Protein transport and trafficking are essential processes in living cells and therefore, important to understand. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) allows quantification of the magnitude and direction of flow of fluorescently tagged proteins inside living cells. This is done through computation of the space-time correlation function of the intensity recorded in image series acquired via standard fluorescence microscopy. However, this powerful technique is often hindered by a high concentration of immobile particles in cells. New methods overcoming this problem will be developed in this thesis.We start by creating a theoretical framework for spatio-temporal correlation functions. This allows easy extension to more complex type of kinetics, but more importantly, it constitutes the basis for our new techniques. Most of these techniques share a common characteristic: they rely on the time frequency space to separate populations of particles with different transport properties from each other. Effectively, slow dynamics are concentrated in the low frequencies, allowing extraction of faster dynamics for a minority population.The first approach we propose is based on the theory of discrete-time signal processing. We use a highpass first-order Butterworth infinite-impulse response (IIR) filter on a pixel-per-pixel basis to select the dynamics we are interested in from a particular data set. Via a dimensionless analysis, we show a first approximation on how this filter will affect measurements of flowing and diffusing populations of particles. This filter can be tuned to select particular dynamics and, in contrast to a previously developed filter, does not depend on the length of the time series to be analyzed. An alternative analysis is to look at only the asymmetric part of the correlation function, since flows are the only asymmetric component.The second approach is to look directly in temporal frequency space, or nu-space. Two new spaces of analysis are introduced, nu-space image correlation spectroscopy (nICS) and k-nu-space image correlation spectroscopy (knICS) for its spatial reciprocate. We derive the form of the correlation function for simple dynamics in knICS. In nICS, due to analytic difficulties we simply derive the form for a simple flow.Finally, we use numerical simulations to show the validity of our approaches and explore the strengths and limits of the newly developed techniques. We show that they are only moderately affected by immobile concentration, noise and other background populations. However, the ratio of flow to the diffusion coefficient in biased diffusion is the major constraint. Two new parameters which were previously not accessible with image correlation analysis are extracted from simulations, the diffusion coefficient of a biased diffusion and flow density.This thesis provides new image correlation tools, which complement existing ones, that promise to shed light on the complicated inner workings of the cell. / Le transport et l'adressage de protéines sont des procédés essentiels pour la cellule; leur compréhension est donc primordiale. La spectroscopie de corrélation spatio-temporelle d'images (spatio-temporal image correlation spectroscopy, STICS) permet la quantification de l'amplitude et de la direction du débit de protéines fluorescentes à l'intérieur de cellules vivantes. Ceci est possible à l'aide du calcul de la fonction de corrélation spatio-temporelle d'une série d'images acquises à l'aide d'un microscope à fluorescence standard. Par contre, cette technique est souvent limitée par de hautes concentrations de particules immobiles. De nouvelles méthodes pour surmonter ce problème seront développées dans ce mémoire. Nous commencerons par développer un cadre théorique pour les fonctions de corrélation spatio-temporelle. Ceci nous permet de généraliser facilement les méthodes pour prendre en compte des dynamiques plus complexes, mais, surtout, ceci constitue la base pour nos nouvelles techniques. La plupart de ces méthodes partagent une caractéristiques communes: elles utilisent les fréquences temporelles afin de séparer les populations possédant des propriétés de transport différentes. En effet, les dynamiques lentes sont situées dans la région des basses fréquences, permettant ainsi l'extraction de dynamiques rapides de populations minoritaires. La première approche que nous proposons se base sur la théorie du traitement de signal à temps discret. Nous utilisons un filtre passe-haut de type Butterworth de premier ordre (réponse à une impulsion infinie, infinite-impulse response, IIR) appliqué sur chaque pixel afin de sélectionner les dynamiques recherchées dans nos données. À l'aide d'une analyse adimensionnelle, nous montrons une première approximation de l'effet de ce filtre sur des populations de flux et de diffusion. Une analyse alternative est d'isoler la partie asymétrique de la fonction de corrélation, puisque seulement les populations de flux s'y retrouvent.La deuxième approche est d'inspecter directement l'espace des fréquences temporelles, ou l'espace nu. Deux nouveaux espaces d'analyse sont présentés, la spectroscopie de corrélation d'images dans l'espace nu (nu-space image correlation spectroscopy, nICS) et la spectroscopie de corrélation d'images dans l'espace k-nu (k-nu-space image correlation spectroscopy, knICS). Nous dérivons la forme de la fonction de corrélation pour des dynamiques simples pour knICS mais, dues à des difficultés analytiques, nous présentons seulement la forme de la fonction d'un flux pour nICS. Enfin, nous utilisons des simulations numériques afin de montrer la validité de nos approches en plus d'explorer les forces et les limites de chacune d'entre elles. Nous montrons qu'elles sont peu affectées par la concentration de particules immobiles, le bruit et les autres populations d'arrière-plan. Néanmoins, le ratio entre la vitesse et la diffusion pour une diffusion biaisée émerge comme une contrainte majeure. Deux nouveaux paramètres précédemment non accessibles aux techniques d'imagerie de corrélation sont extraits soit le coefficient de diffusion d'une diffusion biaisée ainsi que la densité de flux. Ce mémoire fournit de nouveaux outils d'imagerie de corrélation, complétant ainsi les techniques pré-existantes, qui promettent de faire la lumière sur le fonctionnement complexe des cellules.

