identified using the TagIdent Expert protein Analysis System (Expasy) tool, through isoelectric point (pI) and molecular weight of protein; species Homo sapiens. The study was approved by the Ethics Committee in Research of Human Beings of the Centro de Ciências da Saude of the Universidade Federal de Pernambuco. Results: Six proteins related to carcinogenesis were hyperexpressed in obese patients, which were not present in the control group and absent following surgery. These proteins were the receptor of apolipoprotein B, the beta receptor of platelet derived growth factor, thrombospondin- 2, the low density lipoprotein receptor, transthyretin and podoplanin. Two carcinogenic proteins were hyperexpressed in all the subgroups, more frequently in patients with severe obesity (BMI>40 Kg/m2) and hyperinsulinism (>21 mU/L), namely: tetraspanin-13 and the fatty acid binding protein of the liver (FABPL). These were not expressed after surgery. The apoliporpotein A1 was hyperexpressed in all the pre-operative subgroups, and remained after surgery, irrespective of the weight loss percentage, but disappeared in patients with hyperinsulinism. Finally, Kallikrein 11, was detected in all groups of obese pre-operative patients, and remained after surgery except in the group with severe obesity and hyperinsulinism and in the group with lowest weight loss percentage. Conclusion: In the sample group studied, the following potentially carcinogenic patients were identified in obese patients: receptor of apolipoprotein B, the beta receptor of the platelet derived growth factor, trhrombospondin- 2, the low density lipoprotein receptor, transthyretin and podoplanin. Surgical weight loss resulted in the disappearance of these proteins. A change in insulin serum levels influenced the expression of ApoA-1 following surgery; Kallikrein 11 was not influenced by weight loss or by changes in insulin levels.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-07-27T20:16:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gillene Batista Ferreira da Costa.pdf: 1571419 bytes, checksum: 9a32d696aec70ecf4657d46e65dcb369 (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-08-07T22:06:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gillene Batista Ferreira da Costa.pdf: 1571419 bytes, checksum: 9a32d696aec70ecf4657d46e65dcb369 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-07T22:06:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Gillene Batista Ferreira da Costa.pdf: 1571419 bytes, checksum: 9a32d696aec70ecf4657d46e65dcb369 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / CNPq / O 5-fluoruracila (5-FU) é um quimioterápico de uso já consolidado no tratamento de lesões potencialmente malignas de pele. No entanto, em cavidade oral, o uso de quimioterápicos de forma tópica para o tratamento de lesões potencialmente malignas ainda não é uma realidade. Um tratamento tópico evitaria o desconforto pós-operatório causado por procedimentos invasivos. Sendo assim, esse trabalho objetivou avaliar a efetividade do antineoplásico 5-fluoruracila em orabase em lesões potencialmente malignas do dorso da mucosa lingual de camundongos, através da expressão do marcador biológico Ki 67. Para isso, camundongos machos albinos Swiss (Mus musculus) foram submetidos ao carcinógeno 4-nitroquinolona-1-óxido (4NQO), 100 μg/mL, na água de beber por 8 semanas. Após o período de monitoramento de mais 08 semanas, ao desenvolverem o processo de carcinogênese em língua, foram tratados com 01 aplicação tópica diária de 5-FU em orabase, nas concentrações de 0,5% e 5%, por 3 semanas. Após eutanásia dos animais, as línguas foram removidas, analisadas em microscopia de luz e através de imuno-histoquímica para o marcador biológico Ki 67. Observou-se que os animais tratados com 5-FU 0,5% orabase apresentaram uma menor quantidade de células marcadas pelo Ki 67, com uma menor intensidade de coloração, indicando que houve uma menor proliferação celular nos animais tratados, confirmando que o 5-fluoruracil 0,5% em orabase poderá consistir em um recurso terapêutico eficaz no tratamento de lesões potencialmente malignas da cavidade oral. / 5-fluorouracil (5-FU) is a chemotherapy of already consolidated use in the treatment of potentially malignant skin lesions. However, in the oral cavity, the use of topical chemotherapy for the treatment of potentially malignant lesions is not yet a reality. A topical treatment would avoid the postoperative discomfort caused by invasive procedures. Thus, this work aimed to evaluate the effectiveness of 5-fluorouracil antineoplastic in orabase in potentially malignant lesions of the lingual mucosa of mice, through the expression of the biological marker Ki 67. For this, Swiss albino male mice (Mus musculus) were submitted to the carcinogen 4-nitroquinolone-1-oxide (4NQO), 100 μg / mL, in the drinking water for 8 weeks. After the monitoring period of another 8 weeks, when they developed the carcinogenesis process in language, they were daily treated with a daily topical application of 5-FU in orabase, at concentrations of 0.5% and 5%, for 3 weeks. After euthanasia of the animals, the languages were removed, analyzed by light microscopy and by immunohistochemistry for the Ki 67 biological marker. Animals treated with 5-FU 0.5% orabase showed a lower amount of cells labeled with Ki 67, with a lower staining intensity, indicating that there was less cell proliferation in treated animals, confirming that 5-fluorouracil 0,5% in orabase may be an effective therapeutic resource in the treatment of potentially malignant lesions of the cavity oral.