Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Les coronaropathies ischémiques dont l’infarctus du myocarde (IDM) sont responsables de la moitié de ces décès. Après un IDM, le cœur met en place un processus de cicatrisation afin de pallier la mort des cardiomyocytes et la perte de contractilité. S’il est dérégulé, ce processus peut conduire à un remodelage ventriculaire gauche (RVG) délétère qui altère la fonction ventriculaire (FV) et prédispose à l’insuffisance cardiaque. La découverte de nouveaux biomarqueurs capables de prédire le risque du RVG pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients à risque et ainsi de réduire l’incidence de l’insuffisance cardiaque. De nombreuses différences ont été mises en évidence entre les hommes et les femmes avec IDM, et ce au niveau de la pathophysiologie, des symptômes, des biomarqueurs et même du processus du RVG. Ces différences impliquent le besoin de découvrir des biomarqueurs spécifiques à chaque sexe ou d’utiliser les biomarqueurs actuels différemment chez les femmes et les hommes. L’objectif de ce travail de thèse a été de mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs de la FV après un IDM. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux différences homme-femme dans les capacités prédictives de ces biomarqueurs. La première étude a eu pour objectif de valider l’association de cinq gènes avec la FV après un IDM établie lors d’études préliminaires. Une combinaison de trois gènes (LTBP4, TGFBR1 et TNXB) a été identifiée comme étant capable d’améliorer la prédiction de la dysfonction ventriculaire par les marqueurs actuels. Dans un second temps, nous avons montré dans une cohorte nationale d’IDM que le peptide natriurétique NT-proBNP n’était pas capable de prédire la FV chez les femmes alors que la troponine cardiaque était associée avec la dysfonction ventriculaire dans ce groupe. Dans une troisième étude, nous avons mis en évidence l’association entre le gène CDKN1C et la dysfonction ventriculaire spécifiquement chez les femmes. En conclusion, nos études contribuent à la découverte de nouveaux biomarqueurs du RVG post-IDM et attirent l’attention sur les différences hommes-femmes pour l’utilisation de ces biomarqueurs vers une médecine personnalisée / Cardiovascular disease is the first cause of mortality worldwide. Ischemic heart diseases among which myocardial infarction (MI), are responsible for half of these deaths. In order to cope with the loss of cardiomyocytes after MI and to attenuate the alteration of contractility, a repair process is implemented in the heart. If this repair process is dysregulated, it could lead to a maladaptive left ventricular remodeling (LVR) altering LV function and leading to heart failure. The discovery of novel biomarkers able to predict accurately the risk of LVR could lead to a better management of the patients at risk and reduce the incidence of heart failure. Many differences have been highlighted between men and women with MI, regarding the pathophysiology, the symptoms, levels of cardiac biomarkers and the process of LVR. These differences imply the discovery of novel sex-specific biomarkers for LVR prediction or the use of the known biomarkers in a sex-specific manner. The aim of this work was to discover novel biomarkers of left ventricular function (LVF) after an AMI, focusing on sex-differences. First, we aimed to validate the association between five genes previously found to be associated with LVF in small-scale studies. A panel of three genes (LTBP4, TGFBR1 and TNXB) was able to improve the ability of a clinical model to predict LVF. Second, we observed that the cardiac biomarker NT-proBNP was not predictor of LVF in women, whereas cardiac troponin was associated with LVF in this sex-group. A third study showed the association of the gene CDKN1C with LVF post-MI in a female-specific manner. In conclusion, our studies contribute to the discovery of novel biomarkers of LVF and draw the attention to sex differences in the clinical use of biomarkers towards the implementation of personalized medicine

L’adénomyose est une pathologie chronique bénigne de l’utérus caractérisée par une infiltration du myomètre par du tissu endométrial composé de glandes et de stroma avec une hypertrophie et une hyperplasie des cellules musculaires lisses adjacentes. Cette maladie fréquente de la femme en âge de procréer cause des symptômes invalidants comme des dysménorrhées, des saignements utérins anormaux et une infertilité. L’adénomyose utérine est souvent associée à d’autres pathologies gynécologiques bénignes œstrogéno-dépendantes comme les léiomyomes utérins et l’endométriose. Les options thérapeutiques médicamenteuses sont purement symptomatiques et non-curatives et l’adénomyose reste une cause majeure d’hystérectomie. Les mécanismes physiopathologiques qui aboutissent au développement de l’adénomyose sont probablement multifactoriels et ne sont