The transient interaction of the Fyn SH3 domain with a proline-rich peptide was studied using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and isothermal titration calorimetry (ITC). Our results are consistent with an effectively two-state binding reaction mechanism. The association rate constants calculated using NMR and ITC data exhibit the magnitude and temperature dependence consistent with a diffusion-limited process. An Eyring plot of koff exhibits a slight curvature, suggesting that non-polar residues of the hydrophobic interface are solvated in the transition state for dissociation. The temperature dependence of NMR-derived dissociation rates closely matches the heat capacity and enthalpy changes determined by ITC. The combination of NMR and ITC data sheds light on how the Fyn tyrosine kinase is activated by binding to proline-rich targets, and represents a powerful approach for characterizing transient protein-protein interactions. / L'interaction rapide entre le domaine SH3 de la protéine Fyn et un peptide riche en proline a été étudiée par résonance magnétique nucléaire (RMN) et titration calorimétrique isotherme (TCI). Nos résultats concordent avec un mécanisme de réaction à deux états. Les vitesses d'association, calculées par RMN et TCI, indiquent une réaction limitée par la diffusion. Dans un graphique d'Eyring, les vitesses de dissociation exhibent une légère courbure, suggérant que l'interface hydrophobique entre les deux composés est solvatés dans l'état de transition; cette courbure est apparentée à la différence de capacité thermique ayant été déterminée par TCI. L'utilisation combinée de RMN et TCI nous a permis de mieux comprendre comment la tyrosine kinase Fyn est activée par son association avec des peptides. Ainsi, nous avons développé une approche robuste pour caractériser les interactions rapides entre protéines.

<p> Despite the abundance of structural data, we still cannot accurately predict the structural and energetic changes resulting from mutations at protein interfaces. The inadequacy of current computational approaches to the analysis and design of protein-protein interactions has hampered the development of novel therapeutic and diagnostic agents. Given the importance of side-chain packing in specifying the stability of protein-protein interfaces and protein cores, it is essential to quantitatively understand (and predict) the side-chain dihedral angle distributions observed in proteins of known structure, for computational protein design to be successful.</p><p> Following upon the pioneering work of Ramachandran and colleagues on predicting the backbone dihedral angle (&phis; and &psi;) distributions with hard sphere plus stereochemical constraints models, we first use an analysis of the &tau; angle dependence of the distribution of &phis;/&psi; angle observed in proteins of known structure to show that steric constraints <i>alone </i> (i.e. without invoking any additional energetic contributions, such as hydrogen bonding) are sufficient to explain the backbone dihedral angle distributions.</p><p> We then employ a hard-sphere plus stereochemical constraints only model to comprehensively study (predict) the side-chain dihedral angle distributions of all non-charged amino acid (Val, Thr, Ser, Cys, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Met, Mse, Nle). Our results emphasize that, in many cases, modeling steric, local and stereochemical constraints alone can quantitatively describe side-chain conformational statistics.</p><p> In addition, we illustrate how our simple hard sphere models can be applied to rank pretein stabilities and binding affinities. This thesis work will not only lead to a fundamental understanding of protein-protein interactions, but also to the development of efficient computational methods to rationally design protein interfaces with tunable specificity and affinity, and numerous applications in biomedicine.</p>

Articular cartilage is avascular and comprised mainly of a water-rich extracellular matrix (ECM); thus solute and fluid transport through cartilage ECM are crucial to cartilage physiology. Once injured, cartilage has a limited capacity for self-repair, often leading to long-term degeneration and osteoarthritis due to focal damage. Modern strategies for cartilage repair are promising, however they rely upon detection of tissue damage at an early stage following injury. This thesis explores relationships between cartilage injury, matrix damage, and associated changes in fluid and solute transport through cartilage. Results indicate avenues for improvement upon in vitro and in vivo methods for cartilage functional assessment, and early detection of focal lesions.First, an investigation was performed into the effects of a well-characterized in-vitro model for cartilage injury on the transport properties of a wide range of solutes, including fluorescent solutes and contrast agents. Mechanical injury was associated with a significant increase in effective diffusivity versus uninjured explants for all solutes studied. In