que partiellement compris actuellement. Selon la théorie la plus communément admise, l’adénomyose trouve son origine dans la couche basale de l’endomètre avec une invagination de cellules entre les faisceaux musculaires et/ou le long de vaisseaux lymphatiques. De multiples facteurs pourraient être impliqués dans l’initiation de cette invasion, notamment une résistance à l’action de la progestérone, une production intra-lésionnelle d’œstrogènes par activation de l’aromatase, des anomalies myométriales prédisposant à l’invasion, des lésions tissulaires induites par la grossesse, l’accouchement, le dyspéristaltisme utérin ou iatrogènes et des anomalies de l’endomètre le prédisposant à l’invasion. Dans un premier temps nous détaillons, dans un article de revue, les traitements médicamenteux actuellement utilisés pour traiter les symptômes causés par l’adénomyose et discutons les mécanismes physiopathologiques qui pourraient être la cible de nouveaux traitements médicamenteux. Ensuite, nous exposons les résultats de l’étude in vitro des voies de signalisation cellulaires des mitogen-activated protein kinases (MAPKs) et phosphatidylinositol 3 kinase/Akt/mammalian target of rapamycin (PI3K/mTOR/Akt) dans les cellules musculaires lisses utérines issues de femmes avec de l’adénomyose et de témoins sans adénomyose. Nous montrons une augmentation de la prolifération des cellules myométriales avec une activation in vitro de la voie MAPK/ERK chez les femmes avec de l’adénomyose en comparaison avec les témoins. L’activation de la voie PI3K/mTOR/Akt n’est pas significativement différente. La production de dérivés réactifs de l’oxygène et leurs voies de détoxification ne sont pas différentes dans les cellules myométriales de femmes avec de l’adénomyose et celles de témoins, ce qui suggère une activation de la voie des MAPK/ERK indépendante des dérivés réactifs de l’oxygène. Nos résultats montrent que des inhibiteurs des protéines kinases et le rapanalogue temsirolimus contrôlent la prolifération des cellules myométriales in vitro, ce qui suggère une implication des voies de signalisation MAPK/ERK et PI3K/mTOR/Akt dans la prolifération des cellules musculaires lisses dans l’adénomyose et les léiomyomes. Finalement, nous avons étudié l’ostéopontine comme biomarqueur sérique dans une cohorte de femmes en âge de procréer opérées pour des pathologies gynécologiques bénignes. La présence d’endométriose a été déterminée chirurgicalement et les lésions endométriosiques ont été confirmées histologiquement et classées en lésions superficielles, endométriomes ou lésions invasives profondes. La présence d’adénomyose a été déterminée par imagerie par résonance magnétique préopératoire et deux types d’adénomyose ont été caractérisés : l’adénomyose diffuse, l’adénomyose focale avec ou sans lésions diffuses associées. L’ostéopontine sérique est diminuée en cas d’adénomyose focale et de lésions d’endométriose profonde en comparaison avec des témoins sains et augmentée dans l’endométriose superficielle en comparaison avec l’endométriose profonde. (...) / Adenomyosis is chronic benign uterine disease characterized by myometrial infiltration by endometrial tissue – both glands and stroma – with hypertrophy and hyperplasia of surrounding smooth muscle cells. This frequent disease occurring in reproductive age women causes invalidating symptoms such as dysmenorrhoea, abnormal uterine bleeding and infertility. Adenomyosis is frequently associated with other estrogen-dependant gynaecologic diseases such as uterine leiomyomas and endometriosis. Medical treatments are non-curative and act purely by alleviating symptoms and adenomyosis remains a major cause of hysterectomy. Physiopathological mechanisms underlying the disease are probably multifactorial and currently not fully elucidated. According to the most widely accepted theory adenomyosis originates from the basal layer of the endometrium which invaginates between smooth muscle cell bundles and/or along lymphatic vessels. Multiple factors could be implicated in triggering this invasion, amongst others resistance to progesterone, intra-lesional production of estrogens through aromatase activation, myometrial anomalies predisposing to invasion, tissue lesions induced by pregnancy, labour, uterine dysperistaltism or iatrogenic and endometrial anomalies predisposing to invasion. First, in a clinical review article, we detail current medical therapies used to alleviate adenomyosis-associated symptoms and discuss physiopathological mechanisms that could be targets for novel medical treatments. We then describe an in vitro study on the activation of the mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and phosphatidylinositol three kinase/mammalian target of rapamycin/Akt (PI3K/mTOR/Akt) signalling pathways in uterine smooth muscle cells derived from women with adenomyosis and from adenomyosis-free controls. We show an increased proliferation of uterine smooth muscle cells related to the in vitro activation of the MAPK/ERK pathway in women with adenomyosis compared to controls. The activation of PI3K/mTOR/Akt was not significantly different. The production of reactive oxygen species and their detoxification enzymes were not different in uterine smooth muscle cells of women with adenomyosis compared to controls suggesting a reactive oxygen species independent activation of the MAPK/ERK pathway. Our results also show that inhibitors of protein kinases and the rapanalogue temsirolimus control the in vitro proliferation of uterine smooth muscle cells suggesting an implication of both MAPK/ERK and PI3K/mTOR/Akt in the proliferation of uterine smooth muscle cells in adenomyosis and leiomyomas. Finally, we studied osteopontin as a serum biomarker in a cohort of reproductive-age women undergoing surgery for benign gynaecological conditions. The presence of endometriosis was determined surgically and endometriosis lesions were confirmed histologically and classified into superficial lesions, endometriomas and deep infiltrating lesions. The presence of adenomyosis was determined by magnetic resonance imaging before surgery and women were classified according to two types of adenomyosis: diffuse adenomyosis, focal adenomyosis with or without associated diffuse lesions. Osteopontin levels were decreased in case of focal adenomyosis and deep infiltrating endometriosis compared to disease-free women and increased in superficial endometriosis compared to deep infiltrating endometriosis. Osteopontin, a secreted glycoprotein implicated in inflammation and in tumor-metastasis, is not a biomarker of disease severity in endometriosis and adenomyosis but could reflect events implicated in peritoneal dissemination of endometriosis lesions.

De par leur incidence et un diagnostic tardif, les cancers du sein et du colon restent parmi les plus meurtriers en France. L’identification de marqueur précoce semble primordiale pour détecter rapidement ces maladies et ainsi améliorer la survie des patients. Le protéome de chaque stade du cancer du côlon a été identifié et quantifié par spectrométrie de masse. L’Olfactomedine-4 (OLFM4) a été définie comme un biomarqueur potentiel par sa présence dans le sérum et ses variations d’expression. Alors que cette protéine est surexprimée, au niveau du site tumoral primaire,uniquement dans les stades précoces du cancer colorectal, sa surexpression est maintenue dans le sang des patients tous stades confondus. Cette variabilité d’expression est également retrouvée dans le cancer du sein. L’OLFM4 est décrite comme un marqueur des cellules souches colorectales mais ses fonctions restent contradictoires. Selon le contexte cellulaire, nos travaux associent cette protéine sécrétée à l’établissement de propriétés de cellule souche cancéreuse comme la prolifération en faible adhésion et la formation de mammosphères. Elle facilite également le processus migratoire et la résistance à la chimiothérapie. De plus, des expériences in vivo ont confirmé le caractère protumoral de cette protéine. Nous avons également mis en évidence son implication dans la régulation de l’expression du facteur de transcription GLI1 de la voie Sonic Hedgehog et de protéines d’adhésion telle que l’E-Cadherine. Cette étude décrit le lien étroit entre l’induction d’un phénotype agressif et l’OLFM4 dont le dosage sérique permettrait une détection précoce de ces maladies. / Through their high frequencies and the lack of early diagnosis, breast and colorectal cancer remain poor prognosis’ diseases. Therefor, the identification of early markers appears as crucial. The proteomic approach isone of the potential tools to identify these biomarkers as it enables the study of tumour cell lines or tissues amples. Indeed, proteins enriched from a shotgun proteomic approach can be identified and quantified by mass spectrometry. In a previous study, we have analysed the proteome of colorectal tumour at different stages and defined Olfactomedine-4 (OLFM4) as a potential biomarker. While OLFM4 expression is increased at primary tumoral site only in non-invasive stages, we have observed that OLFM4 isover expressed in the blood of patients regardless of the cancer stage. The same analysis was made on breast cancer patients. Although OLFM4 has been described as a stem cell marker, its functions remain unclear. In this study, we found that OLFM4 confers cancer stem cell properties. It acts as a regulator of proliferation in low adhesion conditions, migration, mammosphere formation and tumor growth. These abilities could be dependent of Sonic Hedgehog signalling pathway, especially of transcriptional factor GLI1, and regulation of adhesion proteins like E-cadherin. According to the cellular background, all these features highlight a close relationship between a potential biomarker and its involvement in the acquisition of an aggressive phenotype.