contrast, mechanical injury had no effects on effective partition coefficients for most solutes tested. This distinction is important because measurement of equilibrium partitioning underlies many of the methods currently in use for clinical imaging of cartilage, but we found it to be much less sensitive to cartilage injury than non-equilibrium diffusive transport. Our results emphasized enhanced diffusive transport across the articular surface of injured cartilage, which may have important physiological implications for injury and repair situations. These support development of novel non-equilibrium methods for identification of focal cartilage lesions by contrast agent-based clinical imaging. Second, a new methodology for efficient in vitro mechanical characterization of soft tissue and gel samples was developed, which provides some important advantages over existing methods. Using a novel solution to the poroelastic governing equations for creep valid at early times combined with the classical solution for the stress relaxation problem, this method allows for measurement of gel elastic modulus and hydraulic permeability with some inherent redundancy that improves confidence in measured parameters.This thesis therefore emphasizes the development of new approaches for functional assessment of articular cartilage tissue in the laboratory and in the clinic. Improved observation and quantification of solute transport and poroelastic mechanics in cartilage will contribute to improved tissue functional assessment leading to a better understanding of cartilage physiology and more accurate identification of the stages of degenerative disease. / Le cartilage articulaire est avasculaire et composé principalement d'une matrice extracellulaire riche en eau (ECM). Par conséquent, le transport de solutés et de liquides à travers cette matrice est crucial pour la physiologie du cartilage. Une fois endommagé le cartilage a une capacité limitée pour l'auto-réparation, ce qui conduit souvent à long terme à la dégénération du tissu et à l'osteoarthrite en raison de lésions focalisées. Les stratégies actuelles pour la réparation du cartilage sont prometteuses, mais ils reposent sur la détection de lésions tissulaires à un stade précoce suivant une blessure. Ce mémoire explore la relation entre les lésions cartilagineuses, les dommages à la matrice et les changements dans le transport de solutés et de liquides à travers le cartilage. Nos résultats indiques de nouvelles pistes pour améliorer les méthodes d'évaluation fonctionnelle du cartilage in vitro et in vivo et la détection précoce de lésions focalisées. Premièrement, nous avons examiné les effets d'un modèle bien caractérisé de lésions cartilagineuses sur les propriétés de transport d'un large éventail de solutés y compris de solutés fluorescents et d'agents de contraste. Pour tous les solutés étudiés, l'endommagement mécanique d'explants de cartilage est associée à une augmentation significative de la diffusivité effective comparé aux explants non endommagé. En revanche, les lésions mécaniques n'ont aucun effet sur le coefficient de partage effectif pour la plupart des solutés testés. Cette différence est importante car la mesure du coefficient de partage effectif est à la base de beaucoup de méthodes actuellement utilisées pour l'imagerie clinique du cartilage. Nous démontrons que cette approche est moins sensible aux lésions cartilagineuses que le transport diffusif en conditions de non équilibre. Nos résultats soulignent une augmentation du transport diffusif à travers de la surface articulaire du cartilage endommagé. Ceci pourrait avoir d'importantes implications physiologiques en cas de lésions ou dans des conditions de réparation du cartilage et poussent vers le développement de méthodes d'évaluation sous des conditions de non équilibre pour l'identification de lésions focalisées du cartilage par imagerie clinique sur base d'agents de contraste. Deuxièmement, nous avons développé une nouvelle méthode efficace pour la caractérisation mécanique de tissus mous et d'échantillons de gels in vitro, qui fournit d'importants avantages comparé aux méthodes existantes. Nous avons utilisé une nouvelle solution pour les équations régissant le fluage dans des matériaux poro-élastiques valides au début du phénomène, combiné à la solution classique pour le problème de la relaxation de contrainte. Cette approche permet de mesurer le module élastique et la perméabilité hydraulique d'un gel avec une certaine redondance inhérente qui améliore la confiance dans les paramètres mesurés.Ce mémoire souligne par conséquent de nouvelles approches pour l'évaluation fonctionnelle du tissu cartilagineux articulaire en laboratoire et en clinique. L'amélioration des méthodes d'observation et de quantification du transport de solutés et des mécanismes poro-élastiques dans le cartilage, contribuera à perfectionner l'évaluation fonctionnelle du tissu. Ceci aboutira à une meilleure compréhension de la physiologie cartilagineuse et une identification plus précise des étapes de la maladie dégénérative.

Aggregated Escherichia coli (E. coli) expressing the adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) cause severe cases of fatal neonatal diarrhea. AIDA-I is a glycoprotein, located in the outer membrane of Gram negative E. coli. It causes bacterial aggregation. Autotransporter adhesin heptosyltransferase (Aah) is an E. coli glycosyltransferase that glycosylates AIDA-I. In the first part of this M.Sc. thesis, we observed both non-aggregated and aggregated AIDA-I molecules by single particle transmission electron microscopy and electron tomography in order to provide insights into the poorly understood mechanism of AIDA-I-mediated attachment. Our analysis showed that non-aggregated AIDA-I were elongated molecules ~320 Å long and ~50 Å wide composed of a single AIDA-I polypeptide. While the length and thickness of the molecules were constant, we observed individual molecules with variable curvatures indicating the molecule is flexible. Our results suggest the presence of different structural domains in AIDA-I, resembling 5 "beads on a string" in 2-D averages. At low concentration of β-octylglucoside, AIDA-I molecules aggregated into "spider"-shaped oligomers with elongated "arms" looking similar to monomeric AIDA-I. Interactions between the arms of adjacent oligomers were indicative of the cis-trans interaction of AIDA molecules.In the second part of this M.Sc. thesis, we observed the Aah molecules. Imaging of Aah showed that it assembles into a six fold symmetric ring-shaped complex of ~200 Å in diameter with a ~160 Å pore. Given the 660 kDa measured molecular weight by gel filtration, it is likely that is ring-shaped complexes observed are dodecamers. Aah is the only bacterial glycosyltransferase to have been reported so far to assemble into an oligomer.Taken together, our study provides valuable information on the molecular arrangement of AIDA-I and Aah, and provides the building stones for further studies on the interaction AIDA-I between cells as well as on the glycosylation of AIDA by Aah. / E. coli exprimant l'adhésine impliquée dans l'adhérence diffuse (AIDA-I) causent de graves cas de diarrhée néonatale fatale. AIDA-I est une glycoprotéine, située dans la membrane externe de Gram négatif E. coli. Elle provoque l'agrégation bactérienne. L'autotransporteur adhésine heptosyltransférase (Aah) est une glycosyltransférase chez E. coli qui glycosyle AIDA-I.Dans la première partie de ce mémoire de maîtrise, nous avons observé les molécules d'AIDA sous leurs formes non agrégées et agrégées par microscopie électronique, particules isolées et tomographie électronique afin de donner un aperçu sur le mécanisme d'attachement AIDA. Notre analyse a montré que les molécules AIDA-I sous leurs formes non agrégées étaient des molécules allongées mesurant environ 320 Å en longueur et 50 Å en largeur, composées d'un seul polypeptide AIDA-I. Alors que la longueur et l'épaisseur des molécules sont constantes, nous avons observé des molécules individuelles avec des courbures variables indiquant que la molécule est flexible. Nos résultats suggèrent la présence de différents domaines structuraux dans Aida-I, ressemblant à 5 « perles sur une chaîne » dans nos moyennes deux-dimensionnels. À faible concentration de β-octoglucoside, les AIDA-I molécules s'organisent oligomères ressemblant des « araignées » avec « bras » allongés. Ceux-ci sont d'apparence similaire aux monomères d' AIDA -I. Des interactions entre les bras d'oligomères adjacents ont été observées. Elles pourraient correspondre à l'interaction trans-cis de molécules AIDA-I.Dans la deuxième partie de ce mémoire de maîtrise, nous avons observé les molécules de l'Aah. La visualisation de l'Aah a montré que Aah assemble en un complexe six fois symétrique en forme d'anneau de ~ 200 Å de diamètre avec un trou de ~ 160 Å. Étant donné le poids moléculaire mesuré par filtration sur gel de était de 660 kDa, il est probable que les complexes en forme d'anneau observés sont des dodecamères. Aah est la première glycosyltrsanferase bactérienne jusqu'à lors rapportée à assembler en un oligomère. Pris ensemble, notre étude fournit des renseignements précieux sur l'arrangement moléculaire de AIDA-I et Aah et fournit les pierres de construction pour poursuivre des études sur l'interaction AIDA-I entrecellules, ainsi que sur la glycosylation d'AIDA-I par Aah.