Les microARNs sont reconnus comme des régulateurs essentiels de l'expression des protéines. Des anomalies dans leur fonction sont associées au développement de nombreuses pathologies.tiel des microARNs en tant que biomarqueurs ou cibles thérapeutiques dans une grande variété de pathologies. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié :1) L'association des microARNs urinaires avec l'évolution de la maladie rénale chronique (MRC) chez l'adulte. La prévalence de la MRC est actuellement estimée à 5-10% de la population et est en constante augmentation. La détection précoce et l'identification de patients ayant une MRC progressant rapidement vers l'insuffisance rénale sont la clé pour une meilleure prise en charge de ces patients. Actuellement les outils non-invasifs comme l'albuminurie ou l'estimation du débit de filtration glomérulaire manquent de précision. Dans notre travail, nous avons tenté d'identifier les modifications urinaires des microRNAs afin d'identifier de nouveaux biomarqueurs non-invasifs associés à la progression de la MRC. Nous avons analysé les modifications des microARNs urinaires par séquençage à haut débit dans des échantillons d'urine de 70 patients atteints de MRC et corrélé leurs profils d'expression à la progression de la maladie. Cela a amené à l'identification de 25 microARNs urinaires (pvalue ajustée <0.05) potentiellement associés à la progression de la MRC. Parmi ceux-là, quatre microARNs (hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-410-3p, hsa-miR-301b-3p, and hsa-miR-145-5p) ont été sélectionnés pour être validés dans une cohorte indépendante de 52 patients atteints de MRC. L'augmentation de l'abondance urinaire de hsa-miR-145-5p a été confirmée comme étant associée à la progression de la MRC. Des analyses in vitro de l'effet de l'inhibition de hsa-miR-145-5p dans les cellules rénales ont mis en évidence que ce microARN semblait être impliqué dans le processus de nécrose. En conclusion, cette étude nous a permis d'identifier hsa-miR-145-5p comme Ainsi, de nombreuses études s'intéressent au potenmarqueur potentiel de la progression de la MRC. 2) La présence de microARNs urinaires associés à la néphropathie obstructive, une maladie fréquemment rencontrée chez les enfants qui peut conduire, dans les cas graves, à l'insuffisance rénale précoce. Dans cette étude, nous avons utilisé la biologie des systèmes et avons combiné des données microARN et ARNm de néphropathie obstructive humaine et animale pour obtenir des informations sur les mécanismes possibles impliqués dans cette maladie. En particulier, nous avons étudié simultanément le miRNome urinaire de nourrissons présentant une obstruction de la jonction pyélo-urétérale et le miRNome et le transcriptome tissulaire rénal chez la souris dans le modèle animal d'obstruction urétérale unilatéral (OUU) partiel et néonatal. Plusieurs centaines de microARNs et d'ARNms étant modifiés, la combinaison des microARNs des deux espèces avec les ARNms cibles associés a permis de sélectionner les 5 microARNs et 35 ARNms les plus fortement associés à la néphropathie obstructive. Une validation in vitro et in vivo a mis en avant que let-7a-5p et miR-29-3p ainsi que deux nouvelles cibles potentielles, l'E3 ubiquitin-protein ligase (DTX4) et neuron navigator 1 (NAV1) étaient dérégulées au cours de cette pathologie. Cette étude est la première à corréler le modèle animal d'OUU partiel et néonatal avec l'obstruction pyélo-urétérale chez l'Homme dans une analyse intégrée de biologie des systèmes. Nos résultats ont révélé let-7a et miR-29b en tant que molécules potentiellement impliquées dans le développement de la fibrose dans la néphropathie obstructive via le contrôle de DTX4 chez l'homme et la souris, ce qui n'aurait pas été identifiable autrement. / MicroRNAs are now recognized as key players in the regulation of proteins and any abnormality in their function is a cause for pathway instability, leading to pathological conditions. Numerous reports from a variety of pathologies provide new data about microRNAs function, their targets and their potential as biomarkers and possible ways to control microRNAs' expression for potential therapeutic purpose. A number of reports also connect microRNAs with pathological conditions in the kidney and point to the use of microRNAs as biomarkers for diagnosis and prognosis of kidney disease in blood, serum, tissue and urine samples. In this thesis, we researched:1) A possible role of the microRNAs in the progression of adult chronic kidney disease (CKD), a disease representing a global burden with the tendency to rise worldwide. Progression of CKD is still very hard to detect non-invasively with the currently used clinical tools (eGFR and albuminuria). In our work we studied alterations of the level of the microRNAs in human urine samples of patients with fast or slow progression of CKD, in order to identify new potential biomarkers for non-invasive progression of CKD. Using Next Generation Sequencing, we analyzed urinary microRNA modifications in urine samples of 70 patients with established CKD and correlated their expression profiles to disease progression. This lead to the identification of 25 urinary microRNAs significantly associated to CKD progression (adjusted pvalue<0.05). Among those, four microRNAs (hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-410-3p, hsa-miR-301b-3p, and hsa-miR-145-5p) were selected for validation in an independent cohort of 52 patients with CKD. Increased urinary abundance of hsa-miR-145-5p was confirmed to be associated to progression of CKD. In vitro exploration of the effects of hsa-miR-145-5p inhibition in human kidney cells showed that the microRNA seemed to be involved in necrotic processes. In conclusion we have identified hsa-miR-145-5p as potential urinary microRNA marker of CKD progression. 