Living biological cells are highly complex, multifunctional systems whose physical attributes are relatively unknown. Critical functions involving plasticity of cell morphology, connectivity and response to stimuli are proposed to be fundamentally related to the micromechanical character and the ability of the cell to exert directed mechanical signaling. Unique abilities of atomic force microscopy in measuring cellular viscoelastic properties (on length scales from nanometers to microns) are explored with specific applications to (1) airway smooth muscle cells and (2) hippocampal neurons. Surface indentation techniques for stiffness mapping, as well as quantitative measurements of frequency-dependent complex rheology are featured. Structural and molecular determinants of dynamic mechanical behavior are identified. In smooth muscle cells, an isotropic fiber network provides strong resistance to deformation. Actin polymerization is largely responsible for stiffening following contractile activation, not myosin cross-bridge formation as expected. On neuronal dendrites, stiffness contrast correlates with known distributions and stability of cytoskeletal elements: microtubules along the shafts and dynamic actin in the spines (micron-sized surface protrusions). Focus is given to dendritic spines as the post-synaptic contact sites for most excitatory transmission between neurons. Large heterogeneity is observed in spine mechanical properties, but stiffer spines appear to be associated with axon-like contacts. Spines may stiffen in response to synaptic stimulation, in agreement with recent observations of actin-based stabilization of spine shape (reduced motility) following excitatory treatments. / Remarkably, the frequency dependence of the complex shear moduli (0.5-100 Hz indentations) of both cellular systems is described well by the same rheological model: that of soft glassy materials existing just above the glass transition. The central feature of this model is that storage ( G') and loss moduli (G") scale in parallel as a weak power-law function of frequency. Power-law exponents (alpha), measured to be of the order 0.1, are related to the level of molecular agitations in the cell and determine the degree of solid-like (G' >> G" with a glass transition at alpha = 0) or fluid-like behavior (G' << G" with alpha = 1 for a pure fluid). The soft glassy hypothesis is founded on the concepts of disorder and metastability of structural elements. A Newtonian viscosity (pure fluid) component is also identified with significant effects for high frequency deformations. Together these properties are critical for describing cellular remodeling: contraction in smooth muscle cells or synaptic plasticity at dendritic spines.

Microtubules are the largest, of the three known protein biopolymers comprising the cytoskeleton, the other two being intermediate filaments and filamentous actin. While the mechanical properties of actin networks have been studied extensively, less is known about the mechanical properties of microtubule networks. Microtubules are involved in many of the cell functions, such as cell division and cargo transport within the cell. We use passive microrheology to study the mechanical properties of model microtubule networks in vitro, in the presence of microtubule associated proteins. Micron-sized polystyrene beads are embedded in the network, and their thermal motion is recorded by video microscopy. Our results show that the motion of small beads varies from highly confined to free, likely indicating the heterogeneous structure of the network. In contrast, the motion of larger beads is entirely confined, setting an upper limit on these heterogeneities. The viscoelastic moduli of the model microtubule networks are then obtained from the autocorrelation position function of the beads by using a generalized Langevin equation. We find that the microtubule network examined behaves like a soft viscoelastic solid at low frequencies, and a viscoelastic liquid at higher frequencies. Limitations of the method are discussed, in particular a possible underestimation of the magnitude of the viscoelasticity, and improvements to the technique are suggested.

Optical mapping of DNA provides large-scale genomic information that could be used to diagnose disease, detect pathogens, and study the re-arrangements between single cells crucial to the development of cancer. A recent optical mapping technique called denaturation mapping has the unique advantage of applying physical principles rather than the action of enzymes to probe genomic structure. Denaturation mapping uses fluorescence microscopy to image the pattern of partial melting along a DNA molecule extended in a channel of cross-section 150nm at the heart of a nanofluidic device. We used denaturation mapping to locate single DNA molecules on the genome of Saccharomyces cerevisiae (12.1Mbp). We compared melting patterns to a computationally predicted melting pattern for the entire genome sequence and performed a statistical analysis to show location results were significant. By imaging 84 DNA molecules we assembled an optical map of the yeast genome with >50% coverage. Our results demonstrate the potential of denaturation mapping as single-molecule probe for long-range structure of a eukaryotic, megabase-pair sized genome. / La cartographie optique de l'ADN fournie de l'information génomique à grande-échelle qui pourrait être utilisée pour diagnostiquer les maladies, détecter les pathogènes, et étudier les réarrangements entre cellules individuelles qui sont cruciaux pour le développement du cancer. Une récente technique de cartographie optique appelée cartographie par dénaturation possède l'avantage unique d'appliquer des principes physique plutôt que l'action d'enzymes pour sonder la structure génomique. La cartographie par dénaturation utilise la microcopie à fluorescence pour imager les motifs créés par la fonte partiel de la molécule d'ADN allongé dans un canal d'un diamètre de 150nm au coeur d'un dispositif nanofluidique. Nous avons utilisé la cartographie par dénaturation pour localiser les molécules d'ADN individuelles dans le génome de Saccharomyces cerevisiae (taille de 12.1 Mbp). Nous avons comparé les motifs de fonte à ceux calculés par ordinateur pour la séquence génomique entière et effectué une analyse statistique pour montrer que les résultats de positionnement étaient significatifs. En imageant 84 molécules d'ADN, nous avons assemblé une carte optique du génome de la levure avec une couverture >50%. Nos résultats démontrent le potentiel de la cartographie par dénaturation comme sonde moléculaire pour des structures à longue portée d'un génome eucaryote ayant plusieurs millions de paires de base.

Glycosaminoglycans (GAGs) are linear, heterogeneous, negatively charged polysaccharides, common within the extracellular matrix (ECM) and at the cell-surfaces of all metazoan cells. Apart from their structural importance to the integrity of the ECM, GAGs are also fundamental modulators of various biological processes at the level of cells (i.e. adhesion, signaling and proliferation), tissue (i.e. inflammation, wound repair, tissue morphogenesis and organogenesis) and organism (i.e. cancer and developmental processes). The biological activities of GAGs are intricately linked to their turnover. Niche-adapted microorganisms express GAG-degrading enzymes, allowing them to process GAGs for nutritional purposes, both for themselves and for their mammalian hosts. In particular, bacterial GAG lyases cleave the glycosidic bond next to the uronic acid present in GAGs, through a b-elimination mechanism that yields disaccharide products with a saturated 4-deoxy-a-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid (DUA). Among the lyasses, heparinase II (HepII) and chondroitinase ABC (ChonABC) possess the striking ability to degrade GAGs regardless of their uronic acid epimer. HepII degrades both heparin and heparan sulfate, whereas ChonABC degrades both chondroitin sulfate and dermatan sulfate. This research is aimed at providing insight into the catalytic mechanism and the substrate specificity of these two enzymes at the molecular level. The applied methodologies used were: (1) X-ray crystallography, aimed at obtaining the crystal structures of P. heparinus HepII and B. thetaiotaomicron ChonABCII as well as enzyme-substrate/product complexes, (2) site-directed mutagenesis of key residues ide / Les glycoaminoglycans (GAGs) sont des polysaccharides, hétérogènes, linéaires et négativement chargés, communs de la matrice extracellulaire (ECM) et de la surface cellulaire chez tous les métazoaires. En plus de leurs importances structurales dans l'intégrité de la ECM, les GAGs sont aussi des modulateurs fondamentaux de divers processus biologiques au niveau cellulaire (dans l'adhésion, la signalisation et la prolifération), au niveau tissulaire (dans l'inflammation, la cicatrisation, la morphogénie des tissus et l'organogenèse) ou dans les organismes (dans le cancer et dans les processus du développement). Les activités biologiques de GAGs sont donc fortement liées à leurs « turnover » au cours du