2) The identification of microRNAs associated to obstructive nephropathy, a frequently encountered disease in children that can lead, in severe cases, to end stage renal disease (ESRD). In this study we used a comprehensive system biology analysis in which we combined micro- and mRNA data from human and animal obstructive nephropathy to obtain information on possible mechanisms involved in this disease. In particular, we have studied in parallel the urinary miRNome of infants with ureteropelvic junction (UPJ) obstruction and the kidney tissue miRNome and transcriptome of the corresponding neonatal partial unilateral ureteral obstruction (UUO) mouse model. Several hundreds of microRNAs and mRNAs displayed changed abundance during disease. Combination of microRNAs in both species and associated mRNAs let to the prioritization of 5 microRNAs and 35 mRNAs associated to disease. In vitro and in vivo validation identified consistent dysregulation of let-7a-5p and miR-29-3p and new potential targets, E3 ubiquitin-protein ligase (DTX4) and neuron navigator 1 (NAV1). Our study is the first to correlate a mouse model of neonatal partial UUO with human UPJ obstruction in a comprehensive systems biology analysis. Our data revealed let-7a and miR-29b as molecules potentially involved in the development of fibrosis in UPJ obstruction via the control of DTX4 in both man and mice that would not be identified otherwise.

Le cancer colorectal (CCR) représente la seconde cause de mortalité par cancer dans le monde. Les tumeurs sont classées selon les grades histologiques (état de différenciation cellulaire), en bas et haut grades. Les grades les plus avancés sont associés à de faibles taux de survie globale après chimiothérapie à base de 5-Fluorouracile (5-FU). Les taux de réponse aux traitements basés sur l’utilisation du 5-FU en première ligne de traitement demeurent relativement faibles (20–30%) et associés à de mauvais pronostics et des échappements thérapeutiques, dus à la résistance des cellules cancéreuses. Ces données soulignent donc la nécessité d’identifier de nouveaux biomarqueurs de résistance des cellules de CCR au 5-FU. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont porté sur l’étude de la sortiline, une protéine « multi-tâches » appartenant à la famille des récepteurs à domaine VPS10P avec sorLA et sorCS1-3, qui agit comme un (co)récepteur et un régulateur du traffic et de la sécrétion de protéines. La sortiline (et non sorLA), constitue un biomarqueur d’agressivité dans le CCR et est de mauvais pronostique. In vivo et in vitro, au sein des tumeurs et des cellules de CCR (lignées cellulaires et cultures primaires) résistantes au 5-FU, seule la sortiline apparait surexprimée au niveau transcriptomique et protéique. Ces données indiquent que la sortiline constitue également un biomarqueur de résistance au 5-FU, quels que soient les grades, stades et statuts mutationnels. Cette surexpression de la sortiline est majoritairement localisée au sein de l’appareil de Golgi des cellules résistantes et semble être régulée transcriptionnellement via une down-régulation d’ATF-3. L’inhibition génétique (shRNA) ou pharmacologique (CADA) de la sortiline potentialise les effets cytotoxiques du 5-FU, résultant en une forte augmentation de la mort cellulaire. La sortiline semble donc être également impliquée dans la résistance des cellules de CCR au 5-FU ; l’expression de sorLA ne variant pas après son inhbition. Ces résultats suggèrent que la sortiline pourrait constituer un biomarqueur d’agressivité et de résistance des cellules de CCR au 5-FU, mais aussi une nouvelle cible thérapeutique potentielle. / Worldwide, colorectal cancer (CRC) is the second leading cause of cancer-related deaths. Colorectal adenocarcinomas are divided into low and high grades. More advanced tumor grade is associated with poorer global survival following 5-fluorouracil (5-FU)-based systemic chemotherapy. Even when 5-FU is used as the first-line molecule, responsiveness is only 20–30%, and drug resistance contributes to both poor patient prognosis and relapses, emphasizing the need to identify biomarkers involved in this process. In this study, we focused on sortilin, a multifunctional protein among VPS10P domain-related receptors with sorLA and sorCS1-3, that acts as a receptor and co-receptor as well as a regulator of intra- and extracellular protein sorting and trafficking. We obtained evidence that sortilin, but not sorLA, is a biomarker of CRC aggressiveness associated with poor clinical outcomes. In vivo and in vitro, in both 5-FU–resistant CRC cell lines and primary cultures, only sortilin was overexpressed at both protein and mRNA levels, indicating that it could serve as a biomarker of 5-FU resistance regardless of tumor grade and mutational status. Sortilin overexpression is especially localized in Golgi apparatus of 5-FU resistant cells and seems to be transcriptionally regulated through ATF-3 downregulation. Genetic (shRNA) and pharmacological (CADA) inhibition of sortilin potentiated 5-FU–induced cytotoxicity, resulting in a significant increase in cancer cell eradication, implying that sortilin is also actively involved in 5-FU resistance. Moreover, sorLA expression is unchanged upon sortilin inhibition. Our findings indicate that sortilin is a promising biomarker of 5-FU resistance in CRC, as well as a potential therapeutic target for overcoming 5-FU resistance.

Le sujet de cette thèse s'inscrit dans le cadre du projet NODDICCAP initié par l'entreprise bio-Mérieux et visant le développement de Nouveaux Outils pour le Dépistage, le DIagnostic, l'évaluation du pronostic et le suivi du Cancer Colorectal par une Approche Protéomique. Le développement de ces nouveaux outils passe nécessairement par l'identification de marqueurs tumoraux discriminants et spécifiques du cancer colorectal. L'objectif de la thèse a été d'optimiser l'analyse des images et des données issues de la technologie DIGE (Differential In-Gel Electrophoresis), afin de permettre la découverte de marqueurs potentiels du cancer colorectal. Après avoir identifié les maillons faibles de la chaîne de traitement classique des images de gel d'électrophorèse 2D, nous avons été amenés à reconsidérer les approches utilisées et à rechercher des méthodes de traitement d'image et de données innovantes, ou bien existantes mais issues de domaines voisins. Le choix des méthodes a été guidé par l'évaluation de leur efficacité en comparaison aux méthodes classiquement employées, et également par les contraintes liées au contexte biologique et technologique. Les principales avancées issues de ce travail sont la définition du schéma expérimental, l'approche stratégique de l'analyse d'images ainsi que l'analyse statistique des données. En ce qui concerne le schéma expérimental, le choix d'une lignée cellulaire comme standard commun a permis un meilleur recoupement des données entre différentes expériences. L'analyse stratégique de l'analyse d'image a été améliorée grâce à l'utilisation d'un patron de détection unique. Ce patron unique a été réalisé à l'aide d'une méthode de fusion d'images originale permettant une juste représentativité de chacune des tâches protéiques de l'ensemble des images considérées. Enfin, les méthodes pour l'analyse statistique des données ont tenu compte de l'intensité des tâches protéiques grâce à une régulation de la variance lors de la comparaison des ratios. Par ailleurs, la spécification par le biologiste d'un profil de risque a permis, par exemple, de porter une plus grande attention aux protéines fortement exprimées. L'ensemble des méthodes mises en place depuis l'acquisition des images jusqu'à la découverte et la visualisation des marqueurs protéiques potentiels constitue le workflow IDADIGE (Image and Data Analysis for Differential In Gel Electrophoresis). Ce workflow exploite différents logiciels ainsi que plusieurs fonctions implémentées sous Matlab et regroupées sous le nom ProDIGE. L'exploitation par le laboratoire de protéomique de bioMérieux du workflow IDADIGE a été utilisée en routine et a permis la découverte de marqueurs protéiques du cancer colorectal qui doivent maintenant être validés biologiquement.