métabolisme. Les microorganismes adaptés aux niches expriment des enzymes dégradant les GAGs afin de les utiliser dans leurs nutritions et dans celles de leurs hôtes. Plus particulièrement les GAGs lyases bactériennes dégradent, par un mécanisme de b-élimination, les liaisons glycosidiques contiguës à l'acide uronique présent dans les GAGs, créant ainsi comme produits des disaccharides saturés (DUA). Parmi ces lyases, l'heparinase II (HepII) et la chondroitinase ABC (ChondABC) possèdent toutes deux l'étonnante habileté de dégrader les GAGs quel que soit l'épimérisation de l'acide uronique (HepII dégrade l'héparine et l'heparan sulfate (HS), alors que ChonABC dégrade la choindroitine sulfate et le dermatan sulfate). Le but de ce travail fut de comprendre le mécanisme catalytique et la spécificité des substrats des ces enzymes à un niveau moléculaire. Pour ce faire, les méthodes utilisées ont été (1) la cristallographie et l

Rationale: The current model of muscle contraction cannot explain the history-dependent properties of skeletal muscles: force enhancement after active stretching and force depression after active shortening. The mechanisms responsible for the history-dependent changes in force remain elusive. / Objectives: To elucidate the mechanisms of the history dependence of muscle contraction, therefore, contributing to our understanding of the basic mechanisms of muscle contraction. / Hypotheses: i) Force enhancement and force depression occur along the ascending limb of the force-length relationship, ii) history dependence is associated with non-uniform changes in sarcomere lengths, and iii) force depression can be inhibited through MgADP-activation. / Methods: Single rabbit psoas myofibrils were activated along the ascending limb of the force-length relationship, and subsequently stretched or shortened. Length changes in individual sarcomeres were measured to evaluate the role of sarcomere length non-uniformity on force production. MgADP activation was used in comparison with Ca2+ activation to evaluate the effect of cross-bridge inhibition on force depression. / Results: Force enhancement and force depression were observed along the ascending limb of the force-length relationship. Sarcomere-length non-uniformity did not increase significantly after stretch or shortening of myofibrils. MgADP-activation resulted in higher forces after shortening than Ca2+-activation. / Conclusions: History-dependent changes in force cannot be entirely explained by sarcomere-length non-uniformity. Force depression is caused partly by cross-bridge inhibition. The study strengthens previous findings showing that force production is not solely dependent on the amount of filament overlap. / Préambule: Le modèle actuel de la contraction musculaire ne peut pas expliquer les propriétés mémoire-dépendantes des muscles squelettiques, soit l'augmentation de la force après un étirement actif et une diminution de la force après un raccourcissement actif. Les mécanismes responsables pour les changements mémoire-dépendants de la force restent obscurs. / Objectifs: Élucider les mécanismes concernant la dépendance de mémoire de la contraction musculaire pour contribuer à notre compréhension des mécanismes de base de la contraction musculaire. / Hypothèses: (i) L'augmentation et la diminution de la force se produisent sur la pente ascendante de la relation force-longueur, (ii) la dépendance de mémoire est associée avec des changements non-uniformes des longueurs des sarcomères, et (iii) la diminution de la force peut être inhibée par une activation via MgADP. / Méthodologie: Des myofibrilles singulières de psoas de lapin ont été contractées sur la pente ascendante de la relation force-longueur et ensuite soumises à des étirements ou raccourcissements consécutifs. Des changements de longueur des sarcomères individuels ont été mesurés pour évaluer le rôle de la non-uniformité de la longueur des sarcomères sur la production de force. L'activation par le MgADP à été utilisée en comparaison avec l'activation par le calcium pour évaluer l'effet de l'inhibition du pontage croisé sur la diminution de force. / Résultats: L'augmentation et la diminution de force ont été observées sur la pente ascendante de la relation force-longueur. La non-uniformité de la longueur des sarcomères n'a pas augmenté de façon significative après un étirement ou un raccourcissement des myofibrilles. Les myofibrilles activées par le MgADP ont démontré des forces supérieures après un raccourcissement en comparaison aux myofibrilles activées par le calcium. / Conclusions: Les changements mémoire-dépendants de force ne peuvent pas être totalement expliqués par la théorie de non-uniformité de la longueur des sarcomères. La diminution de force est causée en partie par l'inhibition du pontage croisé. Cette étude renforce les résultats antérieurs qui montrent que la production de force n'est pas dépendante uniquement du degré de chevauchement des filaments.