Le cancer médullaire de la thyroïde (CMT), qui représente 5 à 8% des cancers de la thyroïde, estissu de la transformation maligne des cellules C du parenchyme thyroïdien. Ce cancer, sporadiquedans 70 à 80% des cas et familial pour les 20 à 30% restants, est essentiellement lié à desanomalies du proto-oncogène RET, codant un récepteur à activité tyrosine kinase. La fréquenceélevée des mutations activatrices de RET ont permis d'identifier ce récepteur comme une ciblethérapeutique majeure. Si la chirurgie est le traitement de référence pour les formes localisées, lesformes localement avancées ou métastatiques, de pronostic plus péjoratif étaient avant ledéveloppement des thérapies moléculaires ciblées, dans une impasse thérapeutique. La meilleurecompréhension de la biologie des tumeurs a permis le développement de ces thérapies plusrationnelles et plus spécifiques, en particulier des inhibiteurs d'activité tyrosine kinase (ITK).L'optimisation de leur utilisation en clinique nécessite de mieux comprendre leurs mécanismesd'action.Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse ont été à la fois cognitifs et cliniques, visant àaméliorer la compréhension de la réponse moléculaire à deux ITKs, le sunitinib et la vandetanib,dans le CMT, et à identifier de nouveaux biomarqueurs de suivi thérapeutique. Dans un premiertemps, nous avons montré les effets antiprolifératifs, antitumoraux et antiangiogéniques dusunitinib et du vandetanib dans un modèle de CMT muté RETC634W, mettant en évidence desprofils d'activité proches entre les deux inhibiteurs. Puis, les principales voies de signalisationmises en jeu lors de la réponse à ces ITKs ont été explorées par Reverse-Phase Protein Array(RPPA). Par une approche transcriptomique haut-débit menée sur des modèles précliniques, lesprincipales fonctions cellulaires impliquées dans la réponse au sunitinib et au vandetanib ont étéidentifiées. Le rôle de gènes participant à l'invasion tissulaire et au pouvoir métastatique a été misen évidence. De nouveaux biomarqueurs potentiels de réponse au vandetanib et au sunitinib, telsque l'IL-8 et le TGF-2 dont les taux sériques sont significativement plus élevés chez les patientsatteints de CMT, ont été identifiés. Enfin, l'intérêt de trois approches méthodologiques dans lesuivi de la réponse antitumorale chez les patients a été évalué. Ainsi, le développement d'uneméthode de dosage du vandetanib par spectrométrie de masse a permis de suggérer un lien entredes taux sériques élevés et l'apparition de toxicités sévères. L'évaluation de biomarqueurs dans lesérum de patients traités par le vandetanib a souligné l'intérêt de l'IL-8 comme marqueurpronostic potentiel dans cette pathologie. Enfin les résultats préliminaires, évaluant la réponse ausunitinib par échographie doppler sur un modèle préclinique de souris xénogreffées, ontconfirmé l'intérêt de l'imagerie fonctionnelle dans ce domaine.

Le développement rapide de l'aquaculture dans le monde rend indispensable la maîtrise de ses rejets. Par rapport aux systèmes traditionnels, les systèmes recyclés permettent de réduire les besoins en eau et le volume des rejets. Toutefois, certains nutriments dissous (nitrates, phosphates) s'y concentrent. Le lagunage à haut rendement algal (LHRA) est une des voies possibles pour éliminer ces nutriments. Au cours de ce travail, trois circuits d'élevage: un recyclé, un recyclé avec LHRA et un ouvert témoin ont été étudiés pendant un an pour évaluer l'effet (1) de la réutilisation de l'effluent épuré sur la survie, la croissance et l'alimentation de bars (2) du système d'élevage sur la santé des poissons à travers l'étude de biomarqueurs et de métaux traces bio-accumulés et (3) les conditions optimales de l'épuration algale. Si on n'observe pas d'effet marqué lié au LHRA sur les paramètres zootechniques, une légère réduction de la croissance et de l'alimentation des poissons en circuit recyclé par rapport au témoin est cependant enregistrée. On mesure une faible induction de l'activité EROD et de la SOD dans le circuit recyclé ainsi qu'une bioaccumulation de nombreux métaux dont les teneurs restent cependant très inférieures à celles recommandées pour la consommation humaine. Le traitement par LHRA supprime l'induction de la SOD et la bioaccumulation de la plupart des métaux dans les poissons du circuit recyclé. La croissance des algues et l'épuration des nutriments associée sont saisonnières et améliorées par de faibles densités algales et de forts renouvellements d'eau dans les bassins. L'étude des capacités photosynthétiques des ulves met en évidence une limitation de la croissance algale par le carbone inorganique dissous dans le LHRA. L'intégration du LHRA semble une voie d'amélioration des performances et de la qualité des poissons issus de systèmes recyclés. Par ailleurs, ce travail propose de nouveaux outils d'investigation de la santé des poissons d'élevage.

Un contexte réglementaire de plus en plus strict en évaluation du risque écotoxicologique des milieux aquatiques exige de renforcer les outils d'évaluation. A ce titre, l'étude des biomarqueurs de génotoxicité doit être privilégiée, compte tenu du rôle central de l'ADN dans le fonctionnement du vivant. L'exposition à des agents génotoxiques peut générer des dommages par interaction directe avec l'ADN, mais aussi indirectement, en modulant l'efficacité des mécanismes de réparation de l'ADN, ou la régulation épigénétique de l'expression des gènes. Aujourd'hui, la plupart des biomarqueurs de génotoxicité visent les dommages primaires à l'ADN ou la mutagènicité mais les effets indirects sur sa fonctionnalité sont encore peu étudiés. Dans ce contexte, à l'issue d'une analyse bibliographique comprenant la rédaction d'une revue sur les mécanismes de réparation des dommages à l'ADN chez le poisson, ce travail visait au développement méthodologique de plusieurs biomarqueurs de génotoxicité à l'aide de trois lignées cellulaires pisciaires (RTL-W1, RTGill-W1 et PLHC-1). Pour ce faire, l'essai des comètes en conditions alcalines a été décliné sous plusieurs versions dans l'objectif d'utiliser une technique de base unique permettant la mesure complémentaire de plusieurs biomarqueurs de génotoxicité : les dommages primaires à l'ADN, les activités de réparation et le niveau de méthylation des cytosines du génome. Les résultats soulignent l'intérêt des trois lignées en évaluation de la génotoxicité 1) pour détecter in vitro de manière sensible des atteintes primaires à l'ADN de natures variées à de faibles concentrations grâce à un essai des comètes modifié par une étape de digestion enzymatique avec une glycosylase (Fpg), 2) pour évaluer l'influence des contaminants sur l'activité de réparation par excision de bases (BER) via la mesure de la capacité d'incision d'un ADN substrat porteur de lésions de type 8-oxoGua par des extraits cellulaires (essai BERc). Le niveau de méthylation des cytosines (5-meCyt) des lignées RTgill-W1et RTL-W1 a été mesuré par HPLC-MS-MS, leur valeur élevée permet d'envisager le paramètre méthylation comme biomarqueur potentiel. Ce volet nécessitera cependant des étapes de validations ultérieures car il n'a pas été techniquement possible de mettre au point un essai des comètes modifié pour la mesure du niveau de méthylation de l'ADN. Plusieurs activités de réparation des lignées RTgill-W1 et RTL-W1 ont été caractérisées et révèlent de bonnes aptitudes de réparation de type " Base Excision Repair " (BER) et " Photo Enzymatic Repair " (PER) et une plus faible capacité au " Nucleotide Excision Repair " (NER), soit un profil proche de celui décrit in vivo et sans différence marquée entre les deux lignées. Les biomarqueurs développés sur les lignées cellulaires de poisson au cours de ce travail ont également été appliqués à la mesure des effets génotoxiques d'effluents issus du lessivage de revêtements routiers.

Les tumeurs gliales du cerveau et en particulier les glioblastomes sont des tumeurs de très mauvais pronostic. Les paramètres qui contrôlent des phénotypes comme l'agressivité, la migration, ou la chimio-résistance de ces tumeurs sont mal connus. Dans ce contexte tumoral, il est envisagé que les microARN (ARN non-codants d'une vingtaine de bases) soient des acteurs essentiels des phénomènes de modification phénotypique parce qu'ils sont capables d'orchestrer l'expression de nombreux gènes. Nous avons montré que les microARN sont des marqueurs tissulaires précieux pour le diagnostic permettant de différencier les deux types principaux de gliomes à partir de prélèvements tumoraux. Nous avons aussi observé que plusieurs microARN sont, en outre, sécrétés par les cellules gliales saines ou cancéreuses au sein de microvésicules appelées exosomes. Le contenu en ARN de ces exosomes a été caractérisé par analyse moléculaire transcriptomique (ARN messagers et microARN) par techniques d'hybridation sur puces à ADN Affymetrix. Les profils ARN exosomaux sains et cancéreux sont distincts, mais ils ne reflètent pas intégralement le profil ARN des cellules dont ils sont issus. Des conditions de stress hypoxique ou l'utilisation de composés pharmacologiques (GW4869 et 5-aza-2'-désoxycitidine) n'affectent pas la quantité d'exosomes produite par la lignée de glioblastome (U87) en culture. Les profils ARN sont cependant modifiés, et le contenu des exosomes produits semble donc être un mécanisme actif et régulé. Enfin, des exosomes cancéreux incubés avec des cellules saines ont très peu d'effet sur le phénotype de celles-ci. Les microARN tissulaires et exosomaux seraient donc des acteurs importants de la physiopathologie du gliome et de sa progression, dont les rôles restent encore à préciser.